Genômica comparativa e filogeográfia em espécies do gênero Atta (Hymenoptera: Formicidae)

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE ALAGOAS
CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PROTEÇÃO DE PLANTAS

JOSEFA TATIANA DE SOUZA BARBOSA

GENÔMICA COMPARATIVA E FILOGEOGRÁFIA EM ESPÉCIES DO
GÊNERO Atta (HYMENOPTERA: FORMICIDAE)

RIO LARGO - ALAGOAS
2018

JOSEFA TATIANA DE SOUZA BARBOSA

GENÔMICA COMPARATIVA E FILOGEOGRÁFIA EM ESPÉCIES DO GÊNERO
Atta (HYMENOPTERA: FORMICIDAE)

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em
Proteção de Plantas da Universidade Federal de Alagoas UFAL, como parte dos requisitos para obtenção do título de
Doutora em Agronomia (Proteção de Plantas).

Orientador: Prof. Dr. Antônio Euzébio Goulart Santana
Coorientador: Prof. Dr. Cícero Carlos de Souza Almeida

RIO LARGO - ALAGOAS
2018

Folha de Aprovação

JOSEFA TATIANA DE SOUZA BARBOSA

GENÔMICA COMPARATIVA E FILOGEOGRÁFICA EM ESPÉCIES DO
GÊNERO Atta (HYMENOPTERA: FORMICIDAE)
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em
Proteção de Plantas do Centro de Ciências Agrárias, da
Universidade Federal de Alagoas, como requisito parcial de
avaliação para obtenção do título de Doutora em
Agronomia (Proteção de Plantas).

À Deus, minha família e meu esposo.

Dedico

Agradecimentos

Ao meu Deus por tudo que Ele tem me proporcionado e por toda força para chegar ao
fim dessa batalha e de mais uma conquista. Obrigada Deus!

A meus pais José Edson Padilha Barbosa e Maria do Socorro Vieira Barbosa por todo
amor e por acreditar em mim. As minhas irmãs Jakeline Vieira Barbosa e Priscila Vieira
Barbosa por todo carinho e incentivo e a meus sobrinhos por toda alegria e
descontração. Amo vocês!

Ao meu amado esposo Marcílio de Souza Barbosa, por todo incentivo e contribuição de
maneira essencial, pelo exemplo de profissionalismo, confiança, amizade e pelos
conselhos profissionais ou pessoais. Te amo muito!

A minha sogra Valci Francisca de Souza Santos por todo apoio e palavra de incentivo
na luta desse desafio. Muito obrigada!

À coordenação e todos os professores do Programa de Pós-Graduação em Proteção de
Plantas por todo conhecimento transmitido.

Ao orientador Prof. Dr. Antônio Euzébio Goulart Santana, pela orientação e parceria
científica.

Ao coorientador Prof. Dr. Cícero Carlos Almeida pela parceria científica e por todos os
ensinamentos e críticas na execução e elaboração deste trabalho.

A Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal do Ensino Superior pelo auxílio
financeiro na concessão de bolsa de estudos.

As amigas Márcia Daniela e Anilde Marciel, pela convivência do dia a dia, pelo carinho
e gratidão.

Aos parceiros do Laboratório de Recursos Genéticos: André Marques, Gleica Martins,
Kelly Maia, Eliane Paz, Suzyanne Morais, Lydayanne Lilás, Jaqueline Terto e todos os
demais membros.

Ao técnico em química Sivaldo Paulino do Laboratório de Solos, do Campus de
Arapiraca pela ajuda concedida.

Enfim, a todos que de forma direta ou indireta possibilitaram a realização deste
trabalho. Muito obrigada!

“O que sabemos é uma queda, o que não
sabemos é um oceano”.

Isaac Newton

RESUMO

As formigas cortadeiras do gênero Atta são amplamente distribuídas em toda a Região
Neotropical, sendo importantes pragas de culturas agrícolas e florestais. No Brasil, estão
distribuídas em todo o território nacional. A espécie Atta opaciceps Borgmeier, 1939
está especialmente distribuída pela Região Nordeste do país, abrangendo os Biomas
Caatinga e Mata Atlântica. O trabalho teve como objetivos: sequenciar quatro genomas
mitocondriais completos para as espécies A. opaciceps, A. colombica, A. texana e A.
sexdens rubropilosa e analisar a estrutura populacional de A. opaciceps utilizando
sequências do citocromo oxidase subunidade I (COI). Na montagem do genoma, os
reads para a espécie A. opaciceps foi obtido a partir do sequenciamento, já para as
outras espécies os reads foram obtidos a partir do NCBI. Para a montagem dos
genomas, os reads das quatro espécies foram mapeadas usando o genoma mitocondrial
de A. laevigata como referência e software Geneious para as análises filogenéticas. As
análises para os espaços intergênicos mostraram que em Atta são maiores do que fora do
grupo, concluindo que os mitogenomas de Atta são caracterizados por uma alta
conservação na ordem e organização dos genes. Para abordagem filogeográfica baseada
no gene mitocondrial COI foram amostrados 11 pontos de coleta para a espécie A.
opaciceps distribuídos na Região Nordeste com abrangência de dois Biomas (Caatinga e
Mata Atlântica). Também foi estimado o agrupamento filogeográfico usando análise
bayesiana e modelagem de nichos climáticos identificando assim, cinco haplótipos
distribuídos ao longo de toda a região geográfica. Revelando que os Biomas Caatinga e
Mata Atlântica não influenciaram na modelagem das populações de A. opaciceps, e
sugere que a espécie possui uma ampla capacidade de dispersão e adaptação aos
distintos Biomas.

Palavras-chave: Attini. DNA mitocondrial. Genética de populações.

ABSTRACT

Leaf-cutting ants of the genus Atta are widely distributed throughout the Neotropical
Region, being important pests of agricultural and forest crops. In Brazil, they are
distributed throughout the national territory. The species Atta opaciceps Borgmeier,
1939 is especially distributed in the Northeast of the country, covering the Caatinga and
Atlantic Forest Biomes. The objective of this work was to sequence four complete
mitochondrial genomes for the species A. opaciceps, A. colombica, A. texana and A.
sexdens rubropilosa and to analyze the population structure of A. opaciceps using
cytochrome oxidase I subunit (COI) sequences. In the assemblage of the genome, the
reads for the species A. opaciceps were obtained from the sequencing, whereas for the
other species the reads were obtained from the NCBI. For the assembly of the genomes,
the reads of the four species were mapped using the mitochondrial genome of A.
laevigata as reference and Geneious software for the phylogenetic analyzes. The
analyzes for the intergenic spaces showed that in Atta they are larger than outside the
group, concluding that Atta mitogenomas are characterized by a high conservation in
the order and organization of the genes. For a phylogeographic approach based on the
mitochondrial COI gene, 11 collection points were sampled for the A. opaciceps species
distributed in the Northeast Region with two Biomes (Caatinga and Mata Atlântica). It
was also estimated the phylogeographic grouping using Bayesian analysis and modeling
of climatic niches thus identifying five haplotypes distributed throughout the geographic
region. Revealing that the Caatinga and Atlantic Forest Biomes did not influence the
modeling of the populations of A. opaciceps, and suggests that the species has a wide
dispersion and adaptation capacity to the different Biomes.

Keywords: Attini. Mitochondrial DNA. Genetics of populations.

Lista de Figuras

Revisão de Literatura
Figura 1. Cladograma baseado em mtDNA e nDNA mostrando que as formigas pertencentes ao 17
gênero Atta estão distribuídas em quatro subgêneros, de acordo com estudo de Bacci et
al. (2009)................................................................................................................................

Capítulo I
Figure 1. Complete gene map of A. opaciceps mitogenome. Genes of the circle are transcribed in
the clockwise and counterclockwise directions, respectively. The protein-coding genes
(green), rRNA (red) and tRNA (purple). The green ring represents the A+T contents and
the blue ring shows C+G contents…………………………………………………….…… 39
Figure 2. Genome size of the complete mitogenomes for Atta genus and outgroup. (A) Distribution
of the genic and intergenic spacers. (B) Virtual gel showing the distribution of the
intergenic spacers…………………………………………………….…………………….

Figure 3. Organization of the Atta mitogenomes compared with outgroups. All coding regions
displayed in the same order and direction………………………………………………….

Figure 4. Phylogenetic analysis using maximum likelihood, which the phylogenetic relationships
are represented by complete mitogenomes (A) and coding regions (B)…………………...

Figure 5. Principal component analysis (PCA) for five species of the Atta genus and three species
as outgroups. (A) PCA using the complete mitogenomes and (B) PCA using the coding
regions (Genes + tRNA + rRNA). The colors denote values at first two principal
component (PC) axes............................................................................................................. 43

Capítulo II
Figura 1. Mapa do Brasil e detalhe da Região Nordeste com a distribuição geográfica das
populações e distribuição dos haplótipos para as espécies de Atta. Cada local de coleta é
representado por um ponto. As cores no mapa correspondem os haplótipos, conforme a
legenda................................................................................................................................... 52

Figura 2. Análise filogenética para os haplótipos. As relações filogenéticas usando a abordagem
bayesiana. Esta análise mostra o tempo de divergência entre os haplótipos em milhões de
anos (Ma)............................................................................................................................... 53

Figura 3. Análise de cluster construída usando a abordagem Bayesiana para o agrupamento
filogeográfico. As cores representam os clusters. Cores de fundo ou sombreadas
indicaram incerteza quanto aos respectivos clusters. Os pontos indicam os locais de
amostragem............................................................................................................................ 54
Figura 4. Distribuição geográfica para áreas preditas climaticamente para a ocorrência de A.
opaciceps utilizando variáveis bioclimáticas atuais e do passado. Para o presente (agora,
0 anos BP), Last Glacial Maximum (LGM, 21,000 anos BP) e Last Interglacial (LIG,
120,000-140,000 anos BP). As cores quentes (vermelho/amarelo) representam áreas com
alta probabilidade de ocorrência de A. opaciceps.................................................................

Lista de Tabelas

Capítulo I
Table 1. Mitochondrial genome of the genus Atta and other species of the subfamily Myrmicinae
utilized as the outgroup. The genome sizes in base pairs (bp) for the genome and the coding
and noncoding regions. The genome annotation for tRNA (transport RNA), rRNA
(ribosomal RNA), and protein-coding gene (genes) and the NCBI code for the
genomes………………………………..................................................................................... 44

Capítulo II
Tabela 1. Detalhe dos locais de coleta de Atta opaciceps na região Nordeste do Brasil, indicando as
coordenadas georeferênciadas e o grupo dos haplótipos..........................................................

Tabela 2. Análise de estruturação de populações utilizando SAMOVA (Spatial Analyses of
Molecular Variance).................................................................................................................. 54

SUMÁRIO

1 Introdução Geral..............................................................................................................................

2 Revisão de Literatura....................................................................................................................... 15
2.1 Formigas cortadeiras................................................................................................................

2.1.1 Importância econômica ...................................................................................................

2.1.2 Estudos moleculares em formigas.................................................................................

2.2 Mitogenoma.............................................................................................................................. 19
2.3 Filogeografia............................................................................................................................. 20
Referências.........................................................................................................................................

3 Capítulo I: Mitochondrial genomes of genus Atta (formicidae: myrmicinae) revealed high
conservation of genes organization and giant intergenic spacers…………………………………...

3.2 Material and Methods..............................................................................................................

3.2.1 Biological sample, DNA isolation and High throughput DNA sequencing…………….

3.2.2 Mitochondrial genome assembly and annotation……………………………………….

3.2.3 Genome comparison and phylogenetic analyses………………………………………..

3.3 Results......................................................................................................................................

3.3.1 Genome assembly and mitogenome organization………………………………………

3.3.2 Comparison among mitogenomes in the subfamily Myrmicinae………………………. 32
3.4 Discussion……………………………………………………………………………………. 33
Acknowledgements............................................................................................................................. 34
References........................................................................................................................................... 35
4 Capítulo II: Filogeografia de Atta opaciceps Borgmeier, 1939 (Myrmicinae: Attini) revela
ampla dispersão na Caatinga e Mata Atlântica................................................................................... 43
Resumo......... .....................................................................................................................................

Abstract............................................................................................................................................... 45
4.1 Introdução................................................................................................................................. 46
4.2 Material e Métodos................................................................................................................... 47
4.2.1 Amostragem e extração de DNA......................................................................................

4.2.2 Amplificação e sequenciamento.......................................................................................

4.2.3 Análise de haplótipos........................................................................................................ 48

4.2.4 Estruturação de populações..............................................................................................

4.2.5 Modelagem de nicho ecológico........................................................................................

4.3 Resultados................................................................................................................................. 50
4.3.1 Distribuição e análise de haplótipos.................................................................................

4.3.2 Estruturação de populações..............................................................................................

4.3.3 Modelagem de nicho ecológico........................................................................................

4.4 Discussão.................................................................................................................................. 51
Agradecimentos..................................................................................................................................

Referências.........................................................................................................................................

1 Introdução Geral
Formigas

cortadeiras

são

insetos

sociais

altamente

especializados,

principalmente na divisão de trabalho e no cultivo do fungo simbionte. Pertencem à
família Formicidae, sendo que, os gêneros de maior importância são Atta e
Acromyrmex, os quais apresentam características relevantes e complexa organização
social. A predominância das formigas nos ecossistemas terrestres, tanto pela sua
constância, abundância e riqueza de espécies (HÖLLDOBLER; WILSON, 1990),
representa uma oportunidade para compreender as bases moleculares e como todos os
aspectos da estrutura genômica, expressão gênica, fisiologia e comportamento do
organismo são influenciados (ROBINSON, 2002).
Para alguns insetos foi determinada a sequência completa do genoma
mitocondrial, o que tem permitido desenvolver importantes estudos moleculares,
ecológicos e evolutivos (WANG et al., 2007). No entanto, a maioria dos estudos
evolutivos e populacionais tem sido obtida por meio de sequência de genes
mitocondriais, permitindo ampliar o conhecimento sobre os relacionamentos entre os
taxa (AVISE, 2009).
As formigas foram um grupo promissor para a aplicação desta estratégia de
sequenciamento do genoma mitocondrial, fornecendo dados básicos para compreensão
dos rearranjos mitocondriais ocorridos durante a evolução. O entendimento das bases
moleculares de espécies de Atta tem desempenhado um papel importante nos estudos de
evolução molecular compreendendo como as taxas e os padrões de substituição variam
em todas as sequências e ao longo do tempo (SIMON et al., 2006). De fato, o DNA
mitocondrial (mtDNA) tem sido amplamente utilizado em estudos populacionais,
evolutivos e filogenéticos, devido características marcantes que possui como herança
exclusivamente maternal, que impede a recombinação, além de alta taxa evolutiva e
polimorfismos intraespecíficos, tornando assim uma molécula eficaz em estudos de
filogeografia entre populações de uma espécie ou espécies próximas tornando-o
promissor como marcador molecular (DOWTON et al., 2009).
Dentro das estimativas de diversidade genética e demográficas presentes entre as
diversas populações, os genes têm grande influência nos processos biológicos e as
variações fenotípicas que ocorrem dentro e entre as espécies é resultado das diferenças
genéticas entre indivíduos e populações. A filogeografia busca identificar e
compreender os processos responsáveis pela distribuição geográfica de linhagens
genealógicas, que permitiram a diversificação. A utilização de marcadores moleculares

tem sido empregada para quantificar a diversidade e reconstruir padrões de dispersão
nas diversas populações (GOODISMAN; KOVACS; HUNT, 2008).
A distribuição genética das espécies que resulta no isolamento das populações
pode ser compreendida por meio de técnicas moleculares, analisando diferentes regiões
do genoma. Essas regiões contêm informações sobre os fatores evolutivos que são
responsáveis pela variação genética dentro da espécie. O entendimento e análise do
mtDNA contribui para entender como os eventos históricos contribuíram para o
processo de dispersão dos genes dentro das espécies e assim possibilita compreender a
história evolutiva e os processos de distribuição geográfica das espécies.
Sendo assim, os principais objetivos deste estudo foram: Sequenciar os genomas
mitocondriais de A. opaciceps, A. colombica, A. texana, A. sexdens rubropilosa e
analisar a ordem, organização filogenômica e genética; e Analisar a filogeográfia de
Atta opaciceps Borgmeier, 1939 pertencente a ordem Hymenoptera, família Formicidae
a fim de compreender a estrutura populacional e padrões demográficos da espécie.

2 Revisão de Literatura
2.1 Formigas cortadeiras
O Brasil detém a maior diversidade de formigas das Américas e uma das
maiores do mundo, sendo a diversidade mirmecológica brasileira representativa da
região Neotropical (BACCARO et al., 2015). As formigas estão situadas dentro do
Reino Animal, Filo Arthropoda, Classe Insecta, Ordem Hymenoptera, Família
Formicidae, Subfamília Myrmicinae e Tribo Attini. São consideradas formigas
cortadeiras todas as espécies do genêro Atta (saúva) e Acromyrmex (quenquém)
(DELLA-LUCIA et al., 2011).
São encontradas nos mais diversos biomas, destacando-se por sua grande
herbivoria e distribuição pelo Novo Mundo. Os gêneros Atta e Acromyrmex são os
herbívoros dominantes da região Neotropical. As saúvas ocorrem apenas nas Américas
e sua dispersão compreende o sul dos Estados Unidos ao norte da Argentina
(HÖLLDOBLER; WILSON, 1990). As quenquéns têm sua área de dispersão desde a
Califórnia até a Patagônia, com exceção do Chile e das ilhas de Cuba, Trinidad e
Tobago (MICHELS et al., 2001). Essa distribuição geográfica e a frequência de
espécies da tribo Attini estão ligadas a fatores como condições ambientais, vegetação,
tipo de solo, índices pluviométricos e do processo histórico anterior da área.
No Brasil, as espécies de maior frequência para o gênero Atta são A.
bisphaerica Forel, 1908, A. capiguara Gonçalves, 1944, A. cephalotes Lineu, 1758, A.
goiana Gonçalves, 1942, A. laevigata F. Smith, 1858, A. opaciceps Borgmeier, 1939, A.
robusta Borgmeier, 1939, A. sexdens piriventris Santschi, 1919, A. sexdens rubropilosa
Forel, 1908, A. sexdens sexdens Lineu, 1758, A. silvai Gonçalves, 1982, A.
vollenweideri Forel, 1939 (DELLA-LUCIA et al., 2011).
Dentro da diversidade biológica, as formigas (Formicidae) se destacam
sendo conhecidas atualmente 13.000 espécies de formigas, porém tal número pode
representar apenas metade das espécies de Formicidae (BOLTON, 2014). Estudos
estimam que as formigas tenham surgido ainda no Cretáceo à cerca de 100 milhões de
anos e desde então desenvolveram uma notável gama de comportamentos sociais,
hábitos de forrageamento e associações com outros organismos (WARD et al. 2014;
HOLLDOBLER; WILSON 1990).
Entre os formicidae, a tribo Attini se destaca por possuírem formigas
cortadeiras e representarem um grupo ecologicamente dominante em ecossistemas

terrestres mantendo uma associação obrigatória com fungos. Nessa interação, as
formigas fornecem proteção e substrato vegetal para o desenvolvimento do fungo
simbionte. Os gêneros mais basais ou primitivos são conhecidos como Attini inferiores,
que cultivam o fungo usando como substrato matéria morta como carcaça de insetos e
restos de vegetais, enquanto os gêneros derivados Acromyrmex e Atta, conhecidos como
Attini superiores, cultivam o fungo usando como substrato, material vegetal fresco. A
tribo Attini compreende 16 gêneros com aproximadamente 256 espécies de formigas
descritas (SOSA-CALVO et al., 2013).
Os membros da tribo Attini são cultivadores de fungos da família
Agaricaceae e Pterulaceae (Basidiomycota: Agaricales), que lhe serve como principal
suplemento alimentar (REYNOLDS; CURRIE, 2004). Elas fornecem folhas frescas e
flores como substratos de suporte ao crescimento do cultivo e promovem o crescimento
de seu fungo simbionte por meio da poda e do movimento de enzimas no jardim
(BASS; CHERRET, 1996). O jardim de fungo de formigas da tribo Attini é considerado
uma comunidade microbiana, pois diversos microrganismos podem ser encontrados
neste ambiente particular, além do fungo simbionte Leucoagaricus gongylophorus
(Möller) Singer (Basidiomycota: Agaricales) (RODRIGUES et al., 2008).
Segundo Bacci et al. (2009), após realizar estudos envolvendo genes
mitocondriais e nucleares sugeriram que as formigas pertencentes ao gênero Atta estão
distribuídas em quatro subgêneros (Atta, Epiatta, Neoatta e Archeatta) e que as espécies
relacionadas estão distribuídas em subgêneros, indo do mais basal ao mais recente ou
derivado (Figura 1). Algumas dessas espécies são restritas a algumas regiões, podendo
assim dizer que ocorrem uma relação biogeográfica, enquanto outras têm uma
distribuição mais abrangente como A. laevigata, A. sexdens e A. cephalotes que ocorrem
em várias regiões do país como a região Sudeste e principalmente por atingirem grandes
extensões da América do Sul (DELLA-LUCIA et al., 2011; WEBER, 1972).

Figura 1. Cladograma baseado em mtDNA e nDNA mostrando que as formigas pertencentes ao gênero
Atta estão distribuídas em quatro subgêneros, de acordo com estudo de Bacci et al. (2009).

2.1.1 Importância econômica

As formigas do gênero Atta são consideradas pragas na agricultura em diversas
regiões do Brasil e das Américas pelo hábito de cortarem folhas causando grandes
perdas a diversas culturas com prejuízo econômico elevado, chegando a milhões de
dólares por ano (BOARETTO; FORTI, 1997). Contudo, apesar dos prejuízos causados
possuem importância em diversos ecossistemas como a participação no fluxo de energia
e nutrientes, participando da aeração do solo, polinização e dispersão de sementes.
Participam de processos como a simbiose com plantas, artrópodes, fungos e outros
microrganismos se destacando pela evolução do comportamento que surgiu na história

evolutiva, que foi a agricultura desenvolvendo assim uma intrínseca relação de
mutualismo formiga-fungo (MUELLER et al., 2005; SCHULTZ; BRADY, 2008). A
alta densidade populacional e diversidade de espécies fazem desses himenópteros
componentes fundamentais na caracterização e manutenção da estrutura das
comunidades e na ciclagem da matéria tornando-as úteis como indicadores ambientais e
ecológicos (HOLLDOBLER; WILSON, 1990)
Embora as formigas cortadeiras cortem inúmeras espécies vegetais, algumas
plantas são resistentes ao seu ataque. Estudos tem mostrado um alto grau de nãopreferência de formigas cortadeiras por algumas espécies de plantas que são tóxicas, às
formigas ou a seu fungo. Essas espécies de plantas podem ser agregadas aos plantios
como forma de proteção as plantas cultivadas (RODRIGUES et al., 2008). Também tem
ocorrido o uso de plantas-armadilhas para a proteção de outras plantas que consiste em
plantas que possuem certas substâncias com propriedades atraentes a insetos que podem
ser consorciadas com o intuito de concentrar as pragas em uma determinada área para
sua posterior destruição (SILVA; SILVIE et al., 2006).
Assim as informações básicas para que métodos de controle se tornem eficientes
possibilitará identificar o indivíduo dentro da taxonomia, tornando premissa básica para
que outras linhas dentro da entomologia possam contribuir de forma direta para a
resolução de problemas no manejo de pragas.

2.1.2 Estudos moleculares em formigas
Apesar da importância ecológica a distribuição geográfica de diversas espécies
nos mais variados ambientes é resultado das mudanças climáticas. Estudos de estrutura
genética em populações de insetos sociais tem sido realizados com o uso do DNA
mitocondrial (mtDNA) mostrando a eficiência como marcador molecular e tornando
possível o entendimento das consequências ecológicas e evolutivas destas mudanças
nos estudos das relações filogenéticas intraespecífica (SCHULTZ; BRADY, 2008;
BACCI et al., 2009). Esses insetos formam colônias com estrutura familiar que habitam
ninhos distribuídos de maneira desigual em todo o meio ambiente. Dependendo dos
sistemas sociais e reprodutores específicos, pode existir uma rede hierárquica complexa
de afinidades geográficas dentro e entre ninhos (ROSS; CARPENTER 1991;
CROZIER; PAMILO 1996). Os insetos sociais fornecem exemplos de como as
mudanças no comportamento social podem alterar padrões locais do fluxo de genes.
Assim, o conhecimento da estrutura genética em insetos sociais pode esclarecer vários

processos que são fundamentais como a de que a diferenciação social é responsável por
promover a diferenciação genética.

2.2 Mitogenoma

Estruturalmente, o mtDNA de insetos é uma pequena molécula de DNA com 15
a 20 kb de fita dupla e com estrutura circular, que normalmente possui 13 genes
codificadores de subunidades de enzimas envolvidas na cadeia transportadora de
elétrons ou síntese de ATP, dois genes de RNA ribossomal e 22 genes de RNA
transportador, totalizando 37 genes, alguns pequenos espaçadores intergênicos (IGS)
além de uma região rica em A+T (Origem de replicação) (MEYER, 1994). Os genes
presentes no mtDNA estão associados basicamente ao desempenho das funções das
mitocôndrias em produzir energia. Além de exercer outras importantes funções na
apoptose e envelhecimento celular, o que significa que as mitocôndrias estão envolvidas
em muitas doenças degenerativas (CAMERON, 2014).
O mitogenoma ou genoma mitocondrial (mtDNA) consiste em uma molécula de
DNA utilizada em estudos moleculares e biologia evolutiva. O conhecimento e
obtenção das sequências possibilita o entendimento de sequências de DNA para muitos
grupos de animais para o qual nenhuma informação anteriormente existia (MEYER,
1994). Variações genéticas entre populações podem ser detectadas a nível molecular
através de mudanças diretas na estrutura do DNA, ou indiretamente nas proteínas
codificadas por genes específicos. Logo, o mtDNA é uma molécula de dupla fita
circular e única que não sofre recombinação e são de herança unicamente materna, ao
contrário do genoma nuclear que possui herança biparental (MEYER, 1994).
Devido ao uso extensivo de genes individuais em uma ampla gama de estudos,
o genoma mitocondrial teve grande impacto na genética entomológica. As regiões mais
comumente sequenciadas em sistemática de insetos são os genes Citocromo oxidase I
(COI), Citocromo oxidase II (COII), 16 rDNA e o 12 rDNA. O DNA mitocondrial tem
sido amplamente utilizado para investigar a estrutura da população em estudos
evolutivos e filogeográficos nos vários níveis taxonômicos, validando sua utilidade
como marcador molecular para a sistemática. A popularidade dos marcadores de
mtDNA deriva em grande parte da sua relativa facilidade de isolamento e amplificação,

mesmo de amostras pouco preservadas (CATERINO; CHO; SPERLING, 2000; BACCI
et al., 2009).
Estudos comparativos realizados com mitocôndrias de insetos levou à
identificação das diferenças na organização do mtDNA. Indicando que, embora o
mtDNA de insetos tenha conteúdo de GC diferente, os conteúdos de genes são muito
semelhantes em várias ordens de insetos e essas diferenças significativas no conteúdo de
GC podem sugerir múltiplos ancestrais mitocondriais, apesar de manter o conteúdo
genômico similar. A semelhança cromossômica na ordem dos genes e sua orientação
entre as espécies, sugerem diferenças na transcrição e na regulação de genes
(CHANDRA; VIK; KAPATRAL, 2006).
No sequenciamento do genoma mitocondrial de algumas espécies é possível
encontrar regiões não codificante ou de controle. Essas regiões são compostas por uma
grande região de repetição em tandem, que possui um padrão que muitas vezes não é
observado e, durante a replicação é provável que novos padrões de repetições possam
surgir. A reconstrução filogenética baseada em genomas mitocondriais é importante
para iniciar a montagem de sequências do genoma. Contribuindo para a compreensão
das relações filogenéticas e história evolutiva de muitos grupos de organismos. As
formigas são um grupo de grande relevância para a aplicação de técnicas que envolvem
o sequenciamento do genoma mitocondrial fornecendo dados básicos para estudos que
investigam a história da população, sistemática molecular e filogeografia e também
contribuem para uma melhor compreensão dos rearranjos mitocondriais ocorridos
durante a evolução (LI et al., 2016; RODOVALHO et al., 2014).

2.3 Filogeografia
Estudos filogeográficos tem utilizado a região do citocromo oxidase da
subunidade 1 (CO1) como uma região padronizada a diversos estudos de dispersão. Isto
tem permitido conhecer a estruturação da população resultante de mudanças climáticas
que podem ter ocorrido entre as espécies, além de contribuir para uma compreensão
mais clara dos padrões de distribuição de espécies resultantes de sucessivos ciclos
climáticos durante o Pleistoceno (MAIA et al., 2016). A estruturação de indivíduos
associado ao ambiente geográfico é determinado pelo movimento ou pelos padrões de
dispersão a grandes distâncias. Nas populações é possível detectar as variações
genéticas que ocorrem entre os indivíduos por meio de mudanças diretas na estrutura do

DNA, ou indiretamente nas proteínas codificadas por genes específicos (LABBE;
LENORMAND; RAYMOND, 2005).
A adaptação ocorre por substituição de genes em um ou vários loci, podendo
vários alelos se agregar simultaneamente em um único locus. A distribuição geográfica
pode ocorrer pela presença de um gene de resistência que prevalece devido a melhor
adaptação e se espalha localmente apenas em algumas condições do ambiente ou
globalmente em todas as áreas (LABBE et al., 2005). Isto afeta a estruturação
filogeográfica devido a fatores que ocorreram dentro do habitat e que causaram a
desfragmentação do meio. O padrão filogeográfico entre os haplótipos podem ser
causados pelo fluxo de genes que são restritos ao isolamento ou pela a distância
estreitamente relacionada e detectada com mais frequência na mesma área do que os
relacionados remotamente (LIU et al., 2012).
A filogeografia usa informações geográficas para compreender os processos
demográficos que moldaram a evolução das populações e das espécies por meio de
processos que regem as distribuições geográficas das linhagens genéticas, especialmente
aquelas dentro e entre as espécies estreitamente relacionadas (AVISE, 2001).
Atualmente, os métodos filogeográficos necessitam fornecer um sólido quadro
estatístico para inferência de muitas metodologias existentes que proporcionem
resultados estatisticamente confiáveis.
A distribuição da população pode ser explicada por um conjunto de migrações,
formando clusters populacionais geograficamente estáveis com taxas iguais de migração
e sem migração posterior, além de permitir a inclusão de covariáveis como as
informações fenotípicas ou climáticas (MANOPOULOU et al., 2011).

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3 Capítulo I1
Mitochondrial genomes of genus Atta (Formicidae: Myrmicinae) reveal high gene
organization and giant intergenic spacers

Josefa T. V. Barbosa2, Marcílio S. Barbosa1, Antônio E. G. Santana2, Cicero Almeida1

Laboratory of Genetics Resources, Campus Arapiraca, Universidade Federal de

Alagoas, Brazil;
2

Centro de Ciências Agrárias, Universidade Federal de Alagoas.

Short running title: Mitochondrial genomes of Atta
Corresponding author:
Cícero Almeida
Campus de Arapiraca
Universidade Federal de Alagoas
Avenida Manoel Severino Barbosa s/n, Rodovia AL 115, km 6,5. Bairro Bom Sucesso
Arapiraca, AL, Brazil
Phone number: 55 823482-1831
E-mail: cicerocarlos@pesquisador.cnpq.br
1Capítulo I está escrito de acordo com as normas de submissão do periódico Genetics and Molecular Biology. A

submissão foi realizada no dia 03/04/2018.

Abstract
The ants of the genus Atta are considered an important pest to agriculture in Latin
América, although, Atta species are important contributors to ecosystem functions in the
various habitats in which they occur. Next-generation sequencing product millions or
billions of short reads, however, is necessary to applied methods for assembly of the
genomes. The aim of this study was to assembly four complete mitochondrial genomes
of the genus Atta, construct the phylogenomic tree and analyze the gene content, order
and organization. The mitogenomes of A. colombica, A. opaciceps, A. texana, and A.
sexdens rubropilosa contained 18,392; 19,257; 19,709 and 17,061 bp, respectively. For
A. opaciceps, A. colombica and A. texana, the mitogenomes showed a typical genome
for an insect, which showed 13 protein-coding genes, 21–22 tRNA, and 2 rRNA, which
the genes displayed in the same order. Analysis for intergenic spacer regions showed
that Atta intergenic spacers are larger than those of the outgroups. The phylogenomic
analyses showed similar topologies with previous phylogenetic analyses using partial
genes cytochrome oxidase I, of which sowed high clade support values. We conclude
that Atta mitogenomes are characterized by high conservation in gene order and have
giant intergenic spacers in the genus Atta.
Keywords: ants, evolution, mitogenomes

3.1 Introduction
The ants of the genus Atta are leafcutters belonging to the tribe Attini
(Hymenoptera: Formicidae: Myrmicinae) and are considered an important pest to
agriculture in Latin America, although Atta species are important contributors to
ecosystem functions in the various habitats in which they occur. The species widespread
in Brazil are A. bisphaerica Forel, 1908, A. capiguara Gonçalves, 1944, A. cephalotes
Lineu, 1758, A. goiana Gonçalves, 1942, A. laevigata F. Smith, 1858, A. opaciceps
Borgmeier, 1939, A. robusta Borgmeier, 1939, A. sexdens piriventris Santschi, 1919, A.
sexdens rubropilosa Forel, 1908, A. sexdens sexdens Lineu, 1758, A. silvai Gonçalves,
1982 and A. vollenweideri Forel, 1939.
Phylogenetic analyses have used partial genes cytochrome oxidase I, tRNA
leucine, and cytochrome oxidase II and revealed four clades: (1) A. texana, A. mexicana,
and A. insularis in the Archeatta clade; (2) A. colombica and A. cephalotes in the Atta s.
str. clade; (3) A. opaciceps, A. laevigata, A. capiguara, A. bisphaerica, A. vollenweideri
Forel 1939 and A. saltensis in the Epiatta clade and (4) A. sexdens and A. robusta in the
Neoatta clade (Bacci et al., 2009). These phylogenetics relationships showed some clade
with low branches supports and the phylogenetic analysis using the complete
mitogenomes provides robust inferences. Additionally, the complete mitogenomes
allowing to analyze the rearranges as deletion, duplication and inversion among
mitogenomes. However, the complete mitogenomes for the genus Atta have been
described only for A. laevigata (Rodovalho et al., 2014) and A. cephalotes (Suen et al.,
2011). For other species of the subfamily Myrmicinae, the mitogenomes are available
for Pristomyrmex punctatus (Hasegawa et al., 2011), three species of Solenopsis
(Gotzek et al., 2010), Vollenhovia emeryi (Liu et al., 2016), Wasmannia auropunctata
(Duan et al., 2016) and Myrmica scabrinodis (Babbuci et al., 2014).

In this study, four complete mitochondrial genomes of the genus Atta were
assembled. The mitogenomes were utilized for phylogenomic analyses, gene content
and order for exploring the evolution of this genus Atta. For development of the
mitogenomes the reads of A. opaciceps were sequenced and the reads of A. colombica,
A. texana and A. sexdens rubropilosa were downloaded from NCBI and utilized to
assemble the complete mitogenomes.

3.2 Materials and Methods
3.2.1 Biological sample, DNA isolation, and high-throughput DNA sequencing
For A. opaciceps, the biological sample was collected in the state of Alagoas,
Brazil, and DNA extraction was performed using the cetyltrimethylammonium bromide
(CTAB) extraction method (Doyle and Doyle, 1987). The quality and quantity of the
extracted

DNA

were

verified

visualization

agarose

gel

and

spectrophotometer, respectively. The DNA sample was fragmented by sonication into
500–600 bp to construct the sequencing library, and the fragments were ligated with
adapters using the “Nextera DNA Sample Preparation” (Illumina) kit and sequencing
the paired-end reads with a size of 100 nt based on the Illumina HiSeq2500 platform.
Sequencing was performed at the Central Laboratory for High Performance
Technologies in Life Sciences (LacTad - Laboratório Central de Tecnologias de Alto
Desempenho em Ciências da Vida) at the State University of Campinas - UNICAMP,
São Paulo.
For A. colombica (SRR3187022 and SRR3168931), A. texana (SRR5438011),
and A. sexdens rubropilosa (SRR5651498), the short reads were obtained from public
data from the NCBI, for which the SRA files were unpacked into FASTQ using the
FASTQ-DUMP executable from the SRA Toolkit. The FASTQ files were then filtered

with a minimum quality of 10 and converted into FASTA files and utilized for genome
assembly. Were utilized 30 million reads of A. colombica, 24 million reads of A.
opaciceps, 3.3 million reads of A. texana and 4.2 million reads for A sexdens
rubropilosa.

3.2.2 Mitochondrial genome assembly and annotation
To obtain the mitochondrial genome of the four species, the reads were mapped
using the mitochondrial genome of A. laevigata as the reference, using the software
Geneious R9 (http://www.geneious.com). The draft mitogenomes were checked using
contigs de novo assembling generated by Ray software (Boisvert et al. 2012), performed
using parameter kmer 31 and the largest contig was analyzed using BLAST for
mitochondrial identification. The genome annotation was achieved using the MITOS
(Bernt et al., 2013) and conferred with Geneious software using the mitochondrial
genome of A. laevigata as the reference. The annotations were checked and, where
necessary, were manually corrected. A graphic representation of the mitochondrial
genome of A. opaciceps was created using Geneious.

3.2.3 Genome comparison and phylogenetic analyses
Six mitochondrial genomes for the genus Atta and the other three genomes from
Myrmicinae subfamily were utilized for phylogenetic inferences (Table 1). The mitogenomes
for A. cephalotes, A. laevigata, M. scabrinodis, P. punctatus, and S. richteri were obtained from
the NCBI and the mitogenomes of the A. colombica, A. opaciceps, A. texana and A sexdens

rubropilosa were assembled in this study. The mitogenome sequences were aligned using
the program MAFFT v7.017 (Katoh and Standley, 2013) implemented as the “Multiple align”
tool in Geneious R9, and the evolutionary history was inferred using the maximum likelihood
(ML) method based on the GTR+I+G nucleotide substitution model (Nei and Kumar, 2000),

and branch support was assessed with 1,000 bootstrap replicates. The nucleotide substitution
model and ML analysis were conducted in MEGA7 (Kumar et al., 2016). The genetic
relationships among species were also investigated through a principal component analysis
(PCA) using the function glPca in R package adegenet (Jombart and Ahmed, 2011).

3.3 Results
3.3.1 Genome assembly and mitogenome organization
The mitogenomes of A. colombica, A. opaciceps, A. texana, and A.
sexdens rubropilosa contained 18,392, 19,257, 19,709, and 17,061 bp, respectively
(Table 1). For A. opaciceps, A. colombica, and A. texana, the mitogenomes showed a
typical genome for an insect, which showed 13 protein-coding genes, 21–22 tRNA, and
2 rRNA as well as the noncoding region (Figure 1 and Table 1), of which the genes
displayed in the same order and orientation as present in the hypothesized ancestral
mitogenome (Figure S1). For A. sexdens rubropilosa, a deletion of the six tRNAs and
the NAD2 gene was observed (Table 1 and Figure S1).
The A + T contents of the mitogenomes were high, displaying an A + T content
ranging from 72.7% (A. sexdens rubropilosa) to 82.5% (A. texana). For the coding
region, the lowest A + T content was in COXI, COX3, and ATP6, whereas the highest
A + T content was between ND5 and ND3. The A + T contents between the coding and
noncoding regions were diferent, for which the coding regions displayed an A + T
content ranging from 77.6% (A. cephalotes) to 78.5% (A. texana), whereas the
noncoding regions showed an A + T content ranging from 84.1% (A. sexdens
rubropilosa) to 90.3% (A. texana).
The size of the whole non-coding (intergenic spacers) regions showed that Atta
species have large intergenic spaces when compared with the outgroup (Figure 2A),
wherein the genus Atta displayed spacers ranging from 3,655 to 4,880 bp, whereas the

outgroup showed spacers ranging from 738 to 1,550 bp (Table 1). The large intergenic
spacers in genus Atta are distributed in all intergenic spacers (Figure 1B). For the
coding region, the sequences displayed similar length in Atta and the outgroup (Table
1).

3.3.2 Comparison among mitogenomes
The mitogenome arrangement for the genus Atta was identical, wherein the
protein-coding genes and the rRNA displayed the same order and orientation. For
tRNA, additional tRNA was observed between ATP4 and COX2 in A. cephalotes, but it
was not detected between ND4 and ND5 in A. colombica (Figure S1). Remarkably, A.
sexdens rubropilosa displayed a deletion of six tRNAs + NAD2 (Figure S1).
The phylogenetic analysis showed A. texana as the basal clade, whereas other
species as the derived clade (Figure 3). The topologies obtained with the complete
mitogenome (Figure 3A) and the coding regions (Figure 3B) showed no differences. In
both phylogenetic analyses, the branch-support values were high, with a bootstrap value
of >96% for Atta clades. The results of PCA for the complete genomes and the coding
regions were different, wherein PCA using the complete genomes show clear support
for species delimitation in Atta (Figure S2A), whereas using only the coding regions, A.
colombica and A. cephalotes species displayed in one group and A. laevigata and A.
opaciceps also showed one group (Figure S2B). In the PCA for the complete genome,
the first principal component separated A. laevigata, A. opaciceps, and A. sexdens
rubropilosa from the other species, and the second principal component separated A.
colombica and A. cephalotes from A. texana.

3.4 Discussion
The nucleotide compositions in all analyzed Atta mitogenomes are characterized
by a high frequency of A + T. The same result was reported previously for A. laevigata
by Rodovalho et al. (2014) and the gene order and orientation are the same in all Atta
mitogenomes as in the ancestral insect mitochondrial genome (Cameron et al., 2014).
However, it was observed that Atta mitogenomes are larger than the other outgroup
mitogenomes, suggesting a phylogenetic signal. The size variation is influenced by
expansions in intergenic spaces, which was detected by the larger intergenic spacers in
Atta mitogenomes, and the expansions in the intergenic spaces do not affect the gene
functions and thus can be considered selectively neutral. The intergenic spaces from
other insect mitogenomes have been reported to range from 216 bp in Naupactus
xanthographus (Song et al., 2010) to 5,654 bp in Protaetia brevitarsis (Kim et al.,
2014), suggesting that Atta mitogenomes are characterized by larger intergenic spacers.
Mitogenomes have had an impact on insect genetics, due to which genes have
been utilized for phylogenetic studies. Regarding the genus Atta, Bacci et al. (2009)
utilized partial mitochondrial genes (COI, tRNA leucine, and COII) for phylogenetic
analysis; however, the advent of next-generation sequencing technologies has resulted
in the complete sequencing of mitogenomes, allowing obtaining the robust phylogenetic
analysis using the complete mitogenomes. This approach allows a phylogenetic
reconstruction using complete mitogenomes and only coding regions or noncoding
regions (intergenic spaces). In the present study, two phylogenetic analyses were
conducted, using the complete genomes and only the coding regions. The result showed
that phylogenetic analysis using the complete mitogenomes was more informative in
both ML and PCA analyses than that using the coding regions, wherein the rate of

substitution in the complete mitogenome was larger than that in the coding regions and
the principal component separated the Atta species.
The topologies using the complete mitogenomes were similar to the phylogeny
using partial COI-tRNA-COII (Bacci et al., 2009), of which A. texana in the basal clade,
whereas A. cephalotes and A. colombica in the second clade; A. laevigata and A.
opaciceps in the third clade and A. sexdens rubropilosa in the fourth clade, however, the
bootstrap values using the mitogenomes were larger than partial COI-tRNA-COII,
indicating robust phylogenetic inference with mitogenomes.
Curiously, the mitogenome of A. sexdens rubropilosa (fourth clade) showed
deletion of six tRNAs + NAD2 gene, suggesting that deletion can be typical for this
clade. However, for the clade of A. sexdens rubropilosa, there are A. sexdens sexdens,
A. sexdens piriventris, and A. robusta (Bacci et al., 2009), and genomes identified in the
future will be able to clarify whether deletions are frequent in this clade. We conclude
that Atta mitogenomes are characterized by high conservation in gene order and
organization and the mitogenomes have giant intergenic spacers.

Acknowledgements
Federal University of Alagoas for the laboratories and scientific support and the Fundação de
Apoio à Pesquisa de Alagoas (FAPEAL) for funding this Project

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Legend figure
Figure 1. Complete gene map of Atta opaciceps (A), Atta colombica (B), A. texana (C)
and Atta sexdens rubropilosa (D) mitogenomes. Genes of the circle are transcribed in
the clockwise and counterclockwise directions, respectively. The protein-coding genes
(green), rRNA (red) and tRNA (purple). The green ring represents the A+T contents and
the blue ring shows C+G contents.

Figure 2. Genome size of the complete mitogenomes for Atta genus and outgroup. (A)
Distribution of the genic and intergenic spacers. (B) Virtual gel showing the distribution
of the intergenic spacers.

Figure 3. Phylogenetic analysis using maximum likelihood, which the phylogenetic
relationships are represented by complete mitogenomes (A) and coding regions (B).

Figure S1. Organization of the Atta mitogenomes compared with outgroups. All coding
regions displayed in the same order and direction.

Figure S2. Principal component analysis (PCA) for five species of the Atta genus and
three species as outgroups. (A) PCA using the complete mitogenomes and (B) PCA
using the coding regions (Genes + tRNA + rRNA). The colors denote values at first two
principal component (PC) axes.

Figure 1. Complete gene map of Atta opaciceps (A), Atta colombica (B), A. texana (C) and Atta
sexdens rubropilosa (D) mitogenomes. Genes of the circle are transcribed in the clockwise and
counterclockwise directions, respectively. The protein-coding genes (green), rRNA (red) and tRNA
(purple). The green ring represents the A+T contents and the blue ring shows C+G contents.
180x166mm (100 x 100 DPI)

Figure 2. Genome size of the complete mitogenomes for Atta genus and outgroup. (A) Distribution
of the genic and intergenic spacers. (B) Virtual gel showing the distribution of the intergenic
spacers.
209x64mm (300 x 300 DPI)

Figure 3. Phylogenetic analysis using maximum likelihood, which the phylogenetic relationships
are represented by complete mitogenomes (A) and coding regions (B).
209x34mm (300 x 300 DPI)

Figure S1. Organization of the Atta mitogenomes compared with outgroups. All coding regions
displayed in the same order and direction.
158x66mm (300 x 300 DPI)

Figure S2. Principal component analysis (PCA) for five species of the Atta genus and three species
as outgroups. (A) PCA using the complete mitogenomes and (B) PCA using the coding regions
(Genes + tRNA + rRNA). The colors denote values at first two principal component (PC) axes.
197x96mm (300 x 300 DPI)

Table 1. Mitochondrial genome of the genus Atta and other species of the subfamily
Myrmicinae utilized as the outgroup. The genome sizes in base pairs (bp) for the
genome and the coding and noncoding regions. The genome annotation for tRNA
(transport RNA), rRNA (ribosomal RNA), and protein-coding gene (genes) and the
NCBI code for the genomes.
Size (pb)

Annotations
References

Species

Genome coding no-coding

tRNA

rRNA

Genes

NCBI

M. scabrinodis

15310

14655

738

LN607806

P. punctatus

16180

14693

1550

AB556947 Hasegawa et al., 2011

S. richteri

15560

14673

915

HQ215539 Gotzer et al., 2010

A. cephalotes

18815

14888

3946

HQ415764 Suen et al., 2011

A. colombica

18392

14756

3655

KY950644 This study

A. laevigata

18729

14684

3881

KC346251 Rodovalho et al., 2014

A. opaciceps

19257

14840

4433

KY950643 This study

A. texana

19709

14844

4880

MF417380 This study

A. sexdens rubropilosa

17061

13422

3656

MF591717 This study

Babbucci et al., 2014

4 Capítulo II2
Filogeografia de Atta opaciceps Borgmeier, 1939 (Myrmicinae: Attini) revela ampla
dispersão na Caatinga e Floresta atlântica
Josefa T. V. Barbosa2, Marcílio S. Barbosa1, Antônio E. G. Santana2, Cicero Almeida1

Laboratório de Recursos Genéticos, Campus Arapiraca, Universidade Federal de

Alagoas, Brasil;
2

Centro de Ciências Agrárias, Universidade Federal de Alagoas.

Título de curta duração: Filogeografia de Atta opaciceps
Autor correspondente:
Cícero Almeida
Campus de Arapiraca
Universidade Federal de Alagoas
Avenida Manoel Severino Barbosa s/n, Rodovia AL 115, km 6,5. Bairro Bom Sucesso
Arapiraca, AL, Brasil
Número de telefone: 55 823482-1831
E-mail: cicerocarlos@pesquisador.cnpq.br

2 Capítulo II está escrito de acordo com as normas de submissão do periódico Genetics and Molecular Biology. A

submissão foi realizada no dia 26/04/2018.

Resumo
Atta opaciceps Borgmeier, 1939 (Myrmicinae: Attini) é uma espécie de ocorrência no
Nordeste do Brasil e possui distribuição nos biomas Caatinga e Floresta atlântica. Esses
biomas possuem processos de expansão e retração ao longo das oscilações climáticas,
que podem ter modelado a estruturação populacional de A. opacicpes. O Objetivo do
presente trabalho foi analisar a estrutura populacional de A. opaciceps utilizando
sequências do citocromo oxidase subunidade I (COI). Foram coletadas 127 amostras,
extraído o DNA, amplificada a região do CO1 por PCR e sequenciada usando Bigdye
3.1. As sequências foram alinhadas e utilizadas para obter uma filogenia usando análise
bayesiana e estruturação das populações por meio de simulação usando método
bayesiano. Foram obtidas sequências de 468 pb, compreendendo cinco haplótipos
distribuídos ao longo de toda a região geográfica. A estruturação populacional resultou
em três grupos, com a presença de haplótipos distribuídos ao longo de toda a área de
ocorrência. Os resultados indicam que os biomas Caatinga e Floresta atlântica
caracterizam-se como refúgios e recente dispersão da espécie promoveram uma
homogeneização das populações, sugerindo a espécie possui ampla resiliência as
mudanças climáticas aos distintos biomas.
Palavras-chave: Caatinga; Floresta atlântica; genética de populações; formigas
cortadeiras.

Abstract

Atta opaciceps Borgmeier, 1939 (Myrmicinae: Attini) is a species of occurrence in
northeastern Brazil and is distributed in the Caatinga and Atlantic Forest biomes. These
biomes have expansion and retraction processes along the climatic oscillations, which
can be modeled in a population planning of A. opacicepes. The objective was to analyze
the population structure of A. opaciceps using sequences of the cytochrome oxidase I
subunit (COI). A total of 127 samples were collected from the DNA, amplified in the
CO 1 region by PCR and sequenced using Bigdye 3.1. Sequences were separated and
used for analysis using Bayesian technique and structuring of expression facilities using
the Bayesian method. Sequences of 468 bp were sequenced, comprising five haplotypes
throughout a geographic region. The population structuring lasted for three groups, with
the presence of haplotypes throughout the area of occurrence. The results are the
Caatinga and Atlantic Forest biomes characterized as refuges and are the dispersion of
the species that promotes the homogenization of the populations, suggesting a broad
response capacity as the alteration of the target to the different biomes.
Keywords: Caatinga; Atlantic Forest; population genetics; cutting ants.

4.1 Introdução
A estrutura da diversidade genética das espécies é resultado de processos
demográficos históricos decorrentes de variações climáticas que afetam a compreensão
evolutiva das espécies e a dispersão biológica (Hewitt, 2004; Thomé et al., 2010). As
recorrentes oscilações climáticas nos últimos milhões de anos têm modificado o
processo de evolução causando extinção, dispersão e mudanças na estrutura genética
das populações (Hewitt, 2004). No Brasil, os biomas Caatinga e Floresta atlântica
possui grandes diferenças ecológicas, em que a Floresta atlântica possui alta
precipitação e grande biodiversidade e endemismo (Morellato and Haddad, 2000),
enquanto a Caatinga apresenta baixa precipitação e vegetação heterógena com áreas
geomorfológicas diferentes que podem atuar como fluxo gênico e importante
contribuição para entendimento da estrutura gene de espécies endêmicas (Moro et al.,
2015). A Floresta atlântica tem sido reportado como biomas climaticamente estável,
enquanto a Caatinga com alta instabilidade (Costa et al., 2017).
Atta opaciceps Borgmeier, 1939 (Hymenoptera: Formicidae: Myrmicinae) é uma
espécie de formiga cortadeira pertencente a tribo Attini. Atta opaciceps pertence a um
grupo de formigas que causam danos econômicos, pois atacam intensamente e
constantemente as plantas em qualquer estádio de desenvolvimento, tornando assim um
dos principais insetos-praga dos cultivos florestais. Possui importante papel nos
diversos ecossistemas em que habitam, como participando no fluxo de energia e
nutrientes, aeração do solo, bem como a manutenção da diversidade vegetal (Schultz e
Brady, 2008).
No Brasil a distribuição das formigas do gênero Atta apresenta uma ampla
distribuição

geográfica,

porém

espécie

Atta

opaciceps

Borgmeier,

1939

(Hymenoptera: Formicidae: Myrmicinae) é uma espécie restrita a região nordeste. Atta

opaciceps pertence a um grupo de formigas que causam danos econômicos, pois atacam
intensamente e constantemente as plantas em qualquer estádio de desenvolvimento,
tornando assim um dos principais insetos-praga dos cultivos florestais. Possui
importante papel nos diversos ecossistemas em que habitam, como participando no
fluxo de energia e nutrientes, aeração do solo, bem como a manutenção da diversidade
vegetal (Schultz e Brady, 2008). Estudos populacionais em A. opaciceps se limitam a a
morfologia e distribuição geográfica (Della-Lucia et al., 2011). A espécie está
distribuída nos biomas Caatinga e Floresta atlântica e que as diferenças entre os biomas
podem ter modelado a estrutura genética da espécie, podemos assim investigar as
seguintes questões: (1) Qual é o bioma ancestral de A. opaciceps? (2) A expansão e
retração da Floresta atlântica contribuiu para distribuição de A. opaciceps? (3) Quais as
barreiras de fluxo gênico? Para responder a essas questões, o presente trabalho analisou
a estrutura filogeográfica de A. opaciceps usando sequências do gene mitocondrial
citocromo oxidase subunidade I (COI).

4.2 Material e Métodos

4.2.1 Amostragem e extração de DNA
Foram coletas 137 formigas em ninhos de A. opaciceps, distribuídos em nove
localidades da região Nordeste do Brasil. As localidades foram registradas com
georeferenciamento (Tabela 1). Para cada ponto de coleta realizada, foram coletados
mínimo de 30 indivíduos. A extração de DNA foi realizada utilizando Cetyl Trimethyl
Ammonium Bromide (Doyle and Doyle, 1987). A quantidade e a qualidade do DNA
foram analisadas utilizando um espectrofotômetro e 1% em gel de agarose,
respectivamente.

4.2.2 Amplificação e sequenciamento
O DNA foi utilizado para amplificação por PCR de parte do gene mitocondrial
citocromo oxidase subunidade I (COI). As amplificações por PCR foram realizadas
utilizando 5 μl (tampão de reação), 0,2 U (Taq DNA polimerase), dNTPs (0,5 mM
cada), primers (0,1 µM cada) e 1 µL de DNA (100-300 ng), em um volume final de 50
µL. As condições para a amplificação incluíram uma etapa de desnaturação inicial a 94
°C durante 3 min, seguidos de 35 ciclos de 30 s a 94 ºC para desnaturação do DNA,
anelamento de 30 s a 48 ºC, 72 ºC por 1 min para extensão e uma etapa de extensão
final a 72 ºC por 10 min. As reações de PCR foram conduzidas em um termociclador
BioCycler e os produtos de PCR foram submetidos a eletroforese em gel de agarose a
1%
para
confirmar
Fonte:
Autora,
2018. a amplificação. Os produtos da PCR foram sequenciados usando um
BigDye® Terminator V3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems®) com
eletroforese em um analisador genético ABI 3500 (Applied Biosystems Inc., Foster
City, CA, EUA).

4.2.3 Análise de haplótipos
As sequências foram alinhadas usando MAFFT v7.017 (Katoh e Standley,
2013). O número de haplótipos, diversidade de haplótipos (h), diversidade de
nucleotídeos (π) e os testes de neutralidade (Fs): D de Tajima (1989), Fu e Li (1993) e
Fu (1997) foram calculados utilizando o software DnaSP 5.10.01 (Librado e Rozas,
2009).
O relacionamento genealógico entre os haplótipos foram estimados usando o
método median-joiinig implementado no software Network 4.613 (Bandelt et al., 1999).
A reconstrução filogenética entre os haplótipos foi obtida usando o método bayesiano
por meio do modelo HKY utilizando o software Beast v1.8.0 (Drummond e Rambaut,

2007) e posterior distribuição foi analisada usando Markov Chain Monte Carlo
(MCMC) para 10 milhões de etapas. A convergência dos parâmetros foi verificada
usando o software Tracer 1.5 (Rambaut, 2009). O modelo de substituição HKY foi
obtido utilizando o método Bayesian Information Criterion Evolutionay, implementado
no software Mega 7 (Tamura et al., 2016).

4.2.4 Estruturação das populações
A estruturação das populações foi realizada usando o software SAMOVA
(spatial analysis of molecular variance) (Dupanloup et al., 2002). Este software usa
simulações para identificar grupos de populações (k) que são geograficamente
homogêneas e que maximizam as diferenças entre os grupos, permitindo obter as
variação entre grupos (FCT), entre localidades dentro de cada grupo (Fsc) e entre os
grupos em relação a amostra total (FST). A análise de SAMOVA foi conduzida com
1000 interações para k = [2, ..., 9) grupos. A análise de cluster foi construída usando
uma abordagem bayesiana para agrupamento filogeográfico, implementando o pacote
Bayesian Phylogeographic and Ecological Clustering (BPEC) (Manolopoulou et al.,
2011) em software R (R Development Core Team, 2005), usando os parâmetros ds = 2,
número máximo de migração = 5 e 10 milhões de etapas no MCMC.

4.2.5 Modelagem de nicho ecológico
A modelagem de nichos ecológicos foi realizada utilizando o MAXENT (Versão
3.3.3K, Phillips et al., 2006). Os nichos climáticos utilizados foram as 19 variáveis
BIOCLIM disponíveis no Banco de dados WorldClim (http://www.worldclim.org). Os
dados ambientais contêm três períodos diferentes: Biolim Camadas para o período
1950-2000 em uma resolução de 30 segundos de arco; O último máximo glacial (LGM:
~ 21,000 anos BP), as condições climáticas em 2.5 arc de resolução e a última

interglacial (LIG: ~ 120,000-140,000 anos BP), em uma resolução de 30 segundos de
arco. Para construir os nichos ecológicos, as corridas foram realizadas com os
parâmetros: limiar de convergência (0.00001), máximo Iterações (500) e prevalência
padrão (0,5). Os resultados foram analisados e as figuras obtidas usando o pacote raster
implementado no software estatístico R.

4.3 Resultados

4.3.1 Distribuição e análise de haplótipos
A análise das sequências mostrou a presença de cinco diferentes haplótipos que
foram nomeados de A, B, C, D e E (Figura 1A). Entre os haplótipos, o haplótipo A foi
encontrado em maior proporção e maior dispersão dentro da região de ocorrência de A.
opaciceps. A diversidade de nucleotídeos (π) foi 0,00168 e a diversidade haplótipos
0,643. O teste de Fu e Li foi D=0,91429 (P>10), sendo não significativo e o teste de
Tajima foi D= 0,14619 (P>0,10) também não significativo. Os cincos haplótipos
encontrados são separados somente por uma ou duas substituições (Figura 1B) e que ao
longo de toda a sequência foram detectados somente quatro sítios polimórficos (Figura
1B). Os resultados mostraram uma ampla distribuição dos haplótipos ao longo de toda a
região de ocorrência da espécie, no entanto, o haplótipo A foi mais frequente na Floresta
Atlântica, enquanto os haplótipos C, D e E foram encontrados somente na Caatinga.
Para a Floresta Atlântica a análise filogenética entre os haplótipos mostrou que o
haplótipo B é o mais relacionado com o ancestral, sugerindo que a partir do haplótipo B
tenham surgido os demais (Figura 2). Deve-se enfatizar que o suporte para o clado que
contém o haplótipo B apresentou 100% em relação aos demais haplótipos.

4.3.2 Estruturação de populações
A análise de estruturação de populações utilizando SAMOVA detectou quatro
grupos populacionais, com FCT = 0.82 (P<0.0001), com 88,16% da variação entre os
grupos (Tabela 2). Foi observado que as localidades da Floresta Atlântica ou da borda
Floresta Atlântica com a Caatinga formaram um grupo (Grupo 4), no entanto, contendo
localidade da região central da Caatinga. Esse grupo é caracterizado por apresentar o
haplótipo mais frequente (Haplótipo A). Os demais grupos foram correspondentes ao
demais haplótipos (Tabela 1). A análise de cluster usando a abordagem BPEC detectou
dois grupos: um localizado na região Floresta Atlântica e outro grupo localizado na
região central da Caatinga (Figura 3).

4.3.3 Modelagem de nicho ecológico
A projeção do modelo sobre os parâmetros paleoclimáticos para o presente,
LGM e o LIG sugeriram áreas comparativamente adequas a distribuição de A.
opaciceps (Figura 4). Comparando as previsões para o presente e o LGM, observamos
um maior aumento da população no presente, em que está se expandiu aumentado a sua
concentração. Comparando a distribuição atual com LIG, também observamos uma alta
distribuição e expansão da espécie presente nesse período.

4.4 Discussão
Os resultados obtidos no presente estudo fornecem evidências que contribuem
para a compreensão da história evolutiva e os padrões de variabilidade genética da
espécie A. opaciceps, associados a região Nordeste do Brasil, mostrando a dispersão da
espécie ao longo dos biomas Caatinga e Floresta Atlântica. As populações de A.
opaciceps apresentaram estrutura genética, no entanto, foi observado ampla dispersão e
elevado fluxo gênico entre a Caatinga e Floresta Atlântica, sugerindo que as barreiras

biogeográficas atuais não são suficientes para configurar os biomas como específicos
para grupos populacionais. Essa interpretação é corroborada pela simulação de nicho
ecológico, em que desde o último máximo glacial (LGM) A. opaciceps tem se
expandido tanto na Caatinga como na Floresta Atlântica.
Possivelmente, entre o último interglacial e último máximo glacial, A. opaciceps
pode ter se limitado na região próxima de Prata (PB) e que posteriormente tenha se
expandido para os demais locais da região Nordeste do Brasil. Ao certo não se sabe que
tipo de barreira geográfica ou mesmo biológica determinou a distribuição e expansão de
A. opaciceps. Observou-se que as diferenças entre os haplótipos são bastante pequenas,
com somente uma ou duas substituições, indicando que a diversificação da espécie no
Bioma é recente e que no Bioma Caatinga foi observado a maioria dos haplótipos,
sugerindo ser a Caatinga o centro de origem da espécie e o bioma ancestral da espécie.
Assim, podemos aceitar que a distribuição espacial está relacionada com questões de
adaptação para cada ambiente. Os biomas Caatinga e Floresta Atlântica apresentam
características distintas, sendo a Floresta Atlântica um bioma climaticamente estável,
enquanto a Caatinga é um bioma instável com diversas eco-regões (Costa et al., 2017),
no entanto, A. opaciceps tem se mostrado bastante resiliente quanto as diferenças
climáticas e geomorfológicas, apresentando elevada aptidão aos diferentes ambientes.
Adicionalmente, a expansão e retração da Floresta Atlântica não tem promovido a
mistura de indivíduos de ambos os biomas. A expansão e retração da Floresta Atlântica
tem sido demonstrada por simulação (Costa et al., 2017) e tem contribuído para explicar
a dispersão de algumas espécies.
As evidências do presente trabalho mostram a Caatinga como o bioma ancestral
e possivelmente tenha sido um refúgio durante as oscilações climáticas, como proposto
por simulação para a Floresta Atlântica (Carnaval e Moritz, 2008) e para a Caatinga

(Werneck et al., 2011). Esses modelos sugerem que durante os processos de flutuação
climática a diversidade genética ficou restrita a pequenas regiões. No entanto, a
distribuição de A. opaciceps ocorre ao longo de dois refúgios propostos, sugerindo
elevado nível de dispersão da espécie nos atuais biomas. Esse comportamento de
dispersão de formigas pode estar relacionado com a ausência de barreiras, facilitado
pela rápida dispersão da revoada (voo de fêmeas na época de reprodução) (Seal et al.,
2011).
O padrão de distribuição de A. opaciceps difere de outros organismos: tanto
animal (Werneck et al., 2015) como em vegetal (Gonçalves-Oliveira et al., 2017) em que as
diferenças nos biomas atuam como barreiras as fluxo gênico. Concluímos que A. opaciceps

apresenta uma estruturação filogeográfica distribuída nos biomas da Floresta Atlântica e
da Caatinga, sendo o bioma Caatinga o provável bioma ancestral e que as diferença
climáticas e geomorfológica não atuam como barreira ao fluxo gênico.

Agradecimentos
Universidade Federal de Alagoas pelo laboratório e suporte científico e
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) por financiar
este projeto.

Referências

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Biogeography

20:272-288.

Legenda de Figuras

Figura 1. Mapa do Brasil com a distribuição geográfica das populações e distribuição
dos haplótipos para as espécies de Atta. Cada local de coleta é representado por um
ponto. As cores no gráfico de torta correspondem a haplótipos seguindo a lista na
legenda.

Figura 4: Distribuição geográfica para áreas preditas climaticamente para a ocorrência
de A. opaciceps utilizando variáveis bioclimáticas atuais e do passado. Para o presente
(agora, 0 anos BP), Last Glacial Maximum (LGM, 21,000 anos BP) e Last Interglacial
(LIG, 120,000-140,000 anos BP). As cores quentes (vermelho/amarelo) representam
áreas com alta probabilidade de ocorrência de A. opaciceps.

Figura 1. Mapa do Brasil com a distribuição geográfica das populações e distribuição dos
haplótipos para as espécies de Atta. Cada local de coleta é representado por um ponto. As cores
no gráfico de torta correspondem a haplótipos seguindo a lista na legenda.

Figura 4. Distribuição geográfica para áreas preditas climaticamente para a ocorrência de A.
opaciceps utilizando variáveis bioclimáticas atuais e do passado. Para o presente (agora, 0
anos BP), Last Glacial Maximum (LGM, 21,000 anos BP) e Last Interglacial (LIG, 120,000140,000 anos BP). As cores quentes (vermelho/amarelo) representam áreas com alta
probabilidade de ocorrência de A. opaciceps.

Tabela 1: Detalhe dos locais de coleta de Atta opaciceps na região Nordeste do Brasil,
indicando as coordenadas georeferênciadas e o grupo dos haplótipos.
Coordenadas

SAMOVA

Localidade

Haplótipos
Grupos

Latitude

Longitude

Alegrete do Piauí (PI)

7°14’S

40°51’W

Venha Ver (RN)

6°19’S

38°29’W

Arco Verde (PE)

8°25’S

37°03’W

Arapiraca (AL)

9°45’S

36°39’W

Porto Calvo (AL)

9°02’S

35°23’W

Maceió (AL)

9°39’S

35°44’W

Prata (PA)

7°41’S

37°04’W

Entre Rios (BA)

11°56’S

38°05’W

Petrolândia (PE)

8°58’S

38°13’W

Lavras da Mangabeira (CE)

6°45’S

38°57’W

Caririaçu (CE)

7°02’S

39°17’W

Tabela 2: Análise Espacial da Variação Molecular (SAMOVA)

Causa de variação

d.f.

Percentagem de
variação

Entre os grupos

82,16

Entre as localidades dentro de grupos

17,84

Dentro de localidades

126

00,00

Total

136

100.00

P-valor
FCT = 0.82

P < 0.0001

Grupo 1 (Caririaçu); Grupo 2 (Prata, Entre Rios); Grupo 3 (Lavras), Grupo 4 (Alegrete, Arapiraca, Arcoverde, Petrolândia, Porto Calvo, Venha Ver, Maceió)

Proteção de Plantas

Campus de Engenharias e Ciências Agrárias

Universidade Federal de Alagoas