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                    UNIVERSIDADE FEDERAL DE ALAGOAS
CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PROTEÇÃO DE PLANTAS

Sara Padilha de Farias

Avaliação da sensibilidade de isolados de Cercospora lactucae-sativae Sawada a
estrobilurinas e avaliação de componentes epidemiológicos entre isolados sensíveis
e resistentes.

Rio Largo, AL
2015

Sara Padilha de Farias

Avaliação da sensibilidade de isolados de Cercospora lactucae-sativae Sawada a
estrobilurinas e avaliação de componentes epidemiológicos entre isolados sensíveis
e resistentes.

Dissertação apresentada ao Programa de Pós
Graduação em Proteção de Plantas, do Centro de
Ciências Agrárias, da Universidade Federal de
Alagoas, como parte dos requisitos para obtenção do
título de Mestre em Proteção de Plantas.

Orientador: Prof.Dr. Ricardo Brainer Martins
Coorientadora: Profa Dra Edna Peixoto da Rocha Amorim

Rio Largo, AL
2015

Catalogação na fonte
Universidade Federal de Alagoas
Biblioteca Central
F224a Farias, Sara Padilha de.
Avaliação da sensibilidade de isolados de Cercospora lactucae-sativae Sawada a
estrobilurinas e avaliação de componentes epidemiológicos entre isolados sensíveis e
resistentes. / Sara Padilha de Farias. – Maceió, 2015.
54f. : il. tabs., grafs.
Orientador: Ricardo Brainer Martins.
Dissertação (mestrado em Proteção de Plantas) – Universidade
Federal de Alagoas. Centro de Ciências Agrárias. Rio Largo, 2015.
Bibliografia: f. 46-54.
1. Fungicidas Qol. 2. Lactuca sativa L. 3. Azoxistrobina. 4. Mecanismos de
resistência. I. Título.

SARA PADILHA DE FARIAS

Avaliação da sensibilidade de isolados de Cercospora lactucae-sativae Sawada a
estrobilurinas e avaliação de componentes epidemiológicos entre isolados sensíveis
e resistentes.

Dissertação
submetida
à
banca
avaliadora
como
requisito
para
conclusão do curso de Mestrado em
Proteção de Plantas.

_____________________________________________________________________
Prof. Dr. Ricardo Brainer Martins, Universidade Federal de Alagoas
Orientador

Banca examinadora:

___________________________________________________
Profa. Dra. Iraildes Pereira Assunção– Universidade Federal de Alagoas

___________________________________________________
Prof. Dr. André Luiz Bezerra Galvão – Universidade Federal de Alagoas

Dedico aos meus queridos pais,
irmãos e sobrinhos, pois eles são
minhas jóias raras, presentes de
Deus em minha vida.

AGRADECIMENTOS
Primeiramente a Deus que é minha luz, meu abrigo e minha força para seguir na
caminhada.
À minha família, por todo apoio e carinho, em especial a minha mãe Elineuza
Padilha de Farias e em memória de meu pai José João de Farias, aos meus queridos
irmãos, José Karlisson Padilha de Farias, Reginaldo Padilha de Farias, José Marcelo
Padilha de Farias, Samuel Padilha de Farias, André Padilha de Farias, Simone Padilha
de Farias e Raquel Padilha de Farias. A vocês todo o meu carinho e eterno
agradecimento.
A meu namorado Emerson Ferreira dos Santos, por todo apoio, contribuição no
trabalho, atenção comigo em todos os momentos, enfim, por todo o amor.
A meu orientador Prof. Dr. Ricardo Brainer Martins, pela disponibilidade em
orientar, apoio e contribuição no trabalho.
A minha coorientadora Profª. Drª. Edna Peixoto da Rocha Amorim pela
disponibilidade em orientar, apoio e atenção.
Aos produtores rurais do agreste alagoano pelo fornecimento de amostras.
Ao técnico Sivaldo Souares Paulino pela contribuição em vários momentos
durante o desenvolvimento do trabalho.
Aos alunos bolsistas de iniciação científica Júlia Gabriela Rocha, Taciana
Ferreira e Kledson Mendes pela grande contribuição no trabalho.
A todos do laboratório de Fitopatologia da Universidade Federal de Alagoas Campus Arapiraca.
Ao Centro de Ciências e aos professores do Programa de Pós Graduação em
Proteção de Plantas.
A CAPES, pela conseção de bolsa de estudos.
Aos membros da banca.

RESUMO
A mancha de cercospora causada por Cercospora lactucae-sativae Sawada é uma
doença comum em campos de produção de alface. A doença ocorre nas folhas,
principalmente nas mais velhas, e o principal sintoma são manchas necróticas podendo
gerar grandes prejuízos para o produtor. O controle da doença na região agreste de
Alagoas é feito principalmente pelo uso de um fungicida do grupo químico das
estrobilurinas, o qual é empregado mesmo sem ser registrado para o controle da doença
na cultura. Estudos foram conduzidos para avaliar os efeitos desse fungicida sobre as
populações do patógeno através de testes de sensibilidade e avaliação de componentes
epidemiológicos. Foram selecionados 20 isolados e a variável testada foi o crescimento
micelial em placas. Os testes de sensibilidade foram conduzidos com e sem a presença
de ácido salicil-hidroxâmico (SHAM). O fator de resistência (FR) foi determinado para
averiguar o nível de resistência entre isolados menos sensíveis em relação aos mais
sensíveis. Adicionalmente, quatro isolados (2 mais sensíveis e 2 menos sensíveis) foram
utilizados para a avaliação dos seguintes componentes epidemiológicos: período de
incubação (PI); período latente (PL); severidade da doença; e percentagem de
germinação de esporos produzidos in vivo e in vitro (durante a patogênese). Para os
isolados cuja concentração efetiva de i.a. capaz de inibir em 50% o crescimento micelial
(CE50) pôde ser estimada com e sem SHAM, os valores de CE50 foram de 0,07 a 1,98 µg
ml-1 e 0,007 a 0,339 µg ml-1 ausência e presença de SHAM, respectivamente. Para os
demais isolados, com menor sensibilidade, denominados então como resistentes,
ocorreram duas situações: i) a CE50 só foi estimada na presença de SHAM para dois
isolados, 77D e 76C, cujos valores foram de, respectivamente, 11,32 e 13,52 µg ml-1 ; e
ii) a CE50 não pôde ser estimada com ou sem a presença de SHAM para quatro isolados
(77B, 77C, 77E, e 76E). O FR variou de 1 a 26 para os isolados considerados sensíveis
e de 147 a 175 para os isolados considerados insensíveis. Devido ao elevado FR
encontrado, sugere-se que a mutação G143A pode estar ocorrendo nos isolados
insensíveis. Com relação aos componentes epidemiológicos, os valores de PL e
Severidade foram significativamente (P=0,05) menores e maiores, respetivamente, para
os isolados resistentes. Para as demais variáveis, não houve diferença entre isolados
sensíveis e resistentes.
Palavras-chave: Lactuca sativa L., azoxistrobina, fungicidas Qol, mecanismos de
resistência.

ABSTRACT

The spot cercospora caused by Cercospora lactucae-sativae Sawada is a common
disease in lettuce production fields. The disease occurs in the leaves, especially the
older ones, and the main symptom is necrotic spots may generate large losses for the
producer. Control of the disease in the wild region of Alagoas is mostly done by the use
of a fungicide of the strobilurin chemical group, which is even used without being
registered for the control of disease in the crop. Studies were conducted to evaluate the
effects of the fungicide on the populations of the pathogen by susceptibility testing and
evaluation of epidemiological components. We selected 20 isolates and the variable
tested was the mycelial growth plates. The sensitivity tests were conducted with and
without the presence of salicylhydroxamic acid (SHAM). The resistance factor (RF)
was determined to ascertain the level of resistance among isolates less sensitive
compared to the most sensitive. Additionally, four strains (two most sensitive and least
sensitive 2) were used for epidemiological review of the following components:
incubation period (IP); latent period (LP); severity of the disease; and percentage of
germination of spores produced in vivo and in vitro (in the pathogenesis). To effectively
isolates whose concentration was able to inhibit 50% of the mycelium growth (EC50)
can be estimated with and without SHAM, EC50 values were 0.07 to 1.98 µg ml-1 and
from 0.007 to 0.339 µg ml-1 SHAM absence and presence, respectively. For the
remaining isolated, with lower sensitivity, so called as resistant, there were two
situations: i) the EC50 was estimated only in the presence of SHAM to two isolated,
77D and 76C, whose values were, respectively, 11.32 and 13, 52 µg ml-1; and ii) the
EC50 could not be estimated with or without the presence of SHAM for four isolates
(77B, 77C, 77E, and 76E). FR ranged from 1 to 26 for the isolated considered sensitive
and 147-175 for the isolated considered insensitive. Due to the high RF found, it is
suggested that the G143A mutation may be isolated occurring insensitive. With regard
to the epidemiological components, PL and severity values were significantly (P = 0.05)
lower and higher, respectively, for the resistant isolates. For the other variables, there
was no difference between sensitive and resistant isolates.

Keywords: Lactuca sativa L., azoxystrobin, Qol fungicides, resistance mechanisms.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1. Áreas de produção comercial de alface em que isolados de Cercospora lactucae-sativae foram
obtidos. Cada área recebeu um número único (a numeração de áreas de produção orgânicas são
precedidas pela letra O) e as que estão envoltas por um círculo pontilhado, indicam as áreas de
origem dos isolados utilizados nos experimentos in vitro e in vivo............................................28
Figura 2. Etapas realizadas para obtenção de isolados monospóricos de Cercospora lactucae-sativae.
folhas com sintomas de cercospora em câmara úmida (A); esporos produzidos sobre as lesões
(B); esporos espalhados sobre a placa de petri (C) e colônias desenvolvidas em BDA (D)......29
Figura 3. Preparo de suspensão de conídios de Cercospora lactucae-sativae para ser utilizada na
inoculação (A); inoculação (B e C); câmara úmida (D e E); e observação dos primeiros
sintomas (F)................................................................................................................................32

LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Gráfico 1. Período de incubação (PI) de isolados de C. lactucae-sativae inoculados em mudas de alface
em casa de vegetação, sendo dois isolados sensíveis (5H e 90E) e dois isolados insensíveis
(76E e 77C) a azoxistrobina. para comparação das médias foi aplicado o teste Tukey
(P=0,01)..................................................................................................................... .................41
Gráfico 2. Período latente (PL) de isolados de C. lactucae-sativae inoculados em mudas de alface em casa
de vegetação, sendo dois isolados sensíveis (5H e 90E) e dois isolados insensíveis (76E e 77C)
a azoxistrobina. para comparação das médias foi aplicado o teste Tukey (P=0,01)...................41
Gráfico 3. Severidade da cercosporiose em mudas de alface inoculadas com isolados de C. lactucaesativae, sendo dois isolados sensíveis (5H e 90E) e dois isolados insensíveis (76E e 77C) a
azoxistrobina. para comparação das médias foi aplicado o teste Tukey (P=0,01).....................42
Gráfico 4. Percentagem de germinação de esporos in vivo de isolados de C. lactucae-sativae inoculados
em mudas de alface em casa de vegetação e in vitro de isolados de C. lactucae-sativae
cultivados em laboratório, sendo dois isolados sensíveis (5H e 90E) e dois isolados insensíveis
(76E e 77C) a azoxistrobina........................................................................................................44

LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Sensibilidade de populações de Cercospora lactucae-sativae a azoxistrobina testados in vitro
com e sem a adição de SHAM...................................................................................................36
Tabela 2. Sensibilidade de isolados de C. lactucae-sativae a azoxistrobina e cálculo do fator de resistência
(FR) para comparação da sensibilidade dos isolados insensíveis em relação ao isolado mais
sensível.......................................................................................................................................39

SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO .............................................................................................................................................................. 13
2 REVISÃO DE LITERATURA ................................................................................................................................... 17
2.1 Aspectos inerentes a cultura da alface .....................................................................................................17
2.2 Mancha de cercospora em alface .............................................................................................................19
2.3 Aspectos relacionados aos fungicidas ......................................................................................................21
2.4 Resistência a fungicidas e adaptabilidade ...............................................................................................22
3 MATERIAIS E MÉTODOS ........................................................................................................................................ 27
3.1 Origem dos isolados e obtenção de isolados monospóricos .....................................................................27
3.2 Testes de sensibilidade e efeito da respiração alternativa na sensibilidade ............................................29
3.3 Componentes epidemiológicos in vivo e in vitro .......................................................................................30
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................................................................................. 34
4.1 Origem dos isolados e obtenção de isolados monospóricos .....................................................................34
4.2 Testes de sensibilidade e efeito da respiração alternativa na sensibilidade ............................................34
4.3 Componentes epidemiológicos in vivo e in vitro .......................................................................................40
5 CONCLUSÕES ............................................................................................................................................................... 45
REFERÊNCIAS ................................................................................................................................................................. 47

13

1 INTRODUÇÃO
O estado de Alagoas é autossuficiente na produção de hortaliças folhosas, como
alface, couve, coentro e cebolinha, sendo a região Agreste do estado, mais
especificamente o município de Arapiraca, responsável por 98% do volume destas
olerícolas comercializadas na Ceasa, em Maceió (MONTEIRO, 2008a, 2008b;
AGENCIA ALAGOAS, 2010). A elevada demanda por esses produtos, ciclo de cultivo
curto e a possibilidade de produção durante o ano inteiro em função das condições
edafoclimáticas, garante aos agricultores, pequenos produtores em sua maioria, trabalho
permanente e retorno financeiro rápido e regular. Apesar da importância sócioeconômica da cultura para região Agreste, os produtores carecem de assistência técnica
para manejar problemas fitossanitários que interferem negativamente na qualidade e
quantidade do que é produzido (MONTEIRO, 2008a, 2008b). Nas áreas de cultivo de
alface (Lactuca sativa L.)., a mancha de cercospora constitui um dos principais
problemas fitossanitários da cultura (SANTOS et al., 2014). A doença é causada pelo
fungo Cercospora lactucae-sativae Sawada (sin. Cercospora longissima (Cugini)
Saccardo) (GROENEWALD et al, 2013), e o seu principal sintoma ocorre nas folhas,
correspondendo a manchas circulares pequenas, de coloração bronzeada a parda, tendo
a região central uma coloração mais clara, acinzentada. Sob condições favoráveis as
manchas aumentam de tamanho e podem coalescer, comprometendo, assim, grande
parte do tecido foliar. Normalmente os sintomas iniciam nas folhas mais velhas e
progridem para as mais novas. Por causar danos diretamente sobre as folhas, que
constitui o produto comercializável da cultura, reduz a qualidade e volume da produção,
resultando, assim, em perdas para o produtor (LOPES; QUEZADO-DUVAL, 1998). As
colônias do fungo apresentam coloração variando de verde-escuro a marrom-escuro. Os
conídios são formados sobre conidióforos anfígenos ou fasciculados, marrom-oliváceos,
não ramificados e multiseptados (PAVAN; KUROZAWA, 1997; TONIN et al., 2011).
Os conídios são hialinos, multiseptados, com 11-170 μm de comprimento e 3,8-7,5 μm
de diâmetro, afilando-se para extremidade distal (HSIEH; GOH, 1990; RAID, 1997).
O controle químico é amplamente utilizado pelos olericultores de Arapiraca,
sendo o emprego de fungicidas dos grupos químicos dos triazóis (ingrediente ativo:
difenoconazol), e, principalmente, das estrobilurinas (azoxistrobina) os mais

14

comercializados/empregados para cultura da alface na região (comunicação pessoal).
Posto isto, convém tecer duas considerações importantes: i) os fungicidas destes grupos
não são registrados no Brasil para uso no manejo da mancha de cercospora em alface,
mas sim para o controle de outra mancha foliar, causada pelo fungo Septoria lactucae
(AGROFIT, 2015); e ii) a mancha foliar de maior prevalência, presente em 83% das
áreas de produção (constatado em trabalho de levantamento fitopatológico realizado
durante os anos de 2013/2014 na região), é a mancha de cercospora (SANTOS et al.,
2014). Assim, é possível deduzir duas situações para que os produtores estejam
baseando o controle da doença no uso desses fungicidas. A primeira é a diagnose errada,
confundindo a mancha de septoria com a mancha de cercospora, e a segunda, e
possivelmente a mais correta, é a aplicação deliberada. Mas, independente da situação, o
fato é que as populações de C.lactucae-sativae associadas à cultura estão sendo
expostas aos fungicidas supracitados, os quais, por não haver recomendação técnica,
podem estar sendo empregados em concentração e frequência de aplicação
inapropriadas.
Os

fungicidas

pertencentes

ao

grupo

químico

estrobilurina,

também

denominados como fungicidas QoI (sigla para o termo em inglês Quinone outside
inhibitors), atuam por meio da inibição da respiração mitocondrial, bloqueando a
transferência de elétrons entre o citocromo b e o citocromo C1, interferindo, assim,
diretamente na formação de ATP e, consequentente, no metabolismo energético do
fungo

alvo.

São

eficientemente

empregados

no

controle

de

Ascomicetos,

Basidiomicetos, fungos mitospóricos e Oomicetos (DELEN; TOSUN, 2004; SOUZA;
DUTRA, 2003). Apesar da elevada eficiência, o surgimento de resistência na população
dos patógenos alvos tem sido relatado com razoável frequência.
A resistência as estrobilurinas pode decorrer da ação de três mecanismos
distintos: mutação pontual em diferentes posições do gene do citocromo b (CYTB),
utilização de respiração alternativa e atuação de “bombas de efluxo”. As mutações
pontuais no CYTB são as mais bem estudadas e, aparentemente, as de maior
importância. Elas podem levar a substituição do aminoácido fenilalanina por leucina ou
valina no códon 129 (F129L e F129V, respectivamente), glicina por arginina no códon
(G137R), ou glicina por alanina ou por serina no códon 143 (G143A e G143S,
respectivamente) (MA E MICHAILIDES, 2005; MALANDRAKIS et al., 2006
(FERNÁNDEZ-ORTUÑO et al., 2008). A utilização de respiração alternativa envolve o

15

uso de uma oxidase alternativa que possibilita o desvio do complexo III no ciclo de
respiração e, consequentemente, evita a ação das estrobilurinas (ZIOGAS; BALDWIN;
YOUNG, 1997). Por fim, a ação de proteínas ligadas à membrana celular, com a função
de transportar compostos tóxicos para fora da célula, as bombas de efluxo, também já
foram detectadas em associação com resistência.

Para este último mecanismo,

entretanto, a ação parece ser menor, uma vez que os microrganismos estudados também
possuíam mutações no CYTB (FERNÁNDEZ-ORTUÑO et al. 2008).
Devido o elevado número de relatos de resistência nas populações alvos das
estrobilurinas, a qual pode ser detectada em áreas de cultivo em poucos ciclos da cultura
hospedeira após o início do controle, o Fungicide Resistance Action Committee
(FRAC) atribuiu aos fungicidas deste grupo a maior classificação de risco associado a
fungicidas. Por exemplo, dois anos após o início do uso das estrobilurinas, os primeiros
isolados resistentes, de Erysiphe graminis f. sp. tritici foram detectados em plantios de
cereais, na Alemanha (BERTLETT et al., 2002). Outros casos de resistência já foram
relatados para outros patógenos, como Mycosphaerella graminicola, Plasmopara
viticola, Venturia inaequalis, Mycosphaerella fijiensis var. Difformis, Cercospora
beticola, Cercospora graminicola, Cercospora sojina, entre outros (BLIXT et al., 2009;
FONTAINE et al., 2009; ISHII et al., 2009; WALKER et al., 2009; ZHANG et al.,
2009; FURUYA et al., 2009; KILDEA et al., 2010; LESNIAK et al., 2011; VEGA et
al., 2012; RALLOS et al., 2014; FREDERICK et al., 2014; ROSENZWEIG et al.,
2014). Embora a resistência a fungicida seja em si um problema para o controle, estudos
têm evidenciado que o seu impacto, a velocidade com que surge e predomina na
população do patógeno, chegando a inviabilizar o emprego do fungicida em um curto
período de tempo, varia para cada patossistema. Por exemplo, para Alternaria alternata,
Botrytis cinerea, Mycosphaerella fijiensis, Venturia inaequalis, a resistência espalhojuse rapidamente. Já para Alternaria solani, Cercospora beticola, Cercospora kikuchii,
Cercospora sojina, Micosphaerella musicola, Micosphaerella pinodes, Penicillium
digitatum, Venturia cerasi, o impacto estimado tem sido menor (FRAC, 2014).
Dentre os fatores que podem influenciar o impacto da resistência no controle,
destaca-se o local em que ocorre a mutação e a adaptabilidade dos indivíduos resistentes
(MALANDRAKIS et al., 2006; MALANDRAKIS et al., 2011). O local em que ocorre
a mutação no CYTB tem relação com o nível de resistência, sendo a mutação G143A a
mais frequente em diferentes espécies de fungos fitopatogênicos. Generalizando, os

16

indivíduos portadores desta mutação possuem fator de resistência (sensibilidade de
indivíduos resistentes / sensibilidade de indivíduos sensíveis) maior do que 100 (MA;
MICHAILIDES, 2005; ZHANG, 2012). Após surgimento desses mutantes, outros
aspectos como a adaptabilidade, influenciarão no aumento/decréscimo da resistência na
população do patógeno (BERGAMIN FILHO; AMORIM, 2001). A adaptabilidade, ou
fitness, é uma variável que expressa a eficiência competitiva de indivíduos resistentes
versus indivíduos sensíveis. Em outras palavras, é a capacidade de uma determinada
linhagem em se desenvolver, reproduzir e sobreviver em relação à outra linhagem
exposta a iguais condições (GHINI; KIMATI, 2002). Isto significa que é mais adaptado
o indivíduo que deixar mais descendentes para geração seguinte da população a qual ele
faz parte (LOPES; ROSSO, 2005). Assim, fatores potencialmente ligados à eficiência
de fungos fitopatogênicos em causar doença, como patogenicidade, virulência, produção
de esporos e a germinação destes, período de incubação, etc, têm sido mensurados como
forma de estimar a adaptabilidade (KIM; XIAO, 2011; ZHANG, 2012; RALLOS et al.,
2014). Os custos de aptidão em indivíduos resistentes as estrobilurinas variam entre
diferentes espécies de fitopatógenos (ZHENG; OLAYA; KOLLER, 2000; CHIN et al.,
2001; AVILA-ADAME; KÖLLER, 2003). Como exemplo desta variação, foi
observada maior virulência para isolados resistentes de Cercospora sojina (ZHANG,
2012) e menor virulência para isolados resistentes de Magnaporthe grisea (AVILAADAME; KÖLLER, 2003). Em alguns casos, como em estudo realizado com Botrytis
cinerea, não são observadas diferenças de adaptabilidade entre isolados resistentes e
sensíveis (KIM; XIAO, 2011).
Além de características ligadas aos modos de ação do fungicida e aos
mecanismos de resistência, aspectos inerentes à biologia do fitopatógeno alvo também
podem influenciar no risco de surgimento de resistência. São considerados patógenos
mais propensos ao surgimento de resistência os policíclicos, com dispersão por meio de
esporos no espaço e no tempo, ocorrência de recombinação sexual e a adaptabilidade de
indivíduos resistentes (já discutido acima) (FRAC, 2014). Excetuando-se a reprodução
sexual, ainda não relatada para C. lactucae-sativae, e o mecanismo de resistência (ainda
não estudado para espécie), C. lactucae-sativae se enquadra nas demais por possuir
ciclo de doença curto (4 a 8 dias) e ser disseminada por esporos (conídios, os quais são
produzidos abundamente sobre as lesões da doença nas folhas) (SHERF; MACNAB,
1986).

17

Considerando a exposição das populações de C. lactucae-sativae associadas às
lavouras de alface comercial em Arapiraca a fungicidas contendo a azoxistrobina na sua
composição e a frequência com que casos de resistência são relatados para estes
fungicidas, o presente trabalho objetivou avaliar a sensibilidade de isolados de C.
lactucae-sativae oriundos de áreas de cultivo com e sem histórico de aplicação de
fungicidas, cultivos convencionais e orgânicos, respectivamente. As seguintes hipóteses
foram testadas: i) isolados oriundos de plantios convencionais e orgânicos de alface
possuem o mesmo nível de resistência in vitro a azoxistrobina; e ii) o valor de
indicadores de adaptabilidade in vivo (período de incubação, período latente, severidade
e germinação de esporos produzidos) e in vitro (germinação de esporos) são iguais para
isolados resistentes e sensíveis.

2 REVISÃO DE LITERATURA

2.1 Aspectos inerentes a cultura da alface

A alface (Lactuca sativa L.) é uma planta pertencente à família Asteraceae,
originária da região sul da Europa e Ásia Ocidental (RESENDE et al., 2007;
FILGUEIRA, 2008; HENZ; SUINAGA, 2009). Apesar de ser originária de uma região
de clima temperado, existem hoje muitas variedades adaptadas a regiões tropicais
disponíveis (HENZ; SUINAGA, 2009; KOBORI; BRUNELLI; GLORIA, 2011). As
cultivares classificadas em dois grupos, folhas lisas e folhas crespas. O grupo das folhas
lisas ou manteiga é caracterizado por reunir plantas que podem ou não formar cabeça
compacta e possuem folhas delicadas, de coloração verde amarelada. Deste grupo
destacam-se as cultivares Regina, Elisa, Brasil 303, Daniele e Quatro estações, cujo
período de colheita varia de 55 a 85 dias. O segundo grupo, das folhas crespas,
compreende plantas que não formam cabeça e possuem folhas mais resistentes. São
cultivares importantes deste grupo a Grand Rapids, Verônica, Marianne, Hortência,
Renata, Crespa Loura e Vanessa, cujo período de colheita varia de 60 a 80 dias
(RESENDE et al., 2007). Por essa razão, a alface é produzida em todas as regiões do
Brasil, sendo a hortaliça folhosa de maior consumo no país - o que se atribui, em grande
parte as suas características organolépticas e baixo preço de venda (RESENDE et al.,
2007).

18

No Brasil a produção de alface é realizada em sistemas de cultivo orgânico,
convencional e hidropônico (MIYAZAWA; KHATOUNIAN; PENHA, 2001;
FAVARO-TRINDADE et al., 2007; RESENDE et al., 2007; SOUZA, 2012). A
qualidade, custo de produção, problemas fitossanitários, dentre outras características,
variam em função do sistema adotado (SILVA et al., 2011; SOUZA, 2012).
A agricultura orgânica apresenta maior vantagem em relação à agricultura
convencional em alguns aspectos, visto pela qualidade dos produtos adquiridos e
preservação do meio ambiente, por meio do cultivo mínimo e exclusão do uso de
produtos artificiais, tais como os organismos geneticamente modificados (OGM) e
certos insumos agrícolas externos, como agrotóxicos, aditivos e fertilizantes (MIGUEL;
GRIZOTTO; KURLANETO, 2010; MORGERA; CARO; DURÁN, 2012). O controle
de pragas e doenças nesse sistema ocorre por meio da utilização de extratos de plantas,
caldas a base de cobre e enxofre, controle biológico e métodos fisícos e mecânicos
(RESENDE et al., 2007), em que os produtos utilizados são de baixa toxidade e só
devem ser preconizados se a cultura sofrer risco imediato (ECOSERT, 2008), sendo
recomendados apenas os agrotóxicos orgânicos, que pertencem à classe toxicológica IV
(pouco tóxico) (EMBRAPA, 2007). Porém, algumas desvantagens são inerentes ao
sistema, tais como: a produção em pequena escala; instabilidade decorrente da baixa
capacitação gerencial por parte dos produtores; escassez de pesquisa científica em
agricultura orgânica; falta de preparo dos extensionistas da rede pública para o
atendimento aos produtores; maior demanda de mão-de-obra; dificuldades de acesso ao
crédito bancário; custos de certificação (garantia do selo orgânico) e de
acompanhamento das exigências da certificação; efeitos ambientais negativos caso as
práticas de cultivo forem realizadas de forma inadequada, como exemplo, o
favorecimento ao desenvolvimento de fitopatógenos devido ao manejo inadequado do
solo, entre outros (CAMPANHOLA; VALARINE, 2001).
Em contrapartida, o aumento da produção mundial de alimentos e diminuição
dos custos de produção, deve-se ao sistema convencional (KAMIYAMA, 2011). No
entanto, algumas desvantagens podem ser citadas tais como: o uso intensivo de
pesticidas, o monocultivo e o preparo intensivo do solo, o que pode resultar em
degração ambiental, erosão do solo, contaminação da água, poluição do ar, perda de
biodiversidade e desertificação (PRIMAVESI, 2003; LOPES; LOPES, 2011;

19

MORGERA; CARO; DURÁN, 2012). O controle de doenças acontece principalmente
pelo uso de diferentes fugicidas recomendados para a cultura (ANDREI, 2009).
Por outro lado, o sistema de produção hidropônico propicia uma maior
uniformidade na produção; maior produção por área; redução do ciclo de cultivo; menor
gasto de mão-de-obra; uso racional de água e fertilizantes; produtos limpos e de
qualidade. Porém, necessita de maior investimento inicial, comparado ao cultivo
convencional; necessidade de conhecimentos técnicos e dependência de energia elétrica;
e a vulnerabilidade do sistema com relação à ocorrência de epidemias de podridões
radiculares. O controle de doenças nesse sistêma ocorre através de métodos preventivos
e do controle biológico, já que não existem fungicidas registrados para culturas
hidropônicas no Brasil (CORRÊA; BETTIOL, 2009).
No agreste alagoano a produção de hortaliças, sobretudo as folhosas, é feita no
sistema de cultivo convencional. Na região, a alface e outras folhosas como o coentro e
a cebolinha são as principais hortaliças produzidas. A região tornou-se auto-suficiente
na produção de folhosas, sendo o excedente destinado, majoritariamente, à
comercialização na Ceasa, em Maceió, onde atende a 98% da demanda do Centro de
Abastecimento. A elevada procura, curto período para produção (entre dois e três
meses), e a possibilidade de produção durante o ano inteiro, garante ao pequeno
produtor trabalho permanente e retorno financeiro rápido e regular. Apesar da
importância da produção de hortaliças e dos benefícios gerados para os produtores, estes
reclamam da falta de assistência técnica para manejar problemas fitossanitários, o que
tem ocasionado problemas na qualidade e quantidade dos produtos em função da
ocorrência de pragas e doenças (MONTEIRO, 2008a, 2008b).

2.2 Mancha de cercospora em alface

A mancha de cercospora é muito comum em campos de produção de alface,
tanto em cultivo protegido como em campo (LOPES; QUEZADO-DUVAL, 1998). O
agente causal da doença pertence à classe Deuteromicetos e se reproduz
assexuadamente. Os sintomas afetam, principalmente, as folhas mais velhas e
correspondem a manchas foliares de coloração pardacenta e formato circular com centro
mais claro. Com o passar do tempo a intensidade da doença aumenta, em função do

20

coalescimento e/ou surgimento de novas lesões, e provoca depreciação de valor
comercial do produto (PAVAN; KUROZAWA, 1997; TONIN et al., 2011). Em campo,
os sinais da doença são facilmente visualizados a olho nu, ou com auxílio de uma lupa
de pequena magnitude. Os sinais correspondem às estruturas reprodutivas, conidióforos
e conídios do patógeno e, embora sejam expressas em ambas as faces da folha,
predominam na face abaxial. Os conidióforos são multiseptados, anfígenos ou
fasciculados e de coloração marrom-olivácea. A partir dos conidióforos são produzidos
conídios hialinos, multiseptados e filiformes, com a porção basal mais larga e
extremidade apical mais fina. As dimensões de comprimento e largura variam,
respectivamente, de 11 a 170 µm e de 3,8 a 7,5 µm. Em relação a aspectos culturais, o
fungo apresenta coloração variando de verde-escuro a marrom-escuro (HSIEH; GOH,
1990; RAID, 1997; PAVAN; KUROZAWA, 1997; TONIN et al., 2011). A dispersão
do patógeno ocorre predominantemente pelo vento, sendo a água das chuvas e da
irrigação outros importantes agentes. Os conídios, quando depositados sobre a
superfície da planta hospedeira, necessitam de água para germinar. Três dias após a
penetração e estabelecimento da infecção os primeiros sintomas podem ser observados.
Além da umidade elevada e presença de água livre, temperaturas em torno de 25°C
favorecem a patogênese. A sobrevivência do patógeno pode ocorrer por meio da
infecção de hospedeiros alternativos e da associação a restos culturais e/ou sementes
(TONIN et al., 2011). Apesar das lesões e conídios terem certa semelhança, a mancha
de cercospora pode ser distinguida da mancha causada por Septoria lactucae pela
ausência de picnídios (PAVAN; KUROZAWA, 1997; TONIN et al., 2011).
O controle da doença pode ser feito por meio de, dentre outras medidas, o uso de
sementes certificadas, o transplantio de mudas sadias, propiciar boas condições de
drenagem para evitar o acúmulo de água, aumento do espaçamento entre plantas em
períodos quentes para permitir uma melhor ventilação, não cultivar na proximidade de
plantios velhos para evitar possíveis fontes de inóculo, utilizar irrigação localizada
quando possível, destruir restos de cultura e adotar a rotação de culturas por um período
de um ano ou mais (PEREIRA; PINHEIRO; CARVALHO, 2013).

21

2.3 Aspectos relacionados aos fungicidas

Os fungicidas são produtos utilizados há mais de 200 anos para o controle de
doenças fúngicas (BRENT; HOLLOMON, 2007), e podem ser aplicados em várias
partes das plantas, em produtos que serão armazenados, no solo, etc. A classificação dos
fungicidas é baseada em características distintas, como: a) a mobilidade na planta,
podendo ser de contato (baixa absorção pela planta, atuando na superfície da mesma) ou
sistemicos (são absorvidos pela planta e translocados via xilema e/ou floema para outras
partes da planta); b) a função que exercem, sendo de ação preventiva ou de ação
curativa; c) o sítio de ação, o qual pode ser único ou multiplo; d) o modo de ação,
causando danos à célula e/ou a processos importantes que ocorrem dentro da célula; e) o
tipo de químicos, podendo ser inorgânico ou orgânico; f) o ingrediente ativo
(componente ativo de um agrotóxico); biofungicida, um produto natural a base de
micro-organismos ou substâncias químicas que ocorrem naturalmente no ambiente; g)
grupo químico ou classe, compostos químicos de modo de ação biquímica comum
(MCGRATH, 2004).
A aplicação de fungicidas nem sempre implica na morte dos fungos. Os
fungicidas podem atuar inibindo a germinação ou o crescimento micelial por
determinado período, sendo chamados de fungistáticos; ou inibindo a produção de
esporos, sem, contudo, interferir no crescimento vegetativo do fungo, estes são
conhecidos como antiesporulantes (SOUZA; DUTRA, 2003).
Os fungicidas interferem em processos importantes das células fungicas podendo
causar a sua morte. Os principais processos em que os fungicidas atuam são:
interferência generalizada das funções celulares; interrupção das funções da membrana
celular; inibição da síntese de esteróis; síntese de lipídios e membrana celular; síntese de
ácidos nucleicos; glucanas e síntese da parede celular; efeitos sobre as funções da
membrana celular; inibição da mitose e divisão celular; inibição da síntese de proteínas
e aminoácidos; inibição da respiração; sinais de transdução; mecanismo de ação
indefinido (ZAMBOLIM; VENÂNCIO; OLIVEIRA, 2007).

22

2.4 Resistência a fungicidas e adaptabilidade

Generalizando, o controle de doenças de plantas é realizado prioritariamente
pelo emprego dos fungicidas em razão da, dentre outras razões, facilidade de aplicação
e da rápida obtenção de resultados. Entretanto, o freqüente uso desses produtos,
sobretudo os mais modernos, com modo de ação específico, pode selecionar, ao longo
do tempo, indivíduos resistentes na população do fitopatógeno alvo e findar por ser
tornar menos eficaz ou atóxico ao patógeno (GHINI; KIMATI, 2002).
A resistencia a fungicidas ocorre quando surgem, e passam a predominar na
população do micro-organismo alvo, indivíduos com sensibilidade reduzida, ou com
total perda de sensibilidade, ao fungicida (MCGRATH, 2004). É uma característica
herdável e estável do micro-organismo (GHINI; KIMATI, 2002; SOUZA; DUTRA,
2003; ZAMBOLIM; VENÂNCIO; OLIVEIRA, 2007). A especificidade do modo de
ação dos fungicidas favorece o desenvolvimento da resistência porque, em alguns casos,
pequenas alterações genéticas podem propiciar menor sensibilidade ao(s) produto(s)
empregado(s) ao longo do tempo (MCGRATH, 2004). As alterações podem ser
resultados da modificação no local de ação, considerada como o principal mecanismo
de resistência (BRENT; HOLLOMON, 2007), o aumento da produção do composto que
serve como sítio de ação do fungicida, o desenvolvimento de uma via metabólica
alternativa, a exclusão ou expulsão do fungicida através de proteínas transportadoras
(bombas de efluxo), degradação metabólica do fungicida, entre outros. Indicadores de
alto risco para o desenvolvimento de resistencia é a especificidade desses produtos, a
resistência cruzada, o uso repetitivo de produtos, a rápida multiplicação do patógeno,
mutantes resistentes em laboratório, entre outros (BRENT; HOLLOMON, 2007).
A

frequencia

e

nível

da

sensibilidade

são

importantes

fatores

no

desenvolvimento da resistencia, em que o primeiro corresponde a proporção na
população indivíduos resistentes versus sensíveis e o segundo se refere a diferença da
sensibilidade entre indivíduos/populações sensíveis e resistentes, sendo expresso pelo
Fator de Resistência (FR), o qual pode ser calculado dividindo-se a concentração efetiva
capaz de inibir em 50% o desenvolvimento (CE50) da linhagem resistente/CE50 da
linhagem sensível (GHINI; KIMATI, 2002; ZAMBOLIM; VENÂNCIO; OLIVEIRA,
2007). O fator de resistência tem sido empregado para comparar o grau de resistencia
entre

populações

sensíveis

e

resistentes

(KARAOGLANIDIS;

LOANNIDIS;

23

THANASSOULOPOULOS, 2002), além de ser empregada para estimativa da
resistência cruzada, como foi observado em estudo com Cercospora beticola, cujos
resultados evidenciaram variabilidade nos níveis de resistencia cruzada entre os isolados
testados (KARAOGLANIDIS; LOANNIDIS; THANASSOULOPOULOS, 2000).
A resistência a fungicidas pode ser quantitativa ou qualitativa, em que a primeira
ocorre quando o fungicida age em várias rotas metabólicas do fungo e a segunda quando
a ação do fungicida afeta uma ou poucas rotas metabólicas, sendo que o aparecimento
de mutantes resistentes é mais freqüente para a resistência qualitativa (BERGAMIN
FILHO; AMORIM, 2001). Outro aspecto da resistência, é que ela pode ser cruzada ou
múltipla, em que a resistência cruzada ocorre quando o fungo é resistente a dois ou mais
fungicidas com o mesmo mecanismo de ação e é governada pelo mesmo fator genético;
já a múltipla faz referência a resistência de um fungo a dois ou mais fungicidas, porém
com distintos fatores genéticos envolvidos (GHINI; KIMATI, 2002).
No século passado, a maioria dos fungicidas agrícolas eram protetores, com
atuação em multiplos sítios. Porém, devido a custos elevados esses fungicidas eram
economicamente viáveis apenas para uma pequena gama de culturas. Além disso,
problemas de resíduos no produto fizeram com que o uso desses fungicidas fosse
restringido. Com passar dos anos, a partir da introdução dos fungicidas sistêmicos as
opções para o controle de doenças foi ampliado especialmente com o uso dos fungicidas
inibidores da respiração (QoIs). Dentre estes, as estrobilurinas foram as primeiras a
serem comercializadas. Elas tiveram boa aceitação e foram rapidamente difundidas,
englobando, só na sua “primeira década de vida”, 20% do mercado mudial de
fungicidas (FERNÁNDEZ-ORTUÑO et al., 2008).
As estrobilurinas são substâncias produzidas por Basidiomicetos e Ascomicetos.
As estrobilurinas possuem ação fungicida sobre espécies de fungos do filo
Basidiomicota, Ascomicota, fungos do grupo mitospórico e os Oomicetos. Embora
possuam amplo espectro de ação, as estrobilurinas apresentam um único mecanismo de
ação, sendo o azoxistrobina, o kresoxim-methil, o piraclostrobina, o trifloxistrobina e o
metominostrobina os principais ingredientes ativos. Estes fungicidas inibem a
respiração mitocondrial, interferindo no transporte de elétrons entre o citocromo b e o
citocromo c1, afetando, desta forma, a produção de ATP (SOUZA; DUTRA, 2003). As

24

estrobilurinas atuam como antiesporulantes, inibindo a germinação dos esporos e o
desenvolvimento dos fungos após a germinação (LOMBARDI, 2002).
O rápido desenvolvimento de resistência as estrobilurinas tornou-se cada vez
mais problemático, o que se atribui ao seu modo de ação altamente específico
(FERNÁNDEZ-ORTUÑO et al., 2008). Por apresentarem modo de ação específico,
agindo sobre um único sítio do metabolismo de micro-organismos, aspecto inerente a
todos os sistêmicos, apenas uma alteração nesse sítio seria suficiente para o surgimento
da resistencia (SOUZA; DUTRA, 2003). A resistencia a fungicidas sistemicos é um
processo lento e gradual, porém, quanto maior a pressão de seleção, maiores as chances
de ocorrência de resistência em menor intervalo de tempo (ZAMBOLIM; VENÂNCIO;
OLIVEIRA, 2007). Na literatura já são relatados a ocorrência de vários fitopatógenos
resistentes as estrobilurinas, principalmente a resistência associada a modificação no
local alvo (FERNÁNDEZ-ORTUÑO et al., 2008; BANNO et al., 2009; ISHII et al.,
2009; WALKER et al., 2009; FURUYA et al., 2009; ZHANG et al., 2009; BLIXT et
al., 2009; KILDEA et al., 2010; VEGA et al., 2012; FREDERICK et al., 2014;
ROSENZWEIG et al., 2014; RALLOS et al., 2014).
Apesar de serem eficazes no manejo de cercosporioses os fungicidas
pertencentes

ao

grupo

químico

estrobilurina

apresentam

elevado

rísco

ao

desenvolvimento da resistência em vários fitopatógenos, e a resistência em campo a
esses fungicidas têm sido relatadas em várias espécies de gêneros distintos, tais como:
Mycosphaerella

graminicola,

Plasmopara

viticola,

Venturia

inaequalis,

Mycosphaerella fijiensis var. Difformis, Cercospora beticola, Cercospora graminicola,
Cercospora sojina, entre outros (ANESIADIS; KARAOGLANIDIS; TZAVELLAKLONARI, 2003; FRAC,

2013; KARADIMOS; KARAOGLANIDIS, 2006;

KARAOGLANIDIS; BARDAS, 2006). Entretanto, em alguns casos, a resistência não é
um grande problema, pois, o controle da doença não é afetado gravemente, como no
caso das espécies Cercospora beticola, Cercospora kikuchii, Cercospora sojina em que
são consideradas de médio risco de desenvolverem resistência aos fungicidas (FRAC,
2014).
Os principais mecanismos de resistência a fungicidas Qol são: a respiração
alternativa, os transportadores de efluxo e a modificação no local alvo (FERNÁNDEZORTUÑO et al., 2008).

25

A respiração alternativa consiste no desvio de elétrons mitocondriais
contornando o complexo de citocromo bc1 que é o sítio de inibição do fungicida Qol
(WOOD; HOLLOMON, 2003). Embora a respiração alternativa seja detectada in vitro
para algumas espécies/isolados através de testes de inibição de desenvolvimento fúngico
por meio da deposição destes em meios de cultivo suplementados com fungicida mais
uma alíquota de um agente inibidor da respiração alternativa, o ácido salicilhidroxâmico (SHAM) (KUBICEK et al., 1980; MINAGAWA; YOSHIMOTO, 1987;
VINCELLI, DIXON, 2002; WISE et al., 2008;

BRADLEY; PEDERSEN, 2011;

ZHANG et al., 2012), especula-se que sua importância in vivo deve ser pequena, uma
vez que as plantas produzem flavonas, que, similarmente ao SHAM, atuam
preventivamente evitando a indução da oxidase alternativa (MIZUTANI et al., 1996;
OLAYA; ZHENG; KOLLER, 1998; OLAYA; KOLLER, 1999). Outra razão para a
ausência da respiração alternativa in vivo é a menor quantidade de produção de energia
fornecida por essa via, o que inviabiliza processos importantes no ciclo da doença tais
como: a germinação de esporos e a penetração no hospedeiro, os quais necessitam de
grande quantidade de energia para serem concluídos e propiciarem uma colonização
bem sucedida na planta hospedeira (WOOD; HOLLOMON, 2003).
Os transportadores de efluxo permitem que os fungos expostos a compostos
tóxicos consigam sobreviver, uma vez que promovem proteção da células por
impedirem o acúmulo em seu interior de compostos tóxicos (DEL SORBO;
SCHOONBEEK; DE WAARD, 2000). A primeira ocorrência de tranportadores de
efluxo envolvidos na resistencia a fungicidas Qol foi encontrado em Aspergillus
nidulans, um sistema transportador tipo ABC, multidrogas, mediado pelo produto do
gene AtrBp (ANDRADE et al., 2000). Entretanto, assim como a respiração alternativa,
o impacto dos transportadores de efluxo sobre a resistencia a fungicidas Qol parece ser
limitado, sendo a modificação no local alvo o principal mecanismo de resistência a
fungicidas Qol (FERNÁNDEZ-ORTUÑO et al., 2008).
Dentre as mudanças do local alvo, mutações no gene do citocromo b (CYTB)
podem resultar em duas substituições de aminoácidos importantes, as quais tem sido
detectadas em vários fungos fitopatogénicos e oomicetos resistentes a QoIs. São elas: a
substituição de glicina por alanina na posição 143 (G143A) e a substituição de
fenilalanina por leucina na posição 129 (F129L) (GISI et al., 2002). A mutação na
posição 143 (G143A) é considerada mais grave devido ao alto fator de resistência

26

encontrado, onde os portadores desta mutação expressam um nível de resistência
superior a 100 vezes do que é suportado por isolados sensíveis (ZHANG, 2012). A
mutação na posição 143 (G143A) tem sido relatada para vários fungos fitopatogénicos
(FERNÁNDEZ-ORTUÑO

et

al.,

2008),

como

exemplos,

Botrytis

cinerea,

Microdochium nivale e Microdochium majus, Penicillium digitatum, Venturia
inaequalis, Plasmopara vitícola, Erysiphe necator, Alternaria alternata, Phaeosphaeria
nodorum, Mycosphaerella graminicola, Cercospora beticola, entre outros (ISHII et al.,
2009; WALKER et al., 2009; FONTAINE et al., 2009; ZHANG et al., 2009; BLIXT et
al., 2009; FURUYA et al., 2009; KILDEA et al., 2010; LESNIAK et al., 2011; VEGA
et al., 2012; FREDERICK et al., 2014; ROSENZWEIG et al., 2014; RALLOS et al.,
2014). Em estudo com estirpes mutantes de Cercospora beticola, foi encontrada a
substituição de glicina (GGT) para serina (AGT) na posição 143 (G143S) que tem sido
associada com alto nível de resistência a estrobilurina (MALANDRAKIS et al., 2006;
MALANDRAKIS et al., 2011).
Além dos mecanismos citados o surgimento, aumento de frequência e
perpetuação de indivíduos resistentes na população do patógeno depende de outros
fatores diretamente relacionados ao patógeno, como tamanho da população no momento
da aplicação do produto e a ocorrência de reprodução sexual; sendo populações grandes,
com reprodução cruzada, mais favorável ao surgimento de resistência. Após o
aparecimento de mutantes resistentes, alguns aspectos são fundamentais para que estes
indivíduos se multipliquem e predominem na população: o seu potencial reprodutivo e
sua adequação ao meio e a pressão de seleção exercida sobre a população do fungo alvo.
Generalizando, as chances de mutantes resistentes prevalecerem em uma população são
maiores para àqueles indivíduos resistentes que não sofreram decréscimo em sua
adaptabilidade, as quais podem se manifestar negativamente em importantes funções
epidemiológicas, como: reprodução, sobrevivência, capacidade de disseminação,
esporulação, etc. (BERGAMIN FILHO; AMORIM, 2001). Ou seja, quanto menor a
redução na adaptabilidade dos indivíduos resistentes, maior a chance da resistência ser
estabelecida na população.
A adaptabilidade é uma variável relativa e diretamente relacionada à capacidade
de um determinado indivíduo sobreviver, desenvolver e se reproduzir, contribuindo
assim com novos indivíduos que vão ajudar a perpetuar a espécie. Assim, considerando
um micro-organismo fitopatogênico, pode-se deduzir que a adaptabilidade de uma

27

determinada linhagem resistente depende da capacidade de infecção, da velocidade de
colonização dos tecidos do hospedeiro, da capacidade de esporulação e da sobrevivência
(GHINI; KIMATI, 2002). Outra característica importante para perpetuação da
resistência é que os indivíduos resistentes sejam capazes de competir com indivíduos
sensíveis na ausência do fungicida (GHINI; KIMATI, 2002). Por essa razão, a
adaptabilidade, estimada por meio da avaliação de, por exemplo, características
epidemiológicas, com avaliação de variáveis in vitro e in vitro, tem sido alvo freqüente
em estudos sobre sensibilidade a fungicidas (KIM; XIAO, 2011; ZHANG, 2012;
RALLOS et al., 2014). Assim, tem sido constatado que penalidades à aptidão em
indivíduos resistentes a Qol variam entre os patossistemas (ZHENG; OLAYA;
KÖLLER, 2000; CHIN et al., 2001; AVILA-ADAME; KÖLLER, 2003), podendo i)
haver um ganho, como relatado para Cercospora sojina, onde foi quantificado aumento
de agressividade associado à resistência (ZHANG, 2012), ii) redução, como menor
virulência associada à resistência, conforme descrito para Magnaporthe grisea (AVILAADAME; KÖLLER, 2003); ou iii) não estar associada a decréscimo na adaptabilidade,
como em Botrytis cinerea (KIM; XIAO, 2011).

3 MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 Origem dos isolados e obtenção de isolados monospóricos

Os experimentos foram desenvolvidos no Laboratório de Fitopatologia da
Universidade Federal de Alagoas – Campus Arapiraca, no período de dezembro de 2014
a fevereiro de 2015.
Os isolados foram obtidos a partir de amostras (folhas com sintomas de mancha
de cercospora) coletadas em áreas com sistema de produção comercial convencional ou
orgânico de alface localizado na zona rural de Arapiraca (Figura 1). Em cada área,
plantas com folhas exibindo diferentes níveis de severidade da doença foram coletadas
aleatoriamente entre os canteiros da cultura. Adicionalmente, coordenadas geodésicas
de cada área visitada foi obtida com o uso de aparelho de GPS.

28

Figura 1. Áreas de produção comercial de alface em que isolados de Cercospora lactucae-sativae foram
obtidos. Cada área recebeu um número único (a numeração de áreas de produção orgânicas são
precedidas pela letra O) e as que estão envoltas por um círculo pontilhado, indicam as áreas de
origem dos isolados utilizados nos experimentos in vitro e in vivo.

Fonte: Autora, 2015.

Em todos os experimentos conduzidos em laboratório adotou-se a temperatura
de 25oC e fotoperíodo variável em função do experimento: fotoperíodo de 12 horas
(desenvolvimento de colônia em placa de Petri e incubação em condição de câmara
úmida), escuro contínuo (desenvolvimento de micélio para produção de esporos) ou luz
contínua (indução de esporulação para produção de inóculo e viabilidade de esporos).
Os isolados utilizados nos experimentos foram obtidos via técnica de obtenção
de monospóricos a partir de lesões com a presença de esporos. Com este fim, folhas de
alface com lesões características de mancha de cercospora foram mantidas em condição
de câmara úmida para estimular a produção de esporos durante 24 horas (Figura 2A).
Em seguida, as lesões foram observadas em microscópio estereoscópico e uma das
lesões, contendo estruturas reprodutivas, foi recortada e agitada sobre o fundo de uma
placa de Petri para liberação dos conídios (Figura 2B e C). Em seguida, com o uso de
uma agulha esterilizada, cinco conídios foram transferidos para placa de Petri contendo
BDA. Após sete dias de incubação, uma das colônias desenvolvidas (Figura 2D) foi
repicada para uma nova placa contendo BDA. Desta forma, apenas um isolado
monospórico foi obtido por amostra. A preservação dos isolados foi feita em tubos de
ensaio contendo meio BDA inclinado e pelo Método de Castellani (PIMENTEL;
FIGUEIREDO, 1989). Dentre os isolados obtidos, 20 foram selecionados, com base na
distância entre as áreas de origem, para os experimentos executados in vitro

29

(sensibilidade ao fungicida e efeito da respiração alternativa na sensibilidade, proporção
do crescimento micelial e viabilidade de esporos). Com base nos resultados de
sensibilidade in vitro, quatro isolados, representando extremos de sensibilidade, foram
selecionados para avaliar os componentes epidemiológicos durante teste de
patogenicidade para estimativa dos componentes epidemiológicos.

Figura 2. Etapas realizadas para obtenção de isolados monospóricos de Cercospora lactucae-sativae.
Folhas com sintomas de cercospora em câmara úmida (A); esporos produzidos sobre as lesões
(B); esporos espalhados sobre a placa de Petri (C) e colônias desenvolvidas em BDA (D).

Fonte: Autora, 2015.

3.2 Testes de sensibilidade e efeito da respiração alternativa na sensibilidade

A estrobilurina selecionada para estudo foi a azoxistrobina. Uma solução
estoque foi preparada previamente por meio da diluição do fungicida comercial
(Amistar/Syngenta®) em água destilada esterilizada (ADE). A partir da solução
estoque, a solução de trabalho para cada concentração foi obtida por meio de uma
diluição em série. Em seguida, alíquota de cada solução de trabalho foi adicionada a
BDA para conseguir as concentrações de ingrediente ativo a serem testadas: 0, 0,01, 0,1,
0,5, 1 e 5μg de i. a. mL-1 (as concentrações foram definidas em pré-teste realizado com
cinco isolados). Adicionalmente, os isolados menos sensíveis também foram cultivados
nas concentrações 10, 50 e 100µg ml-1. Para avaliar o efeito da respiração alternativa na
sensibilidade, um segundo experimento, no qual 100μg de ácido salicil-hidroxâmico
(SHAM), diluído em metanol foram adicionados ao BDA contendo o fungicida. A
solução estoque do fungicida e do SHAM foram adicionados ao BDA autoclavado
quando este estava com temperatura entre 45 e 50oC (BRADLEY; PEDERSEN, 2011;
BIRLA et al., 2012; ZHANG et al., 2012).

30

Para execução dos experimentos com e sem SHAM, discos de 5 mm de diâmetro
contendo estruturas fúngicas foram retirados da borda de colônias com 15 dias de idade
e depositados, com a face contendo as estruturas voltada para baixo, em placas de Petri
de 9 mm contendo BDA. Após quinze dias de incubação, o crescimento micelial dos
isolados em diferentes tratamentos foi quantificado por meio da estimativa do diâmetro
médio da colônia a partir da mensuração do diâmetro em duas direções diametralmente
opostas.
A partir dos dados de diâmetro médio do crescimento das colônias foi calculado
o percentual de inibição do crescimento micelial [% de inibição = 100 – (diâmetro na
concentração i x 100)/diâmetro na concentração 0)] para cada concentração por isolado
em cada repetição. Em seguida, a concentração efetiva capaz de inibir em 50% o
crescimento micelial do patógeno (CE50) foi estimada por meio de regressão da % de
inibição versus o log10 da concentração do fungicida. A estimativa de CE50 foi obtida
para cada repetição por isolado com e sem SHAM (TUMBEK et al., 2011;
KARAOGLANIDIS; LOANNIDIS;THANASSOULOPOULOS et al., 2000; 2002).
Adicionalmente, visando comparar os níveis de sensibilidade entre os isolados testados,
o fator de resistencia (FR) foi calculado dividindo o valor de CE50 média dos isolados
mais

resistentes

pelo

valor

de

CE50

média

do

isolado

mais

sensível

(KARAOGLANIDIS; LOANNIDIS;THANASSOULOPOULOS et al., 2000; 2002).

3.3 Componentes epidemiológicos in vivo e in vitro

Para avaliação dos componentes epidemiológicos in vivo, foram utilizadas
mudas de alface de cultivar do grupo Lisa com 20 dias. As mudas foram adquiridas em
sementeira comercial e transplantadas para vasos, com capacidade para 500 ml de solo
(esterilizado em autoclave), os quais foram acondicionados em casa de vegetação. As
mudas foram irrigadas manualmente em dois turnos, no início da manhã, a partir das 7h,
e ao final da tarde, às 17h. As mudas foram observadas diariamente por um período de
17 dias antes da montagem do experimento e as que eventualmente apresentaram
sintomas de doença foram descartadas, restando apenas mudas sadias para serem
utilizadas na avaliação dos componentes.

31

Quatro isolados monospóricos com níveis distintos de sensibilidade a
azoxistrobina, dois sensíveis (isolados 5H e 90E) e dois resistentes (76E e 77C), foram
inoculados nas mudas. O inoculo foi produzido via técnica de secagem micelial, descrita
adiante em testes in vitro, excetuando-se o volume de ADE adicionado durante a
raspagem das colônias para obtenção de suspensão de estruturas fúngicas: 20 ml. Em
seguida, a suspensão foi filtrada através de uma camada de gaze dupla e a concentração
de conídios estimada por meio de uma câmara de Neubauer (YEH; SINCLAIR, 1980).
Para inoculação, a suspensão de 5 x 104 conídios ml-1, acrescido de uma gota de Tween
20 a 0,1% ( vol / vol ), foi borrifada até o escorrimento em ambas as faces de folhas de
mudas de alface com 17 dias de transplantadas (KARAOGLADINIS; BARDAS, 2006).
Em seguida, cada muda inoculada foi envolta por um saco plástico, contendo ADE
borrifada em seu interior, por um período de 15 horas. Findo este período, os sacos
foram removidos e as plantas observadas diariamente para avaliação do surgimento de
sintomas e sinais (Figura 3) (SOUZA, 2007). O experimento foi montado em DIC, com
4 repetições por isolado. A unidade experimental foi constituída por uma planta/vaso.
Como tratamento controle, plantas foram aspergidas com ADE contendo Tween 20.

32

Figura 3. Preparo de suspensão de conídios de Cercospora lactucae-sativae para ser utilizada na
inoculação (A); inoculação (B e C); câmara úmida (D e E); e observação dos primeiros
sintomas (F).

Fonte: Autora, 2015.

As variáveis quantificadas foram o período de incubação (PI) (considerado
completo quando foi observada ao menos uma lesão na metade das folhas
inoculadas/planta), período latente (PL) (considerado completo quando foi observada a
presença de estruturas reprodutivas em pelo menos uma lesão, de metade das folhas
inoculadas/planta), severidade (percentual de tecido foliar lesionado, estimado com
auxílio de escala diagramática desenvolvida por Gomes et al. (2004) – a severidade da
doença foi estimada 13 dias após a inoculação em 5 folhas/planta) e germinação de
esporos produzidos durante a patogênese.
Para avaliação da germinação de esporos, folhas sintomáticas foram destacadas e
postas em câmara úmida para estimular a produção de esporos. Após 24h, os esporos
produzidos foram transferidos diretamente da lesão através da ponta de uma agulha

33

esterilizada para uma alíquota de 200µl de ADE disposta sobre uma fina camada AA
que recobria uma lâmina de microscopia. Após cinco horas de incubação, a germinação
dos esporos foi paralisada pela adição de 250 µL de lactofenol e a germinação
quantificada pela observação de 100 conídios (ASSUNÇÃO et al., 2013). Foram
considerados germinados os conídios que apresentaram pelo menos um tubo
germinativo de comprimento maior ou igual ao diâmetro da base do conídio (ZHANG,
2012; MARTINS, 2007). O experimento foi montado em DIC,com 4 repetições por
isolado. A unidade experimental foi constituída por uma lâmina de microscopia.
Para os testes in vitro, conídios de C. lactucae-sativae dos 4 isolados testados
nos experimentos in vivo foram obtidos por meio da técnica de secagem de massa
micelial desenvolvida por Walker (1980), modificada por Necher et al. (2006) e Souza
et al. (2005), com alterações, descrita abaixo.
Três discos de 5mm de diâmetro de BDA, contendo estruturas de C. lactucaesativae, obtidos de colônias com 15 dias de crescimento, foram transferidos para
erlenmeyers contendo 25ml de meio de cultura aveia água (30g de aveia e 1000ml de
água destilada). Os erlenmeyers foram mantidos no escuro e agitados manualmente, três
vezes por dia, durante 9 dias. Posteriormente, a suspensão contida em cada erlenmeyer
foi vertida sobre camada de Agar água (AA) a 0,13%, contida em placas de Petri. Em
seguida, as placas, abertas, foram acondicionadas a 25°C, sob luz contínua,
proporcionada por lâmpada fluorescente branca de 40W disposta a 40cm de distância
das placas. Após cinco dias, 15 mL de ADE foi adicionado a cada placa e, com o auxílio
de um bastão de vidro, procedeu-se a raspagem das estruturas reprodutivas/somáticas
desenvolvidas sobre o AA desidratado. A suspensão obtida foi filtrada através de uma
camada de gaze e uma alíquota de 300µL do filtrado foi adicionando sobre uma lâmina
de microscopia, recoberta com uma fina camada de AA, disposta dentro de uma placa
de Petri. As lâminas foram mantidas a 25 ± 2ºC e, após 5 horas, foi adicionado 250 µL
de lactofenol a lâmina para paralisar a germinação dos esporos. Em seguida, 100
conídios foram observados sob microscópio ótico e o percentual de conídios
germinados contabilizado (ASSUNÇÃO et al., 2013). O experimento foi montado em
DIC, com 4 repetições. A unidade experimental foi constituída por uma lâmina de
microscopia.

34

Para todos os experimentos, foi possível a aplicação de teste de Tukey (P=0,05)
para comparação dos tratamentos.

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1 Origem dos isolados e obtenção de isolados monospóricos

Este é o primeiro estudo sobre sensibilidade de C. lactucae-sativae a
estrobilurina. Este estudo deu-se em função de três situações: i) a relevância da doença
causada pelo fungo, por ser a doença de maior prevalência na região agreste de Alagoas,
tendo sido encontrada em 83% das 76 áreas de produção visitadas em levantamento
fitopatológico realizado durante a safra 2013/2014 (SANTOS et al., 2014); ii) a
constatação do uso intensivo de fungicidas no manejo da doença, sobretudo a
azoxistrobina, pertencente ao grupo das estrobilurinas; e iii) o relato de que em muitas
áreas a aplicação do fungicida não tem proporcionado o mesmo nível de controle de
safras anteriores. Das 76 áreas visitadas durante levantamento fitopatológico prévio,
optou-se, por questões operacionais de estrutura física e de recursos humanos, por focar
no estudo da sensibilidade de isolados oriundos de oito áreas de cultivo (Figura 1), as
quais foram selecionadas com base na distância geográfica entre si e na forma de
cultivo. Das áreas selecionadas, seis são cultivadas sob sistema convencional e duas sob
sistema orgânico e, do total de 20 isolados estudados, 15 são provenientes de áreas de
cultivo convencional e cinco de áreas de cultivo orgânico.

4.2 Testes de sensibilidade e efeito da respiração alternativa na sensibilidade

A sensibilidade a azoxistrobina diferiu significativamente entre os isolados
testados, variando de 0,07 a 1,98 µg ml-1 e de 0,007 a 13,52 µg ml-1 na ausência e
presença de SHAM, respectivamente (Tabela 1). Em função do fenótipo de
sensibilidade, os isolados puderam ser reunidos em dois grupos, sendo o grupo um
formado por isolados mais sensíveis, cuja a CE50, individualmente, foi inferior a 2
µgml-1, e o grupo dois, formado por isolados que manifestaram dois fenótipos: 1) a CE50
só pôde ser estimada na presença de SHAM, com valores superiores a 11 µg Ml-1; e 2)

35

isolados para os quais, em função da insensibilidade, não foi possível estimar a CE50.
Assim, os isolados do grupo um foram denominados como sensíveis e os isolados do
grupo dois como insensíveis. Do total de isolados testados, 30% foram classificados
como insensíveis – todos oriundos de duas áreas de produção mantidas sob sistema de
produção convencional, 77 e 76 (Figura 1). Dos 70% restantes, 38% são oriundos de
áreas com sistema de cultivo orgânico (Tabela 1). Embora o grupo 1 tenha sido
classificado como sensível, convém ressaltar que os valores de CE50 estimados neste
estudo foram maiores do que o relatado para espécies do mesmo gênero, como
Cercospora kicuchii, Cercospora sojina e Cercospora zeae-maydis, para as quais os
valores da concentração de referência (Baseline) não ultrapassou 0,09 µg de i.a. ml-1
(PRICE, 2013; ZHANG, 2012; BRADLEY; PEDERSEN, 2011). A mesma ponderação
é aplicável a CE50 relatada para espécies de outros gêneros. Por exemplo, para
Guignardia citricarpa e Monilinia fructicola cuja a CE50 média foi de 0,027 e 0,05 µg
i.a. ml-1, respectivamente (AMIRI; BRANNEN; SCHNABEL, 2010; HINCAPIE et
T., 2014). Apesar da inexistência de uma concentração de referência, definida a partir
de valores de CE50 estimada para isolados de C. lactucae-sativae nunca expostos a
azoxistrobina, é razoável supor que esteja havendo seleção para resistência do patógeno
à azoxistrobina por duas razões: 1) a CE50 média do grupo um (0,45 µg ml-1) é mais de
40 vezes maior do que o relatado para baseline de Cercospora spp.; 2) 30% dos isolados
não demonstraram sensibilidade; e 3) os isolados insensíveis foram encontrados em
associação a plantios de duas áreas próximas, onde o uso de controle químico é aplicado
intensivamente.

36

Tabela 1. Sensibilidade de populações de C. lactucae-sativae a azoxistrobina testados in vitro com e sem
a adição de SHAM.

ISOLADOS
77A
77B
77C
77D
77E
76C
76E

CE50 (µg de i.a. mL-1)
SEM SHAM
COM SHAM
0.528cd
0.3391b
n.e.
n.e.
n.e.
n.e.
n.e.
11.324ª
n.e.
n.e.
n.e.
13.521ª
n.e.
n.e.

97A
97E

0.576c
0.545cd

0.0071b
0.0943b

90B
90C
90E
1B*
1C*
1E*
5H*
5J*

1.127b
1.989ª
0.233cde
0.428cde
0.117e
0.103e
0.077e
0.176de

0.433b
0.2927b
0.1239b
0.0196b
0.066b
0.0316b
0.0143b
0.0846b

93B
89C
89D

0.107e
0.161de
0.187de

0.0920b
0.0385b
0.0481b

Fonte: Autora, 2015.
n.e. A CE50 não pôde ser estimada.
Médias obtidas através da aplicação do teste Tukey (P=0,01).
*Isolados provenientes de sistema de produção orgânica.

O estabelecimento de uma concentração inibitória mínima (CIM), também
conhecida como dose discriminante, otimiza o monitoramento temporal da sensibilidade
de populações de fitopatógenos a fungicidas. Estudos de sensibilidade in vitro a
fungicidas implicam em intenso trabalho porque as estimativas de sensibilidade
envolvem o cultivo do patógeno em substratos contendo diferentes concentrações do
fungicida testado. Como em monitoramentos o número de isolados oriundos da

37

população do patógeno deve ser elevado para garantir a representatividade das
estimativas, chega-se a um impasse por questões operacionais. Por essa razão é
desejável que exista uma concentração capaz de permitir a discriminação entre isolados
sensíveis e insensíveis, a CIM. Ou seja, uma concentração capaz de inibir totalmente o
desenvolvimento de isolados sensíveis (AMIRI; BRANNEN; SCHNABEL, 2010;
ZHANG, 2012). Por exemplo, para C. sojina e C. kikuchii, a CIM foi de 1 e 10 µg ml-1,
respectivamente. (ZHANG, 2012; PRICE, 2013). No presente estudo, todos os isolados
insensíveis foram totalmente inibidos, tanto na presença como na ausência de SHAM na
composição do substrato, quando cultivados em concentração igual ou maior do que de
10 µg ml-1. Já os isolados insensíveis não foram inibidos, mesmo quando cultivados em
substrato contendo 100 µg ml-1; excetuando-se os isolados 77D e 76C, os quais tiveram
o desenvolvimento inibido, apenas na presença de SHAM, quando cultivados em
substrato contendo 50 µg ml-1. Assim, propõe-se que a concentração de 10 µg de i.a. ml1

seja utilizada como CIM em monitoramentos do nível de sensibilidade C.lactucae-

sativae.
A respiração alternativa é um dos possíveis mecanismos de resistência a
azoxistrobina em C. lactucae-sativae. Todos os isolados sensíveis de C. lactucaesativae cultivados em meio contendo SHAM tiveram um aumento de sensibilidade ao
fungicida, o que reduziu a CE50 média do grupo dos sensíveis de 0,45 para 0,12 µg ml-1
(Tabela 1). O uso de oxidase alternativa ao complexo de citocromo III no transporte de
elétrons já foi descrito em espécies de Cercospora (BRADLEY; PEDERSEN, 2011;
ZHANG et al., 2012) e

em espécies de outros gêneros (ZIOGAS; BALDWIN;

YOUNG, 1997; OLAYA; KOLLER, 1999; VINCELLI, DIXON, 2002; WISE et al.,
2008; CHEN; JIN; ZHOU, 2009). Em todas as espécies o mecanismo não resultou em
resistência total ao fungicida, mas em tolerância. Embora os isolados não adquiram
resistência total, especula-se que populações patogênicas que tenham em sua
composição indivíduos portadoras deste mecanismo possam persistir após o emprego de
controle químico, propiciando um tempo maior para que outros mecanimos de
resistência mais eficientes surjam entre os indivíduos e que os mesmos sejam
selecionados, passando, então, a predominar na população. Assim, a constatação do
aumento de sensibilidade dos isolados sensíveis de C. lactucae-sativae, quando os
mesmos foram cultivados em substrato contendo SHAM, permite assumir que este

38

mecanismo esteja ocorrendo na população de C. lactucae-sativae associada aos plantios
de alface da região estudada (Tabela 1).
Outros mecanismos de resistência podem estar ocorrendo em paralelo à
respiração alternativa. Considerando os isolados insensíveis, a CE50 não pôde ser
estimada para 66,6% destes, independente do uso ou não de SHAM. Para os isolados
insensíveis restantes, a CE50 só foi estimada com o uso de SHAM e, mesmo assim, os
valores foram elevados, maiores do que 10 µg ml-1 (Tabela 1). Isto evidencia a
ocorrência de, pelo menos, um segundo mecanismo. Dentre os demais mecanismos de
resistência conhecidos, as bombas de efluxo e a modificação no sítio alvo destacam-se a
ocorrência de mudança no sítio alvo como principal mecanismo porque o impacto das
bombas de efluxo sobre a resistencia a fungicidas Qol parece ser limitado
(FERNÁNDEZ-ORTUÑO et al., 2008). A modificação no local alvo, envolvendo as
mutações no gene do citocromo b (CYTB), é relacionada à resistência, sendo a
substituição de glicina por alanina no códon 143 (G143A) presente na maioria dos
fungos fitopatogênicos resistentes (BANNO et al., 2009; ISHII et al., 2009; WALKER
et al., 2009; FREDERICK et al., 2014; FURUYA et al., 2009; ROSENZWEIG et al.,
2014; RALLOS et al., 2014; VEGA et al., 2012; ZHANG et al., 2009; BLIXT et al.,
2009; KILDEA et al., 2010 ). Outras mutações no mesmo gene envolvem a substituição
do aminoácido fenilalanina por leucina ou valina no códon 129 (F129L e F129V,
respectivamente), e glicina por arginina no códon (G137R) (MA; MICHAILIDES,
2005; MALANDRAKIS et al., 2006; FERNÁNDEZ-ORTUÑO et al., 2008).
Dentre as mutações no CYTB, a G143A além de mais frequente, é a que está
relacionada com os maiores níveis de resistência a Qol, enquanto as mutações F129L e
G137R

estão

asociadas

à

expressão

de

resistência

moderada

a

QoIs

(KARAOGLANIDIS; LUO; MICHAILIDES, 2011). Em testes in vitro com a espécie
Pyricularia grisea foi observado que isolados com a mutação G143A foram
significativamente mais resistentes à azoxistrobina e trifloxistrobina do que aqueles com
a mutação F129L (KIM et al., 2003). Na literatura relata-se que a mutação na posição
143 (G143A) é considerada mais grave devido ao alto fator de resistência (FR)
encontrado, que é geralmente superior a 100 (ZHANG, 2012). Segundo a FRAC (2006),
geralmente, isolados, que são pelo menos 100 vezes menos sensíveis aos fungicidas QoI
têm a mutação G143A. Para isolados de C.sojina, por exemplo, a diferença da
sensibilidade encontrada em isolados resistentes em relação aos isolados de linha de

39

base é muito alta, acima de 100 vezes (ZHANG, 2012), o que sugere a existencia da
mutação G143A.
No presente estudo o FR calculado variou de 1 a 26 para os isolados mais
sensíveis. Entretanto, para os isolados insensíveis, para os quais a CE50 foi possível ser
estimada apenas com o uso de SHAM, o FR observado foi de 147 e 175 (Tabela 2).
Assim, sugere-se que, a mutação no local alvo, mais especificamente a mutação G143A,
pode ser o mecanismo de resistência associado aos isolados insensíveis. Futuras
pesquisas devem se concentrar no sequenciamento do CYTB de isolados insensíveis e
sensíveis para confirmar esta suposição.

Tabela 2. Sensibilidade de isolados de C. Lactucae-sativae a azoxistrobina e cálculo do fator de
resistência (FR) para comparação da sensibilidade dos isolados insensíveis em relação ao
isolado mais sensível.

ISOLADOS
76C*
77D*
90C
90B
97A
97E
77A
1B
90E
89D
5J
89C
1C
93B
1E
5H
Fonte: Autora, 2015.
*

CE50 estimada apenas com o uso do SHAM.

FR=fator de resistência
5H=isolado mais sensível

CE50 (µg de i.a. mL-1)
MÉDIA
13.521ª
11.324ª
1.989ª
1.127b
0.576c
0.545cd
0.528cd
0.428cde
0.233cde
0.187de
0.176de
0.161de
0.117e
0.107e
0.103e
0.077e

FR
175
147
26
15
7
7
7
6
3
2
2
2
2
1
1

40

4.3 Componentes epidemiológicos in vivo e in vitro

Com base nos resultados da CE50 do teste de sensibilidade, foram selecionados
dois isolados sensíveis, 90E e 5H, com CE50 média de 0,233 e 0,077 µg ml-1,
respectivamente, e dois insensíveis, 76E e 77C , cuja CE50 não pôde ser estimada.
O PI variou de 5 a 7 dias e não houve diferença significativa entre os isolados
(P=0,11). Porém, o PI para os isolados insensíveis foi menor em relação aos isolados
sensíveis. Já o PL variou de 9 a 13,25 dias, tendo os isolados insensíveis um PL médio
entre 12 a 22% menor do que o dos isolados sensíveis (Gráfico 1 e 2). Assim, os
isolados insensíveis podem propiciar um número maior de ciclos da doença durante o
ciclo da cultura, o que é preocupante, pois de acordo com a FRAC (2014), o risco da
resistência é comumente aumentado quando o patogéno alvo apresenta vários ciclos da
doença. Na literatura relata-se que para C. lactucae-sativae sintomas e novos esporos
podem ser produzidos de 4 a 8 dias após a inoculação (SHERF; MACNAB, 1986), o
que difere em relação aos resultados observados neste estudo, em que a visualização de
sintomas ocorreu entre 5 a 7 dias e a produção de esporos de 9 a 14 dias em geral.
Porém, de acordo com Naqvi (2004) a temperatura ótima para o desenvolvimento da
doença é 25ºC em que os primeiros sintomas podem ser visualizados dentro de 3 dias
após a inoculação. No entanto, caso as temperaturas não sejam adequadas tais como de
15, 20 e 30ºC os períodos de incubação podem ser de 7, 5 e 5 dias, respectivamente.
Isso pode explicar os resultados obtidos neste estudo, uma vez que as temperaturas
observadas durante o período de avaliação do experimento variou de 17 a 35º C.

41

Gráfico 1. Período de incubação (PI) de isolados de C. lactucae-sativae inoculados em mudas de alface
em casa de vegetação, sendo dois isolados sensíveis (5H e 90E) e dois isolados insensíveis
(76E e 77C) a azoxistrobina. Para comparação das médias foi aplicado o teste Tukey (P=0,01).

PERÍODO DE INCUBAÇÃO

DIAS APOS A INOCULAÇÃO (DAI)

8

7
6
5
4
3
2
1
0
77C

76E

90E

5H

ISOLADOS

Fonte: Autora, 2015.
Gráfico 2. Período latente (PL) de isolados de C. lactucae-sativae inoculados em mudas de alface em casa
de vegetação, sendo dois isolados sensíveis (5H e 90E) e dois isolados insensíveis (76E e 77C)
a azoxistrobina. Para comparação das médias foi aplicado o teste Tukey (P=0,01).

Fonte: Autora, 2015.

42

A severidade da doença variou de 1,16 a 26,5%, sendo os isolados insensíveis os
de maior virulência, com destaque para o isolado 77C estatisticamente superior aos
demais (P<0,0001) (Gráfico 3).

Gráfico 3. Severidade da cercosporiose em mudas de alface inoculadas com isolados de C. lactucaesativae, sendo dois isolados sensíveis (5H e 90E) e dois isolados insensíveis (76E e 77C) a
azoxistrobina. Para comparação das médias foi aplicado o teste Tukey (P=0,01).

Fonte: Autora, 2015.

Neste estudo, as plantas foram mantidas com folhas molhadas durante o
primeiro dia, o que pode ter favorecido o desenvolvimento da doença, uma vez que para
C. lactuca sativae o efeito do molhamento foliar propicia as condições ideais para
germinação dos conídios (SAVARY, 1983), principalmente, quando esse período é
superior a 24 horas considerado ideal para a penetração bem sucedida (NAQVI, 2004).
O aumento ou redução da severidade da doença está ligado a fatores do ambiente como
foi observado em um levantamento feito em Pernambuco, em que a influência da
precipitação foi determinante para o aumento da doença em plantios de alface em
sistema de produção convencional e orgânico, em que o nível de severidade variou de
0,84 a 16,86 para este e de 0,07 a 22,53 para aquele quando o índice pluviométrico
durante o período de avaliação foi 434,2 mm. Entretanto, em outro período, quando o
índice pluviométrico foi de 165,7 mm houve redução da severidade que variou de 0,0 a
2,4% para o sistema de produção convencional e de 0,0 a 15,1% para o sistema orgânico
(GOMES, 2006).

43

A maior severidade observada para os isolados insensíveis pode ter relação com
a maior patogenicidade destes em relação aos isolados sensíveis. Além disso, os
isolados insensíveis produziram esporos mais rapidamente dado um PL inferior ao dos
isolados sensíveis. Resultado semelhante foi observado por Zhang (2012) em que para
C. sojina as lesões da doença apareceram um dia antes para isolados resistentes o que
pode explicar a rápida produção de esporos para estes em relação aos isolados sensíveis
e a própria severidade da doença que foi significativamente maior do que a causada
pelos isolados sensíveis. A severidade da doença também foi maior para plantas de
pepino inoculadas com o isolado resistente em comparação com o isolado sensível de
Pseudoperonospora cubensis (ISHII et al., 2001). Em outro estudo a capacidade
competitiva entre um mutante resistente e o tipo selvagem de Magnaporthe oryzae foi
avaliada e apesar do mutante resistente ter produzido maior inoculo secundário, a
severidade da doença da estirpe de tipo selvagem foi significativamente mais elevada
(MA; UDDIN, 2009).
Para a viabilidade de esporos, não foi observada diferença significativa entre os
ensaios in vivo e in vitro (valor de F da ANAVA variando de 0,23 a 0,88), embora
exista a tendência dos esporos produzidos in vivo terem uma taxa maior de germinação.
Não foi detectada diferença significativa em relação à viabilidade de esporos entre os
isolados, tanto para os testes in vivo como para os testes in vitro (P=0,32). Porém, houve
uma tendência de maior viabilidade de esporos para os isolados insensíveis (Gráfico 4).
Já para isolados mutantes de Cercospora beticola um estudo prévio sobre características
da aptidão mostrou que houve uma redução da esporulação em comparação com a de
tipo selvagem (MALANDRAKIS et al., 2006). Em mutantes de Botrytis cinerea
resistentes a piraclostrobina também houve efeito negativo sobre a capacidade de
mutantes para competir com a estirpe selvagem, em que a esporulação e/ou germinação
de esporos foi reduzida (MARKOGLOU et al., 2006). No entanto, em outro estudo,
isolados de Botrytis cinerea resistentes a piraclostrobina, não diferiram quanto as
variáveis analisadas mantendo-se os aspectos de aptidão inalterados (KIM; XIAO,
2011).

44

Gráfico 4. Percentagem de germinação de esporos in vivo de isolados de C. lactucae-sativae inoculados
em mudas de alface em casa de vegetação e in vitro de isolados de C. lactucae-sativae
cultivados em laboratório, sendo dois isolados sensíveis (5H e 90E) e dois isolados insensíveis
(76E e 77C) a azoxistrobina.

Fonte: Autora, 2015.

Sabe-se que fungicidas que tem modo de ação especifico, aumentam o risco de
desenvolvimento de resistência, principalmente, quando isolados resistentes não sofrem
penalidades na sua capacidade de sobreviver e multiplicar-se no ambiente (ISHII et al.,
2001). Custo adaptativo devido a mutações associadas à resistência torna-se evidente na
ausência do fungicida (SCHOUSTRA et al., 2005; JEGER; WIJNGAARDEN;
HOEKSTRA, 2008). Na ausência do fungicida foi observado uma menor capacidade
competitiva de um mutante resistente de Magnaporthe oryzae em relação ao tipo
selvagem indicando custo em aptidão para o mutante resistente (MA; UDDIN, 2009).
Quando ocorrem penalidades na aptidão de isolados resistentes, a ausência do fungicida
poderá reduzir a freqüência de resistência e possibilitar a reintrodução do produto
(FERNÁNDEZ-ORTUÑO et al., 2008), do contrário, estratégias anti-resistência devem
ser empregadas para que se possa retardar o desenvolvimento da resistência (FRAC,
2010).
No presente estudo, não houve penalidades na aptidão dos isolados insensíveis,
que por sua vez se mostraram mais competitivos em relação aos isolados sensíveis.
Com isto, os isolados insensíveis podem prevalecer em campos de produção de alface
na ausência do fungicida. Como agravante, a disseminação do patógeno ocorre

45

principalmente pelo vento (TONIN et al., 2011), podendo promover a disseminação de
esporos a longas distâncias e contaminar áreas ainda não afetadas pela resistência.
Entretanto, as chances de disseminação dos isolados insensíveis para outras áreas
podem ser reduzidas em função da direção dos ventos da região, geralmente, em sentido
leste (E) ou leste sul (E-S) (INMET, 2015) e pelo fato da distribuição desses isolados
ser pontual e em áreas distantes das demais. Assim, outros estudos com um número
maior de isolados devem ser conduzidos em casa de vegetação e em campo para avaliar
se a freqüência de isolados resistentes permanece sem a presença do fungicida em mais
ciclos da planta hospedeira. Além disso, outros parâmetros epidemiológicos devem ser
incluídos em estudos futuros.
Por fim, tendo em vista a confirmação da presença de isolados resistentes na
região e como não foram estabelecidos valores de linha de base para C. lactucaesativae, devido a ausência de plantios sem histórico de aplicação de estrobilurinas, os
valores encontrados neste estudo servirão como referencia para monitorar mudanças na
sensibilidade a esses fungicidas nos anos seguintes. A dose discriminatória sugerida
para o acompanhamento temporal da sensibilidade da população de C. lactucae-sativae
deve ser de 10 µg ml-1 , uma vez que todos os isolados considerados insensíveis
apresentaram a CE50 acima desse valor.

5 CONCLUSÕES
Está ocorrendo resistência de C. lactucae-sativae à azoxistrobina na região
Agreste de Alagoas, uma vez que 30% dos isolados avaliados foram insensíveis ao
fungicida nos testes de inibição do crescimento micelial.
Para 80% dos isolados, a respiração alternativa pode constituir um dos
mecanismos de resistência presentes em C. lactucae-sativae, uma vez que, para estes, o
crescimento micelial foi menor na presença do SHAM.
Para 20% dos isolados avaliados, o uso do SHAM não provocou aumento
significativo da sensibilidade, evidenciando a ocorrência majoritária de outro
mecanismo de resistência que não a respiração alternativa.

46

Não foi detectado custo adaptativo dos isolados resistentes para maioria das
variáveis avaliadas, excetuando-se o PL e a Severidade. Para estas, os valores estimados
para

os

isolados

insensíveis

foram

significativamente

mais

favoráveis

ao

desenvolvimento de doença, o que pode indicar que mesmo descontinuando ou
suspendendo a aplicação do fungicida, eles podem persistir e até aumentar de frequência
na população do patógeno associada aos plantios da região.

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