KAROLLINA SIQUEIRA

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE ALAGOAS
CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO PROFISSIONAL EM ENERGIA DA
BIOMASSA
ÁREA DE CONCENTRAÇÃO: ETANOL

KAROLLINA SIQUEIRA MOURA

USO DE LEVEDURA DO PROCESSO FERMENTATIVO COMO FONTE DE
DIVERSIDADE PARA SELEÇÃO DE MULTIRRESISTÊNCIA

Rio Largo
2016

KAROLLINA SIQUEIRA MOURA

USO DE LEVEDURA DO PROCESSO FERMENTATIVO COMO FONTE DE
DIVERSIDADE PARA SELEÇÃO DE MULTIRRESISTÊNCIA

Dissertação de Mestrado apresentada ao
Programa
de
Pós-graduação
Profissionalizante em Energia da
Biomassa da Universidade Federal de
Alagoas como requisito parcial para
obtenção do grau de Mestre em Energia
da Biomassa.

Orientador: Prof. Dr. Gildemberg Amorim Leal Júnior.

Rio Largo
2016

Catalogação na fonte
Universidade Federal de Alagoas
Biblioteca Central
Bibliotecária Responsável: Janaina Xisto de Barros Lima
M929u

Moura, Karollina Siqueira.
Uso de levedura do processo fermentativo como fonte de diversidade para
seleção de multiresistência / Karollina Siqueira Moura. – 2016.
64 f. : il.
Orientador: Gildemberg Amorim Leal Júnior.
Dissertação (Mestrado Profissional em Energia da Biomassa) – Universidade
Federal de Alagoas. Programa de Pós-Graduação em Energia da Biomassa.
Centro de Ciências Agrárias. Rio Largo, 2016.
Bibliografia: f. 59-64.
1. Levedura. 2. Etanol. 3. Multirresistência. 4. Diversidade. 5. GTG5.
I. Título.
CDU: 664.642:661.722

DEDICO
Ao Theo, meu filho, por ser a motivação maior
de todo este meu esforço. E a minha família pela ajuda
irrestrita para a obtenção deste objetivo.

AGRADECIMENTOS

A Universidade Federal de Alagoas – (UFAL) e ao Centro de Ciências Agrárias –
(CECA) pela aquisição de conhecimento pelo corpo docente fundamental para a minha
construção profissional e pessoal.
Ao meu orientador Gildemberg Leal Amorim Júnior pela confiança e paciência.
Aos meus amigos da Clínica de Fitossanitária do Centro de Ciências Agrárias (UFAL) em especial: Ana Paula Maria da Silva, Ana Paula Vieira e Kledson Lopes Barbosa
pela colaboração substancial para a obtenção dos resultados;
Aos diretores e funcionários das unidades agroindustrial das destilarias da Usina
Santa Clotilde S/A, Usina Coruripe e Alambique Joaquim Gomes pela disponibilização de
material biológico e dos subprodutos da cadeia produtiva do etanol e da cachaça;
À Clínica de Fitossanitária do Centro de Ciências Agrárias – (UFAL) por facultar
recursos que possibilitaram o cumprimento dos objetivos desta dissertação;
Ao Laboratório de Microbiologia aplicada – BIOGEN (UFAL) pela concessão do
laboratório para realização das análises por biologia molecular vital para a discriminação das
linhagens de leveduras;
Ao Laboratório Fitopatologia do Centro de Ciências Agrárias – (UFAL) pela
disponibilização dos equipamentos indispensáveis na obtenção dos resultados;
A todos que, direta ou indiretamente colaboraram para a realização deste trabalho.

“O êxito ou o fracasso de sua vida não depende de
quanta força você põe em uma tentativa, mas da persistência do
que fizer” (Autor desconhecido).

RESUMO

A destilaria é um ambiente de grande diversidade de leveduras que podem apresentar
características desejáveis e indesejáveis para o processo fermentativo. O monitoramento por
técnicas clássicas e moleculares permite conhecer a diversidade da população de leveduras
que serão selecionadas quanto à resistência aos fatores de estresse. As leveduras presentes na
Usina Coruripe na Safra 2013/2014 foram selecionadas através do incremento do teor de
ºBrix buscando o desenvolvimento de linhagens. Primeiramente, a população inicial de
leveduras foi caracterizada pela macromorfologia e pelo polimorfismo da região do genoma
ITS (Internal Transcribed Sequence) e de regiões repetitivas do genoma. A seleção constituiu
de fermentações consecutivas iniciadas com 17 de ºBrix aumentando o teor a cada cinco
fermentações até o grau 22. As leveduras identificadas antes e após o processo de seleção
foram avaliadas para a capacidade de crescimento pelo parâmetro do µMáx (Taxa de
crescimento específica). As linhagens com maior µMáx foram submetidas aos testes
fisiológicos, a fim de identificar a resistência à temperaturas, pH, glicose e etanol. Trinta e
três linhagens de leveduras distribuídas em 12 morfotipos foram obtidas durante o processo
de seleção, resultando em 26 cepas. Vinte e duas das 33 linhagens apresentaram colônias com
textura lisa. O tamanho do fragmento amplificado referente à região ITS identificou linhagens
de levedura do gênero Saccharomyces e grupos genéticos foram obtidos com o microssatélite
GTG5, sendo quatro perfis genéticos obtidos antes da seleção e quatro após pressão de
seleção. Nove isolados apresentaram alta performance em relação a multiplicação celular com
destaque para o isolado C2(4F) com desempenho semelhante a linhagem controle CAT-1
respectivamente, 0,7817 h-1 e 0,8630 h-1. Os isolados C2(6F) e C3(6F) apresentam resistência
à glicose e a temperatura. O isolado C2(3I) obtido antes da seleção foi o mais resistente
considerando todos os parâmetros analisados. Os resultados encontrados revelam a
importância de melhor investigar as leveduras obtidas durante o experimento, visto que a
melhor performance frente aos principais fatores de estresse da fermentação alcóolica foi
encontrada na linhagem isolada na destilaria.

Palavras-chave: Levedura; Etanol, Multirresistência, Diversidade, GTG5.

ABSTRACT
Distillery is an environment of yeast great diversity wich may have wishable characteristics
for the fermentation process. Monitoring by classical and molecular techniques allows to
know the diversity of the population of which will be selected as the resistance to stress
factors that compromise qualitative and quantitative production of ethanol. Looking for the
diversity contribution of plant in the developing lines process, the yeasts present in Usina
Coruripe in Safra 2013/2014 were selected through of ºBrix. Firstly, the population initial of
yeast was characterized by macromorphology and the polymorphism genome ITS region
(Internal Transcribed sequence) and intercalated to the microsatellite regions. The selection is
consecutive fermentations started with 17 ° Brix increasing content every five fermentations
up to grade 22. Yeasts identified before and after the selection process were evaluated for
growth capacity by μMáx (The specific growth rate) parameter. Strains with greater μMáx
were subjected to physiological testing to identify the temperature resistance, pH, glucose and
ethanol. Thirty-three yeast strains distributed in 12 morphotypes were obtained during the
selection process, resulting in 26 strains. Twenty two of the 33 strains showed colonies with
smooth texture. The fragment size amplified referring to the region ITS identified yeast
strains of the genus Saccharomyces and genetic groups were obtained with the GTG5
microsatellite, four genetic profiles were obtained before selecting and four after selection
pressure. Nine isolates showed high performance in relation to cell proliferation highlighting
the isolated C2 (4F) with similar performance lineage CAT-1 control respectively, 0.7817 h-1
and 0.8630 h-1. The isolated C2 (6F) and C3 (6F) are resistant to glucose and temperature. The
isolated C2 (3I) obtained before the selection was the toughest considering all parameters
analyzed. The results reveal the importance of investigate better the yeast obtained during the
experiment, since the best performance front to the main stress factors of alcoholic
fermentation was found in the strain isolated in the distillery.

Keywords: Yeasts, Ethanol, Multi-resistence, Diversity, GTG5.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1 – Ilustração do número de morfotipos obtidos a partir das linhagens de leveduras
isoladas antes e após pressão de seleção...................................................................................34
Figura 2- Ilustração dos morfotipos isolados durante as fermentações para obtenção de
linhagens de leveduras em mosto fermentado de melaço........................................................35
Figura 3 - Ilustração dos aglomerados celulares “pseudohifas” em microscopia óptica e em
meio de cultivo ágar YEPD......................................................................................................39
Figura 4 - Ilustração da eletroforese em gel de agarose com o padrão de amplificação da
região ITS do DNAr das linhagens de leveduras isoladas no início de safra...........................40
Figura 5 - Ilustração da eletroforese em gel de agarose com o padrão de amplificação da
região ITS do DNAr das linhagens de leveduras isoladas no meio de safra............................41
Figura 6 - Ilustração da eletroforese em gel de agarose com o padrão de amplificação da
região ITS do DNAr das linhagens de leveduras isoladas no final de safra. ...........................42
Figura 7 - Ilustração com os padrões genéticos das linhagens de leveduras antes a pressão de
seleção através do microssatélite GTG5....................................................................................43
Figura 8 - Ilustração com os padrões genéticos das linhagens de leveduras após a pressão de
seleção através do microssatélite GTG5....................................................................................44
Figura 9 - Gráfico com as frequências dos perfis genéticos para o microssatélite GTG5 das
linhagens de leveduras obtidas antes e após a pressão de seleção............................................45
Figura 10 - Gráfico com a distribuição dos grupos genéticos das linhagens de leveduras
obtidas após a pressão de seleção.............................................................................................46
Figura 11 - Gráfico com as comparações dos valores do µMáx das linhagens de leveduras
isoladas da coleta um, antes e após pressão de seleção com aumento gradual do ºBrix..........47
Figura 12 - Gráfico com as comparações dos valores do µMáx das linhagens de leveduras
isoladas da coleta dois, antes e após pressão de seleção com aumento gradual do ºBrix.........48
Figura 13 - Gráfico com as comparações dos valores do µMáx das linhagens de leveduras
isoladas da coleta três, antes e após pressão de seleção com aumento gradual do ºBrix..........49

LISTA DE QUADROS

Quadro 1 – Determinação dos isolados selecionados com melhores desempenhos para a
diluição 10-4 frente aos parâmetros etanol, glicose, temperatura e pH...................................58

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Distribuição do número de morfotipos obtidos nos diferentes períodos de safra
2013/2014 antes e após pressão de seleção...............................................................................36
Tabela 2 - Distribuição do número de linhagens de leveduras por coleta antes e após os
ensaios fermentativos com pressão de seleção.........................................................................37
Tabela 3 - Linhagens de leveduras isoladas do processo fermentativo antes e após pressão de
seleção com aumento gradual do ºBrix.....................................................................................38
Tabela 4 - Relação do µMáx e do R2 das linhagens isoladas durante a seleção de
leveduras...................................................................................................................................50
Tabela 5 - Médias do número de colônias nas diluições 10-3 e 10-4 crescidas após cultivo em
meio WLN com etanol nas concentrações 0%, 1,0% e 2,0%...................................................51
Tabela 6 - Médias do número de colônias nas diluições 10-3 e 10-4 crescidas após cultivo em
meio WLN com etanol nas concentrações 100g/L e 200 g/L...................................................53
Tabela 7 - Médias do número de colônias nas diluições 10-3 e 10-4 crescidas após cultivo em
meio WLN a 30ºC, 35ºC e 40ºC...............................................................................................55
Tabela 8 - Médias do número de colônias nas diluições 10-3 e 10-4 crescidas após cultivo em
meio WLN com pH 1,0, 3,0 e 5,0............................................................................................57

LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS

AL - Alagoas.
Atm - atmosfera.
ATP - adenosina Trifosfato.
º Brix - porcentagem em massa de sólidos solúveis contidos numa solução.
BG-1 - linhagem de Saccharomyces cerevisiae isolada na Usina Barra Grande.
BSA - albumina do soro bovina.
CAT-1 - Linhagem de Saccharomyces cerevisiae isolada na Usina Catanduva.
Cél/mL - células por mililitro.
CIA - clorofórmio mais álcool isoamílico.
CTAB - Brometo de cetiltrimetilamônia.
ºC - graus Celsius.
DNA - ácido desoxirribonucleico.
dNTP - desoxirribonucleotídeos trifosfatados.
EDTA - ácido etilenodiamino tetra-acético.
FT858L - Linhagem de Saccharomyces cerevisiae derivada da PE-2.
g - grama (unidade de medida de massa).
ºGL - Gay Lussac (porcentagem em volume, %vol).
g/L - gramas por litro.
GTG5 - oligonucleotídeo GTGGTGGTGGTGGTG.
h-1 - hora.
ISSR - Inter Simple Sequence Repaeat.
ITS - região espaçadora transcrita interna.
L0 – Leitura inicial.
MAPA - Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento.
MgCl2 - cloreto de magnésio.
mg - miligrama.
mL - mililitro.

mM - milimolar.
m/m - massa/massa.
nm - nanômetro.
NaCl - cloreto de sódio.
NADH - nicotinamida-adenina-dinucleotídeo.
PCR - reação em cadeia da polimerase.
PE-2 - linhagem de Saccharomyces cerevisiae isolada na Usina Pedra.
pH - potencial hidrogeniônico.
PVP - polivinilpirrolidona.
R2 - Coeficiente de determinação.
RFLP mtDNA - Mitochondrial DNA Restriction Fragment Length Polymorphism.
rpm - rotação por minuto.
RNA - ácido ribonucleico.
RNAr - RNA ribossômico.
RNAse - enzima que degrada o ácido ribonucleico.
SA-1 - Linhagem de Saccharomyces cerevisiae isolada na Usina Santa Adélia.
TAE - Tris acetato EDTA.
TE - tris-HCl e EDTA.
USP - Universidade de São Paulo.
v/v - volume/volume.
WLN - Wallerstein Laboratory Nutrient ágar.
YEPD - extrato de levedura, peptona de carne e dextrose.
µL - microlitro.
µM - milimolar.
µMáx: - taxa de crescimento específica.
pb - pares de bases.
kb - kilo bases.
% - por cento.
Σ - somatório.

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO..................................................................................................................15
1.1 OBJETIVOS.....................................................................................................................17
1.1.1 Objetivo Geral.............................................................................................................17
1.1.2Objetivo Específicos........................................................................................................17
2 REVISÃO DA LITERATURA...........................................................................................18
2.1 Aspectos Gerais: Etanol de cana-de-açúcar...................................................................18
2.2 Microbiologia da Fermentação: Principais Linhagens de Leveduras..........................19
2.3 Fatores Limitantes do Processo Fermentativo...............................................................20
2.3.1 Etanol..............................................................................................................................21
2.3.2 Alta Concentração de Glicose.......................................................................................22
2.3.3 pH....................................................................................................................................22
2.3.4 Temperatura...................................................................................................................23
2.4. Biomonitoramento: Determinação das Linhagens Dominantes..................................24
2.4.1 Caracterização por Métodos Tradicionais..................................................................24
2.4.2 Caracterização por Biologia Molecular.......................................................................24
2.5 Seleção de Leveduras com Potencial Fermentativo.......................................................25
3 METODOLOGIA................................................................................................................28
3.1 Materiais Biológicos..........................................................................................................28
3.2 Seleção das Linhagens de Leveduras..............................................................................28
3.2.1 Plaqueamento.................................................................................................................29
3.2.2 Isolamento, Purificação e Armazenamento das culturas de leveduras.....................29
3.3 Taxa de Crescimento Específica......................................................................................30
3.4 Análise Molecular.............................................................................................................31

3.4.1 Extração de DNA Nuclear.............................................................................................31
3.4.2 Amplificação do DNA Nuclear......................................................................................31
3.4.2.1 ITS 1 e 4.......................................................................................................................31
3.4.2.2 Microssatélite GTG5...................................................................................................32
3.5 Eletroforese........................................................................................................................32
3.6 Teste de Resistência Fisiológicos: etanol, glicose, temperatura e pH...........................33
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO.........................................................................................34
4.1 Diversidade Morfológica das Leveduras Isoladas Antes e Após Pressão de
Seleção......................................................................................................................................34
4.2 Caracterização por Biologia Molecular..........................................................................40
4.2.1 ITS 1 e 4..........................................................................................................................40
4.2.2 Microssatélite GTG5......................................................................................................42
4.3 Avaliação da Taxa de Crescimento Específico...............................................................46
4.4 Teste de Resistência Fisiológicos......................................................................................50
4.4.1 Etanol..............................................................................................................................50
4.4.2 Glicose.............................................................................................................................53
4.4.3 Temperatura...................................................................................................................54
4.4.4 pH....................................................................................................................................56
5 CONCLUSÃO......................................................................................................................59
REFERÊNCIAS......................................................................................................................60

1 INTRODUÇÃO

sistemas

fermentativos

são

caracterizados

por

uma

vasta

diversidade

microbiológica, tendo nas leveduras do gênero Saccharomyces o principal microrganismo
para a conversão dos açúcares fermentescíveis em etanol. O processo fermentativo, mediado
pelas leveduras, converte açúcares simples, hexoses, em etanol e dióxido de carbono. No
entanto, um fator limitante na produção de etanol é a proliferação de bactérias e de linhagens
de leveduras com baixa capacidade fermentativa (selvagens) devido à ineficiência no controle
microbiológico ao longo do processo. Os microrganismos contaminantes competem alterando
a atividade celular da levedura, desviando o substrato metabolizável para a síntese de
produtos indesejados que depreciam de forma qualitativa e quantitativa a produção de etanol
(SILVA-FILHO, 2005).
No Brasil, o processo fermentativo do tipo batelada conserva características artesanais
apesar dos avanços tecnológicos, tornando-o vulnerável, ao ataque de microrganismos
oportunistas que comprometem a produção de etanol. A determinação da microbiota permite
identificar e selecionar linhagens de Saccharomyces cerevisiae selvagens com a finalidade de
aperfeiçoar o processo fermentativo, visto que, essa espécie de levedura apresenta aptidão em
converter os açúcares fermentescíveis nas condições limitantes impostas pelo processo
industrial de fermentação alcóolica (MOREIRA et al.; 2009). Frente a isso, técnicas
moleculares são empregadas na obtenção da tipagem genética das leveduras presentes no
fermentado de cana-de-açúcar, permitindo assim, inferir que os perfis genéticos encontrados
são linhagens de leveduras selecionadas ou contaminantes do processo. Ao mesmo tempo,
com a caracterização molecular das leveduras predominantes, linhagens com características
de interesse biotecnológico podem ser selecionadas. O uso de marcadores moleculares
representa uma ferramenta valiosa na discriminação de leveduras para fins fermentativos
(SILVA-FILHO, 2003; ANTONANGELO, 2012;).
O biomonitoramento de linhagens de leveduras durante o período de safra permite
compreender a dinâmica das populações de Saccharomyces cerevisiae nativas (selvagens) e
outras, esclarecendo flutuações sobre o rendimento fermentativo. (HOWELL; 2004; SILVAFILHO, et al.; 2005). No Brasil, a utilização do monitoramento genético para a determinação
dos microrganismos envolvidos na produção de álcool carburante é insipiente, comparado ao
número de plantas industriais, dado que, as técnicas clássicas baseadas nas características

morfofisiológicas ainda são as mais utilizadas na seleção de linhagens de leveduras para fins
fermentativos. A imprecisão e a morosidade dos resultados nos sistemas tradicionais
restringem a obtenção de conclusões assertivas e aplicáveis ao setor sucroalcooleiro. Logo,
aplicar técnicas moleculares que são mais concisas e rápidas levam as técnicas tradicionais a
serem utilizadas como coadjuvantes no estudo da diversidade microbiológica em sistemas
fermentativos (TORRIANI et al.; 2004).
O sinergismo existente entre os fatores físico-químicos e biológicos do processo
fermentativo refletem sobre a dinâmica das populações de leveduras. Sendo assim, para
melhor caracterizar essas populações técnicas clássicas e de biologia molecular são
empregadas de forma convergente. Pesquisas que contribuam na identificação de linhagens de
leveduras isoladas de plantas industriais por técnicas tradicionais e moleculares, permitem
caracterizar de forma mais abrangente os microrganismos dominantes. Nesse sentido,
linhagens de leveduras mais aptas ao processo fermentativo podem ser selecionadas e
submetidas a rigorosos testes para serem utilizadas como inóculo de partida em safras
subsequentes, incrementando a produção de etanol. (SILVA-FILHO; 2003; BASÍLIO; 2008).

1.1 OBJETIVOS

1.1.1 Geral
Discriminar as leveduras presentes na produção de etanol, com a finalidade de
identificar a diversidade de linhagens de leveduras e a sucessão durante o processo
fermentativo.

1.1.2 Específicos


Determinar o padrão fingerprint com o microssatélite GTG5, correlatando com

a diversidade microbiana;


Comparar a diversidade de leveduras identificadas pelos sistemas clássico e

molecular;


Submeter às leveduras mais frequentes no processo de seleção a testes de

resistência fisiológicos;


Diagnosticar a resiliência das leveduras predominantes, sugerindo-as como

fermento de partida para a produção de etanol.

2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1 Aspectos Gerais: Etanol de cana-de-açúcar
Referência no cenário mundial desde o cultivo até a geração de etanol, o Brasil,
domina o setor sucroalcooleiro com projeções de aumento na produção de cana-de-açúcar na
ordem de 3,5% até a safra 2018/2019, o que corresponde, a 47,34 milhões de toneladas do
produto. A cana-de-açúcar é produzida principalmente na região sudeste do país, ficando o
Paraná, o Triângulo Mineiro e a Zona da Mata Nordestina como demais zonas de expressão
na produção dessa cultura (MAPA; 2015). As projeções do Ministério da Agricultura,
Pecuária e Abastecimento (2015) é de que a produção de etanol para 2019 será de 58,8
bilhões de litros, representando mais que o dobro da produção registrada em 2008. O aumento
do mercado interno associado a uma taxa de crescimento em torno de 4% ao ano contribuem
para uso do etanol como alternativa energética.
O etanol é um álcool simples, incolor, volátil, de cheiro característico, inflamável
com ponto de ebulição de 78ºC e baixo ponto de fusão em torno de -144,1ºC, sendo formado
pela união de dois átomos de carbono, cinco átomos de hidrogênio e um grupamento
hidroxila. O etanol pode ser originado por síntese química ou fermentativa, sendo a última a
mais utilizada no Brasil (MACHADO; ABREU; 2006). A produção de etanol por via
fermentativa é mediada por microrganismos produtores de enzimas específicas que convertem
os carboidratos simples em etanol (LIMA et al.; 2001; BARRE et al.,2004). Na produção de
etanol pela via fermentativa, os carboidratos potencialmente fermentescíveis são
biotransformados em etanol e gás carbônico como metabólitos primários, e glicerol, ácido
succínico, ácido acético, furfural e biomassa como produtos secundários.
A produção de etanol por metabolismo anaeróbico envolve a transformação da
biomassa de origem açucarada, amilácea ou celulósica em álcool etílico e gás carbônico. A
diferença entre as matérias-primas está nos resíduos de açúcares e no tamanho da molécula,
sendo a biomassa de origem sacarínea, por exemplo, a cana-de-açúcar mais facilmente
metabolizável em virtude dos monômeros de açúcares estarem mais facilmente disponíveis
aos microrganismos. Couto e Sanromán (2005) citam as matérias-primas fermentadas como
alternativas para a produção de etanol através da retirada do álcool de bebidas destiladas ou
fermentadas. Esta alternativa é impraticável economicamente, sendo aplicada apenas diante
da perecividade das bebidas para consumo humano.

No Brasil, o etanol é produzido na forma anidro e hidratado, apresentando 0,7% e
7% de água (m/m) em relação à massa alcóolica, respectivamente. O álcool anidro é
empregado na indústria química e como aditivo a gasolina, enquanto o álcool hidratado
abastece a demanda dos carros flex-fuel e a indústria de bebidas (SANTOS; 2014). A
utilização dos resíduos na cogeração de energia somados a otimização das técnicas de manejo,
fermentação, extração e destilação ratificam o uso do etanol de cana-de-açúcar como
alternativa de matriz energética sustentável (MACHADO; ABREU; 2006; AQUINO; 2014).

2.2 Microbiologia da Fermentação: Principais Linhagens de Leveduras
A fermentação é um processo anaeróbico, catalisado por enzimas, que convertem os
açúcares simples em etanol e gás carbônico como principais produtos metabólitos.
Basicamente, os carboidratos são transformados em duas moléculas de piruvato ou ácido
pirúvico, gerando ATP, molécula energética. Em seguida, cada molécula de piruvato sofre
descarboxilação, catalisada pela enzima piruvato descarboxilase, produzindo acetaldeído.
Este, sob a ação da enzima álcool desidrogenase, é reduzido pela NADH a etanol
(MADIGAN et al.; 2008).
Bactérias e fungos, em especial as leveduras, são microrganismos potencialmente
fermentadores. Contudo, a tolerância das leveduras as altas concentrações de etanol e dióxido
de carbono, associada ao crescimento rápido, induzem as mesmas a serem utilizadas como
modelo de microrganismo para a produção de etanol em escala industrial (MACHADO;
ABREU; 2006). As espécies Saccharomyces cerevisiae e Saccharomyces carlsbergensis são
as leveduras mais utilizadas para a produção de etanol. Kloeckera, Candida, Kluyveromyces e
Pichia são gêneros de leveduras encontradas durante a fermentação do caldo de cana
(GUERRA et al.; 2001; SCHWAN et al.; 2001). As espécies de leveduras Saccharomyces
cerevisiae var. ellipsoideus e Schizosaccharomyces pombe foram relatadas como agentes
biotransformadores para a produção de etanol (ROSA et al.; 2002; PEJIN et al.; 2009).
A levedura da espécie Saccharomyces cerevisiae é predominante no processo
fermentativo, sendo as linhagens melhoradas geneticamente e selvagens selecionadas
largamente utilizadas nas destilarias para a produção de etanol no Brasil, por apresentarem
características fisiológicas que permitem tolerar condições extremas (VENTURA; 2007). A

importância da levedura S. cerevisiae no processo industrial, deriva de um conjunto de
aptidões que juntas convergem para o seu uso na produção de etanol. Entre elas, a alta
capacidade fermentativa somada à tolerância as elevadas concentrações de etanol e aos
inibidores produzidos ao longo do processo, resistência as altas temperaturas e baixo pH
(ANDRIETTA et al.; 2006; MUSSATTO et al.; 2010). A condição do metabolismo
facultativo, oxidativo e fermentativo, permite a levedura Saccharomyces cerevisiae utilizar
rotas metabólicas alternativas diante de condições de estresse, canalizando a energia
produzida para a síntese de metabolitos secundários, por exemplo, a trealose e o glicerol,
associados direta ou indiretamente a sua sobrevivência, como relatado por Tosetto (2008) e
Ribeiro e Reis (2010).
A produção de etanol ainda conserva características artesanais que contribuem
criando condições de estresse, induzindo a contaminação de leveduras não-Saccharomyces
cerevisiae. A falta de assepsia induz o aparecimento de cepas de leveduras nãoSaccharomyces durante a produção de etanol (BERNARDI et al.; 2008). É notório que a falta
de cuidados no controle do processo fermentativo contribui para o aumento da diversidade
microbiológica, favorecendo estirpes selvagens com baixa capacidade fermentativa.

2.3 Fatores Limitantes do Processo Fermentativo
A hostilidade que caracteriza o ambiente fermentativo induz as linhagens de
leveduras a desenvolverem resposta celular frente às condições adversas, tornando-as mais
resilientes e adaptáveis metabolicamente. As células das leveduras devem ser tolerantes aos
múltiplos estresses, mantendo a capacidade de multiplicação celular em condição anaeróbica.
A pressão de seleção exercida pela adversidade ambiental contribui para a seleção de estirpes
mais aptas a produção de etanol, podendo assim, ser indicadas como inóculo de partida nos
vários ciclos consecutivos da fermentação (MUSSATO et al.; 2010).
Linhagens de leveduras Saccharomyces cerevisiae comerciais e não comerciais
apresentam uma correlação entre a condição limitante e a resistência das linhagens comerciais
durante o processo fermentativo. A seleção de linhagens de leveduras mais hábeis para a
produção de vinho (CARRASOCO et al.; 2001; ZUZUARREGUI; OLMO; 2004) é
fundamental para o aumento de rendimento do processo fermentativo. Produtos da via

metabólica podem ser utilizados como critérios de seleção no processo de melhoramento das
linhagens. Há correlação da produção de trealose e glicerol por Saccharomyces cerevisiae em
resposta a condição de estresse, e as presenças desses compostos podem ser traduzidas como
indicador de tolerância a ambiente adverso (SALVATO; 2010). O bom rendimento
fermentativo está associado ao controle eficiente da temperatura, contaminação bacteriana,
pH, aeração, concentração de etanol e disponibilidade dos nutrientes (SOUZA; 2009).

2.3.1 Etanol
O etanol representa o critério tradicionalmente empregado na seleção de leveduras,
visto que a tolerância a elevadas concentrações desse álcool é fundamental para o aumento
dos níveis de produção (CARRASOCO et al.; 2001). A produção de etanol está relacionada
com o volume do produto produzido durante o processo fermentativo.
O etanol é o maior inibidor da viabilidade celular da levedura, já que, em altas
concentrações, ele altera a camada lipídica, reduzindo à atividade metabólica em resposta a
diminuição do transporte de glicose, causando estresse hídrico (OLIVA- NETO; 2011;
FERNANDES et al.; 2008; PROTTI et al.; 2007). O teor alcóolico próximo 11,1 % (v/v)
compromete a viabilidade celular e valores acima de 14,5% (v/v) inibem completamente a
produção de etanol (SILVA et al.; 2008). Pondera-se trabalhar com o teor alcóolico de 8ºGL,
uma vez que valores acima já comprometem a integridade celular da levedura (ALVES;
2004). O crescimento e a viabilidade celular não é alterada em concentração de etanol inferior
a 26 g/L. Contudo, quando atinge 68,5 g/L no meio de fermentação, ocorre a inibição total do
desenvolvimento celular (SOUZA; 2009).
Os efeitos tóxicos da concentração de etanol no meio também afetam outras espécies
de leveduras. A diminuição da viabilidade celular da levedura Saccharomyces pombe é
reduzida quando tratada com etanol a 30% (v/v) por uma hora. Além da diminuição da
viabilidade celular, ocorrem o aumento da permeabilidade na membrana plasmática e a
alteração da forma celular (CANETTA et al.; 2006).

2.3.2 Alta Concentração de Glicose (ACG)

A glicose é o ponto de partida da fermentação alcóolica, sendo um monossacarídeo
de sabor adocicado com forma molecular C6H12O6, podendo ser encontrada na natureza na
forma livre ou combinada. No Brasil, a sacarose da cana-de-açúcar é o carboidrato mais
utilizado para a produção de etanol. A sacarose é um dissacarídeo de forma molecular
C12H22O11 formado pela associação de uma glicose com uma frutose (TORTORA, 2010).
Altas concentrações de glicose refletem negativamente na viabilidade celular da
levedura, em virtude do aumento da pressão osmótica e, consequentemente, pela elevada
produção de álcool que por sua vez, desestabiliza a membrana plasmática (LOPES; 2006).
Fermentações com elevadas concentrações de açúcar comprometem a qualidade da cachaça,
sendo assim importante a correção do ºBrix do caldo-de-cana (MARQUES; SERRA; 2004).
Concentrações de açúcar acima de 16ºBrix implicam em fermentações incompletas e valores
abaixo de 16ºBrix induzem a queda no rendimento em álcool. A correção da concentração de
açúcar quando o grau estiver acima de 16 ºBrix evita o comprometimento metabólico das
leveduras do processo (COUTO; SANROMÁN; 2005).

2.3.3 pH
O pH é um fator limitante na fermentação alcóolica por determinar a proliferação de
bactérias que competem pelo substrato com as leveduras, diminuindo o volume e a qualidade
do etanol produzido. O pH ideal para a produção de etanol deve estar entre 4,5 – 5,0
(SOUZA; 2011). Neste pH, ocorre a inibição das bactérias sem que haja comprometimento
das leveduras, assegurando assim a produção.
A levedura Saccharomyces cerevisiae exige pH 4,5. Neste caso, a acidificação
deverá ser realizada antes a inoculação (CARDOSO; 2006). A manutenção da integridade
metabólica das leveduras é mantida com o mosto apresentando faixa de pH de 5,0 – 6,0. O pH
do mosto deve ser corrigido antes do início da fermentação. A falta de correção do pH
também favorece a formação de metabólicos secundários pelas leveduras, induzindo-as a
ativarem outras rotas metabólicas. O pH abaixo de 4,0 desvia o metabolismo da levedura para
a produção de álcoois superiores, enquanto pH acima de 5,0, produz ácido acético e furfural
(SOUZA; 2011).

2.3.4 Temperatura
A temperatura ideal do mosto para que a fermentação alcoólica ocorra encontra-se no
intervalo de 25 a 30ºC. No entanto, no processo fermentativo, há liberação de calor causando
o aquecimento da dorna. Valores de temperatura no intervalo de 25 a 30ºC induzem a queda
na viabilidade do fermento, aumento da microbiota bacteriana e perdas de álcool por
evaporação. As altas temperaturas interferem na viabilidade celular, ou seja, na capacidade de
conversão do substrato em etanol, que pode ser agravada com o aumento das concentrações
de etanol ou com o baixo pH do mosto (SILVA-FILHO et al.; 2005). Temperatura abaixo do
ótimo também compromete a viabilidade da levedura, contribuindo para a queda na conversão
do substrato em etanol (CARDOSO; 2006). O intervalo de temperatura entre 28 – 32 ºC é
ideal para a produção de etanol (CABRAL et al.; 2006; RIBEIRO; 2006; MORAES; 2001). É
importante ressaltar, que as unidades produtoras de etanol na sua maioria não apresentam
controle efetivo da temperatura, apresentando fermentações em torno de 38ºC, o que
diretamente influencia na atividade celular da levedura.

2.4 Biomonitoramento: Determinação das Linhagens Dominantes
O processo fermentativo do mosto inicia com a multiplicação do fermento
selecionado, podendo ser uma linhagem comercial ou oriunda da seleção durante o período de
safra. A levedura é adicionada juntamente com o mosto a dorna. O processo é repetido várias
vezes durante a safra. As condições de fermentação por batelada, tratamento da dorna para
evitar contaminação por bactérias e o mosto não ser estéril, favorecem a constante sucessão
microbiológica, resultando em linhagens dominantes no processo fermentativo. Apesar de
resistirem ao processo, muitas das leveduras dominantes são ineficientes fermentativamente
se comparadas ao inóculo inicial. Outras leveduras, em menor frequência na população, são
resistentes ao processo, podendo assim, vir a serem utilizadas como inóculo de partida em
substituição ao fermento introduzido inicialmente no processo.

2.4.1 Caracterização por Métodos Tradicionais

O uso do meio de cultura como ferramenta para a seleção de linhagens de leveduras
industriais através da macromorfologia da colônia permite identificar morfotipos com alta
frequência durante a safra. Ao mesmo tempo, leveduras dominantes podem ser submetidas a
testes fisiológicos, a fim de determinar os melhores desempenhos em condições limítrofes.
Linhagens de Saccharomyces cerevisiae selvagens podem ser caracterizadas quanto a
resistência ao etanol, temperatura, pH, concentração de glicose e actiodione (REIS; 2011).
A resistência ao etanol, temperatura e acidez de linhagens da levedura
Saccharomyces cerevisiae, foram analisadas através do crescimento em meio de cultura
YEPD - ágar associado à condição de estresse, permitindo identificar linhagens de leveduras
S. cerevisiae para serem utilizadas na produção de álcool combustível (HARASHIMA et al.;
2012). Zhao et al.; (2011) analisaram a performance das cepas de S. cerevisiae frente aos
fatores de estresse para a produção bioetanol, utilizando testes em placa de Petri com meio
ágar -YEPD.

2.4.2 Caracterização por Biologia Molecular
As exigências do mercado induzem à utilização das técnicas moleculares em
substituição as análises morfológicas e fisiológicas. A caracterização dos microrganismos é de
suma importância, seja para identificar uma levedura contaminante ou para selecionar uma
linhagem de levedura com características desejáveis a produção de etanol. As metodologias
apoiadas no polimorfismo dos ácidos nucleicos são mais reproduzíveis frente aos métodos
clássicos, que dependem do estado fisiológico das células (GUEROLA; 2006). Os métodos
moleculares apresentam simplicidade metodológica, alta precisão e discriminação.
Diversas técnicas moleculares podem ser empregadas na discriminação da microbiota
fermentativa, entre elas, as que utilizam a amplificação de sequências simples entre repetições
do DNA (SILVA-FILHO et al.; 2005). A cariotipagem e o DNA mitocondrial são técnicas de
biologia molecular mais utilizadas na discriminação e no monitoramento das linhagens
dominantes durante o período de safra (AMORIM et al.; 2011). A PCR representa uma
técnica importante para estudos genético-moleculares. A PCR multiplica regiões da molécula
de DNA através da atividade da DNA polimerase, uma enzima termotolerante com a função
de sintetizar regiões do DNA a partir de uma fita molde, utilizando dNTP e um par de

fragmento de DNA que são complementares a região alvo a ser amplificadas (primers). Os
fragmentos de DNA obtidos podem ser visualizados após eletroforese em gel de agarose
como uma banda (FERREIRA; 2002), formando um padrão muitas vezes específico para os
indivíduos avaliados. O polimorfismo é caracterizado pela variação no tamanho e quantidade
dos fragmentos amplificados (LATOUCHE et al.; 1997; SILVA-FILHO et al.; 2005).
Os padrões específicos do DNA fingerprint são gerados utilizando sequências
iniciadoras que refletem o polimorfismo da variabilidade genômica entre indivíduos de
espécie diferente ou da mesma espécie (LUCENA; 2004). A taxonomia das leveduras pode
ser determinada através da amplificação da região do DNA que codifica para o RNA
ribossômico. A amplificação de sequências simples entre repetições de DNA permite
discriminar intraespecificamente linhagens de leveduras. A sucessão e a dominância das
leveduras durante a produção de etanol foi avaliada a partir da caracterização da região
repetitiva do DNA genômico com o microssatélite GTG5 (SILVA-FILHO et al.; 2005;
ANTONANGELO; 2012).

2.5 Seleção de Linhagens de Leveduras com Potencial Fermentativo
O sinergismo das técnicas tradicionais e moleculares subsidia a prospecção de novas
cepas de leveduras, portadoras de características desejáveis a produção de etanol. Essas
linhagens, “personalizadas”, otimizam o processo fermentativo, uma vez que inibem
leveduras com baixa taxa de conversão do substrato em etanol (selvagem). Na safra
2011/2012, aproximadamente 170 unidades produtoras de álcool utilizam linhagem
selecionada, o que representa 70% do etanol produzido no Brasil (AMORIM et al.; 2011).
A produção de etanol no Brasil está relacionada com as linhagens de Saccharomyces
cerevisiae PE-2, FT858L, CAT-1, BG1 e SA1 isoladas inicialmente nas dornas das usinas.
As linhagens CAT-1 e PE-2 foram isoladas das Usinas Virgolino de Oliveira e Usina da
Pedra, respectivamente, representando 70% das leveduras selecionadas para a produção de
álcool no mercado interno. As “super linhagens” decorrem da alta persistência e dominância,
mantendo a viabilidade celular frente aos reciclos fermentativos, como baixa floculação e
produção de espumas somada à elevada taxa de conversão (AMORIM et al.; 2011;
AMORIM; LOPES, 2013).

A linhagem Fermel foi desenvolvida para fermentações a base de melaço, descende
da PE-2, é uma levedura que suporta as oscilações do processo fermentativo, sem perder a
capacidade de conversão. Um ponto alto dessa levedura é a dominância comparada às estirpes
selvagens que depreciam a fermentação. Com a vigência do Protocolo Agroambiental do
Setor Sucroenergético de 2007, as queimadas serão substituídas pela colheita manual ou
mecanizada, aumentando assim a diversidade de microrganismos dentro do processo. Neste
contexto, a Fermel, representa uma alternativa de ganhos de rendimento, atendendo as
exigências do mercado (RPA NEWS: CANA & INDÚSTRIA; 2014).
No processo de geração de novas linhagens, ensaios fermentativos, utilizando as
condições do ambiente industrial, demonstram a supremacia das linhagens selecionadas frente
ao fermento industrial com aumento no rendimento em torno de 3% (AMORIM; BASSO;
LOPES; 2009). Em termos práticos, o valor aparentemente baixo pode representar grande
significância em litros de etanol produzido. Por exemplo, uma destilaria que produz um
milhão de litros álcool/dia pode incrementar a produção em 30.000 litros a mais. Este cenário
ratifica o uso de linhagens selecionadas frente ao fermento industrial, apesar do uso frequente
de linhagens de laboratório, cervejarias, panificação e de outras origens para a produção de
álcool (VICENTE; 2015).
As destilarias brasileiras apresentam uma vasta diversidade de leveduras para uso em
fermentações industriais. Contudo, as linhagens isoladas de outros processos fermentativos,
assim como de laboratório ou de uso doméstico, não sobrevivem diante das condições
adversas encontradas na produção de etanol, sendo substituída pelas estirpes selvagens em
aproximadamente um mês. (BASSO et al.; 2008). Leveduras selvagens podem contribuir com
a diversidade genética, podendo ser utilizadas como ponto de partida para a seleção de
características que favoreçam maior dominância e rendimento fermentativo. As fermentações
para a produção de cachaça podem representar um reservatório de biótipos de leveduras com
aplicabilidade ao processo industrial. A prospecção de leveduras no ambiente industrial deve
ser o ponto de partida na busca de estirpes com potencial fermentativo (SILVA; 2009). No
entanto, linhagens selvagens de Saccharomyces cerevisiae apresentam fenótipo complexo,
tornando um desafio à obtenção do organismo ideal para a produção de etanol de primeira
geração (AMORIM et al.; 2011).
O monitoramento genético da microbiota fermentativa oriunda do mosto fermentado
durante o período de safra revela a dominância existente entre as espécies e linhagens de

leveduras, contribuindo assim, para a caracterização de cepas de referência para a produção de
etanol em escala industrial. O sequenciamento do DNA, associado às pesquisas com
proteômica, metabolômica, expressão gênica, fisiologia e processo industrial, são
imprescindíveis para o entendimento sobre a resiliência de linhagens de leveduras, permitindo
assim, compreender como as linhagens sobrevivem mesmo quando submetidas a inúmeros
ciclos fermentativos e as condições de estresse (ESTRUCH; 1993). A caracterização precisa
das estirpes dominantes contribui para o uso como fermento iniciador, atendendo assim, as
peculiaridades de cada processo.

3 METODOLOGIA

Neste estudo foi investigada a diversidade de linhagens de levedura da espécie
Saccharomyces cerevisiae oriundas do processo fermentativo, com a finalidade de selecionar
linhagens multirresistentes aos fatores limitantes da produção de etanol. As etapas
experimentais foram conduzidas na Clínica de Diagnose Vegetal situada no Centro de
Ciências Agrárias da Universidade Federal de Alagoas.

3.1 Materiais Biológicos
A determinação da diversidade das leveduras no mosto fermentado foi realizada com
amostras da Safra 2013/2014 do processo fermentativo coletadas durante os meses de
dezembro, fevereiro e abril na destilaria da Usina Coruripe, Coruripe-AL. A linhagem de
Saccharomyces cerevisiae (CAT-1), utilizada como controle na tipagem genética e nos testes
de resistência fisiológicos, foi cedida da coleção de cultura da Universidade de São Paulo –
USP. A cultura controle foi mantida a glicerol 15% a -80 ºC.

3.2 Seleção das Linhagens de Leveduras
O aumento do ºBrix foi o parâmetro de pressão de seleção utilizado para a obtenção de
linhagens de leveduras predominantes na fermentação alcoólica. Cada ensaio fermentativo foi
composto por 20 fermentações em batelada com reciclo de células. A cada cinco
fermentações ocorriam o aumento percentual do ºBrix que foi inicialmente 15, e seguiu a
sequência de incremento de 17, 18,5 finalizando com 22 %. A calibração do mosto de
alimentação foi através de refratômetro analógico (marca Digit). Após 24 horas de
fermentação, o volume fermentado foi transferido para tubo plástico de 15 mL, contendo
aproximadamente 10g de massa celular e 200 mL de mosto estéril. A suspensão foi
centrifugada por 3400 rpm durante 5 minutos (Centrifuga Clinica, modelo 80-2B – 15 mL). O
centrifugado foi tratado com água e ácido clorídrico (pH 2 - 3,2) por uma hora. Em seguida,
as células foram novamente centrifugadas e lavadas em solução salina estéril 0,85 % para
posteriormente serem ressuspendidas em mosto de alimentação autoclavado constituído por

melaço, 3 g.L-1 ácido lático, 0,66 g.L-1 de ácido acético e 6,7 % (v/v) de etanol. O mosto foi
autoclavado a 120 ºC a 1atm por 20 minutos.

3.2.1 Plaqueamento
O plaqueamento foi realizado após a coleta das amostras na usina e ao término da
fermentação de cada ciclo de seleção. Uma alíquota do fermentado foi dissolvida por diluição
seriada até 10-3 cel.mL-1 e semeada com alça de Drygalsk em meio de cultura ágar YEPD
(extrato de levedura a 1%, peptona de carne a 2%, dextrose a 2% e ágar-ágar a 2%)
autoclavado e acrescido de amoxilina. O meio de cultura foi autoclavado a 120 ºC a 1atm por
20 minutos. As placas foram incubadas em duplicatas a 30 ºC por 120 horas. Finalizada a
incubação, as placas foram analisadas e os morfotipos foram selecionados conforme as
características macroscópicas.

3.2.2 Isolamento, Purificação e Armazenamento das culturas de Leveduras
A macromorfologia foi o critério adotado para determinar a diversidade de leveduras,
reduzindo assim, o material biológico submetido às análises moleculares e aos testes de
resistência fisiológicos. Foram escolhidas as placas com até 100 colônias. Com auxílio de alça
em níquel-cromo removeu parte da colônia, transferindo-a em seguida, para tubo de ensaio
com 2 mL de solução salina 0,85 % estéril, a fim de obter concentração celular de 108 – 109
cel/mL. A determinação da concentração celular ocorreu por contagem de células em câmara
de Neubauer através da seguinte expressão: (Σ5 quadrantes) x (5x104) x (diluição). O
resultado foi expresso em número de células por mL.
Após a seleção das colônias, uma alíquota da suspensão celular foi plaqueada por
semeadura com estrias em meio ágar YEPD suplementado com amoxilina. As culturas foram
incubadas a 30 ºC por 120 horas. A purificação foi confirmada através da predominância do
padrão do morfotipo previamente isolado.
Confirmada a pureza das culturas de leveduras, repiques das colônias foram
realizados, a fim de obter massa celular para a formação do banco de culturas de coleção e

trabalho. As culturas de coleção foram armazenadas em microtubos de 1,5 mL, contendo 800
µL da cultura e 200 µL de glicerol estéril, sendo mantidas em ultra-refrigeração a -80 ºC. A
coleção de trabalho foi mantida em tubos de ensaio 10x100 mm, contendo meio ágar YEPD
inclinado e armazenados a -4 ºC. O meio de cultura foi autoclavado a 120 ºC a 1atm por 20
minutos. As culturas de trabalho e coleção foram mantidas em duplicatas.
Cada isolado foi identificado com um código constituído pela coleta seguido do
número da colônia acrescido de I (inicial) para o isolado obtido no mosto da destilaria e F
(final) para o isolado obtido após o ciclo de seleção no laboratório. O código foi utilizado para
todas as análises.

3.3 Taxa Específica de Crescimento Máxima
A taxa de crescimento foi determinada pelo teste turbidimétrico tendo a densidade
óptica como parâmetro discriminatório. A velocidade de multiplicação das células foi
determinada por espectrofotômetro (WPA/marca Analítica) com comprimento de onda
600nm, e leitura em absorbância segundo proposto por Hiss (2001). Para a obtenção de massa
celular, foi realizada uma pré-fermentação utilizando para cada isolado dois tubos de ensaio
10x100mm com 10 mL de meio YEPD com 4% de dextrose em cada um. Em seguida, as
culturas foram incubadas por 48 horas. Após a incubação, transferiu-se o volume fermentado
para um erlenmeyer contendo 100 mL de meio YEPD líquido estéril. Ao mesmo tempo, fezse a leitura inicial (L0) com espectrofotômetro em absorbância com comprimento de onda
600nm. Em seguida, as culturas foram incubadas em agitador orbital (modelo MA832/marca
Marconi) a 30 ºC sob agitação de 120 rpm. A cada hora foram feitas coletas do cultivo e
aferições do crescimento da cultura. Para a construção da curva de crescimento foram feitas
nove coletas, a fim de determinar a fase exponencial. Os dados foram tabulados no programa
Microsoft Office Excel versão 2015 (Microsoft Corporation), gerando um gráfico de curva de
regressão linear e, a partir do cálculo da equação linear de primeiro grau (y=ax+b), encontrouse o µmáx.

3.4 Análise Molecular

As colônias selecionadas foram submetidas às técnicas moleculares com a finalidade
de obter o padrão genético e, por conseguinte, a sua predominância durante o processo
fermentativo.

3.4.1 Extração do DNA
O DNA foi extraído utilizando o protocolo modificado descrito por Doyle; Doyle
(1987). Em microtubo de 2 mL adicionou-se 150 mg de massa celular. Em seguida, foi
acrescentado 750µL de tampão CTAB 2% (Tris-HCl pH 8,0; EDTA 70 µm; NaCl 2M; PVP
2%; ß-mercaptoetanol 0,2%, CTAB 2%; proteinase K 50µL) e 4 µL da enzima lisozima por
amostra, incubando-as a 65ºC por 30 minutos em banho-maria digital médio, marca nova
técnica. Decorrido o tempo, resfriou-se a amostra e adicionou 750 µL de CIA (24:1
clorofórmio e álcool isoamílico). A amostra foi homogeneizada e centrifugada a 12000 rpm
por 10 minutos. Posteriormente, 500 µL do sobrenadante foram transferidos para um
microtubo de 1,5 mL, adicionando o mesmo volume de isoprapanol gelado. Logo após, as
amostras foram armazenadas a -20ºC por 30 minutos. Transcorrido o tempo, centrifugou-se as
amostras a 12000 rpm por 15 minutos, descartando a fase líquida. Em seguida, lavou-se o
pellet com etanol 70% gelado, centrifugando a 11000 rpm por 5 minutos. Por fim, secou-se o
pellet em temperatura ambiente para depois ressuspender o DNA em 30 µL de TE (Tris-HCl
10 mM, pH 8,0; EDTA 1 mM) com RNAse. O DNA foi armazenado em freezer a -20ºC.

3.4.2 Amplificação do DNA Nuclear
O material genético alvo do genoma das leveduras foi amplificado por PCR, utilizando
o Termociclador Rotor Gene-Q (QUIAGEN) e, visualizados, após eletroforese com o
fluoróforo Syber Green com auxílio do sistema de fotodocumentação L-PIX (LOCCUS
Biotecnologia).

3.4.2.1 ITS 1 e 4

A região ITS (Internal Transcribed Spacer) das linhagens de leveduras selecionadas
foi amplificada para avaliação do tamanho da sequência com os iniciadores ITS 1 e 4. O
protocolo de PCR com volume reacional final de 25 µL foi constituído por 4 µL do DNA da
colônia selecionada, 12,3 µL de água ultra pura estéril, 0,5 µM do iniciador ITS 1 e a mesma
concentração para o iniciador ITS4, 5 µL de dNTP, 2,5 µM de tampão de PCR e 0,2 µL taq
polimerase (SILVA-FILHO, 2005). A região ITS 1 e 4 foram amplificadas pela ciclagem a
seguir: um ciclo de desnaturação inicial de 2 minutos a 95 ºC, seguido de 35 ciclos de
desnaturação a 95 ºC por 30 segundo, anelamento a 52,5 ºC por 30 segundos, extensão a 72
ºC por 30 segundos, com extensão final a 72 ºC por quatro minutos (SILVA-FILHO, 2005).

3.4.2.2 Microssatélite GTG5
O microssatélite GTGGTGGTGGTGGTG foi amplificado por PCR com volume
reacional final de 25 µL conforme metodologia descrita por Silva-Filho (2005). Com volume
reacional final de 25 µL, a sequência foi amplificada com 4 µL do DNA da colônia
selecionada, 2,5 µL do tampão de PCR, 2,5 µL de BSA, 2,5 µL e 5 µL do iniciador, 1,5 µL de
cloreto de magnésio, 0,25 µL de taq polimerase. Para a obtenção do volume final foi utilizada
água ultra pura estéril. O iniciador GTG5 foi amplificado por PCR através da programação a
seguir: um ciclo de desnaturação inicial de 5 minutos a 94 ºC, seguido de 40 ciclos de
desnaturação de 15 segundos a 94 ºC, anelamento a 45 segundos a 55 ºC, extensão a 90
segundos a 72 ºC, com extensão final de seis minutos a 72 ºC (SILVA-FILHO, 2005).

3.5 Eletroforese
As sequências amplificadas pelo iniciador GTG5 foram separadas por eletroforese em
gel de agarose 2,0 % sob voltagem de 90 volts por 150 minutos em tampão TAE 1X (Tris
acetato 40 mM e EDTA1 mM). Os produtos da amplificação das regiões ITS1 e 4 foram
discriminados por eletroforese em gel de agarose 1,5%, submetidos a 70 volts por 120
minutos em tampão TAE 1X. Os primers GTG5 e ITS1 e 4 foram corados com syber green e
visualizados em sistema de fotodocumentação modelo L-Pix ex, marca Loccus biotecnologia.

3.6 Testes de Resistência Fisiológicos: etanol, glicose, temperatura e pH.
As linhagens de leveduras selecionadas pela tipagem genética foram submetidas a
testes de resistência fisiológicos, com a finalidade de determinar a resiliência das linhagens
frente aos principais fatores limitantes do processo fermentativo. Para a execução dos testes
de resistência foi utilizado o meio de cultura WLN composto por 4 g de extrato de levedura, 5
g triptona, 20 g dextrose, 0,55 g fosfato de potássio mono, 0,125 g sulfato de magnésio, 0,425
g cloreto de potássio, 0,125 g cloreto de cálcio, 0,0025 g cloreto de ferro, 0,0025 g sulfato de
magnésio suplementado com 0,0220 g verde de bromocressol para o preparo de um litro de
meio de cultura. Adicionado à solução nutritiva, acrescentou-se 20 g de ágar. O meio de
cultura foi autoclavado a 120 ºC a 1 atm por 20 minutos. As leveduras com as maiores taxas
de crescimento foram selecionadas e dispostas em três grupos, sendo cada um composto por
três isolados selecionados e a linhagem de Saccharomyces cerevisiae controle (CAT-1).
A resistência ao etanol, glicose, temperatura e pH foram determinadas conforme o
protocolo modificado de Reis (2011). Uma alçada da colônia da levedura foi transferida para
um tubo de ensaio contendo 9 mL de solução salina 0,85 % estéril. Em seguida, a cultura foi
homogeneizada e a concentração celular ajustada para 1x108 cel/mL em câmara de Neubauer.
Após a calibração da concentração celular, uma alíquota de 5 µL da solução foi depositada de
forma puntiforme sobre a superfície do meio de cultura WLN. Os isolados foram testados
através de diluição seriada. Para a determinação da suscetibilidade ao etanol foram testadas
concentrações de álcool absoluto nas proporções de 0 %, 11% e 22% (v/v), sendo as placas
incubadas a 30 ºC por quatro dias. Para a glicose, foram analisadas as concentrações de 100 e
250 g/L com incubação conforme citada anteriormente. A tolerância à temperatura foi
determinada com a incubação dos isolados a 30 ºC, 35 ºC e 40 ºC por quatro dias. Por fim, a
resistência ao pH foi observada com o ajuste do meio de cultura para 1,0, 3,0 e 5,0 com
incubação a 30 ºC por sete dias. Todos os testes foram realizados em duplicata. Após a
incubação, os pontos foram analisados e a resistência determinada através da média do
crescimento da massa celular.
.

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Diversidade morfológica das leveduras isoladas antes e após de pressão de seleção
As leveduras isoladas inicialmente do mosto fermentado coletado na usina Coruripe
em três momentos durante a safra 2013/2014 foram caracterizadas de acordo com a
morfologia. Os morfotipos variaram em cor, borda, textura e tamanho, resultando em 16
linhagens de leveduras divididas em oito morfotipos (Figura 1). A sucessão das populações de
leveduras durante os ciclos fermentativos ao longo da safra foi avaliada considerando o
surgimento dos morfotipos. A diversidade do padrão de colônia das linhagens de leveduras
entre os períodos de safra pode ser utilizada como parâmetro para o entendimento da
variedade e predominância existente entre as linhagens de leveduras ao longo do processo
fermentativo (Figura 2).

Figura 1 – Ilustração do número de morfotipos obtidos a partir das linhagens de leveduras antes
e após pressão de seleção.

Morfotipo

Antes

Após

Morfotipo

Antes

Após

Figura 1 - continuação

Fonte: Autor; 2016.

Figura 2 - Ilustração dos morfotipos isolados durante as fermentações para obtenção de
linhagens de leveduras em mosto fermentado de melaço.

Legenda: As colônias A, C, D, E, J, K (morfotipo liso); B, F, G, H, I, L (morfotipo rugoso).
Fonte: Autor; 2016.

O início de safra é caracterizado por um único tipo de levedura que em grande número
conduzirão a fermentação inicial. À medida que o processo avança ocorrem sucessões
populacionais com redução no número de linhagens de leveduras em resposta as adaptações
ao processo fermentativo. O padrão de diversidade dos morfotipos no início e meio de safra
demonstra a dominância do morfotipo identificado no início do processo fermentativo.
Provavelmente, a levedura iniciadora tolera as intempéries do processo fermentativo,
mantendo elevada a frequência populacional. Tal fato pode ser explicado pela constante
reposição do fermento selecionado ao longo da safra, assim como, pela integridade do
processo e o eficiente controle microbiológico, o que explicaria o comportamento no início e
metade da safra com menor número de morfotipo obtidos na destilaria. No final da safra,
verificou-se um aumento no número de morfotipos possivelmente associado ao período de
coleta da amostra, ou seja, fim de safra, muitas vezes caracterizado por um menor controle

dos fatores limitantes do processo em resposta aos longos dias de fermentação, induzindo
contaminações por leveduras nativas (Tabela 1).

Tabela 1 - Distribuição do número de morfotipos obtidos nos diferentes períodos de safra
2013/2014 antes e após pressão de seleção.

Período da Safra

Destilaria

Ensaio Fermentativo

Início

Meio

Fim

Fonte: Autor; 2016.

O processo de seleção com aumento gradual do ºBrix, utilizando como inóculo a
população presente no mosto fermentado nos três períodos da safra, gerou 17 cepas de
leveduras distribuídas em 11 morfotipos. O mesmo critério pode ser adotado para inferir sobre
os efeitos da pressão de seleção in vitro na população original.
O comportamento do número de morfotipos após a pressão de seleção revela um
aumento na diversidade das colônias nas coletas que amostravam a população do período do
início e meio de safra. O potencial destas populações em gerar maior diversidade foi possível
observar-se na amostragem do final de safra. A situação de pressão de seleção busca aplicar
condições que mimetizem as condições químicas da dorna e novamente mostra a capacidade
desta população em gerar diversidade. No entanto, a população já adaptada, final da safra, não
sofre com a pressão de seleção que mimetiza as condições as quais elas já estão adaptadas,
não havendo incremento na diversidade. A comparação dos resultados mostra que o período
do meio de safra seria o melhor momento para amostragem. O período inicial, por ter uma
alta concentração do inóculo, compromete a diversidade e inviabiliza a pressão de seleção por
não ter um alto grau de polimorfismo a ser explorado.
No estudo foi adotado o padrão da textura e borda da colônia, discriminando as
leveduras em rugosa ou lisa, visto que estas características são condicionantes na seleção de

leveduras para uso em fermentação alcóolica. A maior predominância de leveduras com
morfotipo liso ocorreu no mosto fermentado coletado na destilaria, contabilizando 12
linhagens correspondendo 75 % entre os isolados obtidos antes a pressão de seleção. Após a
seleção, observou-se 59 % de leveduras lisas isoladas após os ensaios fermentativos. Os
padrões de colônia branca e rosa com textura e borda rugosa foram os de maior frequência
entre os morfotipos rugosos com 27,27 % para cada, sendo a maior incidência do morfotipo
de coloração branca após a pressão de seleção. As análises moleculares e os testes de
resistência fisiológicos foram realizados em 26 das 33 linhagens de leveduras selecionadas
(Tabela 2).

Tabela 2 – Distribuição do número de linhagens de leveduras por período da safra antes e após
os ensaios fermentativos com pressão de seleção.

Período de Safra

Seleção

Total

Início
Meio

Antes
4
6

Depois
3
7

7
13

Fim

13
33

Fonte: Autor; 2016.

O aumento do padrão de colônia rugosa ao longo da safra 2013/2014 foi verificado
durante a distribuição dos morfotipos ao longo das coletas antes e também após a pressão de
seleção. O aumento progressivo no número de morfotipos rugosos em relação ao liso após os
ensaios em batelada pode ser atribuído às alterações morfológicas em virtude do parâmetro
adotado para a obtenção de diversidade, visto que, o aumento do ºBrix induz a deformações
na membrana plasmática em virtude as altas concentrações de glicose e, conseguinte, de
etanol no meio (LOPES, 2006). Vinte e duas das 33 colônias de leveduras selecionadas
apresentaram textura lisa, correspondendo a 66,6 %. A maioria das leveduras rugosas foram
obtidas após a pressão de seleção (Tabela 3).

Tabela 3 - Linhagens de leveduras isoladas do processo fermentativo antes e após pressão de
seleção com aumento gradual do ºBrix.

Isolados
C1(1I)
C1(2I)
C1(2.1I)
C1(3I)
C1(1F)**
C1(2F)**
C1(3F)
C2(1I)
C2(1.1I)
C2(2I)
C2(3I)
C2(4I)
C2(4.1I)
C2(1F)
C2(2F)
C2(3F)
C2(3.1F)
C2(4F)
C2(5F)
C2(6F)
C3(1I)
C3(2I)**
C3(3I)
C3(3.1I)
C3(4I)**
C3(5I)
C3(1F)**
C3(2F)**
C3(3F)
C3(4F)**
C3(4.1F)
C3(5F)
C3(6F)
CAT-1*

Textura da colônia
Lisa
Lisa
Lisa
Rugosa
Lisa
Lisa
Lisa
Lisa
Lisa
Rugosa
Lisa
Lisa
Rugosa
Rugosa
Lisa
Lisa
Lisa
Lisa
Rugosa
Rugosa
Lisa
Lisa
Lisa
Lisa
Lisa
Rugosa
Rugosa
Lisa
Lisa
Lisa
Rugosa
Rugosa
Rugosa
Lisa

C1: coleta 1; C2: coleta 2; C3: coleta 3; * Linhagem de Saccharomyces cerevisiae controle; ** Linhagem de
Levedura contaminada por fungo filamentoso. Isolados com grifo obtidos na destilaria e sem grifo oriundos após
o processo de seleção. Fonte: Autor; 2016.

Outro fator que contribuí para a mudança do morfotipo é a elevação da temperatura
durante os ensaios em batelada com aumento gradual do ºBrix, visto que, oscilações acima do
ótimo de crescimento induzem a modificações na textura da colônia, tornando-se rugosa.

Células de leveduras com textura rugosa tendem a formar aglomerados celulares em resposta
ao não desprendimento dos brotos com a célula mãe, gerando perdas de rendimento
fermentativo pela diminuição da superfície celular destinada ao transporte dos açúcares
fermentescíveis (VIANA; 2015). Apesar das condições hostis do ensaio fermentativo para
seleção de linhagens de leveduras, 22 isolados apresentaram o morfotipo liso, característica
desejável ao processo fermentativo. Contudo, outros fatores devem ser melhor investigados,
com a finalidade de uso como linhagem iniciadora para a produção de etanol em escala
industrial.
No isolamento das leveduras do mosto fermentado oriundo do processo de seleção,
foram verificadas projeções de massa celular sobre o meio de cultura ágar YEPD após o
plaqueamento. A microscopia dos filamentos verificou aglomerados celulares em células
típicas da levedura Saccharomyces cerevisiae (Figura 3).

Figura 3 - Ilustração dos aglomerados celulares “pseudohifas” em microscopia óptica e em meio
de cultivo ágar YEPD.

Legenda: (A) pseudohifas em microscopia (seta); (B) pseudohifas em meio ágar YEPD (seta).
Fonte do autor; 2016.

A presença das “hifas gigantes” está relacionada a fermentações com estresse de
nitrogênio (SILVA; CECCATO-ANTONINI; 2002) e elevadas concentrações de álcoois
superiores. Na ausência de nitrogênio e presença de álcoois, há o dimorfismo com

crescimento filamentoso em Saccharomyces cerevisiae com invasividade do ágar
(SUDBERY; CECCATO-ANTONINI; 2004).

O mosto de melaço de cana acrescido de açúcares solúveis podem ter induzido as
A

linhagens ao crescimento filamentoso. O aumento gradual do ºBrix induz a multiplicação
celular ao mesmo tempo em que decaem os níveis de glicose, tornando o meio improdutivo.
A baixa concentração de glicose no meio fermentativo contribui para o crescimento dimórfico
(CULLEN; SPRAGUE JR; 2000). A proporcionalidade direta existente entre a concentração
de açúcar e a produção de etanol pode ter conduzido as leveduras a metabolizarem esse

produto como fonte de carbono em resposta a queda abrupta da glicose no meio (DICKISON;
1996).

4.2 Caracterização por Biologia Molecular
M
L

4.2.1 ITS 1 e 4
A análise do padrão eletroforético da amplificação das regiões que codifica para o
RNA ribossomal das linhagens de leveduras obtidas no início de safra revelou apenas um
perfil genético, inferindo se tratar de leveduras do gênero Saccharomyces (Figura 4). Os
resultados obtidos são condizentes aos encontrados por Antonangelo (2012) que isolou 138
colônias de leveduras com comprimento de banda aproximadamente 800pb, indicando ser da
espécie S. cerevisiae.
Figura 4 - Ilustração da eletroforese em gel de agarose com o padrão de amplificação da região
ITS do DNAr das linhagens de leveduras isoladas no início da safra.
M

Legenda: (M) marcador molecular 100pb; Linhagens de leveduras (1) C1(1I); (2) C1(3I); (3) C1(2I); (4)
C1(2.1I); (5) C1(3F). Gel de agarose de agarose 1,5%, submetidos a 70 volts por 120 minutos em tampão
TAE 1X e corados com syber green. Fonte: Autor; 2016.

As amplificações com as leveduras isoladas no meio de safra apresentaram dois perfis
genéticos baseados no tamanho do fragmento amplificado (Figura 5). Foi observado um
padrão com fragmento com tamanho entre 800 a 1000pb e outro com tamanho entre 400 a
500pb. Os isolados de 1 a 6 e 9 a 14 apresentaram aproximadamente 800pb, indicando ser do
gênero Saccharomyces. Os poços 7 e 8 correspondem a um gênero de levedura nãoSaccharomyces, visto que apresentaram bandas com comprimento inferior ao esperado para a
espécie Saccharomyces cerevisiae.

Figura 5 - Ilustração da eletroforese em gel de agarose com o padrão de amplificação da região
ITS do DNAr das linhagens de leveduras isoladas no meio da safra.
M

Legenda: (M) marcador molecular 100pb; Linhagens de leveduras (1) C2(1I); (2) C2(1.1I); (3) C2(2I);
(4) C2(3I); (5) C2(4I); (6) C2(4.1I); (7) C2(1F); (8) C2(2F); (9) C2(3F); ( 10) C2(3.1F); (11) C2(4F); (12)
C2(5F); (13) C2(6F). Gel de agarose de agarose 1,5%, submetidos a 70 volts por 120 minutos em tampão
TAE 1X e corados com syber green. Fonte: Autor; 2016.

Na coleta do final de safra, a maior diversidade de padrões de bandeamento foi
verificada com três comprimentos de banda aproximadamente 850, 600 e 500pb (Figura 6).
Os poços 1, 3, 5 e 7 apresentaram comprimento de banda compatível com o gênero
Saccharomyces. Os padrões de amplificação das regiões ITS 1 e 4 dos isolados 6 e 8 não são
compatíveis com a espécie S. cerevisiae. Nos poços 2 e 4 não foram verificados os padrões de
amplificação para as regiões ITS analisadas.

Figura 6 - Ilustração da eletroforese em gel de agarose com o padrão de amplificação da região
ITS do DNAr das linhagens de leveduras isoladas no final da safra.
M

Legenda: (M) marcador molecular 100pb; Linhagens de leveduras (1) C3(1I); (2) C3(3I); (3) C3(3.1I); (4)
C3(5I), (5) C3(3F); (6) C3(4.1F); (7) C3(5F); (8) C3(6F). Gel de agarose de agarose 1,5%, submetidos a 70 volts
por 120 minutos em tampão TAE 1X e corados com syber green. Fonte: Autor; 2016.

A maior variabilidade de perfis no final da safra demonstra estreita relação com o
período de coleta da amostra, visto que as condições do processo já não conservam as
características essenciais para a predominância das leveduras do gênero Saccharomyces,
contribuindo assim para a contaminação de leveduras não-Saccharomyces. A comparação dos
fragmentos gerados das regiões ITS antes e após a pressão de seleção revelou baixa
diversidade de levedura, indicando a dominância do gênero Saccharomyces ao longo do
processo fermentativo.

4.2.2 Microssatélite GTG5
A amplificação do DNA genômico com o microssatélite GTG5 permitiu caracterizar as
linhagens de leveduras em oito perfis genéticos, sendo quatro perfis encontrados nas
linhagens isoladas durante a safra na destilaria e quatro perfis nas cepas oriundas após pressão
de seleção. Os padrões genéticos para as linhagens isoladas do mosto fermentado durante a
safra foram denominados de grupo A (1, 2, 3, 7, 10, 11, 13 e 15); grupo B (4, 6, 8, 9 e 14);
grupo C (5); grupo D (12 e 16). A linhagem de Saccharomyces cerevisiae controle CAT-1
apresentou o padrão de bandeamento encontrado no grupo D (Figura 7).

Figura 7 - Ilustração com os padrões genéticos das linhagens de leveduras antes a pressão de
seleção através do microssatélite GTG5.
M

Legenda: (M) marcador molecular 1kb plus; Linhagens de leveduras (1) C1(1I); (2) C1(2I); (3) C1(2.1I); (4)
C1(3.1I); (5) C2(1I); (6) C2(1.1I); (7) C2(2I); (8) C2(3I); (9) C2(4I). Segundo gel (M) marcador molecular 1kb
plus; (11) C2(4.1I); (12) C3(1I); (13) C3(3I); (14) C3(3.1I); (15) C3(5I); (16) CAT-1. Gel de agarose 2,0 % sob
voltagem de 90 volts por 150 minutos em tampão TAE 1X (Tris acetato 40 mM e EDTA1 mM) e corados com
Syber green. Fonte: Autor; 2016.

Nas leveduras obtidas após a pressão seleção sobre as diferentes populações dos
mostos fermentados coletados durante a safra, foi possível discriminar quatro grupos
genéticos. O isolado oito não gerou o padrão de amplificação para o marcador genético. As
linhagens de leveduras oriundas após os ensaios em batelada foram agrupadas conforme o
padrão de bandeamento eletroforético em gel de agarose, sendo o grupo E (1, 3 e 9); grupo F
(2, 4, 5 e 10); grupo G (6); grupo H (7, 11 e 12) conforme verificado na figura 8.

Figura 8 - Ilustração com os padrões genéticos das linhagens de leveduras após a pressão de
seleção através do microssatélite GTG5.
M

Legenda: (M) marcador molecular 1kb plus; Linhagens de leveduras (1) C1(3F); (2) C2(1F); (3) C2(2FI); (4)
C2(3F); (5) C2(3.1F); (6) C2(4F); (7) C2(5F); (8) C2(6F); (9) C3(3F), (10) C3(4.1F); (11) C3(5F). Segundo gel
(M) marcador molecular 1kb plus; (12) C3(6F). Gel de agarose 2,0 % sob voltagem de 90 volts por 150 minutos
em tampão TAE 1X (Tris acetato 40 mM e EDTA1 mM) e corados com Syber green. Fonte: Autor; 2016.

As frequências dos grupos genéticos com o microssatélite GTG5 variaram entre as
populações de leveduras durante a safra 2013/2014 (Figura 9). Dos quatro grupos genéticos
obtidos através do padrão de bandeamento de linhagens provenientes da destilaria, o grupo A
apresentou a maior frequência, com 53,33 %, seguido do grupo B com 33,33 %. Os menores
valores foram encontrados nos grupos C e D com 6,66 % de frequência para cada grupo. O
estudo da diversidade de leveduras industriais por PCR-fingerprint vem sendo largamente
utilizado como metodologia para o monitoramento de leveduras ao longo da safra (SILVAFILHO et al.; 2005; BASÍLIO et al.; 2008).

Figura 9 - Gráfico com as frequências dos perfis genéticos para o microssatélite antes e após a
pressão de seleção.
Frequências dos perfis genéticos para o microssatélite GTG5 antes e após pressão de
seleção

Fonte: Autor; 2016.

Dos quatro padrões genéticos gerados pela amplificação com microssatélite GTG5
após pressão de seleção, apenas o grupo F exibiu maior frequência com 36,36%. Os grupos E
e H apresentaram 27,27% cada, enquanto o grupo G foi o de menor frequência com 9,09%. A
diversidade de leveduras isoladas de alambique para a produção de cachaça foi verificada a
partir das técnicas ISSR com o microssatélite GTG5, e por RFLPmtDNA discriminando 32
cepas de Saccharomyces cerevisiae. A técnica ISSR discriminou 22 perfis, enquanto a RFLP
apresentou sete tipos (GONÇALVES et al.; 2009). A análise comparativa do número de
grupos genéticos obtidos na destilaria e após as fermentações em bateladas indicou o grupo A
como o de maior valoração com oito isolados, seguidos dos grupos B e F com cinco e quatro
isolados, respectivamente. Os grupos E e H apresentaram três isolados cada. Os menores
valores foram encontrados para os grupos C, D e G com um isolado cada. (Figura 10).
A caracterização das linhagens de leveduras pelo sistema clássico permitiu discriminar
12 morfotipos de colônias e oito grupos genéticos. O bandeamento gerado pelo microssatélite
GTG5 foi definitivo na discriminação das linhagens de leveduras através do padrão fingerprint
esperado para o marcador. Os resultados obtidos entre as técnicas tradicionais e moleculares
ratificam a importância do uso sinérgico entre elas, a fim de obter resultados mais acertados e
aplicáveis ao setor sucroenergético.

Figura 10 - Gráfico com a distribuição dos grupos genéticos das linhagens de leveduras obtidas
após a pressão de seleção.

Grupos genéticos

Distribuição dos grupos genéticos entre as linhagens de leveduras
isoladas antes e após pressão de seleção

H
G
F
E
D
C
B
A

1
4
3
1
1
5
8
0

Número de isolados por grupo

Fonte: Autor; 2016.

4.3 Avaliação da Taxa de Crescimento Específico
A avaliação da taxa de crescimento específico foi realizada com as 26 linhagens de
leveduras, sendo 14 cepas obtidas nas dornas na destilaria e 12 após os ensaios com
fermentações em sequência com aumento do ºBrix. A linhagem de Saccharomyces cerevisiae
CAT-1 apresentou o melhor desempenho com 0,8630 h-1. Os isolados C1(1I) e C1(3F)
apresentaram os maiores valores do µMáx com 0,5176 h-1 e 0,5636 h-1, respectivamente
(Figura 11). A superioridade do controle positivo decorre do estudo intensificado dessa
linhagem como modelo de fermento industrial para a produção de etanol (AMORIM; LOPES;
2013). É comprovada a capacidade fermentativa de estirpes de leveduras selvagens em mosto
de cana-de-açúcar com fonte de carboidratos fermentescíveis (BATISTOTE et al.; 2010).
O maior valor do isolado C1(3F) demonstra a eficiência da linhagem em suportar o
estresse das bateladas sequenciais, associadas aos fatores limitantes adotados durante o
processo de seleção. Os resultados obtidos nesse estudo ratificam a importância de investigar
leveduras selvagens oriundas do processo fermentativo.

Figura 11 - Gráfico com as comparações dos valores do µMáx das linhagens de leveduras
isoladas da coleta um, antes e após pressão de seleção com aumento gradual do ºBrix.

Taxa Específica de Crescimento Máxima - Coleta 1
1,0000
0,8630

0,9000

-1

µmáx (h )

0,8000

C1(1I)

0,7000
0,6000
0,5000

0,5176

0,5636
0,4813

0,4483

0,4906

C1(2I)
C1(2.1I)

0,4000

C1(3I)

0,3000

C1(3F)

0,2000

CAT-1

0,1000
0,0000
Isolados

Fonte: Autor; 2016.

Na avaliação das linhagens obtidas no meio da safra antes e depois da seleção é
possível verificar uma maior variação nos valores observados (Figura 12). Observa-se que o
processo seletivo aumenta a média de µMáx da população original.
Analisando os picos do µMáx verificamos que os isolados C2(3I) e C2(4F)
apresentaram os maiores valores, respectivamente, 0,6353 h-1 e 0,7817 h-1. Diferentemente
dos isolados C1(1I), C2(1.1I) e C2(6F) com 0,2935 h-1, 0,2935 h-1 e 0,3882 h-1,
respectivamente. As maiores taxas do µMáx foram dos isolados obtidos após a pressão de
seleção, o que ratifica a necessidade de um estudo mais detalhado sobre as características
fermentativas dessas linhagens. Os valores encontrados quando plotados geram uma curva
representativa do padrão de crescimento dos microrganismos, permitindo usar os maiores
picos para obter o µMáx (HISS, 2001).

Figura 12 - Gráfico com as comparações dos valores de µMáx das linhagens de leveduras
isoladas da coleta dois, antes e após pressão de seleção com aumento gradual do ºBrix.
Taxa Específica de Crescimento Máxima - Coleta 2
C2(1I)

1,0000

0,8630 C2(1.1I)
C2(2I)

0,9000
0,7817

0,8000

0,5414
0,4977

-1

µmáx (h )

0,6000
0,5000
0,4000
0,3000

0,6716
0,6143

0,6353
0,6148

0,7000

0,3931
0,2935
0,2935

C2(3I)
0,6604

C2(4I)
C2(4.1I)

0,5281

C2(1F)
0,3882

C2(2F)
C2(3F)
C2(3.1F)

0,2000

C2(4F)

0,1000

C2(5F)

0,0000

C2(6F)
Isolados

CAT-1

Fonte: Autor; 2016.

Mantendo o padrão de desempenho encontrado no início da safra, a linhagem controle
CAT-1 apresentou taxa de crescimento de 0,8630 superior a todas as linhagens testadas.
Contudo, é importante ressaltar a performance do isolado C2(4F) com valor aproximado ao
registrado pela linhagem controle. Apesar de preliminar, o isolado C2(4F) deve ser melhor
estudado, visto que o mesmo apresentou comportamento diferenciado frente aos 26 isolados
testados nas mesmas condições. Na comparação do µMáx das linhagens comerciais CAT-1,
PE-2 e BG-1 a levedura CAT—1 foi classificada como levedura rápida em virtude da alta
capacidade de conversão do substrato em etanol e a rapidez de multiplicação celular. A
levedura CAT-1 tem sempre mostrado melhor desempenho que as leveduras selvagens
(TONIATO; 2013).
A avaliação do µMáx das oito linhagens de leveduras isoladas durante o processo de
pré e pós-fermentação do inóculo obtido no final de safra demonstrou que os isolados
oriundos antes da pressão de seleção apresentaram maiores valores se comparados as

linhagens obtidas após o experimento (Figura 13). O comportamento atipíco em relação as
coletas 1 e 2 pode estar relacionado ao período da coleta, ou seja, fim de safra.
Provavelmente, durante a safra as leveduras

mais aptas aumentam suas frequências

populacionais o que reflete na sua dominância frente a outras linhagens.

Figura 13 - Gráfico com as comparações dos valores de µMáx das linhagens de leveduras
isoladas da coleta três antes e após pressão de seleção com aumento gradual do ºBrix.
Taxa Específica de Crescimento Máxima - Coleta 3
1,0000
0,8630

0,9000

C3(3I)

0,7000

C3(3.1I)

0,6000
-1

µmáx (h )

C3(1I)

0,8000

0,5000

C3(5I)

0,5249
0,4486

C3(3F)

0,4170

0,3679 0,3482

0,4000
0,3000

0,2253

0,3235
0,2253

C3(4.1F)
C3(5F)

0,2000

C3(6F)

0,1000

CAT-1

0,0000

Isolados

Fonte: Autor; 2016.

A relação entre o µMáx e o R2 das 26 linhagens de leveduras caracterizadas por
parâmetros de cinética de fermentação estão apresentadas a seguir (Tabela 4). O valor do
µMáx foi o parâmetro empregado para a seleção das linhagens submetidas aos testes de
resistência fisiológicos, resultando em nove isolados. A CAT-1 foi à linhagem controle para
referência nos testes com fatores de estresse. O isolado C2(4F) apresentou a maior taxa de
µMáx entre as linhagens selecionadas para o teste. Esse resultado demonstra a necessidade de
averiguar as linhagens pormenorizadamente, a fim, de selecionar cepas com características
que atendam as particularidades de cada processo fermentativo. Leveduras Saccharomyces
cerevisiae selvagens exigem estudo amplo, visto que são linhagens com características
complexas para o uso biotecnológico (AMORIM; 2011).

Tabela 4 - Relação do µMáx e R2 das linhagens isoladas durante a seleção de leveduras.
Isolados
C1(1I)
C1(2I)
C1(2.1I)
C1(3I)
C1(3F)
C2(1I)
C2(1.1I)
C2(2I)
C2(3I)
C2(4I)
C2(4.1I)
C2(1F)
C2(2F)
C2(3F)
C2(3.1F)
C2(4F)
C2(5F)
C2(6F)
C3(1I)
C3(3I)
C3(3.1I)
C3(5I)
C3(3F)
C3(4.1F)
C3(5F)
C3(6F)
CAT-1*

µMáx
0,5176
0,4813
0,4483
0,4906
0,5636
0,2935
0,2935
0,6148
0,6353
0,5414
0,4977
0,3931
0,6716
0,6143
0,5281
0,7817
0,6604
0,3882
0,5249
0,4486
0,4170
0,2253
0,3679
0,3482
0,2253
0,3235
0,8630

R2
0,9900
0,9926
0,9911
0,9918
0,9892
0,9965
0,9970
0,9963
0,9930
0,9910
0,9689
0,9812
0,9953
0,9980
0,9996
0,9972
0,9923
0,9868
0,9945
0,9942
0,9965
0,9660
0,9887
0,9868
0,9869
0,9651
0,9995

C1: coleta 1. C2: coleta 2; C3: coleta 3; * Linhagem de Saccharomyces cerevisiae controle. Fonte: Autor; 2016.

4.4 Testes de Resistência Fisiológicos
4.4.1 Etanol
A resistência ou suscetibilidade ao etanol foram determinadas pelo aparecimento de
colônias individuais ou conjugadas no meio de cultura WLN, sendo descartado o crescimento
de massa celular amorfa ou residual. Para uma melhor análise do comportamento tolerante

das linhagens de leveduras, foram utilizadas as maiores diluições para todos os parâmetros
testados. Os isolados avaliados foram os que melhor apresentaram taxa de crescimento
máximo específico. A CAT-1 levedura da espécie Saccharomyces cerevisiae foi utilizada
como cepa de referência em todos os testes diante do largo uso em fermentações alcóolicas.
A análise foi conduzida separadamente nos três grupos sendo a linhagem CAT-1
como controle. Observa-se que nos três experimentos a CAT-1 apresentou valores de
contagens de células similares indicando consistência do ensaio. A CAT-1 não desenvolveu
nas maiores concentração de etanol, apresentando uma redução de 70% no crescimento ao
crescer em 11% de etanol quando comparado com o cultivo com 0% de etanol. O isolado
C2(3I) do grupo G1 foi o de melhor desempenho com média de duas colônias a 11% de
etanol. No grupo G2 o isolado C2(4I) apresentou as maiores médias com 9,5, 7,5 e 1,0,
respectivamente, 0%, 11% e 22%. O grupo G3 foi representado pelo isolado C1(3F) com
crescimento a 11% de etanol com média de 4,5 colônias. (Tabela 5).

Tabela 5 - Médias do número de colônias nas diluições 10-3 e 10-4 células/crescidas após cultivo em
meio WLN com etanol nas concentrações 0%, 11% e 22%.

Grupos
C2(3I)

C2(3F)
C2(3.1F)
CAT-1
C2(3I)

11 %

C2(3F)
C2(3.1F)
CAT-1

22
%

C2(3I)
C2(3F)

10-3
7,0
3,0
3,5
3,5
2,0
13,5
-

10-4
3,5
11,0
2,0
1,5
3,0
1,0
1,0

Tabela 5 – Continuação.

C2(3.1F)
CAT-1
C2(4F)

C2(4I)
C2(6F)
CAT-1

C2(4F)

11 %

C2(4I)
C2(6F)
CAT-1
C2(4F)

22%

C2(4I)
C2(6F)
CAT-1
C3(5I)

C3(6F)
C1(3F)
CAT-1
C3(5I)

11 %

C3(6F)
C1(3F)
CAT-1
C3(5I)

22%

C3(6F)
C1(3F)
CAT-1

4,0
15,0
0,75
12,5
3,5
3,0
0,5
7,5
1,0
0,5
6,0
3,0
0,5
7,5
-

9,5
2,0
13,3
3,25
7,5
3,25
1,0
1,0
15,0
4,5
3,0
3,5
-

Fonte: Autor; 2016.

A detecção de linhagens de leveduras resistentes ao etanol é de suma importância,
visto que a tolerância às altas concentrações desse álcool representa uma característica
determinante para o aumento do volume de produção. Harashima et al.; (2012) analisaram a
tolerância ao etanol nas concentrações 10 %, 20 % e 25 % de etanol em meio YPD líquido
com incubação a 30 ºC, utilizando como parâmetro para avaliação do crescimento celular o
valor de absorbância a 600 nm. As linhagens de Saccharomyces cerevisiae foram incubadas e
a multiplicação celular avaliada, a fim de obter a resiliência ao etanol.

4.4.2 Glicose
A análise foi conduzida separadamente nos três grupos sendo a linhagem CAT-1
como controle. Observa-se que nos três experimentos a CAT-1 apresentou valores de
contagens de células similares indicando consistência do ensaio. Seguindo o comportamento
verificado para o etanol, a levedura CAT-1 foi a que apresentou os melhores resultados com
destaque para a concentração de 100 g/L. No grupo G1, a linhagem C2(3I) apresentou as
maiores médias para as duas concentrações testadas. No grupo G3, o isolado C3(6F) foi o
único com crescimento a 100 g/L e 200 g/L de glicose. (Tabela 6).
O incremento de glicose através de fermentações com alto ºBrix é determinante para o
incremento na produção, visto que esta condição está intimamente relacionada ao volume de
álcool produzido. Sendo assim, bioprospectar leveduras com aptidão em suportar altos níveis
de glicose sem perder a capacidade fermentativa é condicionante para otimização do processo
fermentativo, reduzindo o tempo de fermentação, assim como o uso das dornas.

Tabela 6 - Médias do número de colônias nas diluições 10-3 e 10-4 crescidas após cultivo em meio
WLN com glicose nas concentrações 100g/L e 200 g/L.

Grupos
C2(3I)

100 g/L

C2(3F)
C2(3.1F)
CAT-1
C2(3I)

200g/L

C2(3F)
C2(3.1F)
CAT-1
C2(4F)

100 g/L

C2(4I)
C2(6F)
CAT-1

G2
200g/L

C2(4F)
C2(4I)
C2(6F)

10-3

10-4

9,5
6,0
20,0
9,0
1,5
22,0
7,0
26,5
8,0

6,5
1,0
5,0
6,0
2,0
7,5
4,0
7,0
4,0

Tabela 6 – Continuação.
CAT-1
C3(5I)

100 g/L

C3(6F)
C1(3F)
CAT-1
C3(5I)

200g/L

C3(6F)
C1(3F)
CAT-1

21,0
2,0
24,0
2,5
16,0

2,0
8,0
1,0
5,5

Fonte: Autor; 2016.

Reis (2011) detectou a resistência de seis linhagens de leveduras a 500 g/L de glicose
em meio WLN. Todas as leveduras discriminadas apresentavam morfologia rugosa. Os
resultados apresentados pela autora supracitada estão em concordância aos apresentados neste
estudo. Cerqueira (2013) verificou a tolerância da linhagem CAT-1 frente à pressão osmótica
proveniente da elevada concentração de glicose.

4.4.3 Temperatura
A análise foi conduzida separadamente nos três grupos sendo a linhagem CAT-1
como controle. Observa-se que nos três experimentos a CAT apresentou valores de contagens
de células similares indicando consistência do ensaio. Seguindo o comportamento verificado
para o etanol e glicose, a levedura CAT-1 foi a que apresentou os melhores resultados. Os
isolados C2(3I), C2(6F) e C3(6F), respectivamente, grupo G1, G2 e G3 apresentaram
termotolerância com crescimento a 30 ºC, 35 ºC e 40 ºC. (Tabela 7).

Tabela 7 - Médias do número de colônias nas diluições 10-3 e 10-4 crescidas após cultivo em meio
WLN mantidos a 30ºC, 35ºC e 40ºC.

Grupos
C2(3I)

30ºC

C2(3F)
C2(3.1F)
CAT-1

35ºC

C2(3I)
C2(3F)
C2(3.1F)
CAT-1
C2(3I)

40ºC

C2(3F)
C2(3.1F)
CAT-1
C2(4F)

30ºC

C2(4I)
C2(6F)
CAT-1

C2(4F)

35ºC

C2(4I)
C2(6F)

CAT-1
C2(4F)

40ºC

C2(4I)
C2(6F)

CAT-1
C3(5I)

30ºC

C3(6F)
C1(3F)
CAT-1

35ºC

C3(5I)
C3(6F)
C1(3F)
CAT-1
C3(5I)

40ºC

C3(6F)
C1(3F)
CAT-1

Fonte: Autor; 2016.

10-3

10-4

11,5
5,0
21,0
3,5
5,5
23,0
12,0
5,5
17,0
11,0
20,0
8,0
20,0
6,5
14,0
1,5
21,0
3,5
26,5
2,5
18,0

5,0
2,5
4,5
6,5
1,5
2,5
2,5
4,5
4,0
1,5
6,5
2,0
6,0
1,5
4,0
13,0
5,5
3,5
4,5
3,5
3,0

Reis (2011) testou a resistência de 22 linhagens de leveduras quanto à temperatura,
variando entre 30º C e 42 ºC. Os melhores resultados ocorreram abaixo de 42 ºC conforme
verificado no presente trabalho. Zhao et al., (2011) analisou a resistência à temperatura com
crescimento em placa de petri em meio ágar YPD. A resiliência foi determinada através da
leitura em espectrofotômetro com comprimento de onda de 600 nm. A metodologia utilizada
foi semelhante à adotada nesta pesquisa. Contudo os parâmetros utilizados para análise do
crescimento celular diferiram, porém sem comprometer o resultado final.
A presença de linhagens de leveduras termotolerantes contribui para o aumento no
volume de etanol produzido, visto que a elevação da temperatura induz a contaminação
bacteriana que compete pelo substrato com a levedura. Neste sentido, leveduras resistentes ao
etanol com alta estabilidade fermentativa asseguram o processo, uma vez que mantém a
capacidade de conversão do substrato açucarado. Outro ponto é o controle ineficiente da
temperatura ao longo do processo, induzindo perdas por evaporação e alterações na
membrana plasmática em resposta a toxicidade ao etanol.

4.4.4 pH
A análise foi conduzida separadamente nos três grupos, sendo a linhagem CAT-1
como controle. O desenvolvimento de colônias em meio WLN não foi verificado para os
isolados testados como para a linhagem de referência CAT-1 para o pH 1,0. Os isolados
C2(3F), C2(3I) e C3(5I) apresentaram melhores médias a 3,0, 5,0 e 5,0, respectivamente.
(Tabela 8). A linhagem CAT-1 apresentou padrão de comportamento semelhante aos
encontrados para os demais parâmetros analisados.
O pH é um fator limitante do processo fermentativo, uma vez que ele interfere no
metabolismo da levedura, reduzindo a capacidade de conversão da glicose em etanol, ao
mesmo tempo em que leveduras mais tolerantes ao pH mais ácido são desejáveis, visto que o
tratamento para sanitização do fermento é feito com ácido clorídrico ou sulfúrico.

resultados encontrados em Reis (2011) corroboram aos verificados no presente estudo, com
ausência de crescimento celular a pH 1,0. À medida que ocorreu a elevação do pH, as
linhagens se desenvolveram conforme esperado.

Tabela 8 - Médias do número de colônias nas diluições 10-3 e 10-4 crescidas após cultivo em meio
WLN com pH 1,0, 3,0 e 5,0.

Grupos
C2(3I)

1,0

C2(3F)
C2(3.1F)
CAT-1
C2(3I)

3,0

C2(3F)
C2(3.1F)
CAT-1
C2(3I)

5,0

C2(3F)
C2(3.1F)
CAT-1
C2(4F)

1,0

C2(4I)
C2(6F)
CAT-1

C2(4F)

3,0

C2(4I)
C2(6F)

CAT-1
C2(4F)

5,0

C2(4I)
C2(6F)

CAT-1
C3(5I)

1,0

C3(6F)
C1(3F)
CAT-1
C3(5I)

3,0

C3(6F)
C1(3F)
CAT-1
C3(5I)

5,0

C3(6F)
C1(3F)
CAT-1

10-3

10-4

3,5
25,5
1,0
6,0
16,75
9,75
0,5
49
16,25
0,5
3,0
2,9
26,25
8,0
5,0
-

5,5
0,75
3,75
3,1
2,33
22,25
16,0
11,75
4,25
17,25
5,25
0,25
4,0
0,75
38
5,75
14,5
12,75

Fonte: Autor; 2016.

O quadro 1 apresenta os melhores desempenhos quanto ao crescimento resiliente ao
etanol, glicose, temperatura e pH dos isolados obtidos antes e após pressão de seleção. O

isolado C2(3I) apresentou os melhores resultados obtidos quanto ao crescimento das
linhagens de leveduras isoladas antes e após pressão de seleção frente aos parâmetros
temperatura, etanol, pH e glicose. As linhagens com padrão de colônia rugosa C2(6F) e
C3(6F) apresentaram desempenho positivo para a glicose e temperatura. A linhagem padrão
CAT-1 obteve o melhor desenvolvimento frente a todos os parâmetros testados e suas
variações. A alta performance da linhagem CAT-1 está intimamente associada a habilidade de
tolerar condições limítrofes durante o processo fermentativo, fazendo desta estirpe modelo de
microrganismo para a produção de etanol em escala industrial.
A análise dos resultados obtidos revela a importância de melhor investigar linhagens
de leveduras portadoras de multirresistências para a produção de etanol, visto que a
capacidade de resiliência aos principais fatores limitantes da fermentação alcóolica encontrase aleatoriamente entre as linhagens, o que dificulta a escolha de um isolado que reúna todos.
Ao mesmo tempo, o monitoramento de safra permite selecionar leveduras com habilidades às
condições do processo fermentativo em virtude a adaptação ao ambiente.

Quadro 1 – Determinação dos isolados selecionados com melhores desempenhos para a
diluição 10-4 frente aos parâmetros etanol, glicose, temperatura e pH.
ETANOL
Isolado/Morfotipo
C2(3I) - Liso
C2(3.1F) - Liso
C2(4I) - Liso
C3(5I) - Rugoso
C2(3F) - Liso
C2(4F) - Liso
C1(3F) – Liso
C2(6F) - Rugoso
C3(6F) - Rugoso
CAT-1 - Liso
Fonte: Autor; 2016.

11%

22%

GLICOSE
100g/L

200g/L

TEMPERATURA
30ºC

35ºC

40ºC

PH
1,0

3,0

5,0

5 CONCLxUSÃO



O processo de pressão de seleção para obtenção de diversidade de linhagens de

leveduras permitiu identificar 12 morfotipos após os ensaios fermentativos, demonstrando a
eficiência das fermentações em batelada como metodologia para determinação da
variabilidade de leveduras em sistemas fermentativos;


O morfotipo liso foi predominante no mosto oriundo da destilaria, o que

concluí se tratar das linhagens iniciadoras (fermento selecionado). Contudo, ao longo das
fermentações em bateladas, ocorreu um aumento do padrão de colônia rugosa, provavelmente
em decorrência da pressão de seleção e da contaminação ao longo dos vários dias de safra;


A análise genética do comprimento de banda da região ITS permitiu identificar

a predominância do gênero Saccharomyces ao longo do processo de seleção. O padrão de
amplificação obtido pelo microssatélite GTG5 não gerou o fingerprint esperado. Entretanto, o
polimorfismo visualizado possibilitou a caracterização das linhagens de leveduras em oito
grupos genéticos;


O mosto fermentado coletado na usina é uma fonte de variabilidade genética

para seleção de linhagens com tolerância múltipla, sendo as leveduras com morfotipo liso as
mais resistentes aos fatores de estresse, se comparadas ao morfotipo rugoso;


O processo de seleção gera diversidade genética e linhagens resistentes, mas

requer melhorias, visando à redução do surgimento de leveduras com baixa capacidade
fermentativa. Consequentemente, leveduras selecionadas poderão ser utilizadas de forma
assertiva como inóculo de partida em substituição ao fermento comercial para a produção de
etanol.

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