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                    UNIVERSIDADE FEDERAL DE ALAGOAS – UFAL
CAMPUS DE ENGENHARIA E CIÊNCIAS AGRÁRIAS – CECA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PROTEÇÃO DE PLANTAS - PPGPP

RONALD BENVINDO BORGES SILVA

DIVERSIDADE DE Pectobacterium spp. ASSOCIADAS À PODRIDÃO MOLE
EM HORTALIÇAS NO ESTADO DE ALAGOAS

RIO LARGO – AL
2026

UNIVERSIDADE FEDERAL DE ALAGOAS – UFAL
CAMPUS DE ENGENHARIA E CIÊNCIAS AGRÁRIAS – CECA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PROTEÇÃO DE PLANTAS - PPGPP

RONALD BENVINDO BORGES SILVA

DIVERSIDADE DE Pectobacterium spp. ASSOCIADAS À PODRIDÃO MOLE
EM HORTALIÇAS NO ESTADO DE ALAGOAS

Dissertação apresentado à coordenação
do Programa de Pós-Graduação em Proteção de
Plantas da Universidade Federal de Alagoas –
UFAL, como requisito para a obtenção do título
de Mestre em Proteção de Plantas.
Orientador: Prof. Dr. Adriano Márcio Freire
Silva.

RIO LARGO – AL
2026

\

Catalogação na Fonte
Universidade Federal de Alagoas
Biblioteca Campus de Engenharias Ciências Agrárias
Bibliotecário Responsável: Stefano João dos Santos
S568d

Silva, Ronald Benvindo Borges
Diversidade de Pectobacterium spp. Associadas à podridão mole
em hortaliças no estado de Alagoas / Ronald Benvindo Borges
Silva. – Rio largo, Al - , 2026.
51 f. : il.
Dissertação (Mestrado em proteção de plantas) Universidade
Federal de Alagoas, Campus Ceca – Rio largo, 2026.
Orientador: Prof. Dr. Adriano Márcio Freire Silva.
1. Doenças bacterianas, Pectobacteriaceae, Caracterização
olecular. Título. II.
CDU: 631.46:635

AGRADECIMENTOS
A realização deste mestrado representa não apenas a conclusão de uma etapa acadêmica,
mas também a concretização de uma trajetória construída com o apoio, incentivo e
colaboração de pessoas muito especiais, às quais manifesto a minha mais sincera gratidão.
Inicialmente, expresso minha profunda gratidão aos meus pais, José Raimundo e Lídia
Borges (em memória) pelo apoio incondicional, pela compreensão e pelos valores
transmitidos ao longo de toda a minha caminhada.
À minha namorada, Camilla Amanda, expresso meu sincero agradecimento pela
compreensão, pelo apoio constante e pela presença ao longo de toda essa jornada.
Agradeço, em especial, a Iara Costa e Frederico Feijó, pelo incentivo contínuo, pelo
conhecimento compartilhado e pela parceria ao longo deste percurso. Suas contribuições
foram fundamentais para o desenvolvimento deste trabalho.
Ao Fagner, meu amigo e irmão de jornada, registro minha gratidão pelo apoio, pela
disponibilidade e pelas valiosas contribuições durante esse processo.
Aos amigos do Laboratório de Fitopatologia Molecular e Virologia Vegetal, expresso meu
apreço pelo ambiente de cooperação, aprendizado e respeito construído ao longo desta
jornada.
Aos amigos que formei durante a pós-graduação, agradeço pela convivência, pela parceria
e pelo apoio mútuo ao longo desta etapa, que certamente contribuíram significativamente
para a conclusão deste trabalho.
Ao meu orientador, Adriano Márcio, externo minha gratidão pela orientação, amizade e
pelos conhecimentos transmitidos ao longo de toda a formação.
Agradeço, igualmente, as Professoras Sarah Jacqueline e Mayra Ferro, pelas contribuições,
ensinamentos, amizade e disposição em colaborar com a pesquisa.
À Universidade Federal de Alagoas e à Fundação de Apoio à Pesquisa do Estado de
Alagoas, registro meu reconhecimento pelo suporte institucional e financeiro durante toda
a formação.
Por fim, a todos que, direta ou indiretamente, contribuíram para a realização desta etapa,
deixo consignado o meu mais sincero agradecimento.

RESUMO
Os cultivos de hortaliças estão presentes em diversos municípios do Estado de Alagoas,
sendo um importante recurso econômico para os pequenos produtores locais. No entanto,
diversas hortaliças tem apresentado sintomas de podridão mole, uma doença altamente
destrutiva causada principalmente por bactérias do gênero Pectobacterium. Apesar disso,
há poucas informações sobre a diversidade desse patógeno no estado. Neste estudo, 50
isolados patogênicos pertencentes ao gênero Pectobacterium foram obtidos de alface,
couve e pimentão em regiões produtoras do estado de Alagoas e caracterizados com base
na filogenia, utilizando sequências parciais da região 16S rDNA e dos genes gapA, mdh,
icdA, proA e recA. Nas análises moleculares utilizando a região 16S rDNA com os 26
isolados, identificou-se três haplótipos em clados distintos em uma árvore de
verossimilhança. A partir dessa análise, oito isolados representativos foram selecionados
para compor a filogenia de inferência Bayesiana com os dados concatenados dos genes
gapA, mdh, icdA, proA e recA. Através das análises moleculares três espécies de
Pectobacterium foram identificadas causando podridão mole em hortaliças no estado de
Alagoas: Pectobacterium brasiliense, Pectocbacterium aroidearum e Pectocbacterium
sp. Nesse contexto, o estudo constitui o primeiro relato de espécies pertencentes ao gênero
Pectobacteruim em hortaliças no Estado de Alagoas, Brasil.
Palavras-chave: Doenças bacterianas, Pectobacteriaceae, Caracterização olecular.

ABSTRACT
Vegetable crops are present in several municipalities in the state of Alagoas, representing
an important economic resource for small local producers. However, many vegetables
have shown symptoms of soft rot, a highly destructive disease mainly caused by bacteria
of the genus Pectobacterium. Despite this, there is little information about the diversity
of this pathogen in the state. In this study, 50 pathogenic isolates belonging to the genus
Pectobacterium were obtained from lettuce, cabbage, and bell peppers in producing
regions of the state of Alagoas and characterized based on phylogeny, using partial
sequences of the 16S rDNA region and the genes gapA, mdh, icdA, proA, and recA. In
molecular analyses using the 16S rDNA region with the 26 isolates, three haplotypes were
identified in distinct clades in a likelihood tree. Based on this analysis, eight
representative isolates were selected to compose the Bayesian inference phylogeny with
concatenated data from the genes gapA, mdh, icdA, proA, and recA. Through molecular
analyses, three species of Pectobacterium were identified causing soft rot in vegetables
in the state of Alagoas: Pectobacterium brasiliense, Pectobacterium aroidearum, and
Pectobacterium sp. In this context, the study constitutes the first report of species
belonging to the genus Pectobacterium in vegetables in the State of Alagoas, Brazil.

Keywords: Bacterial diseases, Pectobacteriaceae, Molecular characterization.

LISTAS DE FIGURAS
Figura 1. Morfologia de colônia de vidro quebrado dos isolados bacterianos obtidos. ... 19
Figura 2. Genotipagem de bactérias pectinoliticas baseada no marcador Eric-PCR .......20
Figura 3. Rede de haplótipos formada por isolados pertencentes ao gênero
Pectobacterium. ...............................................................................................................21
Figura 4. Árvore filogenética com as respectivas espécies de Pectobacterium de cada
. ....................................................................................................................................... 23
Figura 5. Prevalência de Pectobacterium spp. causadoras de podridão mole em hortaliças
no Estado de Alagoas .......................................................................................................24

LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Primers empregados na amplificação de segmentos genômicos via método de
PCRs ............................................................................................................................... 15
Tabela 2. Sequências genômicas parciais utilizadas nas análises de MLSA, provenientes
do banco de dados GenBank ............................................................................................17
Tabela 3. Isolados bacterianos obtidos de hortaliças nos municípios de Alagoas. ......... 19

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ADE – Água destilada esterilizada
BLASTn – Basic Local Alignment Search Tool for Nucleotides
°C – Grau Celsius
CEASAS – Centrais de Abastecimento Sociedade Anônima
CIPRES – Cyberinfrastructure for Phylogenetic Research
CPG – Caseína hidrolisada, peptona e glicose
CVP – Cristal violeta pectato
DNA – Ácido desoxirribonucleico
DNASP - DNA Sequence Polymorphism
DNTP – Desoxirribonucleotídeo Trifosfato
ELISA – Enzime-Linked Immunosorbent Assay
FAO – Food and Agriculture Organization
GenBrank – Banco de Dados de Sequências Genéticas
IB – Inferência Bayesiana
IBGE – Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística
IBSBF – Coleção de Culturas de Fitobactérias do Instituto Biológico
MEGA6 – Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 6
MgCl2 – Cloreto de magnésio
MLSA – Multilocus Sequence Analysis
MrBAYES – Bayesian Phylogenetic analysis
MUSCLE – Multiple Sequence Comparison by Log-Expectation
mL – Mililitro
Mm – Milímetro
MV – Máxima verossimilhança

NCBI – National Center for Biotechnology Information
ng – Nanograma
ng/μl – Nanogramas por microlitro
Pae – Pectina acetil esterase
PAUP – Phylogenetic Analysus Using
Pb – Par de bases
PCR – Reação de Cadeia de Polimerase
qPCR – Reação de Cadeia de Polimerase quantitativa
repPCR – Sequências palindrômicas extragênicas repetitivas
Pel – Pectato liase
Pme – Pectina metil esterase
Pnl – Pectina liase
rDNA – Ácido desoxirribonucleico ribossomal
RNA – Ácido ribonucleico
Rep-RNA – RNA autorreplicante
SEBRAE - Serviço Brasileiro de Apoio às Micro e Pequenas Empresas
SEPLAG - Secretaria de Planejamento, Gestão e Patrimônio
t/ha – Toneladas por hectare
U/μL – Unidades por microlitro
UFC – Unidades formadoras de colônia
µL – Microlitro
μM – Micromolar

SUMÁRIO
1.

INTRODUÇÃO .............................................................................................................. 1

2.

REVISÃO DE LITERATURA....................................................................................... 3
2.1. Importância das hortaliças........................................................................................... 3
2.2. Produção de hortaliças no Estado de Alagoas ............................................................. 4
2.3. Podridão mole bacteriana ............................................................................................ 5
2.4. Pectobacteriaceae causadoras de podridão mole ......................................................... 6

3.

MATERIAL E MÉTODOS .......................................................................................... 12
3.1. Local da pesquisa ...................................................................................................... 12
3.2. Obtenção e seleção dos isolados bacterianos ............................................................ 12
3.3. Teste de patogenicidade em alface, couve e pimentão .............................................. 12
3.4. Extração de DNA e análises moleculares .................................................................. 13

4.

3.4.1.

Obtenção do perfil genômico dos isolados......................................................... 13

3.4.2.

Haplotipagem e caracterização molecular .......................................................... 13

3.4.3.

Análises filogenéticas ......................................................................................... 17

RESULTADOS ............................................................................................................ 19
4.1. Coleta dos isolados bacterianos ................................................................................. 19
4.2. Teste de patogenicidade dos isolados ........................................................................ 19
4.3. Genotipagem dos isolados pelo método de rep-PCR ................................................ 20
4.4. Determinação do gênero bacteriano pela rede de haplótipos .................................... 20
4.5. Análise das sequências multilocus (MLSA).............................................................. 21

5.

DISCUSSÃO ................................................................................................................ 25

6.

CONCLUSÃO.............................................................................................................. 27

7.

REFERÊNCIAS ........................................................................................................... 28

1

1. INTRODUÇÃO
As hortaliças constituem importantes fontes alimentares devido à presença de
fitoquímicos, vitaminas, minerais e fibras, essenciais para manutenção da saúde humana
(Rolnik; Olas, 2020). A China é a principal produtora de hortaliças do mundo, com
aproximadamente 1,1 bilhão de toneladas, enquanto Brasil constitui uma pequena
parcela, com cerca de 9 milhões de toneladas, concentradas predominantemente nas
regiões sul e sudeste do país (FAO et al., 2020).
No Nordeste brasileiro, a horticultura está amplamente distribuídas em diversos
estados, incluindo Alagoas (Brainer, 2021). Entre as mesorregiões alagoanas, o Agreste
se destaca como o principal polo hortícola, com o município de Arapiraca apresentando
a maior produtividade e concentrando mais de 800 produtores responsáveis pelo cultivo
de uma grande variedade de hortaliças (SEBRAE, 2023). Dentre as principais culturas
produzidas na região, destaca-se o coentro (10.773 toneladas), tomate (9.501 toneladas)
e batata-doce (5.837 toneladas) (SEPLAG, 2016; IBGE, 2017).
Apesar da importância econômica e social do cultivo de hortícolas, o setor ainda
enfrenta desafios significativos, especialmente relacionados à manutenção da qualidade
dos produtos destinados à exportação (Mattos et al., 2009). Entre os obstáculos no
plantio de olericulturas, destaca-se a elevada suscetibilidade das culturas a doenças,
como a podridão mole bacteriana, que ocasiona perdas expressivas ao longo da cadeia
produtiva (Lana; Moita, 2020).
A podridão mole bacteriana é uma doença de ampla distribuição, afetando
diversas culturas de hortaliças em todo mundo, incluindo o Brasil (Cardoso, 2019).
Entre os principais agentes fitopatogênicos destacam-se espécies do gênero
Pectobacterium, bactérias pectinolíticas produtoras de enzimas capazes de degradar a
pectina, componente estrutural da parede celular vegetal (Grimault et al., 1997). Os
sintomas característicos são encharcamento, maceração, perda da coloração e odor
fétido, os quais são intensificados por condições ambientais favoráveis, especialmente
elevada temperatura e umidade (Romeiro, 2005). Esses fatores aceleram a progressão da
doença, reforçando a necessidade da aplicação de técnicas de diagnósticos para
identificação da podridão mole (Van Gijsegem; Van Der Wolf; Toth, 2021).

2

A identificação de bactérias fitopatogênicas, pode ser realizada por meio das
características morfológicas, testes bioquímicos e imunológicos; no entanto, as técnicas
moleculares têm se destacado pela maior precisão e reprodutivibilidade (Umesha;
Avinash, 2015). Entre essas abordagens, a polymerase chain reaction, apresenta uma
alta sensibilidade e confiabilidade, obtendo-se um rápido resultado. Desta forma, a PCR
se tornou uma ferramenta essencial para a detecção mais precisa de espécies-alvo,
contribuindo diretamente para tomada de decisões do manejo da doença em hortaliças
(Preethi; Umesha, 2025).
No Estado de Alagoas, estudos sobre a diversidade de bactérias associadas à
podridão mole em hortaliças ainda são limitados. Considerando que o conhecimento
dessa diversidade é fundamental para o desenvolvimento de estratégias eficazes de
manejo da doença, o presente estudo teve por objetivo identificar a diversidade de
Pectobacterium spp. causadoras de podridão mole em hortaliças cultivadas no Estado de
Alagoas, utilizando análise de sequências multilocus (MLSA).

3

2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. Importância das hortaliças
As hortaliças constituem um amplo grupo de plantas que desempenham um papel
fundamental na alimentação, devido à sua composição de macro e micronutrientes
essenciais para a saúde humana (Rolnik; Olas, 2020). Em 2018, a produção de
hortaliças alcançou aproximadamente 1,1 bilhão de toneladas, com a China respondendo
por 50,7% desse total. No mesmo ano, o Brasil atingiu uma produtividade de 9 milhões de
toneladas (FAO et al., 2020). Adicionamente, dados indicam que, em 2015 a
horticultura brasileira registrou uma produção superior a 19 milhões de toneladas
(Clemente, 2015).
Estima-se que no Brasil, mais de 30 espécies de hortaliças sejam cultivadas em
atividades agrícolas, sendo responsável pela geração de mais de 13 milhões de
empregos na agricultura familiar (Carvalho; Kist; Beling, 2019). Entre os cultivos que
concentram os maiores volumes de produção destacam-se o tomate, a batata, a cebola, a
cenoura, a batata-doce e o alho. Essa diversidade de hortaliças, representa uma
vantagem para os pequenos agricultores, por possibilitar o escalonamento da produção e
o cultivo em diferentes épocas do ano (Clemente, 2015).
A Companhia Nacional de Abastecimento (CONAB) realizou um levantamento
sobre a comercialização de hortícolas, incluindo alface, batata, cebola, cenoura e tomate
em Centrais de Abastecimento (CEASAs) de diversos estados brasileiros, abrangendo
os período de 2023 a 2025. Nesse intervalo, foi registrada um movimentação de 5
milhões de toneladas comercializadas. Em 2023, o maior volume de comercialização
ocorreu em agosto, com cerca de 450 mil toneladas. Em 2024, outubro apresentou uma
média de 440 mil toneladas, enquanto que em 2025, o pico foi observado em julho, com
aproximadamente de 430 mil toneladas comercializadas (Companhia Nacional de
Abastecimento, 2025).
Segundo o Censo Agropecuário 2017, a região do Nordeste brasileiro possui a
maior quantidade de estabelecimentos nacionais dedicados à horticultura, abrangendo
cerca de 41%. No entanto, a região do Sudeste se destaca pelo maior valor de produção
em comparação as outras macrorregiões. Nas regiões do Nordeste brasileiro, o Estado do
Maranhão produz principalmente coentro, alface, cebolinha, quiabo e milho verde; O
Piauí destaca-se na produção de coentro, cebolinha, alface, milho verde, tomate e

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pimentão. Já nos Estados da Paraíba, Rio Grande do Norte, Pernambuco, Alagoas e
Sergipe, se assemelham na preferência da produção de batata-doce, coentro e alface. No
estado da Bahia, tem-se a maior produção de tomate e alface (Brainer, 2021).
2.2. Produção de hortaliças no Estado de Alagoas
A horticultura é bastante distribuída pelo estado de Alagoas, presente em diversos
municípios, constituindo uma importante fonte econômica tanto para o estado quanto para
às unidades familiares que compõem 90,6% dos estabelecimentos agropecuários
(SEPLAG, 2016). De acordo com o Censo Agropecuário do IBGE (2017), Alagoas obteve
uma vasta produção de hortaliças em toneladas, com destaque para o coentro, que liderou
com 10.773 toneladas, seguindo pelo tomate (9.501 toneladas) e pela batata-doce (5.837
toneladas). Na sequência, destacam-se a produção de alface (4.329 toneladas), inhame
(3.095 toneladas), abóbora (1.642 toneladas), couve (1.166 toneladas) e pimentão (933
toneladas). A cebolinha apresentou uma produção de 931 toneladas, enquanto o repolho
alcançou 425 toneladas. As hortícolas rúcula, berinjela, couve-flor e cebola, registraram
produções menores de 107, 70, 22 e 6 toneladas, respectivamente.
Entre as mesorregiões alagoanas, destaca-se o Agreste como o principal produtor
de hortaliças, englobando vários municípios que desempenham essa atividade agrícola
como Limoeiro de Anadia, União dos Palmares, Arapiraca, Taquarana, entre outros. O
município de Arapiraca é a principal região com maior produção de hortaliças no agreste
alagoano, englobando cerca de 800 produtores que cultivam uma grande variedade de
hortaliças como alface, coentro, cebolinha, entre outros (SEBRAE, 2023).
No entanto, na região do Sertão alagoano, os produtores rurais se adaptaram-se às
condições locais e implementaram o cultivo de hortaliças em pequenas propriedades,
tanto para subsistência quanto para obtenção de uma renda econômica. O município de
Água Branca, é um grande produtor de segmentos orgânicos, cultivando variedades
intermitentes como coentro, tomate, pimentão, alface, cebolinha, couve, pimenta e
abóbora (Barboza, 2022).
No Leste alagoano, apesar da predominância de cana-de-açúcar, não é somente
dessa cultura que se movimenta a economia dessa mesorregião. O solo fértil e clima
chuvoso, favorece o desenvolvimento de diversas culturas. Em Coruripe, encontra-se a
produção de hortaliças como alface, repolho, couve, coentro, chuchu, abóbora, batatadoce, macaxeira e inhame (Dos Santos, 2019).

5

Apesar das condições favoráveis de solo e clima em Alagoas para o plantio de
hortaliças, os diferentes fatores ambientais podem aumentar a susceptibilidade na
instalação e propagação de patógenos que causam danos direto ou indiretamente a
produção (Pereira; Pinheiro, 2012). As doenças bacterianas, como podridão mole pode
ocorrer no pré ou pós colheita, resultando em danos significativos que levam a perda total
da safra (Chaves; Tofoli, 2024).
2.3. Podridão mole bacteriana
A podridão mole é uma doença bacteriana causada por bactérias pectinolíticas
pertencentes à família Pectobacteriaceae, que infectam uma ampla gama de hospedeiros
vegetais e provocam danos irreversíveis às plantas. Esses patógenos produzem enzimas
extracelulares como pectato liase (Pel), pectina liase (Pnl), pectina metil esterase (Pme)
e pectina acetil esterase (Pae), responsáveis pela degradação da pectina, um componente
estrutural importante da parede celular que confere rigidez ao tecido vegetal (Dess et al.,
2017).
Entre os diversos organismos capazes de causar podridão mole em hortaliças,
destacam-se a virulência de espécies do gênero Pectobacterium, associadas a culturas
como batata, cebola, tomate e pimentão. A doença pode ocorrer tanto em pré quanto em
pós- colheita, sendo influenciada por fatores ambientais, edáficos pelas condições
fisiolígicas do hospedeiro, que favorecem a colonização e a disseminação dos
fitopatógenos (Filho et al., 2018).
Diversas hortaliças são afetadas pela podridão mole, resultando em perdas
significativas durante o cultivo. Entre as principais culturas afetadas, destacam-se a
alface e a couve-chinesa, que apresentam sintomas iniciais de murcha das folhas
externas. À medida que a doença progride, observa-se encharcamento, maceração e
esverdeamento, culminando no apodrecimento total da planta (Ren; Petzoldt; Dickson,
2001).
Em batata, a podridão mole manifesta-se por lesões úmidas e escurecimento das
hastes, podendo evoluir para amarelamento e murcha da parte aérea em condições mais
severas. Os tubérculos infectados apresentam textura amolecida ou cremosa, coloração
escura e odor desagradável. As bactérias associadas aos tubérculos doentes, podem ser
liberadas no solo e disseminarem para tubérculos adjacentes, principalmente por meio
de água contaminada (Beriam; Destéfano; Occhiena, 2020).
Em culturas como tomate, berinjela e pimentão, observa-se escurecimento do
caule, enquanto nos frutos surgem manchas encharcadas e irregulares, geralmente

6

iniciadas nos pedúnculos, que evoluem para apodrecimento total com aspecto amolecidos
(Bergamin; Kimati; Amorim, 1995).
Atualmente, não existem métodos de controle da podridão mole, sendo as
estratégias disponíveis baseadas principalmente em medidas preventivas e profiláticas
para mitigar os danos causados pela doença (Motyka et al., 2017). Apesar dos avanços
tecnológicos, ainda há necessidade do desenvolvimento de ferramentas capazes de
detectar precocemente bactérias pectinolíticas, de modo a reduzir os impactos sobre as
culturas vegetais. A diversidade dos gêneros que integram a Família Pectobacteriaceae,
aliada à influência de fatores ambientais e a susceptibilidade dos hospedeiros,
representam um grande desafio para o controle da podridão mole (Kabir; Taheri;
Dumenyo, 2020).
2.4. Pectobacteriaceae causadoras de podridão mole
O gênero Pectobacterium é amplamente estudado por causar significativas perdas
econômicas em diferentes culturas. Espécies pertencentes a esse gênero, estão listadas
entre as 10 bactérias fitopatogênicas mais destrutivas do mundo (Mansfield et al., 2012).
Taxonomicamente, o gênero pertence ao domínio Bacteria, Filo Proteobacteria, Classe
Gammaproteobacteria, Ordem Enterobacteriales e, recentemente, alocado na Família
Pectobacteriaceae. Estas bactérias são Gram-negativas, anaeróbicas facultativas,
apresentam formato de bastonetes com a presença de flagelos (Adeolu et al., 2016).
As espécies de Pectobacterium e Dickeya foram inicialmente agrupadas no gênero
Erwinia como proposto por Winslow et al. (1920), que inclui bactérias pectinolíticas
Gram-negativas, flageladas, fermentativas e não esporulantes. Esse agrupamento foi
subdividido em três seções: Amylovora (espécies necrotróficas), Carotovora (espécies
pectinolíticas causadoras de podridão mole) e Herbicola (isolados que apresentavam
pigmentos amarelos, incluindo saprófitas). Posteriormente, em 1945, Waldee propôs a
transferência das bactérias pectinolíticas do grupo Carotovora para o gênero
Pectobacterium, uma reclassificação posteriormente consolidade por Dye (1969).
Com base em análises genômicas, Samson et al. (2005) propuseram a
reclassificação de Erwinia chysanthemi em um novo gênero, denominado Dickeya,
inicialmente composta por seis espécies. Posteriormente, Adeolu et al. (2016),
revisaram a classificação da antiga família Enterobacteaceae, reorganizando-a na ordem
Enterobacterales, que passa a englobar diversas famílias, incluindo a Pectobacteriaceae.
Essa família, frequentemente referida como “Soft rot Pectobacteriaceae” reune gêneros
de bactérias fitopatogênicas responsáveis podridão mole, destacando-se Pectobacterium
e Dickeya, além de outros gêneros associados, como Lonsdalea e Brenneria (Adeolu et

7

al., 2016).
Avanços nas análises filogenéticas, particularmente baseadas na região 16S
rDNA, resultaram em um aumento significativo no número de espécies reconhecidas do
gênero Pectobacterium. Atualmente, são descritas 20 espécies, incluindo P. actinidiae,
P. aquaticum, P. aroidearum, P. atrosepticum, P. betavasculorum, P. brasiliense, P.
cacticida, P. carotovorum, P. fontis, P. odoriferum, P. parmentieri, P. parvum, P.
peruviense, P. polaris, P. polonicum, P. punjabense, P. quasiaquaticum, P. versateli,
P. wasabiae e P. zantedeschiae (Van Gijsegem; van der Wolf; Toth, 2021).
O gênero Dickeya também apresentou um aumento no número de espécies por
meio das análises filogenéticas, genômicas e fenotípicas de isolados de coleções antigas.
Como resultado, uma reorganização taxonômica foi proposta, culminando no
reconhecimento de 12 espécies aceitas: D. aquatica, D. chrysanthemi, D. dadantii, D.
dianthicola, D. fangzhongdai, D. lacustris, D. oryzae, D. paradisiaca, D. poaceiphila,
D. solani, D. undicola e D. zeae (Hugouvieux-Cotte-Pattat; Pédron; Gijsegem, 2023).
Nesse contexto, observa-se que ao longo dos anos, a organização taxonômica
dos agentes causadores de podridão mole tem sido fundamentada em testes bioquímicos,
sorológicos e moleculares (Narayanasamy, 2011). Destacam-se, em especial, as
abordagens moleculares baseadas na análise da região 16S ribossomal, por se tratarem
de métodos rápidos, específicos e altamente sensíveis. Essas abordagens envolvem a
Polymerase chain reaction (PCR), na qual fragmentos de DNA são amplificados por
meio de primers específicos direcionados a genes delimitados. A partir dessas análises,
torna-se possível uma reorganização mais confiável das espécies, contribuindo para
maior precisão na sua caracterização taxonômica (Kang; Knwon; Go, 2003).
2.5. Métodos de diagnósticos e identificação de Pectobacterium spp.
Entre os métodos clássicos de identificação bacteriana, destacam-se as abordagens
baseadas na caracterização morfológica das colônias das bactérias pectinolíticas. Nessas
análises, observa-se o aspecto de “vidro quebrado” com o auxílio de lupa com
iluminação oblíqua, que constitui uma característica diagnóstica típica de bactérias
produtoras de pectina (Kelman; Dickey, 1995). Adicionamente, outras características
das colônias são observadas a olho nu, como o formato, a coloração e textura (Baris,
2009; Ryskaliyeva et al., 2020). Somando-se a isso, existe a técnica de coloração de
Gram, que é um método colorimétrico para evidênciar a composição da parede celular
bacteriana, permitindo a distinção entre bactérias gram-positivas ou gram-negativas
(Wilson, 1997).
Além dessas abordagens, os testes bioquímicos são amplamente utilizados, por

8

serem técnicas simples e de baixo custo. Por meio desses testes, é possível avaliar a
degradação de pectina, o equilíbrio de pH, a produção de indigoidina, entre outras reações
metabólicas (Shrestha, 2025). Os meios de culturas seletivos são amplamente utilizados
para identificação de bactérias pectinolíticas, destacando-se o meio de cristal violeta
pectato (CVP), amplamente reconhecido como o mais seletivo para detecção de
bactérias produtoras de pectina. De forma complementar, o meio de caseína-peptonaglicose (CPG) que também é usado para a mesma finalidade (Kelman; Dickey, 1995;
Hélias et al., 2012). Além disso, pode-se utilizar o meio de cultura Miller-Scroth para
identificação e diferenciação de espécies do gênero Pectobacterium (Pierce; McCain,
1992).
Apesar da importância dos testes bioquímicos para identificação dos organismos
cultivados in vitro, essas técnicas apresentam limitações consideráveis, como a falta de
padrões característicos dos isolados patogênicos com gêneros ou espécies conhecidas e
dependência de condições específicas para o crescimento bacteriano, levando a uma baixa
precisão dos resultados (Toth; Avrova; Hyman, 2001). Outro fator limitante, é que os
métodos bioquímicos apresentam precisão restrita na identificação de bactérias não
convencionais. Essas abordagens tendem a ser mais acuradas para a caracterização de
bactérias comuns e pouco exigentes, mostrando-se menos eficientes para o diagnóstico
de grupos bacterianos atípicos ou com maiores exigências nutricionais (Arbefeville;
Timbrook; Garner, 2024).
Ainda sobre os métodos convencionais, destaca-se os métodos sorológicos usados
para detecção de espécies bacterianas, como os testes de aglutinação (Graham, 1963),
imunofluorescência (De Boer; Copeman; Vruggink, 1979), difusão dupla em agar
(Dickey; Zumoff; Uyemoto, 1984) e Enzime-Linked Immunosorbent Assay – ELISA
(Gorris et al., 1994). Entre as técnicas citadas, a ELISA é o método imunoenzimático
mais utilizado, em razão do seu baixo custo, alta sensibilidade e especificidade, além da
possibilitar a realização de análise simultânea de múltiplas amostras (Sakamoto et al.,
2018). Esse diagnóstico, baseia-se na reação antígeno-anticorpo, sendo selecionados
antígenos específicos que compõem a parede celular bacteriana da espécie de interesse.
Entretanto, os métodos imunológicos como o ELISA podem apresentar resultados falsopositivos, além de limitações de detecção de patógenos que estejam em baixas
concentrações (Filho, 2023).
Diante dos fatores limitantes dos métodos convencionais, buscaram-se
alternativas mais eficazes para identificação bacteriana. Diante disso, a técnica molecular
por Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) tornou-se uma forte aliada na detecção e
organização das classes bacterianas em níveis de gêneros e espécies. Diferentemente dos

9

testes bioquímicos e fisiológicos, o PCR permite uma detecção mais precisa e
relativamente rápida de bactérias fitopatogênicas (López et al., 2017).
Entre os tipos de PCR, ressalta-se o PCR convencional, que permite detectar a
presença ou ausência de um alvo específico por meio do uso de um único par de primer,
apresentando como vantagens a alta sensibilidade e especificidade, além de não sofrer
interferência de outros primers, porque só é utilizado um par (Rahman et al., 2013).
Enquanto que a PCR multiplex, possibilita a utilização de múltiplos primers específicos
na mesma reação em cadeia, permitindo a deteção simultânea da espécie-alvo
(Czechowski et al., 2004).
Outro método relevante é a PCR em tempo real (qPCR) ou quantitativa, a qual
oferece elevada sensibilidade, especificidade e, sobretudo, um tempo de processamento
reduzido quando comparado a outras técnicas aplicadas aos diagnósticos de fitopatógenos
(Cankar et al., 2006). O qPCR utiliza marcadores fluorescentes, que amplificam e
quantificam em tempo real o DNA ou RNA, sendo amplamente adotado na atualidade
(Harshitha; Arunraj, 2021). Ademais, destaca-se o PCR com sequências palindrômicas
extragênicas repetitivas (rep-PCR), que é empregado para avaliar a relação entre os
isolados. Esse método é menos complexo e utiliza primers complementares a sequência
de DNA duplicadas, que são naturalmente mais presentes nos genomas bacterianos. Desta
forma, o rep-PCR permite identificar os isolados de espécies distintas (Havenga et al.,
2022).
Diversos estudos são conduzidos e baseados em sequências de análises
moleculares da região 16S Ribossomal. O conhecimento acerca da região 16S, mostrouse promissor para uma organização precisa dos microrganismos procariontes, uma vez
que essa é evolutivamente conservada nas bactérias. Ainda assim, existe variações
específicas na sequência de pares de bases nessa região, permitindo a diferenciação dos
tipos bacterianos (Atlas; Bartha, 1998).
Por fim, ressalta-se a análise de sequências multilocus (MLSA), que vem sendo
cada vez mais utilizada na organização taxonômica e na identificação de espécies
bacterianas (Glaeser; Kämpfer, 2015). Essa abordagem baseia-se no sequenciamento de
nucleotídeos de diversos genes codificadores de proteínas para alcançar uma melhor
correlação entre os isolados. A MLSA proporciona uma maior precisão filogenética, uma
vez que as sequências são concatenadas em uma ordem definida e alinhadas com as
sequências de referências correspondentes (Gevers et al., 2005).

10

Diante do exposto, observa-se que as técnicas tradicionais ainda permanecem em
uso, sobretudo por fornecem um parâmetro inicial do tipo bacteriano analisado (Scala;
Pucci; Loreti, 2018). No entanto, as técnicas moleculares, como PCR e MLSA,
representam um avanço significativo na identificação e organização taxonômica de
maneira mais precisa e confiável, razão pela qual estão sendo amplamente utilizada em
diversas pesquisas científicas (De Jesús et al., 2024).
2.6. Diversidade de espécies de Pectobacterium em hortaliças
O gênero de Pectobacterium compreende uma ampla diversidade de espécies
fitopatogênicas capazes de infectar diferentes hospedeiros, apresentando a habilidade de
persistir de forma latente em plantas assintomáticas (Ma et al., 2007). Esta capacidade
favorece a propagação da bactéria através de manejo na cultura, água contaminada e
restos culturais, contribuindo para instalação da doença, especialmente hortaliças, que
apresentam uma susceptibilidade a doenças (Czajkowski et al., 2011).
As hortaliças são as principais culturas afetadas pela podridão mole causada por
espécies do gênero Pectobacterium (Zaczek-Moczydłowska et al., 2019). Em cultivos
de chicória no Estado de São Paulo, foram observados sintomas de encharcamento e
necrose, sendo a infecção por Pectobacterium brasiliense confirmada por análise
molecular do DNA isolado (Appy et al., 2023).
O Allium fistulosum, popularmente conhecido como cebolinha, apresenta
elevada suscetibilidade a doenças bacterianas, incluindo a podridão mole. Bulbos
sintomáticos localizados em cultivos na China, foram desinfestados para posterior
isolamento das bactérias e, por meio da análise das sequências de rDNA da região 16S,
verificou-se elevada similaridade com P. carotovorum subsp. carotovorum (Zhu et al.,
2023).
Em brócolis, registrou-se uma significativa perda na produção devido a infecção
bacteriana, caracterizada por sintomas de podridão e odor desagradável. A partir de três
isolados obtidos, foi possível realizar testes fisiológicos, bioquímicos e moleculares do
DNA total extraído, confirmando a presença da Pectobacterium polaris como agente
causal da podridão mole nessa cultura (Qin et al., 2024).
Tecidos vegetais de pimentão, repolho, cenoura, alface, batata e abobrinha,
apresentando sintomas característicos de podridão mole, foram utilizados para o
isolamento bacteriano. As amostras foram submetidas à reação em cadeia da polimerase
(PCR) e, posteriormente, a análises filogenéticas dos genes dnaX, gapA e leuS. Os

11

resultados evidenciaram a presença das espécies P. brasiliense, P. carotovorum, P. polaris
e P. versatile (Parvin, Taghavi; Osdaghi, 2023).
Em folhosas, a podridão mole manifestou-se no repolho por meio de maceração
tecidual e descolamento das folhas. A análise da sequência multilocus dos genes dnaX,
mdh, icdA e proA realizada com cinco isolados, confirmou-se a presença de
Pectobacterium carotovorum, Pectobacterium versatile e Pectobacterium odoriferum
(Jelusic et al., 2023). Outro estudo identificou em alface sintomas de murcha,
descoloramento e odor desagradável. O isolamento bacteriano foi realizado, seguido pela
análise do genoma completo, confirmando-se a ocorrência de Pectobacterium (Thomas;
Narine; Saravanakumar, 2024).
A berinjela representa uma cultura de expressiva importância agrícola, porém é
frequentemente acometida pela podridão mole bacteriana. No estudo conduzido por He et
al. (2023), foram obtidos 15 isolados a partir de lesões no caule, típicas da doença.
Posteriormente, realizaram-se ensaios bioquímicos, análises das sequências do gene 16S
rRNA e multilocus, bem como testes de patogenicidade. Os resultados confirmaram a
infecção por Pectobacterium.

12

3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. Local da pesquisa
O presente estudo foi conduzido no Laboratório de Bioquímica e Fitopatologia
do Campus de Engenharias e Ciências Agrárias, da Universidade Federal de Alagoas,
CECA/UFAL.
3.2. Obtenção e seleção dos isolados bacterianos
Os isolados bacterianos foram coletados em alface, couve e pimentão com
sintomas típicos de podridão mole em plantios comerciais nos municípios de Arapiraca,
Limoeiro de Anadia e Taquarana no estado de Alagoas, Brasil. A seleção dos isolados
se deu a partir da identificação bacterianas em meio CPG (1g de caseína hidrolisada,
10g de peptona, 10g de glicose, 18g de ágar, completando o volume com água destilada
esterilizada (ADE) até completar 1000mL. Através desse meio, as colônias jovens de
bactérias pectinolíticas que apresentaram aspecto de “vidro quebrado” foram selecionadas
(Kelman e Dickey 1995). Os novos isolados bacterianos foram catalogados e
depositados na coleção de Fitopatógenos da Universidade Federal de Alagoas
(COUFAL).
3.3. Teste de patogenicidade em alface, couve e pimentão
Para o teste de patogenicidade em folhas de alface e couve, utilizou-se suspensões
bacterianas [A570 = 0,36 (±1,0 x 109 UFC mL-1)] preparadas a partir de culturas que
crescidas em meio casamino acid-peptone-glucose (CPG) por 48 h a uma temperatura de
28°C. As suspensões foram inoculadas pelo método de picada, que consiste na realização
de uma lesão na nervura central das folhas, seguida da deposição de 20 µL da suspensão
bacteriana. No caso do pimentão, a inoculação foi realizada em lados opostos do fruto,
utilizando palitos previamente esterilizados, obtendo pequena quantidade da colônia
bacterina e penetrando a uma profundidade de 1 mm (Mariano et al., 2016). O tratamento
controle consistiu em folhas de alface e couve, e fruto de pimentão inoculados com ADE.
Após as inoculações, as folhas e frutos foram submetidos à câmara úmida por 6 horas e as
avaliações realizadas até 48 horas após a inoculação.

13

3.4. Extração de DNA e análises moleculares
A extração do DNA genômico foi realizado de acordo com o método descrito por
Ausubel et al. (2003). A qualidade do DNA genômico foi visualizada em gel de agarose
e corado com SyBr Gold (Thermo Fish Scientific). As amostras foram quantificadas em
NanoDrop Lite Plus Spectrophotometer, ajustadas para concentração final de 20 ng/μl, e
armazenadas a - 20° C.
3.4.1. Obtenção do perfil genômico dos isolados
Os isolados patogênicos à alface, couve e pimentão foram selecionados para
realização de uma triagem inicial por meio da técnica de genotipagem (rep-PCR)
adaptada de Versalovic et al. (1991). Utilizando-se o par de primers ERIC (ERIC1R
5’ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC3’

e

ERIC2R

5’AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG3’), as reações de PCR receberam 1X de Master
Mix 2X (Promega) (0,05 U/μL de Taq DNA polimerase, tampão de reação, 4 Mm de
MgCl2, 0,4 Mm de cada DNTP), 10 μM de cada primer e 100 ng de DNA.
As amostras foram amplificadas em termociclador modelo MaxyGene Gradient,
com as seguintes condições: desnaturação inicial a 95ºC por 7 minutos; 30 ciclos de
desnaturação a 94ºC 1 minuto, anelamento a 53 ºC por 1 minuto e extensão a 65 ºC por
8 minutos, seguido de uma extensão final a 65 ºC por 15 minutos. Os produtos da PCR
foram visualizados em gel e agarose a 1,5%, corados com SyBr e visualizados em sob
luz UV.
3.4.2. Haplotipagem e caracterização molecular
Inicialmente foi realizada um haplotipagem com base na comparação das
sequências de nucleotídeos da região 16S rDNA. As sequências dos isolados foram
analisadas com o algoritmo BLASTn (Altschul et al., 1990) e o banco de dados de
nucleotídeos não-redundante GenBrank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) para
determinar as sequências com as quais elas compartilham maior identidade. A rede de
haplótipos foi determinada pela construção de uma árvore filogenética de
verossimilhança realizada no programa MEGA v.12. Após essa análise, isolados
representativos de cada haplótipo foram selecionados para compor a filogenia
sequenciando o seguinte conjunto de genes: Gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase A,
Malato desidrogenase, Isocitrato desidrogenase, específica para NADP+, Gama glutamil
fosfato redutase e Recombinase A para identificação precisa das espécies
Pectobacterium.

14

As reações de PCR montadas com 1μM de cada primer, 0,1mM de DNTP, 1,5mM
de MgCl, 1X tampão, 1U de Taq e 50ng de DNA, seguindo o método de Dos Santos et
al. (2019). Foram utilizados os primers 27Wf/1492Rv, sob as seguintes condições de
termociclagem: desnaturação de 94°C por 2 minutos e 30 ciclos de desnaturação a 94°C
por 30 segundos, anelamento a 55°C por 30 segundos e extensão a 72°C por 1 minuto;
por fim, extensão final de 72°C por 10 minutos. Para identificação a nível de espécies
dos isolados obtidos no presente estudo, foi realizada a amplificação via PCR utilizando
primers específicos dos genes gapA, mdh, icdA, proA e recA (Tabela 1).

15

Tabela 1. Primers empregados na amplificação de segmentos genômicos via método de PCRs.
GENES

NOME COMPLETO

SEQUÊNCIA

TAMANHO DA

TERMOCICLAGEM

TIPO

REFERÊNCIA

GÊNERO

SEQUÊNCIA (PB)

E ESPÉCIE
gapA326F
gapA845R

Gliceraldeído-3-fosfato
desidrogenase A

ATCTTCCTGACCGACGAAACTGC
ACGTCATCTTCGGTGTTAACCCAG

Desnaturação inicial; 95°C, 3 min;
450

Espécie

Ma et al., 2007.

Espécie

Ma et al., 2007.

Espécie

Ma et al., 2007.

30 ciclos (Desnaturação: 94°C, 30
seg, Anelamento: 52°C, 30 seg,
Extensão: 72°C, 1 min); Extensão
final, 72°C, 6 min.

mdh86F

Malato desidrogenase

mdh628R

CCCAGCTTCCTTCAGGTTCAGA
CTGCATTCTGAATACGTTTGGTCA

Desnaturação inicial; 95°C, 3 min;
460

30 ciclos (Desnaturação: 94°C, 30
seg, Anelamento: 52°C, 30 seg,
Extensão: 72°C, 1 min); Extensão
final, 72°C, 6 min.

icdA400F
icdA977R

Isocitrato desidrogenase,
específica para NADP+

GGTGGTATCCGTTCTCTGAACG
TAGTCGCCGTTCAGGTTCATACA

Desnaturação inicial; 95°C, 3 min;
520

30 ciclos (Desnaturação: 94°C, 30
seg, Anelamento: 52°C, 30 seg,
Extensão: 72°C, 1 min); Extensão
final, 72°C, 6 min.

16

proAF1
proAR1

Gama glutamil fosfato
redutase

Desnaturação inicial; 95°C, 3 min;

CGGYAATGCGGTGATTCTGCG
630

GGGTACTGACCGCCACTTC

Espécie

Ma et al., 2007.

Espécie

Warelon et al.,

30 ciclos (Desnaturação: 94°C, 30
seg, Anelamento: 52°C, 30 seg,
Extensão: 72°C, 1 min); Extensão
final, 72°C, 6 min.

RecAf

Recombinase A

recAr

GGTAAAGGGTCTATCATGGG
CCTTCACCATACATAATTTGGA

Desnaturação inicial; 95°C, 7 min;
730

30 ciclos (Desnaturação: 94°C, 1

2002.

min, Anelamento: 44°C, 1 min,
Extensão: 65°C, 8 min); Extensão
final, 65°C, 15 min.
27Wf

16S ribosomal RNA

1492Rv

AGAGTTTGATCMTGGCTCAG
GGTTACCTTGTTACCGACTT

500 – 900

Desnaturação inicial; 94°C, 2 min;

Gênero

Dos Santos et al.,

30 ciclos (Desnaturação: 94°C, 30

Pectobacterium

2019.

seg, Anelamento: 55°C, 30 seg,
Extensão: 72°C, 1 min); Extensão
final, 72°C, 10 min.

Eric1R
Eric2R

Rep-PCR

ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC3
AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG3

desnaturação inicial por 7 minutos
100 – 5000

à 95ºC; 30 ciclos de 1 minuto a 94º
C para desnaturação, 1 minuto a
53º C para anelamento e 8 minutos
a 65º C para extensão; e extensão
final por 15 minutos a 65º C

Fonte: Autor, 2026.

Versalovic;
-

Koueth; Lupski,
1991.

17

3.4.3. Análises filogenéticas
A análise filogenética foi realizada com as sequências de cada isolado
selecionado,

sendo

inseridas

no

software

Codon

Code

Aligner

v.

6.0.2

(www.codoncode.com) (Codon Code Corporation, Dedham, Massachusetts, USA), e
analisadas visualmente. O arranjo dos nucleotídeos em posições ambíguas, foram
corrigidos por comparação das sequências senso e anti-senso. Sequências parciais obtidas
para os genes específicos de icdA, gapA, mdh, proA e recA foram analisadas com o
algoritmo BLASTn e o banco de dados de nucleotídeos não-redundante do GenBank
(www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank)

para

determinar

as

espécies

com

as

quais

compartilharam maior identidade de sequência (Altschul et al., 1990; Ma et al., 2007).
Os alinhamentos múltiplos das sequências foram realizados através do algoritmo
MUSCLE implementado no programa MEGA v.6 e ajustados manualmente. As
sequências genômicas das espécies de Pectobacterium que estavam disponíveis no
GenBank também foram utilizadas na análise (Tabela 2). As árvores filogenéticas foram
reconstruídas utilizando inferência Bayesiana com a ferramenta MrBayes (Ronquist et
al., 2012) v.3.2.6 disponibilizada no portal CIPRES (Miller et al., 2010). O modelo de
substituição de nucleotídeos e o modelo para distribuição de heterogeneidade foram
escolhidos com o auxílio dos programas PAUP v.4.0b10 (Swofford, 2003) e
MrModelTest2 v.2.3 (Nylander, 2004). As árvores foram visualizadas e editadas nos
programas FigTree v. 1.4 23 (ztree.bio.ed.ac.uk/software/figtree).

Tabela 2. Sequências genômicas parciais utilizadas nas análises de MLSA, provenientes
do banco de dados GenBank.
Códigos
KC20

Nome das
espécies
Pectobactrium
aroidearum

GAPA

ICDA

MDH

RECA

PROA

MF443742

MF443747

MF443744.1

-

MF443743.1

SCRI1043

Pectobacterium
atrosepticum

EU340587

EF550736.1

EF550788

BX950851

EF550945.1

CFBP1526*

Pectobacterium
atrosepticum

JN600350.1

JN600339

JN600342.1

DQ523478.1

KCQ16512

IBSBF1692*

Pectobacterium
carotovorum

EF550681.1

EF550734.1

EF550786.1

KU510128.1

EF550943.1

18

Subsp
brasiliense
ATCC15713*

Pectobacterium
carotovorum
subsp
carotovorum

CP001657

CP001657

CP001657

SCRI482

Pectobacterium
carotovorum
subsp odorierum

EU340589

EU340589

EU340589

ATCC43762*

Pectobacterium
betavasculorum

FJ895843

FJ895844

FJ895845

FJ217089

FJ895847

CFBP8475*

Pectobacterium
pamentieri

CP015749

CP015749

CP015749

CP015749

CP015749

ATCC 43316

P. wasabiae

FJ895855

FJ895856

FJ895857

DQ859798

FJ895859

PZ244499

PZ244507

PZ244515

PZ244531

PZ244523

PZ244500

PZ244508

PZ244516

PZ244532

PZ244524

PZ244501

PZ244509

PZ244517

PZ244533

PZ244525

PZ244502

PZ244510

PZ244518

PZ244534

PZ244526

PZ244503

PZ244511

PZ244519

PZ244535

PZ244527

PZ244504

PZ244512

PZ244520

PZ244536

PZ244528

PZ244505

PZ244513

PZ244521

PZ244537

PZ244529

PZ244514
PZ244522
Fonte: Autor,2026.

PZ244538

PZ244530

COUFAL0728
COUFAL0729
COUFAL0730
COUFAL0731
COUFAL0732
COUFAL0733
COUFAL0734
COUFAL0735

Pectobactrium
brasiliense
Pectobactrium
brasiliense
Pectobactrium
brasiliense
Pectobactrium
aroidearum
Pectobactrium
aroidearum
Pectobactrium
aroidearum
Pectobactrium
sp.
Pectobactrium
sp.

CP001657

CP001657

EU340589
EU340589

PZ244506

19

4. RESULTADOS
4.1. Coleta dos isolados bacterianos
Um total de 66 isolados foi obtido a partir de folhas de alface e couve, assim
como de frutos de pimentão (Tabela 3). As colônias dos isolados bacterianos
apresentaram em meio CPG aspecto de “vidro quebrado”, característica típica de
bactérias pectinolíticas causadoras de podridão mole (Figura 1).
Tabela 3. Isolados bacterianos obtidos de hortaliças nos municípios de Alagoas.
Municípios de coletas

Quantidade de isolados

Hortaliças sintomáticas

Arapiraca

40

Alface e couve

Taquarana

10

Alface e pimentão

Limoeiro de Anadia

16
Fonte: Autor, 2026.

Alface

Figura 1. Morfologia de colônia de vidro quebrado dos isolados bacterianos obtidos.

Fonte: Autor, 2026.
4.2. Teste de patogenicidade dos isolados
No teste de patogenicidade 50 isolados obtidos foram patogênicos a alface, couve
e pimentão, sendo capazes de causar podridão mole nos seus respectivos hospedeiros.
Foram observados sintomas característicos da doença, como odor fétido, encharcamento
e maceração dos tecidos vegetais, resultando na perda total das hortaliças.
Nenhum sintoma foi observado no tratamento controle. As bactérias foram
reisoladas a partir dos tecidos sintomáticos, e os isolados recuperados apresentaram
características morfológicas idênticas às das culturas de origem cumprindo assim, os
postulados de Koch.

20

4.3. Genotipagem dos isolados pelo método de rep-PCR
A genotipagem foi realizada por meio do método de Rep-PCR utilizando o
marcador Eric. Esse ensaio evidenciou a presença de diferentes linhagens clonais entre
os 50 isolados patogênicos. Desta forma, foram selecionados dois representantes de cada
linhagem, totalizando 26 isolados escolhidos para haplotipagem baseada nas sequências
da região 16S ribossomal (Figura 2).
Figura 2. Genotipagem de bactérias pectinoliticas baseada no marcador Eric-PCR.

Fonte: Autor, 2026.
4.4. Determinação do gênero bacteriano pela rede de haplótipos
Os 26 isolados selecionados na genotipagem, ficaram distribuídos em três clados
distintos na árvore de verossimilhança. O primeiro clado foi constituído por 17 isolados;
o segundo por sete isolados e o terceiro por dois isolados (Figura 3). O número de
isolados enviados para sequenciamento dos genes gapA, icdA, mdh, proA e recA foi
reduzido: selecionados três isolados do clado 1 (16, 23 e 18), três do clado 2 (20, 7 e 15)
e dois do clado 3 (2 e 4). Todos os isolados analisados foram identificados como
pertencentes ao gênero Pectobacterium.

21

Figura 3. Rede de haplótipos formada por isolados pertencentes ao gênero
Pectobacterium.

Fonte: Autor, 2026.

4.5. Análise das sequências multilocus (MLSA)
Os isolados selecionados da rede de haplótipos foram submetidos à
caracterização molecular, no qual foram obtidas sequências com 408 bases para gapA,
479 para icdA, 473 bases para mdh, 614 bases para proA e 631 para recA. A árvore
filogenética de Inferência Bayesiana para o conjunto de dados combinados contou com
38 taxons sendo a espécie Brenneria lupinicola (EluW3L16) utilizada como taxon
externo. O alinhamento apresentou 2569 caracteres, destes 504 eram sítios informativos
parcimônia, 1902 eram sítios conservados e 667 eram sítios variáveis. Os limites dos
loci nos alinhamentos foram: 1–408 para gapA, 409-887 para icdA, 888-1324 para mdh,
1325-1938 para proA e 1939-2569 para recA. Nos dados individuais para as análises
filogenéticas de BI, foram calculados os seguintes modelos evolutivos de acordo com
AIC, SIM+I+G para os genes gapA, mdh e recAe e GTR+I+G para os genes icdA e
proA.

22

Confirmando a análise preliminar da rede de haplótipos, a filogenia de inferência
Bayesiana para os dados combinados (icdA, gapA, mdh, proA e recA) revelaram três
espécies que agruparam em clados distintos dentro do gênero Pectobacterium, formando
grupos bem suportados. Verificou-se que os isolados 16 (COUFAL0728), 23
(COUFAL0729) e 18 (COUFAL0730), gruparam-se com Pectobacterium brasiliensis.
Os isolados 15 (COUFAL0731), 7 (COUFAL0732) e 20 (COUFAL0733), gruparam-se
com Pectocbacterium aroidearum e os isolados 2 (COUFAL0734) e 4 (COUFAL0735)
não se agruparam com nenhuma espécie conhecida do gênero Pectobacterium, sendo
aqui identificada como Pectobacterium sp. (Figura 4).
Ao analisar a predominância das espécies de Pectobacterium associadas às
hortaliças no estado de Alagoas, verifica-se que, entre os 50 isolados patogênicos, a
espécie Pectobacterium brasiliensis foi a mais frequente, correspondendo a 38
indivíduos (76%). Desses, 37 foram associados à cultura da alface e um à couve. Em
menos frequência, 10 isolados foram identificados como Pectocbacterium aroidearum
(20%), sendo nove provenientes da alface e um do pimentão. Por fim, os dois isolados
foram classificados como Pectobacterium sp. (4%), ocorrendo exclusivamente em
plantas de alface (Figura 5).

23

Figura 4. Árvore filogenética com as respectivas espécies de Pectobacterium de cada
isolado selecionado na técnica de MLSA.

Fonte: Autor, 2026.

24

Figura 5. Prevalência de Pectobacterium spp. causadoras de podridão mole em
hortaliças no Estado de Alagoas.

Nota: Foram incluídos na análise os 50 isolados patogênicos determinados
a partir do teste de patogenicidade realizados com 66 isolados obtidos.

Fonte: Autor, 2026.

25

5. DISCUSSÃO
A podridão mole é uma doença destrutiva, responsável por significativas perdas
econômicas na produção de hortaliças, além de ser difundida globalmente (Opara;
Asuquo, 2016). A doença é ocasionada por espécies pertencentes aos gêneros de
Pectobacterium e Dickeya, esses agentes possuem fácil propagação e ampla gama de
hospedeiros, especialmente na ausência de manejo adequado (Raid, 1997). Os isolados
obtidos de hortaliças coletadas dos municípios do Agreste alagoano, foram submetidos
ao teste de patogenicidade nos hospedeiros: alface, couve e pimentão. O teste de
patogenicidade demonstrou que, dos 66 isolados de Pectobacterium, 50 isolados
possuíram a capacidade de causar sintomas típicos de podridão mole. Oservando-se,
ainda, características morfológicas de colônias típicas de bactérias pectinolíticas. O teste
de patogenicidade é uma técnica simples, porém amplamente utilizada para avaliar a
ampla gama de hospedeiros vegetais que os isolados patogênicos acometem (Moraes,
2018).
A partir da análise filogenética da região 16S ribossomal, foi possível observar
que Pectobacterium é gênero bacteriano que está causando podridão mole em hortaliças
no Agreste alagoano. O avanço tecnológico e estudos genômicos, possibilitaram o
conhecimento amplo da região 16S rDNA, uma região conservada, possibilitando
comparações dos genomas para identificação precisa de bactérias desconhecidas (Zuo;
Xu; Hao, 2015; Demongeot; Seligmann; 2019). A utilização da região 16S rDNA em
análises via BLASTn permite identificar, organizar e reclassificar bactérias em distintos
táxons (Mashavha, 2013). Com base nessas abordagens genômicas, foi proposta a ordem
Enterobacteriales, a qual compreende grandes famílias como Enterobacteriaceae e
Pectobacteriaceae, esta última englobando Pectobacterium, um dos principais agentes
causadores da podridão mole em hortaliças no mundo (Adeolu et al., 2016).
Após a identificação do gênero, oito isolados foram selecionados aleatoriamente
entre os 26 representados na rede de haplótipos. Esses isolados foram então submetidos
ao sequenciamento e à analise filogenética dos genes icdA, gapA, mdh, proA e recA
para identificação das espécies de Pectobacterium associadas à podridão mole em
hortaliças no estado de Alagoas. Os resultados demonstraram que os 17 isolados
agrupados no primeiro clado da rede de haplótipos pertencem à espécie Pectobacterium
brasiliense, sendo 16 isolados obtidos da cultura da alface e 1 de couve. Os isolados
agrupados no segundo clado foram identificados como Pectobacterium aroidearum, dos
quais seis foram associados à alface e um ao pimentão. Por fim, os dois isolados presentes
no clado três não se agruparam com nenhuma espécie conhecida do gênero
Pectobacterium, sendo então denominados de Pectobacterium sp.

26

Ao analisar os relatos de infecções causadas pelas mesmas espécies encontradas
no presente estudo, observa-se que a ocorrência de Pectobacterium brasiliense em
hortaliças folhosas é amplamente relatada em diversos países, sendo que alguns estudos
se refere a essa espécie por sua nomenclatura antiga de Pectobacterium carotovorum
subsp. brasiliense (Nabhan et al., 2012). No Havaí, cepas de P. brasiliense (PL131 e
PL133) foram identificadas em plantações de couve-folha (Brassica oleracea var.
sabellica L.) (Boluk et al., 2020). Na China, foi relatada a ocorrência de Pectobacterium
brasiliense IBSBF1692 em plantas de mostarda-folha, uma hortaliça amplamente
cultivada nas províncias do sul do país (Li et al., 2024).
Ainda na China, sintomas de podridão mole foram observados em couve-flor
chinesa (Brassica parachinensis), conhecida como Choi-Sum, sendo confirmada a
identificação de P. brasiliense em 63 isolados associados à cultura (Ding et al., 2026).
Em Trinidad, no sul do Caribe, amostras de alface apresentaram sintomas típicos de
podridão mole, como descoloração de nervuras, murchamento e odor fétido. A partir das
análises moleculares, confirmou-se a presença da Pectobacterium brasiliense associada
à cultura (Thomas; Narine; Saravanakumar, 2024).
A Pectobacterium aroidearum já foi relatada no Brasil. Associada à podridão
mole em alface (Lactuca sativa L.) e couve-chinesa (Brassica pekinensis Rupr.), em
cultivos localizados nos municípios de Juazeiro e Petrolina (Barroso et al., 2019). No
sul da Geórgia, Estados Unidos, sintomas de podridão mole foram associados à
pimentões. Confirmou-se que um dos agentes etiológicos da podridão mole nesse fruto,
era a espécie P. aroidearum (Hua; Ali; Ji, 2020). Na China, Pectobacterium aroidearum
foi associada a severos danos em mostarda- folha, um tipo de couve muito cultivado na
região Yunnan (Chu et al., 2024).
Os resultadoa aqui obtidos, contribuem para uma melhor compreensão do
patossistema da podridão mole em hortaliças no estado de Alagoas, fornecendo bases
científicas para pesquisas futuras. Essas informaçoes poderão, ainda, subsidiar o
desenvolvimento de estratégias potenciais de controle e de manejo da doença, bem como
contribuir para a mitigação dos danos causados às plantas hospedeiras.

27

6. CONCLUSÃO
•

Pectobacterium brasiliensis, Pectocbacterium aroidearum e uma espécie não
conhecida do gênero Pectobacterium são as bactérias pectinolíticas causadoras de
podridão mole em hortaliças no estado de Alagoas.

•

A bactéria pectinolítica prevalente em hortaliças no estado de alagoas é
Pectobacterium brasiliensis.

28

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