Etiologia da Mancha Marrom da Palma (Nopalea cochenillifera Salm-Dyck), Resistência de Genótipos e Efeito da Temperatura e Umidade Sobre a Doença

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE ALAGOAS
CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PROTEÇÃO DE PLANTAS

LUCAS FONSECA MENEZES OLIVEIRA

ETIOLOGIA DA MANCHA MARROM DE PALMA (Nopalea cochenillifera SalmDyck), RESISTÊNCIA DE GENÓTIPOS E EFEITO DA TEMPERATURA E
UMIDADE SOBRE A DOENÇA

Rio Largo - AL
2016

LUCAS FONSECA MENEZES OLIVEIRA

ETIOLOGIA DA MANCHA MARROM DE PALMA (Nopalea cochenillifera SalmDyck), RESISTÊNCIA DE GENÓTIPOS E EFEITO DA TEMPERATURA E
UMIDADE SOBRE A DOENÇA

Tese de doutorado apresentada ao
Programa de Pós-Graduação em Proteção
de Plantas do Centro de Ciências Agrárias
da Universidade Federal de Alagoas como
requisito parcial para obtenção do grau de
Doutor em Proteção de Plantas.
Orientador: Prof. Dr. Gaus Silvestre de
Andrade Lima

Rio Largo - AL
2016

LUCAS FONSECA MENEZES OLIVEIRA

ETIOLOGIA DA MANCHA MARROM DE PALMA (Nopalea cochenillifera SalmDyck), RESISTÊNCIA DE GENÓTIPOS E EFEITO DA TEMPERATURA E
UMIDADE SOBRE A DOENÇA

Tese de doutorado submetida ao corpo
docente do Programa de Pós-Graduação
em Proteção de Plantas, do Centro de
Ciências Agrárias da Universidade
Federal de Alagoas.

Prof. Dr. Gaus Silvestre de Andrade Lima
Universidade Federal de Alagoas (Orientador)

Banca Examinadora:

Prof.ª Dr.ª Maria de Fátima Silva Muniz
Universidade Federal de Alagoas (Examinador Interno)

Prof. Dr. José Teodorico de Araújo Filho
Universidade Federal de Alagoas (Examinador Externo)

Dr. João Gomes da Costa
Embrapa Tabuleiros Costeiros – UEP Rio Largo (Examinador Externo)

Rio Largo - AL
2016

Catalogação na fonte
Universidade Federal de Alagoas
Biblioteca Central
Divisão de Tratamento Técnico
Bibliotecária Responsável: Helena Cristina Pimentel do Vale
O48e

Oliveira, Lucas Fonseca Menezes.
Etiologia da mancha marrom de palma (Nopalea cochenillifera Salm Dyck), resistência de genótipos e efeito da temperatura e umidade sobre a
doença / Lucas Fonseca Menezes Oliveira. – 2016.
72 f. : il.
Orientadora: Gaus Silvestre de Andrade Lima.
Tese (doutorado em Proteção de Plantas) – Universidade Federal de
Alagoas. Centro de Ciências Agrárias. Rio Largo, 2015.
Inclui bibliografia.
1. Caracterização molecular. 2. Agressividade do patógeno. 4. Palma
Forrageira – Doenças e pragas. 4. Colletotrichum. I. Título.
CDU: 633.39

A Rosalva Fonseca Oliveira.
Todas suas histórias trazem
um aprendizado.
DEDICO

AGRADECIMENTOS
Gostaria de agradecer inicialmente a minha família por todo o apoio e incentivo que
me deram desde o momento que fiz a escolha pelo curso e Engenharia Agronômica até hoje
quando concluo o meu doutorado. Agradeço muito a meus pais, Antônio e Maria, e aos meus
irmãos Yuri e Thais, por sempre estarem ao meu lado, me incentivando e apoiando, mesmo
sem compreender absolutamente para quê eu passava tanto tempo na universidade. Agradeço
também a meus avós, tios e primos que me apoiaram muito nessa jornada.
Faço um agradecimento mais que especial a Mirella Scarlati, minha noiva, que teve
muita paciência comigo, quando eu ficava distraído pensando no que tinha que fazer, na
quantidade de material que eu tinha que ler e escrever, agradeço por todo seu apoio, amor e
carinho em todos os momentos dessa jornada.
Agradeço muito a Universidade Federal de Alagoas, que através do Programa de Pós
Graduação em Proteção de Plantas possibilitou o meu doutorado. Agradeço ao meu orientador
Prof. Dr. Gaus Silvestre de Andrade e Lima, que acreditou em mim mesmo quando tive que
me ausentar da Universidade.
Agradeço imensamente aos amigos que fiz no Laboratório de Fitopatologia e
Virologia Molecular, Fred, Antônio, Nayana, Adso, Mayra, Roberto, Tamires, Ana, Ana,
Laura, Leonardo, Janaine, Jussara, Gilberlan, Daniel, Isabella, Rafael, Sarah. Muitíssimo
obrigado a todos, sem o esforço conjunto de todos seria impossível realizar o trabalho.
Agradeço imensamente a Embrapa Caprinos e Ovinos que me acolheu no meio deste
percurso e que possibilitou a minha liberação para concluir o meu doutorado, muito obrigado
Drª Ana Clara, Dr Vinicius, Dr Leandro, Dr Caetano, Dr Éden, pelo esforço e pelo incentivo.
Lembrar de todas as pessoas que participam de nossas vidas é uma tarefa muito
difícil, tenho muito receio de ter omitido o nome de alguém, por isso deixo meu
agradecimento a todas as pessoas que passaram pela minha vida. As palavras de todos me
influenciaram de alguma forma nas minhas decisões que me trouxeram até esse momento.

Muito obrigado a todos.

RESUMO
A palma forrageira (Nopalea cochenillifera) tem como seu centro de origem o México, sendo
cultivada atualmente em todo o mundo, esta cultura foi inicialmente introduzida no Brasil
pelos portugueses com o objetivo de hospedar a cochonilha do carmim, para a produção do
corante vermelho carmim. Na primeira década do século XX a palma começou a despertar
interesse como forrageira, sendo introduzida no Nordeste brasileiro. Mesmo apresentando
grande rusticidade e adaptação as condições climáticas da região semiárida, a cultura da
palma forrageira está sujeita ao ataque de diversas doenças que causam grandes prejuízos para
a sua produção. Dentre os agentes causais de doenças em palma, os fungos do gênero
Colletotrichum são responsáveis por danos econômicos consideraveis a cultura. Um dos
maiores problemas na caracterização das espécies de Colletotrichum é a sua grande
variabilidade morfocultural, sendo necessária a utilização de técnicas de biologia molecular
para auxiliar na taxonomia deste gênero. Outra característica importante deste gênero fúngico
é sua adaptabilidade, o que lhe permite crescer nas mais variadas condições climáticas e nos
mais variados hospedeiros. Desta maneira o objetivo deste trabalho foi caracterizar a
etiologia, a resistência e a epidemiologia entre isolados de Colletotrichum sp. e genótipos de
palma (Nopalea cochenillifera). Cladódios apresentando sintomas de manchas necróticas em
sua superfície, foram coletados em áreas produtoras nos estados de Alagoas e Pernambuco.
No laboratório foi realizado o isolamento dos fitopatógenos e obtenção da cultura
monospórica de cada um dos isolados. O material isolado foi caracterizado a partir de técnicas
moleculares, morfológicas e culturais. A caracterização dos isolados possibilitou a
identificação das espécies C. siamense, C. fructicola e C. karstii causando doença em palma
forrageira no Brasil. Em seguida as espécies fúngicas identificadas foram utilizadas na
determinação de qual temperatura e umidade favorecem o seu crescimento, além de serem
utilizadas na caracterização da resistência dos seguintes genótipos de palma: Palma Alagoas,
Miúda, Orelha de onça, Palma melancia, Tamazunchale, Clones 06, 07, 13, 21 e F-21. A
partir das atividades realizadas a temperatura de 22 °C favoreceu o desenvolvimento das
lesões nos cladódios, independente da espécie de Colletotrichum considerada. O período de
permanência em câmara úmida superior a 36 horas favoreceu o desenvolvimento das lesões
nos cladódios quando inoculados com isolados de Colletotricum. Colletotrichum siamense
apresentou maior agressividade em genótipos de palma forrageira quando comparado com C.
karstii e C. fructicola. Os genótipos: Miúda, Clones 07, 13 e 21 apresentaram menores lesões
quando inoculados com isolados de Colletotrichum spp.
Palavras-Chave: Caracterização molecular. Agressividade do patógeno. Colletotrichum.

ABSTRACT
The cactus (Nopalea cochenillifera) has as its center of origin Mexico, currently being grown
around the world, this culture was first introduced in Brazil by the Portuguese in order to host
cochineal carmine, for the production of carmine red dye. In the first decade of XX century
the palm began to arouse interest as forage, being introduced in the Brazilian northeast. Even
with great hardiness and adaptation to climatic conditions of the semiarid region, the culture
of spineless cactus is subject to attack by various diseases that cause great harm to their
production. Among the causative agents of diseases in cactus, fungi of the genus
Colletotrichum are responsible for considerable economic damage to culture. One of the
biggest problems in the characterization of species of Colletotrichum is its great variability
morphocultural, requiring the use of molecular biology techniques to assist in the taxonomy
of this genus. Another important feature of this fungal genus is its adaptability, which allows
you to grow in various weather conditions and in various hosts. Thus the aim of this study
was to characterize the etiology, epidemiology and resistance among isolates of
Colletotrichum sp. and palm genotypes (Nopalea cochenillifera). Cladodes showing
symptoms of necrotic spots on its surface, were collected in producing areas in the states of
Alagoas and Pernambuco. In the laboratory it was carried out the isolation of pathogens and
achieving monospórica culture each isolate. The isolated material was characterized from
molecular, morphological and cultural techniques. Characterizing isolates allowed the
identification of C. siamense, C. karstii and C. fructicola causing disease in forage cactus in
Brazil. Then the identified fungus species were used in determining which temperature and
humidity conducive to their growth, and are used to characterize the resistance of these palm
genotypes: Palma Alagoas, Miúda, Orelha de Onça, Palma Melancia, Tamazunchale, Clones
06, 07, 13, 21 and F-21. From the activities carried out at 22 ° C favored the development of
lesions in the cladodes, regardless of the species of Colletotrichum considered. The length of
stay in a humid chamber more than 36 hours favored the development of lesions in the
cladodes when inoculated with Colletotricum isolates. Colletotrichum siamese showed greater
aggression in forage cactus genotypes compared with C. karstii and C. fructicola. Genotypes:
Miúda, Clones 07, 13 and 21 showed minor injuries when inoculated with Colletotrichum
spp.
Keywords: Molecular characterization. Aggressiveness of the pathogen. Colletotrichum.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Sintomas de manchas em cladódios de palma forrageira miúda..............................31
Figura 2 - Cladódios de palma miúda (Nopalea cochenillifera) inoculadas com discos
contendo estruturas de Colletotrichum spp............................................................37
Figura 3 - Árvore filogenética de Inferência Bayesiana com isolados de Colletotrichum
pertencentes a dois complexos, utilizando o gene GAPDH...................................40
Figura 4 - Árvore filogenética de Inferência Bayesiana com isolados de Colletotrichum
pertencentes a dois complexos, utilizando o gene TUB2......................................41
Figura 5 - Árvore filogenética de Inferência Bayesiana com isolados de Colletotrichum
pertencentes a dois complexos, analisando os dados das regiões genômicas
GAPDH, TUB2 e ITS de maneira concatenada.....................................................42
Figura 6 - Aspecto dos três grupos de isolados de Colletotrichum em meio BDA sintético,
observados ao 7° dia. Imagem superior verso e imagem inferior reverso.............45
Figura 7 - Características morfológicas de conídios (I) e apressórios (II) de C. fructicola, C.
siamense e C. karstii cultivados em meio BDA. As imagens foram obtidas com
lentes de 40x de aumento e escala de 20μm...........................................................47
Figura 8 - Manchas em cladódios causadas por C. siamense, C. karstii e C. fructicola, após 10
dias de incubação a 22, 26, 30 e 34 °C, em palma Miúda.....................................60
Figura 9 - Diâmetro de lesões causadas por C. siamense, C. karstii e C. fructicola em
diferentes temperaturas e períodos de permanência em câmara úmida, em palma
Miúda.....................................................................................................................61
Figura 10 - Manchas em cladódios causadas por C. siamense, C. karstii e C. fructicola, após
10 dias de incubação em câmara úmida de 12, 24, 36, 48 e 60 horas, em palma
Miúda.....................................................................................................................63
Figura 11 - Manchas de cladódios causadas por C. siamense, C. karstii e C. fructicola em
genótipos promissores de palma forrageira do gênero Nopalea............................65
Figura 12 - Diâmetro de lesões de C. siamense, C. karstii e C. fructicola inoculados em
diferentes genótipos de palma forrageira do gênero Nopalea................................66

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Local e ano de coleta de cladódios de palma forrageira..........................................31
Tabela 2 - Descrição dos primers usados para identificação de espécies pertencentes ao gênero
Colletotrichum........................................................................................................34
Tabela 3 - Sequências do gênero Colletotrichum incluídas nas análises multigênicas e
respectivos números de acessos do GenBank........................................................35
Tabela 4 - Relação entre espécies de Colletotrichum e locais de coleta de isolados obtidos a
partir de palma forrageira.......................................................................................39
Tabela 5 - Características morfológicas de isolados de Colletotrichum obtidos a partir de
lesões em cladódios de palma forrageira...............................................................44
Tabela 6 - Variação e média de comprimento, largura e relação comprimento largura de
conídios e apressórios de isolados de Colletotrichum............................................48
Tabela 7 - Diâmetro médio (mm) de mancha de cladódios causada por C. siamense, C. karstii
e C. fructicola em genótipos de palma forrageira..................................................64

SUMÁRIO
1

INTRODUÇÃO GERAL ........................................................................................ 13

2.1

Palma Forrageira ................................................................................................. 15

2.2

Principais Doenças na Cultura da Palma Forrageira ....................................... 18

2.3

Gênero Colletotrichum .......................................................................................... 21

2.4

Efeito da temperatura e umidade sobre a severidade de doenças. .................. 23

REFERENCIAS ..................................................................................................................... 25
3
ETIOLOGIA DA MANCHA MARROM DE PALMA (Nopalea cochenillifera
Salm-Dyck). ............................................................................................................................. 30
3.1

Introdução ............................................................................................................. 32

3.2

MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................................. 34

3.2.1

Origem, obtenção e preservação dos isolados do gênero Colletotrichum.............. 34

3.2.2

Teste de patogenicidade ......................................................................................... 35

3.2.3

Caracterização molecular ....................................................................................... 36

3.2.3.1

Extração de DNA................................................................................................ 36

3.2.3.2

Amplificação do DNA e sequenciamento dos produtos de PCR ....................... 36

3.2.3.3

Análises filogenéticas ......................................................................................... 37

3.2.4

Caracterização cultural e morfológica.................................................................... 39

3.3

Resultados e Discussão ......................................................................................... 40

3.3.1

Testes de Patogenicidade ....................................................................................... 40

3.3.2

Caracterização Molecular ....................................................................................... 41

3.3.3

Caracterização Morfológica e Cultural .................................................................. 46

3.4

Conclusões ............................................................................................................. 53

REFERENCIAS ..................................................................................................................... 54
4
RESISTÊNCIA DE GENÓTIPOS DE Nopalea cochenillifera E EFEITO DA
TEMPERATURA E UMIDADE SOBRE A MANCHA MARROM. ............................... 57

4.1

Introdução ............................................................................................................. 59

4.2

Material e Métodos............................................................................................... 61

4.2.1

Obtenção dos genótipos de palma da variedade miúda e isolados utilizados ........ 61

4.2.2
Efeito da temperatura e de períodos de permanência em câmara úmida na
severidade de manchas de cladódios ........................................................................................ 61
4.2.3

Comportamento de genótipos de palma em relação a manchas de cladódios ........ 62

4.3

Resultados e Discussão ......................................................................................... 63

4.3.1
Efeito da temperatura e do período de permanência em câmara úmida na
severidade de manchas de cladódios. ....................................................................................... 63
4.3.2

Comportamento de genótipos de palma em relação a manchas de cladódios ........ 67

4.4

Conclusões ............................................................................................................. 70

REFERENCIAS ..................................................................................................................... 71

INTRODUÇÃO GERAL

Pertencendo a família das cactáceas, a palma forrageira (Opuntia fícus-indica Mill e
Nopalea cochenillifera Salm-Dyck) tem como centro de origem no México, sendo um dos
símbolos florísticos da região. Atualmente a palma encontra-se disseminada por todo o
planeta, desde os Estados Unidos da América, até a Coreia e Austrália, passando pelo Brasil,
Chile, Peru, Argentina, Portugal, Itália, dentre outros (BARRIOS; MUÑOZ-URÍAS, 2001;
HOFFMAN, 2001; TAYLOR, 2002).
Mundialmente, a palma forrageira apresenta múltiplos usos, desde o paisagismo até a
produção de fármacos e produtos para a indústria de alimentos. No Brasil a palma
inicialmente foi introduzida visando a produção do corante carmim, contudo houveram
problemas na produção e a cultura ficou esquecida até o início do século XX quando passou a
ser utilizada como alimento forrageiro para a bovinocultura na região Nordeste (PESSOA,
1967; SANTOS et al., 2012).
Atualmente a palma é utilizada como alimento estratégico para os rebanhos bovinos,
caprinos e ovinos da região semiárida, como fonte de água e energia para os rebanhos. Isto se
dá pela enorme adaptabilidade desta cultura as condições edafoclimáticas da região, resistindo
a longos períodos de estiagem sem perder água e suas características físico-químicas.
Atualmente no Brasil não existem dados precisos do total de palma forrageira produzida, mas
estima-se que no país exista uma área plantada de aproximadamente 600.000 ha, com
potencial produtivo de 200t/ha de massa fresca de palma por ano, fazendo do Brasil um dos
maiores produtores mundiais desta cultura (FARIAS et al. 2000; SANTOS et al., 2006;
DUBEUX JUNIOR et al. 2013)
Mesmo

apresentando

enorme

rusticidade

adaptabilidade

condições

edafoclimáticas da região Nordeste, a cultura da palma sofre com o ataque de pragas e
doenças que podem reduzir significativamente o seu potencial produtivo. Dentre as doenças
que acometem a palma forrageira as manchas e podridões nos cladódios aparecem como um
dos principais causadores de danos na cultura (GRANATA, 2001).
Dentre os agentes fitopatogênicos causadores de manchas nos cladódios destaca-se o
gênero fúngico Colletotrichum sp., responsável pela antracnose em uma infinidade de culturas
agrícolas nas mais diversas regiões do planeta. Este gênero fúngico está presente em todas as
regiões tropicais e subtropicais do mundo, causando doenças em uma infinidade de
hospedeiros, que vão de fruteiras, a gramíneas, olericolas, oleaginosas, essências florestais,
cereais, dentre outros (KELLY; OLSEN, 2011).

O gênero Colletotrichum é bastante diverso, com uma infinidade de espécies
conhecidas e com novas espécies sendo descritas a cada dia. A diversidade existente neste
gênero dificulta a sua classificação, sendo necessárias diversas técnicas para caracterizar
corretamente suas espécies, técnicas estas que vão desde a caracterização morfocultural das
suas estruturas até a caracterização molecular, utilizando técnicas de sequenciamento genético
(KUMAR et al. 2011; DEAN et al. 2012; WEIR et al. 2012).
Os fungos fitopatogênicos podem ser encontrados em todos os ecossistemas do
planeta podendo se desenvolver em locais com baixas temperaturas até regiões mais quentes.
Esta diversidade de habitats possibilita a separação geográfica de algumas espécies e gêneros
que são mais sensíveis e que necessitam de condições especificas para o seu desenvolvimento.
Contudo alguns gêneros fúngicos, a exemplo do Colletotrichum, podem suportar variações de
temperatura e umidade que lhes permitem colonizar diversos hospedeiros nas mais variadas
condições edafoclimáticas do planeta (DODD et al. 1992; AGRIOS, 2005; KENAGA, 1994).
Desta maneira, objetivou-se com esse trabalho caracterizar a etiologia, a resistência e
a epidemiologia entre isolados de Colletotrichum sp. e genótipos de palma (N. cochenillifera).

REVISÃO DE LITERATURA

2.1

Palma Forrageira
A palma forrageira (Opuntia fícus-indica Mill e Nopalea cochenillifera Salm-Dyck)

tem como seu centro de origem o México, sendo cultivada atualmente em todo o mundo,
desde o Canadá até a Argentina, do nível do mar até 5100 metros de altitude no Peru. A palma
foi levada a Espanha em 1520, sendo levada então para Portugal, África, Ásia e Oceania
(BARRIOS; MUÑOZ-URÍAS, 2001; HOFFMAN, 2001). São representantes da família das
cactáceas e estão divididas em aproximadamente 178 gêneros com cerca de 2000 espécies
(TAYLOR et al., 2002), sendo que nos gêneros Opuntia e Nopalea, são encontradas as
cactáceas mais utilizadas como plantas forrageiras (SILVA et al., 1990).
Mundialmente, a palma forrageira é utilizada para o consumo humano como verdura,
fruta fresca ou processada, utilizada na medicina, como fonte de energia, na indústria de
cosméticos, fabricação de adesivos, fibras para artesanato, fabricação de papel, corantes,
mucilagens, antitranspirantes, ornamentação e para produção de forragem (SANTOS et al.,
2012).
Segundo Pessoa (1967) a palma foi inicialmente introduzida no Brasil pelos
portugueses, provavelmente trazidas das Ilhas Canárias, com o objetivo de hospedar o inseto,
denominado cochonilha do carmim [Dactylopius coccus Costa (Homóptera, Dactylopiidae)],
que não causa danos à planta quando bem manejada, e que produz um corante vermelho
(carmim). Contudo, o cultivo da palma com este objetivo não obteve sucesso e a partir de
então passou a ser cultivada como planta ornamental (SANTOS et al., 2006). Apenas na
primeira década do século XX a palma começou a despertar interesse como forrageira, sendo
introduzida no Nordeste brasileiro e disseminada por ordem do governo após a seca de 1932,
seu cultivo foi introduzido do Piauí a Bahia, tratando-se assim do primeiro trabalho
governamental de difusão da cultura (LIMA et al., 2001).
No ano de 2014 o Governo Federal lançou o Projeto de Suporte de Plantio de Palma
Forrageira (REPALMA), com o intuito de distribuir sementes de palma forrageira livres de
pragas e doenças, através da implantação de unidades de produção de palma em áreas onde a
cultura foi dizimada por pragas e pelos seguidos anos de seca na região semiárida.
A Empresa Pernambucana de Pesquisa Agropecuária (IPA) detém um banco de
germoplasma de palma forrageira, localizado na Estação Experimental de Arcoverde (PE),
com cerca de 1.400 acessos de diferentes materiais, sendo 200 destes introduzidos de vários
locais como o México, EUA, África do Sul, Argélia, Chile entre outros (SANTOS et al.,

2006). No país, há a predominância de três cultivares para fins forrageiros, a gigante ou
graúda, a redonda e a miúda ou doce.
Opuntia fícus-indica, popularmente referida como palma Gigante ou Graúda, é uma
planta de porte médio e caule pouco ramificado, conferindo aspecto ereto e crescimento
vertical e pouco frondoso para planta. Os cladódios têm forma oval elíptica ou sub ovalada e
coloração verde fosco, podendo pesar entre 1kg e 1,8kg, medindo entre 40cm e 50cm de
comprimento. As flores são hermafroditas, de coloração amarela e cuja corola fica aberta na
antese, o fruto é uma baga ovoide de coloração amarela tornando-se roxo quando maduro.
Esta cultivar é considerada mais produtiva e resistente à restrição hídrica, no entanto é
considerada menos palatável para os animais e com menor valor nutritivo. (SANTOS et al.,
1990; SANTOS et al., 2001).
Já Nopalea cochenillifera, (palma Miúda ou palma Doce), tem cladódio com forma
acentuadamente obovada e coloração verde intenso brilhante, pesando aproximadamente 350g
e medindo 25cm de comprimento. As flores são vermelhas e sua corola permanece meio
fechada durante o ciclo, sendo que o fruto é uma baga de coloração roxa. Esta espécie é
considerada mais exigente em água e quanto à qualidade do solo, apresentando maior
produção de matéria seca quando comparada com O. fícus-indica (SANTOS et al., 1990;
SANTOS et al., 2001). Nos últimos anos, têm-se observado grande expansão das áreas
cultivadas com palma miúda no Nordeste brasileiro em função de sua resistência à cochonilha
do carmim e de suas características de palatabilidade e digestibilidade para os ruminantes.
Desde a primeira intervenção governamental na produção de palma para fins
forrageiros sua área plantada vem crescendo após períodos prolongados de estiagem na região
semiárida. Nos últimos anos, a palma forrageira voltou a ser cultivada em larga escala pelos
criadores das bacias leiteiras, principalmente de Pernambuco, Alagoas, Ceará e Paraíba
(SANTOS et al., 2006). Segundo Dubeux Junior et al. (2013), o Brasil possui uma área
aproximada de 600 mil hectares plantados com palma forrageira, sendo sua produção quase
que exclusivamente encontrada na região semiárida do Nordeste brasileiro.
A agropecuária é uma das principais atividades desenvolvidas no Nordeste do Brasil,
com destaque para os rebanhos bovino, ovino e caprino, que de forma geral são criados
extensivamente. No Nordeste a pecuária é prejudicada pelas constantes secas e períodos
curtos de chuvas, que contribui para a baixa produtividade nos rebanhos. A baixa
disponibilidade de forragem faz com que os produtores procurem por alimentos alternativos,
necessitando maiores investimentos. Nesta realidade, a palma forrageira aparece como
alternativa de cultivo, adaptada ao clima semiárido, por ter mecanismo fisiológico especial no

que se refere a absorção, aproveitamento e perda de água (OLIVEIRA et al., 2010; SANTOS
et al., 2012).
O potencial forrageiro da palma vem da sua grande capacidade de absorver e
aproveitar a água em seus processos fisiológicos, apresentando eficiência de uso de água de
até 11 vezes quando comparada com plantas de mecanismo C3 (CAVALCANTE et al.,
2014), com algumas variedades acumulando até 90% de seu peso vivo em água (SANTOS et
al., 2006), e pela capacidade de produzir grande quantidade de matéria verde como, por
exemplo, a palma miúda que produz, em média, 68 t.ha-1.ano-1 de massa verde, em densidade
de cultivo de 20.000 plantas.ha-1 (VASCONCELOS et al., 2007), e a redonda que produz, em
média, 175 t.ha-1.ano-1 de massa verde na mesma densidade de plantio (FARIAS et al., 2000).
Mesmo sendo bastante adaptada às condições edafoclimáticas da região semiárida do
Brasil, a palma forrageira é relativamente exigente quanto às características físico-químicas
do solo. Desde que apresentem boa fertilidade, as áreas de plantio podem ser de textura
arenosa à argilosa, sendo mais recomendados solos argilo-arenosos. Dependendo do
espaçamento de plantio e nível de fertilidade do solo, nos plantios mais adensados podem ser
utilizadas 30t de esterco de curral/ha. Além da fertilidade, é fundamental que os solos sejam
de boa drenagem. O bom rendimento da palma forrageira está relacionado a precipitações que
variam de 400 a 800 mm de chuva por ano, umidade relativa acima de 40% e temperaturas
médias de 25 °C (LOPES et al., 2012; OLIVEIRA et al., 2010).
Dada suas características morfofisiológicas, que garantem sua sobrevivência nas
regiões áridas e semiáridas, a palma forrageira desempenha papel de grande importância
como volumoso nos sistemas produtivos no semiárido nordestino, sendo utilizada
principalmente na bovinocultura leiteira e na caprino e ovinoculturas, como fonte alternativa
de água para os animais e como suplemento nas rações nos períodos mais secos do ano uma
vez que. Diversas variedades de palma forrageira apresentam composição química e
digestibilidade similares aos encontrados em silagens de milho e sorgo, tendo como único
fator limitante na alimentação animal a quantidade de matéria seca e fibra que pode ser
facilmente suplementada com outros volumosos (SANTOS et al., 2006 SILVA; SANTOS
2006).
Mesmo apresentando grande rusticidade e adaptação a condições de pouca
disponibilidade de água, a cultura da palma forrageira está sujeita ao ataque de diversas
doenças que podem ser causadas por vários agentes, como bactérias, micoplasmas, fungos,
nematóides e vírus (GRANATA, 2001). A expansão das áreas de plantio, juntamente com o

uso de sistemas de irrigação projetados para aumentar a produtividade da cultura favorece o
desenvolvimento destas doenças.

2.2

Principais Doenças na Cultura da Palma Forrageira
As doenças da palma têm sido pouco estudadas no Brasil e quase todos os trabalhos

apenas descrevem o assinalamento, a sintomatologia e a patogenicidade dos agentes
causadores. As doenças de origem fúngica são as mais importantes, podendo afetar cladódios,
sistema radicular e frutos nas fases de pré e pós-colheita. A maior severidade das doenças
fúngicas tem sido correlacionada com estresse nutricional, suscetibilidade de cultivares e
clones e adensamento de plantio. Os danos causados por essas doenças à cultura reduzem a
produtividade e limitam o cultivo de espécie, cultivar ou clone de maior interesse de cultivo
ou valor comercial (GRANATA, 2001, BARBOSA et al., 2012).
Diversos autores (KIM et al., 2000b, GRANATA 2001, GRANATA; SIDOTI 2002,
AYALA-ESCOBAR et al., 2006, QUEZADA-SALINAS et al., 2006, SANTOS et al., 2006,
SOUZA et al., 2010, BARBOSA et al., 2012, BEZERRA et al., 2012) relatam um complexo
de patógenos que podem ser associados às doenças mais comuns encontradas nos palmais do
Brasil e de diversos países produtores desta cultura. Dentre as principais doenças elencadas
pelos autores podemos citar:
Podridão de Fusário: o desenvolvimento desta doença é favorecido por solos de
elevada acidez, baixa permeabilidade e alta umidade, ocorrendo nas raquetes-sementes e
raquetes da base em plantas adultas. Tradicionalmente está associada aos fungos Fusarium
solani (Mart.) Sacc. e F. oxysporum Schltdl. Os sintomas se iniciam com podridão de
consistência mole e coloração esverdeada na raquete da base. Tanto as raquetes primárias
quanto as secundárias murcham e tombam sobre a planta poucos dias após a infecção. Os
tecidos da raquete infectada tornam-se aquosos e escurecem. O seccionamento dos tecidos
afetados revela uma cor vermelha evidente na membrana celular do tecido afetado
(GRANATA 2001, SANTOS et al., 2006).
Podridão Negra: comumente associada ao fungo Lasiodiplodia theobromae (Pat.)
Griffon & Maubl., a podridão ocorre, geralmente, a partir do local de inserção das raquetes,
sendo no início de cor marrom e, em seguida, torna-se escura devido à produção de estruturas
do fungo. A podridão é consistente, com abundante exsudação de goma de coloração amarelo
leitosa tornando-se, posteriormente, enegrecida (SOUZA et al., 2010).
A Podridão de Macrofomina, está diretamente associada ao fungo Macrophomina
phaseolina (Tass.) Goid, ocorre com bastante frequência no México, podendo causar morte

em 50% das plantas nas áreas infectadas. A doença se manifesta inicialmente por meio de
manchas cloróticas na parte externa e verde escuras na parte interna dos cladódios. Com a
evolução da doença, ocorrem rachaduras no tecido devido a uma putrefação semi-aquosa, e se
torna preta, o que é seguido de uma perfuração no local da mancha (GRANATA, 2001).
A Podridão do colo na palma forrageira é comumente associada a alguns patógenos
do gênero Phytophtora como, por exemplo, P. cactorum (Leb. e Cohn) Schroet. e
P.nicotianae (Breda Hahn). Em épocas quentes e úmidas, a planta doente exsuda uma goma
na base do caule, perto da coroa. As plantas jovens apresentam uma putrefação marrom com
um exsudato líquido. As partes internas do tecido enfermo apodrecem e se tornam
avermelhados. A putrefação não se estende mais do que 20 a 30 cm acima da coroa, mas pode
abranger toda a circunferência do caule, causando a morte da planta. Os sintomas das plantas
afetadas são: interrupção do crescimento, clorose e murcha dos cladódios. A putrefação
resulta numa menor turgescência do caule e muitas vezes as plantas tombam. Quando os
zoósporos penetram nas raízes, ocorrem putrefação e desintegração do tecido (CACCIOLA &
MAGNANO, 1988; GRANATA, 2001).
Mancha de Alternaria: atribuída ao fungo Alternaria tenuis Nees. Ex Pers, foi
identificada no interior de Pernambuco ocorrendo de forma epidêmica com 70% de incidência
em cultura de palma miúda e causando intensa queda das raquetes na cultura. Na palma miúda
os sintomas da doença caracterizam-se por manchas de coloração preta nas raquetes, nas
formas circulares ou elípticas, medindo 1,0-3,0 cm de diâmetro com abundante esporulação
na superfície da lesão. As lesões podem se estender de uma face a outra da raquete, exibindo
perfurações devido à queda do tecido infectado. As manchas podem coalescer, formando
grandes áreas necrosadas e causando queda na raquete das plantas (SWART; SWART, 2003;
SANTOS et al., 2006).
A Mancha Negra pode ser associada a fungos do gênero Pseudocercospora. Em
palmas atacadas por estes fungos podem ser detectados dois sintomas distintos. Inicialmente
as plantas apresentam descoloração da cutícula adquirindo cor clara com pequenos pontos de
cor azeitona. Posteriormente, as manchas adquirem coloração café-escuro, com diâmetro entre
3 e 4 cm, apresentando também uma margem amarela. Em seguida, a parte afetada seca e
muitas vezes o tecido afetado cai deixando orificios através do cladódio. Outro sintoma
observado, embora menos frequente, caracteriza-se por manchas indefinidas que podem
invadir todo ou parte do cladódio. A sua incidência mais elevada foi observada nos cladódios
sombreadas e na presença de umidade relativa elevada (MÉNDEZ-GALLEGOS et al., 2008).
Realizando trabalhos de caracterização morfológica e molecular do agente causal de uma

nova doença que atingiu as plantações de palma forrageira no México, Ayala-Escobar et al.
(2006), identificaram a nova espécie Pseudocercospora opuntiae como o agente causal da
mancha negra em palma forrageira no México.
Buscando entender as origens da mancha negra em palma forrageira, QuezadaSalinas et al. (2006), realizaram diversos ensaios com materiais apresentando sintomas de
manchas negras circulares de tamanho definido e manchas negras de formato indefinido que
podem tomar parte ou até todo o cladódio, provenientes do Estado de Morelos no México,
identificando como agentes causais da doença os fungos Pseudocercospora sp. e
Colletotrichum gloeosporioides. Méndez-Gallegos et al. (2009), também associaram C.
gloeosporioides como um dos agentes causadores da mancha negra, quando a doença está em
estágio mais avançado.
Colletotrichum gloeosporioides é conhecido como o causador da antracnose, um
problema em palmas cultivadas em épocas úmidas ou em áreas irrigadas. O patógeno pode
causar lesões tanto nas raquetes quanto nos frutos e consiste de manchas marrom escuras com
pontos avermelhados, começando geralmente pelas bordas dos cladódios, estendendo-se ao
restante do mesmo. Quando ativo o fungo produz uma massa de esporos vermelho alaranjado
no interior das lesões (KELLY; OLSEN, 2011).
Kim et al. (2000a), observaram mancha negra em pitaya (Hylocereus trigonus)
cultivada em diversas casas de vegetação em regiões produtoras na Coreia. Os sintomas
encontrados incluíam podridão úmida de coloração marrom clara ou podridão aquosa nas
hastes das plantas. O fungo formava colônias cinza escuro, densa ou flocosa em meio de
batata dextrose ágar, frequentemente apresentando vários acérvulos de coloração rosa clara,
geralmente rodeados por setas. Os conídios eram hialinos, cilíndricos, unicelulares e
arredondados no final. A partir destas características os autores identificaram o agente causal
da mancha negra como Colletotrichum sp.
Em outro trabalho realizado na ilha de Cheju também na Coreia, Kim et at. (2000b),
identificaram, a partir de características morfológicas e da sintomatologia na planta, o fungo
C. gloeosporioides e o seu teleomorfo Glomerella cingulata Stoneman causando antracnose
em extensas áreas produtoras de palma forrageira (Opuntia fícus-indica Mill) utilizada na
produção de alimentos processados.
Buscando compreender as origens de lesões de antracnose em hastes de pitaya (H.
polyrhizus) cultivado nos estados de Kedah e Penang na Malásia, Vijaya et al. (2015),
analisaram 10 isolados de Colletotrichum obtidos a partir de lesões típicas nas hastes das
plantas. A partir de características morfológicas, de cor e aparência das colônias e da forma

dos conídios, bem como de sequencias das regiões ITS, TUB2, AC e GAPDH, os isolados
foram identificados como sendo do fungo C. truncatum, sendo este o primeiro relato do
patógeno C. truncatum causando antracnose em H. polyrhizus na Malásia.

2.3

Gênero Colletotrichum
Colletotrichum spp. é um importante gênero fúngico que abrange espécies

saprofíticas e fitopatogênicas associadas a plantas no mundo, principalmente em regiões
tropicais e subtropicais (BAILEY et al., 1992), atingindo uma ampla gama de hospedeiros
incluindo cereais, legumes, vegetais, culturas perenes e árvores frutíferas (KUMAR et al.,
2011). Em levantamento realizado por Dean et al. (2012), a importância para a agricultura
mundial do gênero Colletotrichum foi mais uma vez reconhecida quando este foi classificado
como um dos 10 fungos de maior importância mundial.
Muitas incertezas existem no que diz respeito à sistemática de fungos patogénicos
deste género e, a depender dos critérios utilizados, o número de espécies pode variar de 29 a
mais de 700 (von ARX, 1957; SUTTON, 1992). Uma das espécies de taxonomia mais
confusa é C. gloeosporioides, um exemplo disto é que 594 espécies de Colletotrichum foram
reclassificadas por von Arx como sinônimos de C. gloeosporioides. Segundo Phoulivong et
al. (2010) C. gloeosporioides pode infectar pelo menos 1000 espécies de plantas.
As espécies de Colletotrichum utilizam diversas estratégias para invadir o tecido dos
hospedeiros, que vão desde a colonização hemibiotrófica intracelular até a necrotrófica
subcuticular, além disto, estes agentes patogénicos desenvolveram uma série de estruturas
especializadas de infecção como, por exemplo, tubos germinativos, apressórios e hifas
intracelulares, que são utilizados na colonização de hospedeiros através de ferimentos,
aberturas naturais ou diretamente via apressórios. Por causa disto, as espécies de
Colletotrichum proporcionam excelentes modelos para o estudo da base molecular da
infecção, diferenciação de estruturas e interações entre fungos e plantas (JEFFRIES et al.,
1990; PERFECT et al., 1999; DEAN et al., 2012).
Em alguns casos, várias espécies de Colletotrichum ou seus biótipos podem formar
um complexo de infecção em um único hospedeiro (FREEMAN et al., 1998). O potencial de
inoculação cruzada de Colletotrichum spp. tem sido amplamente relatado como, por exemplo,
C. gloeosporioides isolado de abacate e manga que também pode produzir lesões em
morango, pimenta, goiaba e mamão que são cultivados em áreas adjacentes (SANDERS;
KORSTEN, 2003).

Em decorrência da grande quantidade de hospedeiros e da inoculação cruzada das
espécies de Colletotrichum, a distinção entre as espécies deste gênero é de fundamental
importância para o desenvolvimento ou aperfeiçoamento de práticas que visam o controle
eficiente das doenças causadas por esses fungos (FREEMAN et al., 1998).
Antes do acesso a sequencias de DNA, a taxonomia do Colletotrichum era baseada
em características como: espécies hospedeiras, substrato, tamanho e formato de conídios,
formato do apressório, velocidade de crescimento da cultura, cor da cultura, surgimento ou
não de fase teleomorfa, etc. No entanto, surgiram problemas porque muitas das características
morfológicas mudam sob diferentes condições de crescimento, além disto estas características
também podem mudar ou se perder com repetidos subcultivos (WEIR et al., 2012).
Atualmente a morfologia e patologia não são suficientes na distinção entre espécies
de Colletotrichum e métodos baseados no DNA são agora rotineiramente utilizados em
conjunto com características morfológicas para identificar e caracterizar Colletotrichum spp.
(McKAY et al., 2009; RATANACHERDCHAI et al., 2010). A região ITS do 5.8S rDNA tem
sido amplamente sequenciada em estudos de identificação molecular das espécies do gênero
Colletotrichum (MILLS et al., 1992). A epitipificação para C. gloeosporiodes com base nas
sequências de ITS, por exemplo, possibilitou um grande avanço no entendimento deste gênero
(CANNON et al., 2008). No entanto, já são conhecidas as limitações do gene ITS para
identificação de algumas espécies, e o conhecimento de genes mais informativos tornou-se
cada vez mais necessário (WEIR et al., 2012; SHARMA et al., 2013).
Através da análise multilocus, quando mais de uma região genômica é utilizada na
caracterização molecular dos isolados, as espécies deste gênero foram separadas em nove
principais complexos: C. gloeosporioides, C. boninense, C. acutatum, C. graminicola, C.
spaethianum, C. destructivum, C. dematium, C. truncatum, C. orbiculare (CANNON et al.,
2012) e posteriormente, o complexo C. brevisporum foi adicionado (NOIREUNG et al.,
2012).
A partir do conceito de complexos dentro do gênero Colletotrichum vários trabalhos
foram desenvolvidos, como as revisões dos complexos C. gloeosporiodes, C. boninense, C.
acutatum, C. destructivum, com base em análise multilocus utilizando os genes GAPDH,
ACT, CHS-1, TUB2, CAL, HIS3, GS, superóxido-dismutase de manganês (SOD) e a região
ITS (CANNON et al., 2012; WEIR et al., 2012; DAMM et al., 2012a; DAMM et al., 2012b;
DAMM et al., 2014).
Nos últimos anos o gene GAPDH tem sido utilizado em muitos trabalhos como
medida inicial de diversidade de espécie do gênero Colletotrichum (LIMA et al., 2013;

COSTA, 2014) e tem sido indicado como referencial na identificação de espécies, visto que
sua combinação com outros genes pode ser utilizada para distinguir de forma confiável a
maioria das espécies do gênero (WEIR et al., 2012).

2.4

Efeito da temperatura e umidade sobre a severidade de doenças.
Fatores ambientais tem papel fundamental no desenvolvimento epidemiológico de

doenças. As relações entre intensidade e duração da chuva, disposição da lavoura e dispersão
do inóculo possibilitam diferentes níveis de severidade das doenças (DODD et al., 1992).
Segundo Agrios (2005) a temperatura e a umidade na superfície da planta são os fatores
ambientais que mais afetam o início e o progresso de doenças infecciosas em plantas. Existem
quatro combinações de temperatura e umidade que favorecem um grande número de doenças
e seus agentes causais: quente e seco, quente e úmido, frio e seco, frio e úmido (KENAGA,
1994).
A temperatura interage com outros fatores, como umidade na superfície das folhas,
umidade no ambiente, luz ou microbiota competidora (ROYLE; BUTLER, 1986),
influenciando no crescimento micelial, na esporulação, na germinação de conídios e na
coloração das colônias, podendo ser utilizada, em alguns casos, como parâmetro para
diferenciação de espécies (MAIA et al., 2011).
A duração da umidade superficial, no entanto, aparenta ter a relação mais direta com
a germinação, infecção e crescimento do patógeno no hospedeiro. A umidade é indispensável
para a germinação da maioria dos esporos fúngicos e para a penetração do tubo germinativo
no hospedeiro, além de aumentar a suscetibilidade a certos patógenos, afetando a incidência e
a severidade, possibilitando a ocorrência de doenças (ARINZE, 1986).
O efeito do clima no progresso da doença torna-se aparente quando se considera a
importância da época do ano, isto é, as condições climáticas e o estádio de crescimento das
plantas, quando o hospedeiro e o patógeno podem coexistir, a duração e a frequência de
temperatura e pluviosidade favorável, o tempo de aparecimento dos vetores e a duração do
ciclo de infecção de uma doença em particular (KENAGA, 1994).
Variáveis de clima como temperatura, umidade relativa e número de dias chuvosos
têm grande influência no desenvolvimento da antracnose. Em condições de temperatura mais
amenas, o patógeno pode crescer rapidamente e surtos severos de doença são esperados
durante estações chuvosas prolongadas (PANDEY et al., 1997). Em trabalho com antracnose
em goiaba Soares et al. (2008), observaram que a taxa de germinação e formação dos
apressórios no C. gloeosporioides é maior em temperaturas que variam de 15 a 30 °C, com

temperatura ótima de 25 °C, já C. acutatum é mais sensível as variações de temperatura, com
ponto ótimo a 20 °C. O período de umidade afeta mais C. acutatum que C. gloeosporioides,
apresentando menor germinação com 6 horas de umidade do que com 12 ou 24 horas.
As variáveis ambientais, principalmente a temperatura e a umidade relativa
influenciam diretamente a disseminação de C. gossypii South var. cephalosporioides S.A.
Costa bem como o progresso da ramulose no algodoeiro (CIA; SALGADO, 2005). Em
regiões com temperaturas elevadas, a viabilidade dos esporos e a formação de lesões são
reduzidas, culminando com a redução no progresso da doença. Por outro lado, a maior
incidência de tombamento de plântulas de algodoeiro, em pré e pós-emergência, é atribuída a
baixas temperaturas no solo durante o período de germinação (TANAKA, 1995).
A relação de dependência entre temperatura e período de umidade com a
percentagem de doença, estabelecida sob condições controladas, nem sempre pode ser
observada no campo. Isto ocorre especialmente por causa das variações de temperatura e
umidade nas lavouras, além disto, também existem vaiáveis no campo que não estão presentes
em estudos com condições controladas, como plantas em estágios de maturação e em
condições fisiológicas diferentes (BIALE, 1950).
O conhecimento sobre o processo de infecção e colonização do Colletotrichum spp.,
e os fatores ambientais que influenciam este processo, são pré-requisitos para o
desenvolvimento de estratégias de controle eficientes e no desenvolvimento de sistemas de
prevenção de doenças (FRAISSE et al., 2006; SOARES et al., 2008).

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ETIOLOGIA DA MANCHA MARROM DE PALMA (Nopalea cochenillifera

Salm-Dyck).

RESUMO
A palma forrageira (Nopalea cochenillifera), começou a despertar interesse como forrageira
na primeira década do século XX, sendo introduzida no Nordeste brasileiro. Mesmo
apresentando grande rusticidade e adaptação a condições climáticas da região semiárida, a
cultura da palma forrageira está sujeita ao ataque de diversas pragas e doenças que causam
grandes prejuízos para a sua produção. Dentre os agentes causais de doenças em palma, os
fungos do gênero Colletotrichum são responsáveis por danos econômicos considerais à
cultura. Um dos maiores problemas na caracterização das espécies de Colletotrichum é a sua
grande variabilidade morfocultural, sendo necessária a utilização de diversas técnicas de
identificação, dentre elas, estão as técnicas de biologia molecular, que possibilitam
identificação mais precisa das espécies deste gênero fúngico. Desta forma, objetivou-se neste
trabalho realizar um estudo sobre a etiologia de isolados de Colletotrichum sp. obtidos a partir
de lesões características de mancha marrom em cladódios de palma forrageira. Para tanto
cladódios apresentando sintomas de manchas marrons em sua superfície, foram coletados em
áreas produtoras nos estados de Alagoas e Pernambuco. No laboratório foi realizado o
isolamento dos fitopatógenos e obtenção da cultura monospórica dos mesmos para posterior
identificação. O material isolado foi caracterizado a partir de técnicas moleculares utilizando
as seguintes regiões genômicas: GAPDH, TUB2 e ITS, em conjunto com técnicas de
caracterização morfológica e cultural. A caracterização dos isolados possibilitou a
identificação das espécies C. siamense, C. fructicola e C. karstii causando doença em palma
forrageira no Brasil.
Palavras-Chave: Morfologia. Sequenciamento genético. Antracnose.

ETIOLOGY BROWN STAIN IN PALMA (Nopalea cochenillifera Salm-Dyck).

ABSTRACT
The cactus (Nopalea cochenillifera), began to arouse interest as forage in the first decade of
the XX century, being introduced in the Brazilian northeast. Even with great hardiness and
adaptation to climatic conditions of the semiarid region, the culture of spineless cactus is
subject to attack by various pests and diseases that cause great harm to their production.
Among the causative agents of diseases in cactus, fungi of the genus Colletotrichum are
responsible for considerais economic damage to the crop. One of the biggest problems in the
characterization of species of Colletotrichum is its great variability morphocultural, requiring
the use of several identification techniques, among which are the techniques of molecular
biology, which allow more precise identification of the species of this fungal genus. Thus, the
objective of this study was to conduct a study on the etiology of Colletotrichum sp. obtained
from injuries brown stain characteristics in cladodes of cactus pear. Therefore cladodes with
symptoms of brown spots on its surface, were collected in producing areas in the states of
Alagoas and Pernambuco. In the laboratory we performed the isolation of plant pathogens and
obtaining monospórica culture the same for later identification. The isolated material was
characterized using molecular techniques from the following genomic regions: GAPDH,
TUB2 and ITS, together with morphological and cultural characterization techniques.
Characterizing isolates allowed the identification of C. siamense, C. karstii and C. fructicola
causing disease in forage cactus in Brazil.
Keywords: Morphology. Genetic sequencing Anthracnose.

3.1

Introdução
O potencial forrageiro da palma, aliado à sua capacidade de reter e conservar água,

faz dessa cultura uma alternativa viável para os prolongados períodos de seca que ocorrem no
Nordeste brasileiro. Sendo plantada na maioria dos estados do Nordeste, a palma forrageira
fornece água e reserva energética para os rebanhos de bovinos, caprinos e ovinos durante
vários meses do ano. A sua adaptabilidade às condições edafoclimáticas da região semiárida
não isenta a palma forrageira do ataque de pragas e doenças (SANTOS et al., 2006; SANTOS
et al., 2012; CAVALCANTE et al., 2014).
Entre as principais doenças que atacam a cultura os fungos causadores de podridões e
manchas dos cladódios estão entre os mais devastadores para a palma forrageira. O gênero
Colletotrichum já foi relatado causando danos econômicos em diversas culturas agrícolas de
importância mundial, como cereais, frutas, hortaliças, plantas medicinais, dentre outros. Na
palma forrageira este fungo é conhecido por causar antracnose nos frutos e manchas nos
cladódios, já sendo relatado em diversos países produtores de palma (GRANATA, 2001;
BARBOSA et al., 2012).
O gênero Colletotricum apresenta uma grande variedade de espécies, sendo
encontrado em todos os continentes. Tal variedade de espécies, hospedeiros e ambientes onde
este fungo é encontrado dificulta a sua caracterização de forma eficaz, o que ocasionou,
durante muitos anos, diversas sinonímias e informações conflitantes sobre a sua taxonomia.
Originalmente este gênero era identificado a partir de características morfológicas e culturais,
dos seus hospedeiros, dos sintomas que causavam em seus hospedeiros e das condições
edafoclimáticas nas quais se desenvolviam. Contudo, com o surgimento das técnicas de
biologia molecular observou-se as diversas falhas na classificação deste fitopatógeno (von
ARX, 1957; SUTTON, 1992; DEAN et al., 2012; WEIR et al., 2012).
O sequenciamento da região genômica ITS do 5.8S rDNA foi utilizado durante
vários anos como ferramenta para identificar e reclassificar as diversas espécies de
Colletotrichum, contudo com o passar dos anos e com o aperfeiçoamento das técnicas de
biologia molecular observou-se que este fitopatógeno não pode ser classificado apenas a partir
de uma região genômica. A partir deste momento teve início a exploração de novas regiões
genômicas com potencial para auxiliar na taxonomia deste e de outros fitopatógenos.
Atualmente são utilizadas várias regiões genômicas na caracterização molecular do gênero
Colletotrichum, tais como os genes GAPDH, ACT, CHS-1, TUB2, CAL, HIS3, GS,
superóxido-dismutase de manganês (SOD) e a região ITS (MILLS et al., 1992; CANNON et

al., 2012; WEIR et al., 2012; DAMM et al., 2012a; DAMM et al., 2012b; DAMM et al.,
2014).
Vale ressaltar que a caracterização molecular não é aceita como única ferramenta
para identificar uma espécie fúngica, sendo necessária a utilização de uma série de
ferramentas como, por exemplo, características culturais, morfológicas e hospedeiros, para
caracterizar

classificar

corretamente

fitopatógenos

(McKAY

al.,

2009;

RATANACHERDCHAI et al., 2010).
Desta forma objetivou-se nesse trabalho realizar estudo sobre a etiologia de isolados
de Colletotrichum sp. obtidos a partir de lesões características de mancha marrom em
cladódios de palma forrageira.

3.2

Material e Métodos
O trabalho foi conduzido no Laboratório de Fitopatologia Molecular e Virologia

vegetal do Centro de Ciências Agrárias (CECA) da Universidade Federal de Alagoas (UFAL).

3.2.1

Origem, obtenção e preservação dos isolados do gênero Colletotrichum.
Cladódios apresentando sintomas de machas necróticas em sua superfície (Figura 1),

foram coletados em áreas produtoras de nove municípios nos estados de Alagoas e
Pernambuco. (Tabela 1). Em cada área foram coletados 50 cladódios apresentando sintomas
de manchas (Figura 1).

Figura 1 - Sintomas de manchas em cladódios de palma forrageira miúda.

Fonte: Feijó, F. M.

Tabela 1 - Local e ano de coleta de cladódios de palma forrageira
Município de Coleta
Atalaia/AL
Arapiraca/AL
Estrela de Alagoas/AL
Delmiro Gouveia/AL
Santana do Ipanema/AL
Cassimbinhas/AL
Bom Conselho/PE
São João/PE
Lajedo/PE

Coordenadas Geográficas
N
W
09º 30’ 07"
36º 01' 22"
09° 47’ 54”
36° 36’ 00”
09° 23’ 24’’
36° 45' 36"
09° 38’ 58”
37° 99’ 90”
09° 37’ 04”
37° 24’ 84”
09° 40’ 16”
36° 99’ 14”
09° 10' 12"
36° 40' 48"
08° 52' 33"
36° 22' 01"
08° 65’ 83”
36° 32’ 97”

Ano
2014
2015
2015
2015
2015
2015
2015
2015
2015

Fonte: Autor.

No Laboratório, os cladódios foram lavados em água corrente e secos ao ar. Foi
realizada a técnica de isolamento indireto onde foram retirados fragmentos da área de
transição entre o tecido sadio e o doente, os quais foram desinfestados com soluções de álcool

a 70% por 30 segundos, hipoclorito de sódio a 1% por um minuto, lavados em água destilada
esterilizada (ADE), postos para secar em papel de filtro e posteriormente transferidos para
placas de Petri contendo meio BDA (Batata – Dextrose – Ágar). Após a formação das
colônias, discos de meio de cultura contendo o crescimento do fungo, foram retirados das
bordas das colônias e transferidos para placas de petri contendo meio BDA e mantidos em
temperatura ambiente por 10 dias, até o surgimento das estruturas de reprodução do fungo
para posterior identificação.
Para a obtenção das culturas monospóricas foram preparadas suspensões de esporos
através de uma raspagem superficial sobre a colônia e colocada em um recipiente contendo
1mL de ADE. Em seguida, foram realizadas contagens de esporos em câmara de Neubauer de
forma a ajustar a suspensão para 105 esporos/ml. Após a diluição foram colocados 40µl desta
suspensão em uma placa de petri contendo meio AA (ágar - água) e espalhada uniformemente
com auxílio de uma alça de Drigalski. As placas de Petri contendo os esporos foram
examinadas no microscópio óptico e os esporos individuais e germinados foram transferidos
para placas contendo BDA, onde foram mantidas à temperatura ambiente.
Após a obtenção das culturas monospóricas, os isolados foram preservados
utilizando dois métodos: no primeiro método foram utilizados tubos de ensaio contendo meio
de cultura BDA, onde se transferia um disco de micélio do fungo 5 mm de cada isolado por
tubo; o segundo método utilizado foi o de Castellani, onde cinco discos de 5mm contendo o
micélio foram transferidos para frascos de vidro (10mL) contendo 5mL de ADE.

3.2.2

Teste de patogenicidade
O teste de patogenicidade foi realizado em cladódios sadios os quais foram tratados

com solução de hipoclorito de sódio a 1% por cinco minutos, posteriormente lavados em água
destilada (AD) e secos à temperatura ambiente. Foram utilizados dois métodos para o teste de
patogenicidade. No primeiro método as inoculações foram realizadas através da aplicação de
quatro gotas de 40µL de uma suspensão de esporos (106 conídios/ml) sobre a superfície dos
cladódios em posições equidistantes. Os ferimentos foram realizados com o auxílio de uma
agulha previamente flambada. Na testemunha foi utilizada apenas ADE. No segundo método
discos de micélio de 5mm foram depositados sobre os cladódios com ferimentos realizados
com uma agulha previamente flambada. Na testemunha foi utilizada apenas discos de BDA
(FLORES - FLORES et al. 2013).
Posteriormente, cada cladódio foi acondicionado separadamente em sacos plásticos
contendo um chumaço de algodão umedecido com AD, após 48h os cladódios foram retirados

dos sacos plásticos e acondicionados em BOD. O experimento foi mantido em incubadora
BOD a 25 ± 1 ºC e fotoperíodo de 12 horas por até 10 dias.

3.2.3

Caracterização molecular

3.2.3.1 Extração de DNA
A extração de DNA foi realizada segundo protocolo CTAB adaptado de Doyle &
Doyle (1987), onde o micélio dos isolados crescidos em meio líquido de Asparagina durante
cinco dias foi lavado com ADE e em seguida, macerado com nitrogênio líquido em almofariz
de porcelana com auxílio de um pistilo. Em seguida adicionou-se 2000 µL de tampão de
extração CTAB a 4% (CTAB a 4%, NaCl 1,4/M, EDTA 20/mM, Tris-HCl 100 mM, PVP a
1%) e 4 µL de β-mercaptoetanol, onde apenas 500 µL do micélio macerado foi transferido
para tubos de micro centrífuga com capacidade de 1,5 ml. Os tubos foram mantidos em banho
maria a 65°C por 30 minutos.
Após o banho maria os tubos foram deixados em repouso até atingirem temperatura
ambiente, em seguida foram adicionados 600µL de CIA (clorofórmio: álcool isoamílico 24:1) em cada tubo e as amostras foram agitadas em vortex para homogeneização.
Posteriormente, as amostras foram centrifugadas a 12.000rpm por 5 minutos. Após
centrifugação, o sobrenadante foi transferido para um novo tubo de 1,5mL onde foram
adicionados 400µL de isopropanol, as amostras foram acondicionadas a -20 °C por no
mínimo 30 minutos. Em seguida as amostras foram centrifugadas a 12.000rpm por 5 minutos.
Após a centrifugação a fase liquida foi descartada e o DNA precipitado foi lavado com 1 ml
de etanol a 70% e centrifugado por 3 minutos a 12000rpm, sendo o procedimento de lavagem
realizado duas vezes. Após as lavagens o DNA foi seco em temperatura ambiente e, em
seguida, ressuspendido com 40µL de TE (Tris- HCl 10 mM, EDTA 1 mM) (10mL) + RNAse
(50µL), na proporção de 1:49. O DNA obtido foi armazenado sob temperatura de -20°C até
sua utilização para amplificação.

3.2.3.2 Amplificação do DNA e sequenciamento dos produtos de PCR
O DNA de cada isolado foi utilizado como molde em PCR contendo primers
específicos para o gene que codifica para a proteína gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase
(GAPDH). Os produtos de PCR obtidos foram sequenciados na empresa Macrogen (Coreia
do Sul), sendo as sequências utilizadas para determinação preliminar das espécies, por meio
de inferência filogenética. Com base nessa primeira análise, representantes de cada espécie

tiveram seu DNA utilizado em outras reações visando à amplificação do gene β-tubulina
(TUB2) e da região ITS-rDNA para confirmação das espécies identificadas (Tabela 2).

Tabela 2 - Descrição dos primers usados para identificação de espécies pertencentes ao
gênero Colletotrichum
Gene

Primer
GDR
GDF
T1
Bt2B
ITS1
ITS4

GAPDH
TUB2
ITS

Sequencia (5’- 3’)
GCCGTCAACGACCCCTTCATTGA
GGGTGGAGTCGTACTTGAGCATGT
AACATGCGTGAGATTGTAAGT
ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC
TCCGTAGGTGAACCTGCGG
TCCTCCGCTTATTGATATGC

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O’Donnel; Cigelnik, 1997
Glass; Donaldson, 1995
White et al., 1990

Fonte: Autor.

As reações de amplificação foram preparadas com tampão 10X, MgCl2 50 mM,
DNTP’s 10 mM, 10 μM de cada oligonucleotídeo, 1U de Taq DNA Polimerase e 1μL de
DNA diluído (1:20). O volume final das reações foi ajustado para 30μL com água Milli-Q
auto clavada. As reações de PCR ocorreram em termociclador Applied Biosystems (2720
Thermal Cycler) nas seguintes condições: um ciclo a 94°C por 4 min (desnaturação inicial);
35 ciclos a 94°C por 45s (desnaturação), 60°C por 45s (anelamento), e 72°C por 1 min
(extensão); e um ciclo final à 72°C por 7 min, para o gene GAPDH. Para o gene TUB2, a
desnaturação inicial consistiu em 95°C por 4 min e 35 ciclos de 95°C por 30 s, 55°C por 30 s,
72°C por 45 s e um ciclo final de 7 min por 72°C. Para a região ITS, a desnaturação inicial
foi de 95°C por 2 min e 38 ciclos de 95°C por 1 min, 55°C por 30 s, 72°C por 45 s e um ciclo
final de 10 min por 72°C. Em seguida, o produto de PCR foi enviado para purificação e
sequenciamento com os mesmos primers utilizados na amplificação.

3.2.3.3 Análises filogenéticas
As sequências de nucleotídeos foram montadas com o software Códon Code Aligner
v. 4.1.1 (www.codoncode.com) (Códon Code Corporation, Dedham, Massachusetts, USA), e
analisadas visualmente. Os arranjos de nucleotídeos em posições ambíguas foram corrigidos
por comparação das sequências senso e anti-senso. Sequências parciais obtidas para o gene
GAPDH foram inicialmente analisadas com o algoritmo BLASTn e o banco de dados de
nucleotídeos

não-redundante

GenBank

(www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank),

também

comparadas com sequências no banco de dados Q-Bank Fungi (http://www.q-bank.eu/fungi/)
para determinar as espécies fúngicas com as quais elas compartilharam maior identidade de
sequência.

Para identificação preliminar dos isolados, foi construída uma árvore filogenética
bayesiana com as sequências parciais do gene GAPDH. Para posicionamento taxonômico
definitivo, um subgrupo de isolados foi escolhido para obtenção de sequências adicionais com
os genes TUB2 e ITS. Foram então obtidas filogenias para os dados concatenados das
sequências parciais dos genes GAPDH, TUB2 e ITS do subgrupo dos isolados obtidos neste
trabalho e sequências disponíveis no GenBank (Tabela 3).

Tabela 3 - Sequências do gênero Colletotrichum incluídas nas análises multigênicas e
respectivos números de acessos do GenBank
Espécie

N. da Cultura

C. alienum
C. theobromicola
C. tropicale
C. gloeosporioides
C. musae
C. fructicola
C. siamense
C. boninense
C. cymbidiicola
C. constrictum
C. brasiliense
C. karstii
C. trumcatun*

C1189
C1316.13
5101
IMI 356878
C1266.11
C1253.2
C1276.5
CBS:112115
CBS:123757
CBS:128504
CBS:128501
CBS:106.91
CBS:151.35

Número de acesso no GenBank
ITS
GAPDH
TUB2
JX010018
JX010385
JX010217
JX010006
JX010447
JX010294
JX010007
JX010407
JX010264
JX010056
JX010445
JX010152
JX010015
JX010395
JX010142
JX009998
JX010388
JX010167
JX009942
JX010402
JX010245
JQ005247
JQ005594
JQ005160
JQ005255
JQ005602
JQ005168
JQ005325
JQ005672
JQ005238
JQ005322
JQ005669
JQ005235
JQ005307
JQ005654
JQ005220
GU228254
GU228156
NR111458

Fonte: Autor
Nota: *Out group. GAPDH: glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase; TUB2: ß-tubulin; ITS: internal
transcribed spacer.

Alinhamentos múltiplos de sequências nucleotídicas foram preparados para os
conjuntos de dados GAPDH, TUB2 e dados concatenados (GAPDH, TUB2) utilizando-se o
algoritmo MUSCLE (EDGAR, 2004) e ajustados manualmente no pacote MEGA6
(Molecular Evolutionary Genetics Analysis) (TAMURA et al., 2013). A análise de Inferência
Bayesiana (BI) para os conjuntos de dados GAPDH, TUB2 e dados concatenados foi
realizada, separadamente, empregando o método da cadeia de Markov Monte Carlo (MCMC),
no portal CIPRES (MILLER et al., 2010) usando MrBayes v. 3.2.3 (RONQUIST et al., 2012).
O melhor modelo de substituição de nucleotídeos foi determinado para os dados de
cada região genômica usando MrModeltest 2.3 (POSADA; BUCKLEY, 2004) de acordo com
o Akaike Information Criterion (AIC). As quatro cadeias MCMC foram conduzidas
simultaneamente, iniciando as árvores aleatoriamente até 10.000.000 de gerações, para cada

conjunto de dados. As árvores foram amostradas a cada 1.000 gerações, resultando em 10.000
árvores. As primeiras 2.500 árvores foram descartadas da análise, como uma fase de burn-in.
Os valores de probabilidade posterior (RANNALA, YANG, 1996) foram determinados a
partir de uma árvore consenso majority-rule gerada com as 7.500 árvores remanescentes. As
árvores

foram

visualizadas

editadas

nos

programas

FigTree

1.4

(ztree.bio.ed.ac.uk/software/figtree).

3.2.4

Caracterização cultural e morfológica
De cada isolado foi retirado da borda da colônia um disco de meio contendo o

micélio, e em seguida transferidos para o centro de placas de petri contendo meio BDA.
Foram avaliados diariamente, durante sete dias, o diâmetro médio das colônias tomado no
reverso das placas, através da mensuração, em dois sentidos diametralmente opostos, com o
auxílio de um paquímetro digital. Ao final, foi observada também a coloração das colônias. O
delineamento experimental foi inteiramente casualizado, com quatro repetições por
tratamento, sendo a repetição constituída por uma placa de Petri. Os dados obtidos foram
utilizados para calcular o índice de crescimento micelial – ICM (mm/dia) pela seguinte
fórmula:
ICM = C1 + C2 … + Cn
N1 N2

Onde:
ICM= índice de crescimento micelial
C1= crescimento micelial no primeiro dia
N1= número de dias

A caracterização morfológica baseou-se no tamanho e forma dos conídios e
apressórios de cada isolado observados com auxílio de microscópio óptico, com aumento de
40 vezes. A produção de esporos dos isolados foi obtida por meio do cultivo em meio BDA
em temperatura de 25 ± 1 °C por 10 dias e fotoperíodo de 12 horas. Imagens da morfologia
dos conídios foram capturas e posteriormente, cinquenta conídios de cada isolado tiveram
largura e comprimento medidos por meio da mensuração projetadas em monitor de
computador, através do software Cell senses Standard.
Foi utilizado o método de micro cultivo em ágar-água para avaliação do formato dos
apressórios. As lâminas foram observadas em microscópio óptico e a mensuração dos

apressórios feita como descrito para os conídios. O formato dos conídios e apressórios foi
avaliado de acordo com chave de identificação proposta por Sutton (1980; 1992).

3.3

Resultados e Discussão
A partir das coletas realizadas em localidades de Alagoas e Pernambuco foram

obtidos 17 isolados de fungos apresentando características morfológicas compatíveis com o
gênero Colletotrichum.

3.3.1

Testes de Patogenicidade
Durante o teste de patogenicidade todos os isolados obtidos causaram lesões em

raquetes de palma miúda quando inoculados a partir de discos contendo estruturas do
patógeno na superfície da raquete com ferimento (Figura 2). Quando a inoculação ocorreu a
partir da suspensão de conídios nenhum dos isolados causou lesão nas raquetes de palma.

Figura 2 - Cladódios de palma miúda (Nopalea cochenillifera) inoculadas com discos
contendo estruturas de Colletotrichum spp

Fonte: Feijó, F. M.

É sabido que a maioria das infecções fúngicas na parte aérea da palma ocorre a partir
de ferimentos nas raquetes (SOUZA et al., 2010), ferimentos estes que podem ser atribuídos a
ação de insetos, pequenos roedores, do rebanho quando o palmal é utilizado para pastejo
direto ou quando as raquetes são cortadas para alimentação no cocho pelos animais.
Não foram observados sintomas quando a inoculação se deu a partir de suspensão de
conídios, possivelmente em decorrência do fato de o patógeno necessitar de um período de

tempo elevado para iniciar a infecção. Quezada-Salinas et al. (2006), estudaram a etiologia da
mancha negra em palma forrageira verificando que as lesões características da doença foram
observadas após 110 dias de inoculação por aspersão de conídios, sendo que estruturas
características do Colletotrichum sp. foram identificadas após o aparecimento de estruturas de
Pseudocercospora sp., indicando correlação entre os dois patógenos no desenvolvimento da
doença. Desta forma, é interessante que seja estudado o efeito sinergístico de Colletotrichum
spp. com outros fungos fitopatogênicos.
Em sequência ao teste de patogenicidade foi realizado o reisolamento dos 17 isolados
de Colletotrichum spp. obtidos, confirmando desta forma os postulados de Koch. Após a
conservação dos isolados foi realizada a caracterização molecular, cultural e morfológica dos
mesmos objetivando identificar as espécies de Colletotrichum encontradas na cultura da
palma forrageira.

3.3.2

Caracterização Molecular
A análise molecular dos genes GAPDH, TUB2 e ITS permitiu identificar três

espécies de Colletotrichum nas amostras coletadas, C. siamense, C. karstii e C. fructicola.
Estas espécies estão distribuídas em dois complexos dentro do gênero, o complexo C.
gloeosporioides (WEIR et al., 2012) e o complexo C. boninense (DAMM et al., 2012). A
comparação das sequências dos isolados caracterizados neste estudo com as sequencias
depositadas no Genbank, permitiu a atribuição preliminar das espécies, bem como os
complexos de espécies que as mesmas se enquadram conforme Tabela 4.

Tabela 4 - Relação entre espécies de Colletotrichum e locais de coleta de isolados obtidos
a partir de palma forrageira
Localidade
Arapiraca/AL
Arapiraca/AL
Arapiraca/AL
Arapiraca/AL
Arapiraca/AL
Atalaia/AL
Estrela de Alagoas/AL
Estrela de Alagoas/AL
Estrela de Alagoas/AL
São João/PE
São João/PE
São João/PE
São João/PE
Bom Conselho/PE
Bom Conselho/PE
Bom Conselho/PE
Bom Conselho/PE

Isolado
A15
A23
A31
A34
A38
BR1.1
EA4.4
EA45
EA5.1
SJ2
SJ12
SJ42
SJ48
BC4
BC8
BC15
BC18

Espécie
C. siamense
C. siamense
C. siamense
C. siamense
C. siamense
C. fructicola
C. fructicola
C. fructicola
C. fructicola
C. fructicola
C. fructicola
C. fructicola
C. fructicola
C. siamense
C. karsti
C. karsti
C. karsti

Complexo de Espécies.
C. gloeosporioides
C. gloeosporioides
C. gloeosporioides
C. gloeosporioides
C. gloeosporioides
C. gloeosporioides
C. gloeosporioides
C. gloeosporioides
C. gloeosporioides
C. gloeosporioides
C. gloeosporioides
C. gloeosporioides
C. gloeosporioides
C. gloeosporioides
C. boninense
C. boninense
C. boninense

Fonte: Autor

A análise filogenética confirmou a atribuição preliminar das espécies baseadas no
Blastn. Independentemente das regiões genômicas consideradas (GAPDH ou TUB2), a
filogenia resultou em árvores com a mesma topologia, com as amostras de C. siamense e C
fructicola no mesmo ramo filogenético por pertencerem ao mesmo complexo de espécies, C.
gloeosporioides, enquanto as amostras de C. karstii agruparam em um ramo distinto, pertente
ao complexo de espécies C. boninense (Figura 3; Figura 4).

Figura 3 - Árvore filogenética de Inferência Bayesiana com isolados de Colletotrichum
pertencentes a dois complexos, utilizando o gene GAPDH

Fonte: Autor

Figura 4 - Árvore filogenética de Inferência Bayesiana com isolados de Colletotrichum
pertencentes a dois complexos, utilizando o gene TUB2

Fonte: Autor

A topologia da árvore filogenética também não foi influenciada quando os dados de
GAPDH e TUB2 foram analisados de maneira concatenada (Figura 5), reforçando novamente
a caracterização preliminar das amostras como sendo pertencentes às espécies de C. siamense,
C fructicola e C. karstii.

Figura 5 - Árvore filogenética de Inferência Bayesiana com isolados de Colletotrichum
pertencentes a dois complexos, analisando os dados das regiões genômicas GAPDH,
TUB2 e ITS de maneira concatenada

Fonte: Autor.

Takahashi et al. (2008), baseando-se em características morfoculturais, relataram
pela primeira vez no Brasil o fungo C. gloeosporioides como agente causador de antracnose
em plantas de pitaya (Hylocereus megalanthus) uma cactácea de alto valor comercial pelos
seus frutos, sendo este um dos primeiros relatos no país deste patógeno causando doenças em
cactáceas.
No Brasil os relatos existentes de Colletotrichum causando doenças em palma são
bastante escassos, sendo o primeiro relato de C. gloeosporioides em N. cochenillifera no país
realizado por Rosa et al. (2008), a partir de caracterização morfocultural e do sequenciamento
da região genômica ITS.
Entretanto, a caracterização de espécies de Colletotrichum utilizando o gene ITS para
identificação das mesmas apresenta algumas limitações, e o conhecimento de genes mais
informativos tornou-se cada vez mais necessário (SHARMA et al., 2013; WEIR et al., 2012).

Em países tradicionalmente produtores de palma forrageira e outras cactáceas, como
o México e a Coreia, encontram-se relatos, baseando-se na caracterização morfológica do
patógeno, C. gloeosporioides como um dos agentes causadores da mancha negra e da
antracnose em suas lavouras (KIM et al., 2000a; KIM et al., 2000b; QUEZADA-SALINAS et
al., 2006; MÉNDEZ-GALLEGOS et al., 2008). Em estudo realizado para identificar os
fungos relacionados à mancha negra em palma forrageira e sua sensibilidade à quitozana
FLORES - FLORES et al. (2013), identificaram C. gloeosporioides a partir do
sequenciamento do gene ITS como sendo um dos agentes causadores dessa enfermidade na
palma.
Sabe-se, contudo, que a caracterização de espécies do gênero Colletotrichum não
deve ser realizada apenas pela morfologia de suas estruturas reprodutivas (McKAY et al.,
2009; RATANACHERDCHAI et al., 2010; WEIR et al., 2012), tornando imprecisas as
afirmações de que o agente causador de doenças em palma forrageira no Brasil seria
Colletotrichum gloeosporioides.
3.3.3

Caracterização Morfológica e Cultural
Durante a caracterização cultural, os isolados estudados apresentaram dados para o

índice de crescimento micelial (ICM) variando entre 6,52 e 10,25 mm/dia, não havendo
diferença estatisica entre os isolados em relação ao ICM. Em relação a topografia das
colônias, todos os isolados apresentaram micélio aéreo (com crescimento de até 3mm de
altura).
Tendo como base as características culturais das colônias em meio BDA sintético, os
isolados avaliados apresentaram-se distintos em relação à coloração das colônias, permitindo
que os isolados fossem agrupados em três grupos distintos (Tabela 5). O grupo I, representado
pelos isolados: BR1.1, EA4.4, EA45, EA5.1, SJ2, SJ12, SJ42 e SJ48 da espécie C. fructicola.
O grupo II foi representado pela espécie C. siamense e pelos isolados: A15, A23, A31, A34,
A38 e BC4. O grupo III, corresponde à espécie C. karstii e aos isolados: BC8, BC15 e BC18
(Figura 6).

Tabela 5 - Características morfológicas de isolados de Colletotrichum obtidos a partir de
lesões em cladódios de palma forrageira
Espécie

Isolado

Reverso

BR 1.1

Branco aveludado, com centro
acinzentado.

Centro esverdeado, com borda
esbranquiçada.

EA 5.1

Centro esbranquiçado, com
bordas marrom escuro.

EA 45

Centro esverdeado, com
bordas brancas.

Centro amarelado, com borda
bege.
Centro acinzentado, com halo
escuro em volta e bordas
esbranquiçadas.

EA 4.4

Centro branco-acinzentado,
com halo esverdeado e borda
verde-musgo.

Centro bege escuro, com halo
bege claro e bordas amareladas.

6,52

SJ 2

Centro cinza claro, com halo
Centro bege escuro, com halo
branco acinzentado e bordas
bege claro e bordas amareladas.
verde musgo com halo branco.

7,27

SJ 12

Centro cinza esverdeado, com
halo acinzentado e borda bege
claro.

7,41

SJ 42
SJ 48
A 31
A 38
A 23
C. siamense

Centro preto com halo
acinzentado, borda amarelada
com halo bege.
Centro acinzentado, com halo
Centro cinza esverdeado, com
marrom claro e borda brancaborda esbranquiçada.
amarelada.
Marrom esverdeado com borda
Branco aveludado.
bege.
Branco aveludado.
Bege.
Branco aveludado.
Centro bege, com borda branca.
Branco aveludado com centro
Centro marrom, com borda
marro claro.
bege claro.

A 15
BC 4

Branco aveludado, com centro
acinzentado.
Branco aveludado.
Branco acinzentado.

BC 18

Cinza claro.

BC 15

Centro cinza médio, com
borda branca.

BC 8

Cinza claro.

A 34

Fonte: Autor.

ICM

Verso

C. fructicola

C. karstii

Caracterização Cultural

Centro esverdeado, com borda
bege.
Bege.
Branco.
Centro esverdeado, com borda
bege.
Centro marrom claro, com
borda bege claro.
Centro esverdeado, com borda
bege.

9,36
5,09
8,13

8,72
9,29
10,25
8,07
7,95
8,98
8,80
9,29
9,18
7,77
8,50

Figura 6 - Aspecto dos três grupos de isolados de Colletotrichum em meio BDA sintético,
observados ao 7° dia. Imagem superior verso e Imagem inferior reverso

Fonte: Feijó, F. M.

As características culturais das espécies de Colletotrichum observadas neste trabalho
estão de acordo com o que foi apresentado por Prihastuti et al. (2009), ao descrevem as

colônias de C. fructicola em meio BDA como sendo inicialmente brancas e tornando-se cinza
escuro no centro com a idade e com reverso verde acinzentado com halo branco, apresentando
micélio aéreo cinza claro, denso e cotonoso, com massa de conídios visível.
Prihastuti et al. (2009) também descrevem colônias de C. siamense em BDA como
sendo de coloração inicialmente branca passando a marrom ou rosa claros, com reverso entre
amarelo e rosa claros, micélio aéreo verde claro para branco, denso e cotonoso e massa de
conídios visível no ponto de deposição do disco contendo estruturas do patógeno.
Damm et al. (2012), descrevem as colônias de C. karstii em meio BDA com
coloração variando de cinza claro a branca, com micélio aéreo no centro e disperso em tufos,
o reverso das colônias sendo laranja claro, com os conídios em massas alaranjadas. As
diferenças observadas entre a caracterização cultural dos isolados deste trabalho e ao que foi
relatado na literatura estão associadas a idade das colônias e a condições especificas de
crescimento destas, fatores que não influenciam diretamente na identificação das espécies.
Quando analisados em microscópio óptico os isolados de C. frutícola apresentaram
conídios com coloração hialina, formato reto, cilíndrico tendo uma das extremidades
arredonda e outra afilada ou ligeiramente pontiaguda. Apressórios com coloração castanho
claro a médio, subglobosos, ovoides ou elipsoidais. Já os isolados de C. siamense
apresentaram conídios com coloração hialina, formato reto, cilíndrico, com ligeira constrição
no centro, tendo as duas extremidades arredondas. Apressórios de coloração castanho médio a
escuro, subglobosos ou com formato irregular. Os isolados de C. karstii apresentaram
conídios com coloração hialina, formato reto, cilíndrico com as extremidades arredondas.
Apressórios de coloração castanho claro a médio, formato irregular ou elipsoidal (Figura 7).
A tabela 6 apresenta a variação no comprimento, na largura e na relação entre
comprimento e largura de conídios e apressórios dos isolados obtidos neste trabalho e os seus
respectivos valores médios, não havendo diferença estatística entre os valores de
comprimento, largura e relação comprimento largura tanto para conídios quanto para
apressórios dos isolados em cada uma das espécies de Colletotrichum identificadas.

Figura 7 - Características morfológicas de conídios (I) e apressórios (II) de C. fructicola,
C. siamense e C. karstii cultivados em meio BDA. As imagens foram obtidas com lentes
de 40x de aumento e escala de 20μm

Fonte: Autor

Tabela 6 - Variação e média de comprimento, largura e relação comprimento largura de
conídios e apressórios de isolados de Colletotrichum
Espécie

SJ2
SJ12
SJ42
SJ48
C. fructicola
EA4.4
EA45
EA5.1
BR1.1

A15
A23
A31
C. siamense
A34
A38
BC4

BC8
C. karstii

Conídio

Isolado

BC15
BC18

Apressório

Comp.
3,38-6,68
4,87
3,39-6,40
4,8
4,08-7,26
5,81
4,18-7,01
5,66
4,17-6,85
5,62
4,64-7,33
5,67
3,95-6,77
5,43
3,85-9,06
5,76

Larg. Com./Larg.
1,13-2,15 2,01-4,44
1,64
3,02
0,93-2,40 1,74-4,28
1,79
2,78
1,54-2,97 1,85-3,72
2,29
2,59
1,40-2,54 1,99-4,45
1,94
2,97
1,29-2,78 2,00-4,80
1,94
2,98
1,36-2,74 1,93-4,10
2,1
2,75
1,53-2,74 1,93-4,24
1,97
2,8
1,69-3,67 1,14-3,37
2,75
2,15

Comp.
2,09-5,90
3,75
3,06-7,64
5,13
4,58-6,26
5,28
4,05-9,52
5,59
3,65-7,50
5,41
3,70-7,80
5,1
3,85-7,14
5,28
3,85-9,06
5,7

Larg. Com./Larg.
2,08-522 0,51-2,28
2,93
1,32
2,00-4,51 0,82-2,53
3,1
1,7
2,56-4,98 0,97-2,44
3,43
1,63
2,33-5,15 0,94-2,51
3,51
1,63
2,48-4,50 0,91-2,79
3,55
1,56
2,66-4,47 1,01-2,23
3,39
1,52
2,33-4,30 1,06-2,34
3,4
1,58
1,69-3,67 1,14-3,83
2,67
2,22

3,68-9,37
5,48
2,23-6,17
4,44
3,26-6,75
4,79
3,34-7,49
5,27
3,55-6,11
4,98
4,65-7,16
5,99

1,12-2,72
1,93
0,96-2,09
1,59
1,25-2,31
1,75
1,25-2,84
1,92
0,93-2,83
1,94
1,40-2,93
2,05

1,35-4,43
2,87
1,07-5,02
2,93
1,62-4,66
2,82
1,78-4,67
2,82
1,85-4,39
2,63
2,24-4,50
2,97

1,84-5,23
3,52
1,58-5,64
3,8
1,63-5,54
3,71
1,74-5,83
3,47
1,95-4,80
3,18
2,96-7,47
5,17

1,25-3,20
2,43
1,17-2,95
2,08
1,37-3,30
2,56
1,51-3,42
2,61
1,58-2,86
2,17
2,72-4,21
3,26

0,81-2,38
1,49
0,72-2,41
1,45
0,76-2,46
1,47
0,78-2,51
1,52
0,87-2,31
1,48
1,08-2,67
1,61

4,35-7,22 1,95-3,24

1,65-3,43

4,35-7,22 1,95-3,24

1,65-3,43

5,98
2,52
5,66-9,41 2,44-4,49

2,41
1,49-2,88

5,98
2,52
3,20-7,76 2,31-5,32

2,41
0,87-2,20

7,23
3,46
2,53-9,16 1,76-6,15

2,12
0,90-3,55

4,89
3,55
2,24-6,24 1,44-5,26

1,41
0,43-3,13

5,87

2,62

2,31

3,71

2,35

1,68

Fonte: Autor

Quando caracterizados por Prihastuti et al. (2009), os conídios e apressórios de C.
siamense e C. fructicola apresentaram comprimento e largura médios superiores aos

observados neste trabalho e com características de formato e coloração similares. Damm et al.
(2012), ao caracterizar os conídios e apressórios de C. karstii observaram as estruturas com
comprimento e largura superiores aos observados neste trabalho, mas com relação entre
comprimento e largura semelhantes às descritas para os isolados de C. karstii de palma
forrageira.
A variabilidade entre as características culturais nas espécies de Colletotrichum é
bastante relatada na literatura (COUTO; MENEZES, 2004; MENEZES, 2006; WEIR et al.,
2012), podendo estar relacionada às condições de cultivo, luminosidade, temperatura,
umidade, idade das colônias e hospedeiro de origem. Tal variabilidade impede que
características culturais e morfológicas sejam utilizadas como ferramentas exclusivas para a
identificação de espécies de Colletotrichum, sendo necessária a associação com ferramentas
da biologia molecular para auxiliar na identificação de espécies deste gênero fúngico.
Até o momento não existem relatos de C. fructicola, C. siamense e C. boninense
causando doenças em palma forrageira no Brasil. Bragança et al. (2015) utilizando análises
multilocus identificaram C. fructicola causando lesões necróticas em folhas de mandioca
cultivada em lavouras no interior da Bahia. Capobiango et al. (2015), realizando estudos no
interior de Minas Gerais isolou e caracterizou C. siamense a partir de frutos de morango que
apresentavam lesões necróticas e deprimidas típicas de patógenos do gênero Colletotrichum.
Lima et al. (2013) identificou C. karstii causando sintomas de antracnose durante a pós
colheita de mangas cv. Tommy Atkins cultivadas na região do Vale do São Francisco, interior
de Pernambuco. Os relatos destas espécies de Colletotrichum causando danos econômicos em
diversas culturas de importância agrícola corrobora a existência de diversas espécies deste
patógeno no Brasil.
Os municípios de Arapiraca, Atalaia, Bom Conselho, Estrela de Alagoas e São João,
onde foram obtidos os isolados de Colletotrichum em palma forrageira utilizados neste estudo
produzem fruteiras e culturas agrícolas (IBGE, 2014), que são relatadas como hospedeiras das
espécies de Colletotrichum identificadas neste trabalho. Tal fato sugere que o patógeno possa
estar migrando de outros hospedeiros para a palma forrageira, uma vez que a área plantada
desta cultura vem crescendo de forma constante nos últimos anos.
A ocorrência de apenas uma espécie de Colletotrichum em cada um dos locais de
coleta, C. siamense em Arapiraca, C. karstii em Bom Conselho e C. fructicola em Atalaia,
São João e Estrela de Alagoas, com exceção de apenas um isolado de C. siamense em Bom
Conselho, indica isolamento geográfico entre as espécies deste patógeno.

Tal isolamento pode ser resultante de características edafoclimáticas e de relevo nas
regiões de coleta impedindo a livre circulação dos patógenos entre as localidades. Chiorato et
al. (2006) analisaram a co-evolução entre patótipos de C. lindemuthianum oriundos de regiões
geográficas distintas e espécies de feijoeiro, constatando que a origem geográfica dos isolados
alterou as condições de crescimento e de patogenicidade do fungo quando inoculado em
vagens de feijoeiro.
O primeiro relato de três espécies distintas de Colletotrichum causando doenças em
palma forrageira no Brasil, evidência a falta de especificidade entre as espécies deste gênero e
os seus hospedeiros, a variabilidade nas características de crescimento e patogenicidade do
fungo, tornando necessários estudos epidemiológicos comparativos entre as espécies de
Colletotrichum na palma forrageira.

3.4

Conclusões


Este é o primeiro relato das espécies C. siamense, C. fructicola e C. karstii

causando doença em palma forrageira (Nopalea cochenillifera) no Brasil.

REFERENCIAS

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RESISTÊNCIA DE GENÓTIPOS DE Nopalea cochenillifera E EFEITO DA

TEMPERATURA E UMIDADE SOBRE A MANCHA MARROM.

RESUMO
A palma vem sendo utilizada no Brasil desde o início do século XX na alimentação animal.
Mesmo apresentando grande rusticidade e adaptação às condições climáticas da região
semiárida, a cultura da palma forrageira está sujeita ao ataque de diversos patogenos que
causam grandes prejuízos para a sua produção. Dentre os agentes causais de doenças em
palma, os fungos do gênero Colletotrichum são responsáveis por danos econômicos
consideraveis a cultura. Outra característica importante deste gênero fúngico é sua
adaptabilidade, o que lhe permite crescer nas mais variadas condições climáticas e nos mais
variados hospedeiros. Objetivou-se com este trabalho determinar a influência da temperatura
e da umidade na severidade da mancha marrom em genótipos de palma forrageira. Cladódios
apresentando sintomas de manchas marrons em sua superfície, foram coletados em áreas
produtoras nos estados de Alagoas e Pernambuco. No laboratório foi realizado o isolamento
dos fitopatógenos e obtenção da cultura monospórica de cada um dos isolados. Cladódios de
palma miúda foram inoculados com isolados de C. siamense, C. fructicola e C. karstii e
acondicionadas nas temperaturas de 22, 26, 30 e 34 °C com o intuito de determinar qual
temperatura favorece o crescimento do patógeno, posteriormente os cladódios foram
inoculados com as mesmas espécies de Colletotrichum e acondicionadas em câmara úmida
durante 12, 24, 36, 48 e 60 horas buscando determinar qual período de umidade favorece o
patógeno. Essas mesmas espécies fúngicas também foram utilizadas na caracterização da
resistência dos seguintes genótipos de palma: Palma Alagoas, Miúda, Orelha de onça, Palma
melancia, Tamazunchale, Clones 06, 07, 13, 21 e F-21. A partir das atividades realizadas a
temperatura de 22 °C favoreceu o desenvolvimento das lesões nos cladódios, independente da
espécie de Colletotrichum considerada. O período de permanência em câmara úmida superior
a 36 horas favoreceu o desenvolvimento das lesões nos cladódios quando inoculados com
isolados de Colletotricum spp. Colletotrichum siamense apresentou maior agressividade em
genótipos de palma forrageira quando comparado com C. karstii e C. fructicola. Os
genótipos: Miúda, Clones 07, 13 e 21 apresentaram menor diâmetro de lesões quando
inoculados com isolados de Colletotrichum spp.
Palavras-Chave: Palma forrageira. Agressividade do patógeno. Colletotrichum.

RESISTANCE OF GENOTYPES OF Nopalea cochenillifera AND EFFECT OF
TEMPERATURE AND HUMIDITY ON THE BROWN STAIN.
ABSTRACT
The palm has been used in Brazil since the early XX century in animal feed. Even with great
hardiness and adaptation to climatic conditions of the semiarid region, the culture of cactus is
subject to attack by many pathogens that cause great harm to their production. Among the
causative agents of diseases in cactus, fungi of the genus Colletotrichum are responsible for
considerable economic damage to culture. Another important feature of this fungal genus is
its adaptability, which allows you to grow in various weather conditions and in various hosts.
The objective of this study was to determine the influence of temperature and humidity on the
severity of brown spot of forage palm genotypes. Cladodes with symptoms of brown spots on
its surface, were collected in producing areas in the states of Alagoas and Pernambuco. In the
laboratory it was carried out the isolation of pathogens and achieving monospórica culture
each isolate, cactus cladodes were inoculated with isolates of C. siamense, C. fructicola and
C. karstii and conditioned at temperatures of 22, 26, 30 and 34 ° C in order to determine
which temperature favors the growth of pathogens, subsequently the cladodes They were
inoculated with the same species of Colletotrichum and placed in a moist chamber for 12, 24,
36, 48 and 60 hours trying to determine which moisture period favors the pathogen. These
same fungal species were also used to characterize the resistance of the following palm
genotypes: Palma Alagoas, Miúda, Orelha de Onça, Palma Melancia, Tamazunchale, Clones
06, 07, 13, 21 and F-21. From the activities carried out at 22 ° C favored the development of
lesions in the cladodes, regardless of the species of Colletotrichum considered. The length of
stay in a humid chamber more than 36 hours favored the development of lesions in the
cladodes when inoculated with isolates Colletotricum spp. Colletotrichum siamense showed
greater aggression in forage cactus genotypes compared with C. karstii and C. fructicola.
Genotypes: Miúda, Clones 07, 13 and 21 showed smaller diameter lesions when inoculated
with Colletotrichum spp.
Keywords: Cactus. Aggressiveness of the pathogen. Colletotrichum.

4.1

Introdução
A família das cactáceas é composta por aproximadamente 178 gêneros e mais de

2000 espécies, dentre estes os gêneros Opuntia e Nopalea dispõem de diversas espécies com
potencial forrageiro. No Brasil as espécies Opuntia fícus-indica Mill e Nopalea cochenillifera
Salm-Dyck mais conhecidas como palma gigante e palma miúda, respectivamente, são
utilizadas como forrageiras na alimentação de rebanhos na agropecuária nordestina (SANTOS
et al., 1990; TAYLOR et al., 2002).
Na agropecuária brasileira são exploradas, predominantemente, três variedades de
palma forrageira, Gigante e Redonda (O. fícus-indica) e palma Miúda (N. cochenillifera),
pelas suas características agronômicas de produtividade, palatabilidade, rusticidade e
digestibilidade. No entanto, o Brasil possui um banco ativo de germoplasma de palma
forrageira composto por cerca de 1.400 acessos de diferentes materiais, sendo 200 destes
introduzidos de vários locais como o México, EUA, África do Sul, Argélia, Chile entre
outros, sob a administração do Instituto de Pesquisa Agropecuária de Pernambuco (IPA), que
realiza parcerias com instituições de pesquisa e universidades no desenvolvimento de novas
cultivares e variedades (SANTOS et al., 2006).
Atualmente no Brasil, são escassos os trabalhos envolvendo o desenvolvimento de
novas cultivares de palma forrageira, sendo que os trabalhos existentes são voltados ao
desenvolvimento de cultivares que mantenham o seu potencial produtivo e que sejam
resistentes à principal praga da cultura, a cochonilha do carmim. Contudo, trabalhos voltados
à resistência de doenças também são necessários, em vista da grande quantidade de
fitopatógenos que causam danos a cultura. Um fator importante no desenvolvimento dos
fitopatógenos é a sua interação com as condições edafoclimáticas do local (VASCONCELOS
et al., 2009; LOPES et al. 2010; CAVALCANTE et al., 2014; SILVA et al., 2014).
Os fungos fitopatogênicos desenvolvem-se nos mais diversos ambientes, com grande
variedade de temperatura e umidade. O gênero Colletotrichum apresenta-se em grande
variedade de ambientes, podendo se desenvolver em temperaturas variando entre 15 – 30 °C e
em locais com umidade variando entre 40 – 80%. Esta variedade de ambiente permite que os
fungos desse gênero criem estratégias especificas para colonizar e se desenvolver nos
hospedeiros (PANDEY et al., 1997; SOARES, et al. 2008).
A região semiárida brasileira apresenta temperaturas que variam de 15 – 40 °C a
depender da época do ano, com umidade relativa podendo passar dos 80%. Tal variabilidade
climática pode restringir o desenvolvimento de diversos seres vivos, incluindo várias espécies

fúngicas. Contudo algumas espécies se adaptaram podendo sobreviver em condições adversas
causando danos na produção de diversas culturas agrícolas, incluindo a palma forrageira.
Objetivou-se com esse trabalho determinar a influência da temperatura e da
umidade na severidade da mancha marrom em genótipos de palma forrageira.

4.2

Material e Métodos
Os experimentos foram realizados no Laboratório de Fitopatologia do Centro de

Ciências Agrárias da Universidade Federal de Alagoas (CECA/UFAL), localizado no
município de Rio Largo.
4.2.1

Obtenção dos genótipos de palma da variedade miúda e isolados utilizados
Os cladódios de palma-forrageira do gênero Nopalea (N. cochenillifera) utilizados

neste estudo foram provenientes do banco de germoplasma da Secretaria de Agricultura do
Estado de Alagoas situado no município de Santana do Ipanema – Alagoas. Foram avaliados
dez genótipos: Palma Alagoas, Miúda, Orelha de Onça, Palma Melancia, Tamazunchale,
Clones 06, 07, 13, 21 e F-21.
Durante os experimentos de temperatura, umidade e comportamento dos genótipos
de palma, foi escolhido aleatóriamente um isolado de cada espécie de Colletotrichum
identificada anteriormente: C. siamense (A38), C. karstii (BC15), e C. fructicola (EA45).

4.2.2

Efeito da temperatura e de períodos de permanência em câmara úmida na severidade
de manchas de cladódios
Para inoculação dos cladódios de palma miúda, os mesmos foram feridos com agulha

previamente flambada, onde foram inoculados discos de meio de cultura contendo estruturas
do patógeno e com 5mm de diâmetro. Na testemunha foram utilizados discos de BDA puro
(FLORES - FLORES et al. 2013). Em seguida cada cladódio foi acondicionado
separadamente em sacos plásticos contendo um chumaço de algodão umedecido com AD.
Após 48h os cladódios foram retirados dos sacos plásticos e novamente acondicionados em
BOD (Biochemistry Oxigen Demand). Posteriormente, os cladódios foram mantidos em
incubadoras BOD ajustadas para as temperaturas de 22, 26, 30 e 34°C. O experimento foi
mantido em incubadora BOD com fotoperíodo de 12 horas por até 10 dias.
O delineamento experimental utilizado foi o inteiramente casualizado em arranjo
fatorial (4 x 3), representado por quatro temperaturas, três espécies de Colletotrichum e quatro
repetições, sendo a unidade experimental constituída por um cladódio com quatro pontos de
inoculação sendo um a testemunha. Dez dias após a inoculação o diâmetro das lesões foi
determinado medindo-se cada lesão em dois sentidos perpendiculares com o auxílio de um
paquímetro digital, obtendo-se assim a severidade das manchas.
Os valores médios obtidos foram submetidos à análise de variância e os dados
utilizados na realização de análises de regressão linear entre a variável temperatura e o

diâmetro médio das lesões. As severidades das lesões ocasionadas pelos diferentes isolados
(diâmetro das lesões) foi comparada pelo teste de Scott - Knott a de 5% de probabilidade
utilizando o software ASSISTAT 7.7 beta.
O experimento que determinou o efeito de períodos de permanência em câmara
úmida também foi conduzido em incubadoras B.O.D. na temperatura que causou maior
severidade para cada espécie de Colletotrichum testada. Os períodos de câmara úmida, foram
montados de acordo com a metodologia do teste de temperatura, onde, cada cladódio foi
acondicionado separadamente em sacos plásticos contendo um chumaço de algodão
umedecido com AD que foram retirados a cada 12 horas constituindo assim cinco períodos de
permanência em câmara umida a serem avaliados: 12, 24, 36, 48 e 60 horas.
O delineamento experimental utilizado foi o inteiramente casualizado em arranjo
fatorial (5 x 3), representado por cinco períodos de permanência em câmara umida, três
espécies de Colletotrichum e quatro repetições, sendo a unidade experimental constituída por
um cladódio com quatro pontos de inoculação sendo um a testemunha. Dez dias após a
inoculação o diâmetro das lesões foi determinado medindo-se cada lesão em dois sentidos
perpendiculares com o auxílio de um paquímetro digital, obtendo-se assim a severidade das
manchas.
Os valores médios obtidos foram submetidos à análise de variância e os dados
utilizados na realização de análises de regressão quadratica entre a variável período de
permanência em câmara úmida e o diâmetro médio das lesões. O diâmetro das lesões
ocasionadas pelos diferentes isolados de Colletotrichum foi comparada pelo teste de Scott Knott a 5% de probabilidade, utilizando o software ASSISTAT 7.7 beta.

4.2.3

Comportamento de genótipos de palma em relação a manchas de cladódios
Cladódios dos dez genótipos de Nopalea foram inoculados com discos de meio de

cultura contendo estruturas do patógeno com 5mm de diâmetro, na testemunha foram
utilizados discos de BDA (FLORES - FLORES et al., 2013). Posteriormente, cada cladódio
foi acondicionado separadamente em sacos plásticos contendo um chumaço de algodão
umedecido com AD. Após 48h os cladódios foram retirados dos sacos plásticos e novamente
acondicionados em BOD. Após a inoculação os cladódios foram acondicionados em
incubadoras do tipo B.O.D. à temperatura de 22 °C ± 1 °C.
O experimento foi realizado em delineamento inteiramente casualizado em aranjo
fatorial (10 x 3), representado por dez genótipos, três espécies de Colletotrichum e quatro
repetições, sendo a unidade experimental constituída por um cladódio com quatro pontos de

inoculação sendo um a testemunha. Dez dias após a inoculação os diâmetros das lesões foram
determinados em dois sentidos perpendiculares com o auxílio de um paquímetro digital,
obtendo-se assim a severidade das lesões. As médias de severidade das lesões foram
submetidas à análise de variância e os valores obtidos comparados pelo teste de Scott - Knott
ao nível de 5% de probabilidade utilizando o software ASSISTAT 7.7 beta.

4.3

Resultados e Discussão

4.3.1

Efeito da temperatura e do período de permanência em câmara úmida na severidade
de manchas de cladódios.
Passado o período de incubação, todos os cladódios utilizados no experimento

apresentaram lesões características de mancha marrom, com tamanho da lesão variando de
acordo com a temperatura de incubação e com o isolado utilizado (Figura 8).

Figura 8 - Manchas em cladódios causadas por C. siamense, C. karstii e C. fructicola, após
10 dias de incubação a 22, 26, 30 e 34 °C, em palma Miúda

Fonte: Feijó, F. M.

Figura 9 - Diâmetro de lesões causadas por C. siamense, C. karstii e C. fructicola em
diferentes temperaturas e períodos de permanência em câmara úmida, em palma Miúda

Fonte: Feijó, F. M.

Passados 10 dias da inoculação observou-se que a temperatura de 22 °C possibilitou
o maior desenvolvimento das manchas de cladódios causadas pelos três isolados utilizados,
seguida pela temperatura de 26 °C e por fim pelas temperaturas de 30 e 34 °C que

possibilitaram as menores lesões nos cladódios. Observou-se também que C. siamense
apresentou maiores lesões nas temperaturas de 22 e 26 °C diferindo estatisticamente das
demais temperaturas, e que esta espécie de Colletotrichum causou maiores lesões médias em
todas as temperaturas estudadas, indicando maior agressividade quando comparado com as
demais espécies testadas. Já C. karstii e C. fructicola apresentaram lesões significativamente
maiores apenas na temperatura de 22 °C (Figura 9).
O modelo matemático utilizado durante a analise de regressão da interação entre
temperaturas de incubação e isolados de Colletotrichum foi o linear para todos os isolados,
demonstrando que quanto maior a temperatura de incubação dos cladódios, menor o
desenvolvimento dos isolados de Colletotrichum.
Colletotricum é um gênero fúngico cosmopolita, encontrado em regiões tropicais e
subtropicais, onde as temperaturas médias variam entre 15 e 35 °C (BAILEY et al., 1992).
Maia et al. (2011), constataram que temperaturas entre 20 e 25 °C proporcionaram maior
crescimento de colônias de Colletotrichum spp. obtidos a partir de folhas, hastes e frutos de
mangueiras.
Avaliando o desenvolvimento de C. gloeosporioides e C. acutatum em frutos de
goiaba Soares – Colletti; Lourenço (2014), constataram que os patógenos apresentaram o
maior desenvolvimento em temperaturas entre 25 e 27 °C após 12 dias de incubação, não
havendo diferença estatística entre o desenvolvimento das lesões das duas espécies de
Colletotrichum utilizadas no estudo. Dias et al. (2005), avaliando o desenvolvimento de
isolados de Colletotrichum spp. obtidos a partir de folhas, ramos e frutos de cafeeiro no
interior de Minas Gerais, observaram que temperaturas entre 22 e 28 °C possibilitaram maior
desenvolvimento das colônias do patógeno, sendo as temperaturas entre 23 e 25 °C mais
adequadas para a produção de conídios dos mesmos.
Temperaturas variando de 10 a 26 °C possibilitaram o crescimento de C. lupini em
variedades de Lupinus angustifolius L. (tremoceiro) com vários graus de susceptibilidade ao
patógeno. Neste mesmo trabalho, Tomas et al. (2008), constataram que a susceptibilidade das
variedades de tremoceiro a C. lupini não foi alterada com a variação da temperatura, após
todas as variedades apresentarem incidência da doença inferior a 10% quando submetidas a
temperatura de 10 °C.
Os cladódios de palma Miúda incubados a 22 °C durante 10 dias apresentaram lesões
características da mancha marrom com diamentros variados de acordo com o período de
permanência em câmara úmida (Figura 10).

Figura 10 - Manchas em cladódios causadas por C. siamense, C. karstii e C. fructicola,
após 10 dias de incubação em câmara úmida de 12, 24, 36, 48 e 60 horas, em palma
Miúda

Fonte: Feijó, F. M.

Após o período de incubação observou-se que nos cladódios inoculados com C.
siamense os períodos de câmara úmida de 24, 36, 48 e 60 horas proporcionaram maiores
lesões típicas das manchas de cladódios. Já nos cladódios inoculados com C. karstii e C.
fructicola os períodos de câmara úmida de 36, 48 e 60 horas foram os que proporcionaram
maiores lesões típicas da doença (Figura 9).
Os resultados apresentados indicam que a partir de 36 horas de câmara úmida as três
espécies de Colletotrichum utilizadas neste trabalho se desenvolvem da mesma forma e que o
acréscimo no período de umidade não ocasiona diferenças significativas na formação de
lesões. Soares et al. (2008), observaram elevada germinação de conídios e formação de
apressórios em goiabas inoculados com isolado de C. gloeosporioides após período de
molhamento de 6 horas, em contrapartida ao inocular frutos de goiaba com isolado de C.
acutatum os autores observaram maior geminação de conídios e formação de apressórios em
períodos de molhamento superiores a 12 horas.
A origem tropical e subtropical do gênero Colletotrichum sifre influência da
temperatura e umidade necessária para o desenvolvimento do patógeno. Regiões mais quentes
e úmidas possibilitam o maior desenvolvimento do fungo ocasionando maiores lesões em seus
hospedeiros, confirmando a adaptabilidade deste patógeno às mais variadas condições
edafoclimáticas do planeta.

Espécies de Colletotrichum utilizam diversas estratégias para invadir, infectar e
colonizar o tecido dos hospedeiros através de ferimentos, aberturas naturais ou diretamente
via apressórios, além de poderem emitir tubos germinativos e hifas intracelulares. (JEFFRIES
et al., 1990; PERFECT et al., 1999). Estas e outras ferramentas adaptativas permitem que este
patógeno se desenvolva nas mais diversas localidades do planeta e sob as mais variadas
condições de temperatura e umidade.

4.3.2

Comportamento de genótipos de palma em relação a manchas de cladódios
Passado o período de incubação observou-se o desenvolvimento de lesões típicas de

mancha de cladódios nos dez genótipos utilizados no experimento (Figura 11).
Os genótipos Orelha de Onça, Alagoas, Melancia, Tamazunchale e Clone 6
apresentaram os maiores diâmentros de lesões quando inoculados com o isolado A38 (C.
siamense), diferindo estatisticamente dos demais genótipos. Quando inoculados com o isolado
EA45 (C. fructicola), o genótipo Clone F21 e Tamazunchale apresentaram os maiores
diâmetros de lesões, diferindo estatisticamente dos demais. As lesões provocadas pelo isolado
BC15 (C. karstii) não apresentaram diferença estatística em nenhum dos genótipos utilizados
neste trabalho (Tabela 7).

Tabela 7 - Diâmetro médio (mm) de mancha de cladódios causada por C. siamense, C.
karstii e C. fructicola em genótipos de palma forrageira
Genótipo
Clone 06
Clone 07
Clone 13
Clone 21
Clone F21
Miuda
Alagoas
Melancia
Tamazunchale
O. Onça

C. siamense

Isolado
C. karstii

C. fructicola

11,11aA
8,70bA
8,88bA
8,85bA
9,75bA
9,50bA
11,32aA
10,88aA
10,61aA
11,01aA

8,21aB
8,15aA
8,38aA
8,33aA
8,40aB
8,41aA
8,45aB
9,00aB
8,96aB
9,27aB

8,83bB
8,33bA
8,35bA
8,93bA
10,71aA
8,60bA
8,27bB
9,19bB
9,88aA
8,91bB

Fonte: Autor
Nota: Valores seguidos pela mesma letra minúscula na vertical e mesma letra maiúscula na horizontal não
diferem estatisticamente a 5% de probabilidade pelo teste de Scott-knott.

Figura 11 - Manchas de cladódios causadas por C. siamense, C. karstii e C. fructicola em
genótipos promissores de palma forrageira do gênero Nopalea

Fonte: Feijó, F. M.

Observa-se ainda que nos genótipos Clone 06, Alagoas, Melancia e Orelha de Onça o
isolado de C. siamense (A38) apresentou lesões, que diferiram estatisticamente, quando
comparado com os isolados de C. karstii (BC15) e C. fructicola (EA45), nos genótipos Clone
F21 e Tamazunchale os isolados A38 e EA45 proporcionaram maiores lesões, diferindo
estatisticamente das lesões causadas pelo isolado BC15.

Os resultados apresentados indicam que C. siamense apresenta maior agressividade a
genótipos de palma forrageira, quando comparado com C. fructicola e C. karstii. Dentre os
genótipos utilizados neste trabalho os Clones 7, 13, 21 e Miuda apresentaram os menores
diâmetros médios de lesões ocasionadas por Colletotrichum, quando comparados com os
demais genótipos (Figura 12).
Figura 12 - Diâmetro de lesões de C. siamense, C. karstii e C. fructicola inoculados em
diferentes genótipos de palma forrageira do gênero Nopalea

Fonte: Feijó, F. M.

Os resultados observados sugerem que determinados genótipos de palma forrageira
têm potencial de resistência a espécies de Colletotrichum. Estudos relacionando resistência de
genótipos de palma forrageira a doenças fúngicas no Brasil são escassos, sendo encontrados
trabalhos tratando da seleção de genótipos que apresentam resistência a insetos
(VASCONCELOS et al., 2009; LOPES et al. 2010) e seleção de genótipos que apresentam
melhores respostas produtivas à diferentes condições de manejo (CAVALCANTE et al.,
2014; SILVA et al., 2014).
Desta forma os resultados apresentados sugerem a necessidade de novos estudos
relacionando genótipos promissores de palma forrageira a patógenos causadores de manchas
de cladódios como, por exemplo, Colletotrichum spp., em busca de cultivares que aliem a
resistência a fitopatógenos com outras características agronômicas interessantes, como
produtividade, acúmulo de água, produção de matéria seca, digestibilidade etc.

4.4

Conclusões


A temperatura de 22 °C favoreceu o desenvolvimento das lesões nos cladódios,

independente da espécie de Colletotrichum considerada;


O período de permanência em câmara úmida superior a 36 horas favoreceu o

desenvolvimento das lesões nos cladódios quando inoculados com isolados de Colletotricum
spp.;


Colletotrichum siamense apresentou maior agressividade em genótipos de

palma forrageira quando comparado com C. karstii e C. fructicola;


Os genótipos de palma forrageira Miúda e os Clones 07, 13 e 21 apresentaram

menores diâmetros de lesões quando inoculados com isolados de Colletotrichum spp.

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Universidade Federal de Alagoas