Infecção Mista de Badnavírus e Begomovírus em Centrosema brasilianum (L.) Benth
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE ALAGOAS
CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM
PROTEÇÃO DE PLANTAS
RAÍZA DA ROCHA OLIVEIRA TEIXEIRA
INFECÇÃO MISTA DE BADNAVÍRUS E BEGOMOVÍRUS EM
Centrosema brasilianum (L.) Benth
Rio Largo - AL
2017
RAÍZA DA ROCHA OLIVEIRA TEIXEIRA
INFECÇÃO MISTA DE BADNAVÍRUS E BEGOMOVÍRUS EM
Centrosema brasilianum (L.) Benth
Dissertação de Mestrado apresentada ao
Programa de Pós-Graduação em Proteção
de Plantas do Centro de Ciências Agrárias
da Universidade Federal de Alagoas como
requisito parcial para obtenção do grau de
Mestre em Proteção de Plantas.
Orientadora: Prof. Dra. Sarah Jacqueline
Cavalcanti Silva
Coorientadora: Dra. Iraildes Pereira
Assunção
Rio Largo - AL
2017
Catalogação na fonte
Universidade Federal de Alagoas
Biblioteca Centro de Ciências Agrárias – CECA
Erisson Rodrigues de Santana - Bibliotecário
T266i Teixeira, Raíza da Rocha Oliveira.
Infecção mista de badnavírus e begomovírus em Centrosema
brasilianum (L.) Benth / Raíza da Rocha Oliveira Teixeira. – Rio
Largo, 2017.
60 f.: il.
Dissertação (Mestrado em Proteção de plantas) –
Universidade Federal de Alagoas. Programa de Pós - graduação em
Proteção de Plantas. Centro de Ciências Agrárias, 2017.
Orientador(a): Dra. Sarah Jacqueline Cavalcanti Silva.
Coorientadora: Dra. Iraildes Pereira Assunção
1. Caracterização molecular. 2. Badnavirus
3. Begomovirus.
CDU: 632
14
RAÍZA DA ROCHA OLIVEIRA TEIXEIRA
INFECÇÃO MISTA DE BADNAVÍRUS E BEGOMOVÍRUS EM
Centrosema brasilianum (L.) Benth
Dissertação submetida ao corpo docente do
Programa de Pós-Graduação em Proteção de
Plantas, do Centro de Ciências Agrárias da
Universidade Federal de Alagoas. E aprovada em
25 de agosto de 2017.
Profª. Drª. Sarah Jacqueline Cavalcanti Silva - Universidade Federal de Alagoas
(Orientadora)
Banca Examinadora:
Prof. Dr. Gaus Silvestre de Andrade Lima – Universidade Federal de Alagoas
(Examinador)
Profª. Drª. Kátia Cilene da Silva Félix – Faculdade Sete de Setembro (FASETE)
(Examinador)
Rio Largo - AL
2017
15
AGRADECIMENTOS
À Deus em primeiro lugar, que dizem que escreve certo por linhas tortas – mas diria que nós
que enxergamos torto – agradeço por não me permitir desistir, por me mostrar pessoas
maravilhosas e por me fazer ser constantemente grata pelas oportunidades.
À minha família pelas bases construídas, pelos ensinamentos e por sempre acreditar no meu
potencial. Aos amigos pelo apoio 24 horas por dia e pelas alegrias compartilhadas.
Aos Professores Drs Gaus Silvestre de Andrade Lima e Iraildes Pereira Assunção pelo
acolhimento e oportunidade no laboratório.
À Professora Dra Sarah Jacqueline Cavalcanti Silva pela orientação e ajuda com tudo. Serei
sempre grata.
À Mayra Ferro e Caio Henrique Hollanda, que além dos momentos de descontração
(constantes), me presentearam com muita ajuda no laboratório, sem vocês não teria sido
possível chegar até aqui tão rápido.
A todos do Laboratório de Fitopatologia Molecular e Virologia Vegetal pela convivência,
pela ajuda, pelos momentos de alegria e gordices. Cada um, com seu jeitinho, contribuiu para
uma caminhada mais leve em meio a tanta correria.
A todos os professores do Programa de Pós-graduação em Proteção de Plantas CECA-UFAL
por dividirem seu conhecimento e experiência.
A todos os meus colegas do Programa de Pós-graduação em Proteção de Plantas do CECAUFAL pelos momentos juntos em sala de aula (e em restaurantes).
A CAPES pela bolsa de mestrado concedida
A todos aqueles que deixaram sua marca – mesmo sem saber – e contribuíram para a
conclusão deste trabalho.
Eternamente grata!
16
RESUMO
Doenças causadas por vírus que pertecem aos gêneros Badnavirus e Begomovirus têm
emergido como sérios problemas para muitas culturas economicamente importantes nas
regiões tropicais e subtropicais do mundo, incluindo o Brasil. Os begomovírus (Família
Geminiviridae) incluem vírus com genoma de DNA circular fita simples encapsidados em
partículas quase-icosaédricas geminadas e transmitidos pelo complexo de espécie crípticas da
mosca-branca Bemisia tabaci. Badnavírus (Família Caulimoviridae) consiste em um grupo de
vírus com genoma de DNA circular fita dupla, encapsidados em partículas baciliformes não
envelopados, e transmitidos principalmente por cochonilhas. Fitovírus possuem uma ampla
gama de hospedeiras daninhas/silvestres, as quais podem funcionar como reservatórios de
vírus, bem como fontes de inoculo e fonte de novas espécies virais para epidemias em cultura.
Centosema brasilianum é uma planta daninha da família Fabaceae, que é frequentemente
encontrada exibindo sintomas de mosaico e crescendo nas proximidades de muitas plantas
cultivadas na região Nordeste do país. Em março de 2017, foi encontrada uma planta de C.
brasilianum mostrando sintomas de mosaico e enrolamento foliar, no município de Maceió,
estado de Alagoas. Objetivo desse trabalho foi detectar e caracterizar molecularmente vírus
com genoma de DNA infectando C. brasilianum. O DNA total foi extraído a partir da amostra
e usado como molde para reações de amplificação por PCR utilizando os primers universais
BADNA-FP e BADNA-RP e PAL1v1978 e PAR1c496, visando respectivamente a detecção
de badnavírus e begomovírus. Amostras que testaram positivas para PCR foram diretamente
sequenciadas pelo método de primer walking. Sequências parciais foram obtidas para região
RT/RNaseH dos badnavírus e DNA-A dos begomovírus. Comparações de sequências
pareadas e análises filogenéticas indicaram a presença de infecção mista em C. brasilianum
por badnavírus e begomovírus. O isolado BR:Mac:17, pertence a uma provável nova espécie
de badnavírus para a qual foi designado o nome tentativo Centrosema bacilliform virus
(CenBV). Esta espécie foi filogeneticamente mais relacionada com Grapevine roditis leaf
discoloration-associated virus (GRLDaV), proveniente da videira (Vitis vinífera L).
Enquanto, o isolado BR:Mac2:17 é um Begomovirus, provavelmente da espécie Bean golden
mosaic virus (BGMV). Análises filogenéticas, de recombinação e de evolução em rede
mostraram fortes evidências de que BR:Mac2:17 é de fato é um isolado de BGMV. Os
resultados demonstram que C. brasilianum pode atuar como reservatório de badnavírus e
begomovírus na ausência da cultura no campo.
Palavras-chaves: Badnavirus, Begomovirus, caracterização molecular
17
ABSTRACT
Diseases caused by viruses belonging to the genera Badnavirus and Begomovirus have
emerged as serious problems for many economically important crops in the tropical and
subtropical regions of the world, including Brazil. Begomovirus (Family Geminiviridae)
include viruses with circular single-stranded DNA genomes encapsidated in quasi- cosahedral
and transmitted by the species complex of the whitefly Bemisia tabaci. Badnavirus (Family
Caulimoviridae) consists of a group of viruses with double-stranded circular DNA genomes,
encapsidated in non-enveloped bacilliform particles, and transmitted mainly by mealybugs.
Plant viruses have a wide range of host / wild hosts, which can function as virus reservoirs, as
well as sources of inoculum and source of new viral species for crop epidemics. Centosema
brasilianum is a weed of the Fabaceae family, which is often found exhibiting mosaic
symptoms and growing in close proximity to many plants grown in the northeastern region of
Brazil. In May 2017, a plant of C. brasilianum showing symptoms of mosaic and leaf foliage
was found in Maceió, Alagoas state. The aim of this work was to detect and molecularly
characterize viruses with DNA genomes infecting C. brasilianum. The total DNA was
extracted from the sample and used as template for PCR amplification reactions using the
universal primers BADNA-FP and BADNA-RP and PAL1v1978 and PAR1c496, targeting
the detection of badnavirus and begomovirus. Samples that tested positive for PCR were
directly sequenced by the primer walking method. Partial sequences were obtained for RT /
RNaseH region of the badnavirus and begomovirus DNA-A. Comparisons of paired
sequences and phylogenetic analyzes indicated the presence of mixed infection in C.
brasilianum by badnavirus and begomovirus. The isolate BR: Mac: 17 belongs to a probable
new species of badnavirus for which the tentative name Centrosema bacilliform virus
(CenBV) has been designated. This species was phylogenetically more related to Grapevine
roditis leaf discoloration-associated virus (GRLDaV), originating from the vine (Vitis
vinifera L). Meanwhile, the isolated BR: Mac2: 17 is a Begomovirus, probably of the Bean
golden mosaic virus (BGMV) species. Phylogenetic, recombination, and network evolution
analyzes have shown strong evidence that BR: Mac2: 17 is indeed a BGMV isolate. The
results demonstrate that C. brasilianum can act as reservoir of badnavirus and begomovirus in
the absence of the crop in the field.
Key words: Badnavirus, Begomovirus, molecular characterization
18
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1. Planta de C. brasilianum. ......................................................................................... 23
Figura 2. Organização genômica dos begomovírus monossegmentados e bissegmentados. As
ORFs (V1, V2, C3, C4, e etc) estão coloridas de acordo com as proteínas que estas codificam.
CR, região comum. O “hairpin” que inclui a origem de replicação está indicado na LIR. ..... 28
Figura 3. Representação da partícula viral de morfologia isométrica e baciliforme da família
caulimoviridae.......................................................................................................................... 30
Figura 4. (A) Representação esquemática da organização genômica de Commelina yellow
mottle virus (CoYMV) espécie-tipo do gênero Badnavirus. O círculo completo representa o
genoma de DNA de fita dupla. As setas largas indicam a posição das ORFs I, II e III. (B)
Representação linear do mapa genômico de badnavírus mostrando a identificação dos
domínios: domínios de movimento (M), motivo de ligação ao RNA (BR), região conservada
de cisteína (CYS), aspartato protease (PR), transcriptase reversa (RT) e ribonuclease H (RH)
(BRIDDON et al., 1999). ......................................................................................................... 33
Figura 5. Produto da PCR visualizado em gel de agarose a 0,8%. Onde M: marcador
molecular KASVI; 1: fragmento de aproximadamente 1,2kb referente a região comum e as
extremidades amino terminal dos genes Rep e Cp do genoma dos begomovírus; 2: fragmento
de aproximadamente 580 pb referente ao domínio RT/RNaseH do genoma dos badnavírus; 3:
Controle negativo. .................................................................................................................... 43
Figura 6. Matriz bidimensional representando porcentagem de identidade de comparações
pareadas de sequências nucleotídicas do domínio RT/RNAse H do isolado BR_Mac1_17 com
amostras de badnavirus disponíveis no GenBank. ................................................................... 44
Figura 7.Matriz bidimensional representando porcentagem de identidade de comparações
pareadas de sequências nucleotídicas do DNA-A do isolado BR_Mac2_17 com amostras de
begomovírus disponíveis no GenBank. ................................................................................... 45
Figura 8. Planta de C. brasilianum exibindo sintomas de mosaico e enrolamento foliar (seta
vermelha) causados pela de infecção mista com os vírus CenBV e BGMV. .......................... 47
Figura 9. Análise filogenética de inferência Bayesiana baseada na sequência da região
RT/RNaseH da ORF III do genoma dos badnavírus mais similares obtidos no
GenBank.BR_Mac1_17 foi isolado neste estudo. ................................................................... 48
Figura 10. Análise filogenética de Máxima Verossimilhança baseada na sequência parcial do
DNA-A do genoma dos begomoírus mais similares obtidos no GenBank BGMV, MaYVV,
MaCmMV, CPGMV e CenYSV. BR_Mac2_17 foi isolado neste estudo. ............................. 49
Figura 11. Análise reticulada do isolado BR_Mac1_17 para eventos de recombinação. ........ 50
Figura 12. Análise reticulada do isolado BR_Mac2_17 para eventos de recombinação. Onde
observa-se eventos de recombinação intraespecífica com BGMV, ......................................... 51
19
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Sequências de badnavirus e begomovirus obtidas a partir do banco de dados nãoredundantes GenBank. ............................................................................................................. 39
Tabela 2. Eventos de recombinação detectados entre diferentes isolados de espécies de
begomovirus............................................................................................................................. 51
20
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................................21
2 REVISÃO DE LITERATURA ...........................................................................................23
2.1 Centrosema brasilianum (L.) Benth ...............................................................................23
2.2 Ocorrência de vírus em Centrosema spp. .......................................................................23
2.3 Família Geminiviridae ....................................................................................................24
2.4 Gênero Begomovirus .......................................................................................................25
2.5 Organização genômica e replicação dos Begomovirus ...................................................27
2.6. Família Caulimoviridae .................................................................................................29
2.7 Gênero Badnavirus .........................................................................................................32
2.8 Diversidade de Begomovirus e Badnavirus em plantas daninhas/silvestres da família
Fabaceae no Brasil ................................................................................................................34
3 MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................................37
3.1 Coleta do material vegetal ..............................................................................................37
3.2 Detecção e caracterização dos genomas parciais de begomovírus e badnavírus ............37
3.3 Análise de sequências e demarcação de espécies ...........................................................38
3.4 Análise filogenética ........................................................................................................41
3.5 Análises de recombinação...............................................................................................41
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO .........................................................................................43
4.1 Análises de sequências e demarcação de espécie ...........................................................43
4.2 Análises Filogenéticas ....................................................................................................47
5 CONCLUSÕES ....................................................................................................................53
6 REFERÊNCIAS ...................................................................................................................54
21
1 INTRODUÇÃO
Espécies incluídas nos gêneros Badnavirus e Begomovirus constituem um dos mais
importantes grupos de fitovírus de DNA que tem emergido como sérios patógenos para um
grande número de plantas cultivadas, especialmente nas regiões tropicais e subtropicais do
mundo (BHAT et al., 2016; INOUE-NAGATA et al., 2016).
Os badnavírus (Família Caulimoviridae) são vírus de DNA fita dupla circular, com
partículas bacilliformes e genoma monossegmentado com cerca de 7,2 a 9,2 kb. Estes são
transmitidos naturalmente por cochonilhas (Planoccocus spp) e algumas espécies por pulgões
(Aphis spp.). Os badnavírus causam doença em muitas hospedeiras monocotiledôneas e
dicotiledôneas como arroz (Oryza sativa L.) (OMURA et al., 1983), a cana-de-açúcar
(Saccharum officinarum L.) (LOCKHART; AUTREY, 1988), banana (Musa spp.)
(LOCKHART; OLSZEWKI, 1993), cacau (Theobroma cacao L.) (BRUNT et al., 1997),
citros (Citrus spp.) (AHLAWAT et al., 1996), pimento (Capsicum spp.) (LOCKHART et al,
1997), inhame (Dioscorea spp.) (PHILLIPS et al., 1999) e o taro (Colocasia esculenta (L.)
Schott.) (YANG et al., 2003). Alguns badnavírus também ocorrem como vírus endógenos,
que se integram aos genomas hospedeiros e que podem ser ativados, por exemplo, através do
estresse abiótico, dando origem a formas epissomais infecciosas (BHAT et al, 2016). No
Brasil, infecções causadas por badnavírus já foram descritas nas culturas do abacaxi, banana,
inhame e cana-de-açúcar (FIGUEIREDO et al., 2006; BRIOSO et al., 2012, LIMA et al.,
2013; SANTOS, 2013; SILVA et al., 2015).
Os
begomovírus
(Família
Geminiviridae)
englobam
vírus
com
genoma
monossegmentado ou bissegmentado de DNA fita simples circular, encapsidados em
partículas quase-icosaédricas geminadas. Estes vírus são transmitidos predominantemente
pela mosca-branca Bemisa tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae) para uma ampla gama de
hospedeiras dicotiledôneas (ZERBINI et al., 2017). No Brasil, begomovírus são fatores
limitantes para os cultivos de feijão e tomate, levando a perdas substanciais na produtividade
dessas culturas (INOUE-NAGATA et al., 2017).
Além de infectarem plantas cultivadas, os begomovírus também infectam outras
hospedeiras daninhas/silvestres, principalmente aquelas pertencentes às famílias Malvaceae,
Euphorbiaceae e Fabaceae (MORALES; ANDERSON, 2001). Poucos são os relatos de
22
ocorrência de badnavírus em plantas daninhas, predominando a infecção de Commelina spp.,
família Commelinaceae (GEERING; HULL, 2012). Plantas daninhas abrigam muitas espécies
de vírus que podem ocorrer em infecção mista. Hospedeiras daninhas em infecção mista
promovem a interação entre diferentes espécies e/ou isolados vírais levando a uma série de
efeitos como: aumento/decréscimo das taxas de replicação, transmissão e expressão de
sintomas na hospedeira (SYLLER, 2012). Adicionalmente, infeções mistas com mais de uma
espécie viral constitue o pré-requesito para ocorrência de recombinação, um importante
mecanismo na evolução de badnavírus e begomovírus (PADIDAM et al., 1999; AHMAD et
al., 2011; SILVA et al., 2012; LIMA et al., 2013; RAMOS-SOBRINHO et al., 2014;
SHARMA et al., 2015).
Plantas daninhas desempenham um importante papel na epidemiologia de
begomovírus, atuando como hospedeiras alternativas e como fontes de novos vírus/isolados
que surgem por recombinação ou pseudo-recombinação que podem ser transmitidos para
plantas cultivadas via inseto vetor (COTRIM et al., 2007; CASTILLO-URQUIZA et al.,
2008; SILVA et al., 2012). No entanto, são escassas as informações sobre a importância de
plantas daninhas na epidemiologia de espécies do gênero Badnavirus.
Diante do exposto, objetivou-se por meio desse trabalho realizar a caracterização
molecular de vírus de DNA infectando Centrosema brasilianum, uma planta daninha
associada a diversas culturas economicamente importantes no estado de Alagoas.
23
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Centrosema brasilianum (L.) Benth
Conhecida popularmente como feijão-bravo ou fava-branca, a Centrosema
brasilianum é uma leguminosa forrageira perene nativa da América do Sul, pertence à família
Fabaceae (Leguminosae), que apresenta ampla distribuição geográfica e é umas das maiores
famílias botânicas - com aproximadamente 19.000 espécies e mais de 730 gêneros - (SOUZA;
LORENZI, 2008; QUEIROZ, 2009). Segundo Penteado et al (1996), a maioria das espécies
de Centrosema está distribuída por savanas e florestas de regiões tropicais e subtropicais das
Américas do Sul e Central. No Brasil ocorre a maior riqueza de Centrosema, sendo
encontradas 31 espécies, das quais dez apresentam ocorrência exclusiva neste país.
Figura 1. Planta de C. brasilianum.
Fonte: The Field Museum – Neotropical Herbarium Specimens
2.2 Ocorrência de vírus em Centrosema spp.
Relatos de ocorrência de viroses em plantas do gênero Centrosema mundialmente são
escassos e incluem espécies que pertencem aos grupos Comovirus, Potyvirus, Cucumovirus,
Potexvirus, Carlavirus e Geminivirus (SCHULTZE-KRAFT et al., 1990).
24
O primeiro vírus descrito em Centrosema sp. foi de Centrosema mosaic virus (CaMV
ou CenMV), um Potexvirus encontrado na Nova Guiné (CROWLEY; FRANCKI, 1963;
PURCIFULL; EDWARDSON, 1982; VAN VELSEN; CROWLEY, 1961 e 1962) que pode
ser transmitido por afídeos e besouros. Uma outra espécie de Centrosema mosaic virus
(CeMV, gênero Potyvirus) foi isolada e caracterizada na Colômbia em 1984 (CIAT, 1985 e
1986). Esta inclui como hospedeiros C. brasilianum, C. macrocarpum, C. pascuorum, C.
pubescens, C. schottii e Glycine max, e pode ser transmitido por afídeos e sementes (SchultzeKraft et al, 1990). Outro Potyvirus, Passionfruit woodiness virus (PWV), foi descrito da
Austrália infectando C. pubescens (GREBER, 1971; SCHULTZE-KRAFT et al., 1990).
No Brasil, até o momento apenas uma espécie de vírus foi descrita, Centrosema yellow
spot virus (CenYSV), e um begomovírus (família Geminiviridae) foi isolado e caracterizado
molecularmente a partir de amostras foliares de C. brasilianum exibindo sintomas de manchas
foliares amarelas, no município de Caruaru, estado de Pernambuco (SILVA et al., 2012).
2.3 Família Geminiviridae
Geminiviridae é uma das mais importantes e numerosas famílias de vírus que infectam
plantas, englobando pequenos vírus não envelopados, com genoma de DNA fita simples
(ssDNA) circular contendo 2500-5200 bases, envoltos por um capsídeo icosaédrico geminado
(BROWN et al., 2012; ZERBINI et al., 2017).
A família possui até o momento 369 espécies reconhecidas pelo International Comitee
on Taxonomy of Viruses – ICTV (http://www.ictvonline.org/virusTaxonomy.asp) e
distribuídas em oito gêneros: Becurtovirus, Begomovirus, Capulavirus, Curtovirus,
Eragrovirus, Mastrevirus, Topocuvirus e Turncurtovirus, definidos com base na gama de
hospedeiros, tipo de inseto vetor, organização genômica e relacionamento filogenético
(VARSANI et al., 2014, BROWN et al., 2015; GILBERTSON et al., 2015).
Becurtovirus,
Curtovirus,
Mastrevirus,
e
Turncurtovirus
têm
genoma
monossegmentados e são transmitidos por diferentes espécies de cigarrinhas para espécies
dicotiledôneas e monocotiledôneas. Capulavirus, Glabrovirus e Topocuvirus também são
monossegmentados, mas são transmitidos respectivamente pelo pulgão Aphis cracivora, e os
membrancídeos Spissistilus festinus e Micruotalis malleifera (BROWN et al., 2012; ZERBINI
et al., 2017; VARSANI et al., 2017). A espécie Eragrostis curvula streak virus, única espécie
do gênero Eragrovirus, tem genoma monossegmentado e seu vetor ainda não foi determinado
(ZERBINI et al., 2017).
25
O gênero Begomovirus (espécie tipo, Bean golden yellow mosaic virus) é o mais
numeroso, contando atualmente com 322 espécies reconhecidas pelo ICTV.Estes são
transmitidos pelo grupo de espécies crítpticas de mosca-branca do complexo Bemisia tabaci
(Hemiptera: Aleyrodidae). (ICTV, 2017).
2.4 Gênero Begomovirus
As espécies do gênero Begomovirus infectam uma ampla gama de plantas
dicotiledôneas principalmente nas regiões tropicais e subtropicais do mundo (BROWN et al.,
2015). Os begomovírus tornaram-se um grupo de vírus emergentes devido à alta incidência e
severidade das doenças causadas em culturas economicamente importantes como tomate
(Solanum lycopersicum) (COSTA, 1976), feijão (Phaseolus vulgaris) (COSTA, 1965),
pimenta (Capsicum spp.) ( LIMA et al., 2001), mandioca (Manihot esculenta) (DUBERN,
1979) e batata (Solanum tuberosum) (DANIELS, 1985), além de infectar plantas
silvestres/daninhas em diferentes famílias botânicas (MORALES; ANDERSON, 2001;
NAVAS-CASTILLO et al., 2011; BROWN et al., 2015).
As perdas econômicas ocasionadas por begomovírus são difíceis de avaliar.
Entretanto, estima-se que perdas causadas por begomovírus associados ao mosaico da
mandioca (Cassava Mosaic Disease) chegaram a US$ 2 bilhões por ano na África (PATIL;
FAUQUET, 2009). No Brasil, é estimado que as begomoviroses causaram perdas de US$ 5
bilhões no período de 1995 a 2000 (JESKE, 2009). O tomateiro e o feijoeiro são as principais
culturas afetadas por begomovírus no país, com perdas que podem chegar a 100%
(MORALES; ANDERSON, 2001). Para os feijões (Phaseolus spp.), perdas médias anuais de
20% têm sido estimadas (FARIA et al., 2014).
Os begomovírus são encontrados basicamente no floema das plantas infectadas,
entretanto, algumas espécies são capazes de infectar tecidos mais externos como as células do
mesófilo (NELSON; VAN BEL, 1998). Diferentes isolados de uma mesma espécie podem
causar sintomas que variam significativamente, dependendo do background genético do
hospedeiro, das condições ambientais e do estágio de crescimento e condições fisiológicas do
hospedeiro no momento da infecção (PICÓ et al.,1996). No geral begomovírus causam
sintomas similares em plantas incluindo: nanismo, distorção foliar, algumas combinações de
mosaico dourado, amarelo claro e verde, enrolamento foliar, enrrugamento, amarelecimento
veinal e interveinal e manchas amarelas nas folhas (INOUE-NAGATA et al., 2016).
26
Baseado na organização genômica, diversidade genética e distribuição geográfica, os
begomovírus são divididos em dois grupos: os do Velho Mundo/Old World (VM/OW), que
compreende África, Europa, Ásia e Austrália; e Novo Mundo/New World (NM/NW),
compreendendo as Américas (GILBERTSON et al., 2015; INOUE-NAGATA; LIMA;
GILBERTSON, 2016). Os begomovírus do VM apresentam predominantemente um
componente genômico e frequentemente estão associados a moléculas de ssDNA (~1.350 nt)
satélites denominados alfassatélites (anteriormente DNA-1), betassatélites (anteriormente
DNA 2) e deltassatélites (FAUQUET; STANLEY, 2005; ZHOU et al., 2013).
Os betasatélites requerem um begomovírus auxiliar para sua replicação, encapsidação,
movimento célula a célula e sistêmico na planta hospedeira, e transmissão por B. tabaci
(BRIDDON et al., 2006; ZHOU, 2013). Possuem uma origem de replicação (ori) que inclui o
nonanucleotídeo TAATATTAC, observado na maioria dos begomovirus (BRIDDON et al.,
2006). Além de codificar uma única proteína multifuncional, βC1, que atua na indução de
sintomas e aumento da patogenicidade do vírus auxiliar pela elevação dos níveis de DNA
viral e supressão do sistema de defesa antiviral da hospedeira via silenciamento póstranscricional (CUI et al., 2005; SAEED et al., 2005; BRIDDON et al., 2006; EINI et al.,
2012; GOPAL et al., 2007). Apesar do requerimento do vírus auxiliar para replicação, os
betassatélites são promíscuos, podendo ser transreplicados por uma diversidade de vírus
auxiliares não cognatos, incluindo begomovírus mono e bissegmentados (MANSSOR et al.,
2006; SAEED et al., 2007, ZHOU, 2013).
Diferente dos beta-satélites, os alfa-satélites possuem na sua origem de replicação o
nonanucleotídeo (TAGTATTAC) semelhante ao dos nanovírus (família Nanoviridae)
(BRIDDON et al., 2004; BRIDDON et al., 2006). Alfa-satélites codificam uma proteína
associada a replicação (Rep) que permite autonomia na replicação e parecem não ser
essenciais para o desenvolvimento e manutenção da doença (BRIDDON et al., 2006). Embora
em alguns casos foi demonstrado que estes podem atenuar os sintomas da doença; ou mesmo
codificar uma Rep com uma forte atividade de supressão de silenciamento gênico, sendo mais
eficiente em suplantar os mecanismos de defesa da hospedeira quando comparado aos betasatélites (PAPROTKA, 2010; PATIL et al., 2010; IDRIS et al., 2011). Alfa-satélites foram
encontrados em associação com begomovírus bipartidos no Novo Mundo (Brasil, Cuba e
Venezuela) (PAPROTKA et al., 2010, ROMAY et al., 2010).
Os begomovírus do NW são, na sua maioria, bissegmentados (dois componentes
genômicos – DNA-A e DNA-B) com aproximadamente 2,6 Kb cada (Figura 2). (HANLEYBOWDOIN et al., 1999). No entanto, em 2013 foi descrito o primeiro relato de begomovírus
27
monossegmentado nativo do NW, o Tomato leaf deformation virus (ToLDeV) causando
sintomas associados ao Tomato leaf curl disease (ToLCD) no Peru e Equador (MELGAREJO
et al., 2013; SÁNCHEZ-CAMPOS et al., 2013). Adicionalmente, foi demonstrada a
ocorrência dos DNAs alfa-satélites Cleome leaf crumple virus (ClLCrV), Euphorbia mosaic
virus (EuMV) e Melon chlorotic mosaic virus (MeCMV) em associação com begomovírus
bissegmentados do NW (PAPROTKA; METZLER; JESKE, 2010b; ROMAY et al., 2010).
2.5 Organização genômica e replicação dos Begomovirus
Os DNA-A e DNA-B cognatos dos begomovirus bissegmentados, possuem uma
região conservada (Região Comum, RC) com aproximadamente 200pb, a qual compartilha
acima de 90% de identidade de sequência (LAZAROWITZ et al., 1992; FONTES et al.,
1994b). A RC abriga uma sequência de nove nucleotídeos (5’-TAATATT↓AC-3’), chamada
de nonanucleotídeo, que está presente em todos os geminivírus e onde se situa a origem de
replicação viral (OROZCO; HANLEY-BOWDOIN, 1996).
O genoma dos begomovírus possui Open Reading Frames (ORFs) que codificam
proteínas multifuncionais, que no caso dos geminivírus, reflete uma compensação ao pequeno
tamanho do genoma (2.600 nucleotídeos) (FONDONG, 2013). A transcrição é bidirecional
tanto no DNA-A, que codifica genes envolvidos na replicação e encapsidação viral, quanto no
DNA-B, que codifica genes envolvidos na movimentação do vírus da planta
(TIMMERMANS; DAS; MESSING, 1994; BROWN, 1997; FARIA et al., 2000).
No DNA-A, no sentido viral encontra-se o gene que codifica para a proteína capsidial
(CP, coat protein) que tem a função de proteger o genoma viral contra degradação e é
fundamental para a transmissão e determina a especificidade do vírus pelo inseto vetor
(BRIDDON et al., 1990; HÖFER et al., 1997a). No sentido complementar encontram-se os
genes que codificam para as seguintes proteínas: (1) Replication-associated protein (REP),
proteína associada a replicação do ssDNA viral no núcleo da célula hospedeira iniciando a
replicação por círculo rolante (GUTIERREZ, 1999). A função desta proteína é ligar ao sítio
de início da replicação viral e clivar umas das fitas de DNA (FONTES; LUCKOW;
HANLEY-BOWDOIN, 1992); (2) Trans-activating protein (TrAP), proteína transativadora
da transcrição, que atua nos promotores de genes de sentido viral dos DNA-A e DNA-B (CP e
NSP). (SUNTER; BISARO, 1992) e que também atua como supressora de silenciamento
gênico (VOINNET et al., 1999); (3) Replication-enhancer protein (REn), fator acessório (não
28
essencial) de amplificação da replicação viral por ser capaz de aumentar a afinidade da
proteína Rep na origem de replicação; (4) C4, proteína que também está envolvida na
supressão de silenciamento gênico. (HANLEY-BOWDOIN et al., 1999)
O DNA-B possui dois genes, um no sentido viral que codifica a proteína Nuclear
shuttle protein (NSP) responsável pelo transporte intracelular do DNA através do envelope
nuclear; e no sentido complementar codifica a proteína Moviment protein (MP) envolvida no
movimento célula-a-célula do vírus por meio do aumento do limite de exclusão dos
plasmodesmas. Acredita-se que o transporte célula-a-célula é realizado por um complexo
MP/DNA/NSP. (HEHNLE; WEGE; JESKE, 2004).
Figura 2. Organização genômica dos begomovírus monossegmentados e bissegmentados. As ORFs (V1, V2, C3,
C4, e etc) estão coloridas de acordo com as proteínas que estas codificam. CR, região comum. O “hairpin” que
inclui a origem de replicação está indicado na LIR.
Fonte: Adaptado de Zerbini et al. (2017).
O processo de infecção dos membros de Geminiviridae tem início com entrada das
partículas virais na planta por meio da inoculação pelo inseto vetor. No interior da célula da
hospedeira ele irá se desassociar de forma espontânea do capsídeo e será transportado até o
núcleo, onde ocorrerá a replicação do vírus (LAZAROWITZ, 1992; PALMER; RYBICKI,
1998). Dentro do núcleo celular o ssDNA é convertido em um intermediário de fita dupla
(dsDNA) chamado de Forma Replicativa (FR). Não se sabe ao certo, mas essa conversão
ocorre provavelmente por meio de fatores do hospedeiro (STENGER et al., 1991; STANLEY,
1995; ZERBINI; CARVALHO; MACIEL-ZAMBOLIN, 2000). A FR vai se acumulando
dentro da célula e serve como molde para a síntese de novos componentes genômicos e na
transcrição dos genes virais. A replicação desses vírus ocorre via mecanismo de círculo
29
rolante, semelhante ao utilizado pelos bacteriófagos ϕX174 e M13 ( STENGER et al., 1991;
STANLEY, 1995).
A localização da origem de replicação (ori) é na RC dos dois componentes genômicos.
Neste local, existe uma sequência conservada em forma de grampo, structurally conserved
element (SCE), chamada de nonanucleotídeo, encontrada em todos os geminivírus e que
constitui o domínio funcional da origem de replicação (HEYRAUD-NITSCHKE et al., 1995;
OROZCO; HANLEY-BOWDOIN, 1998). É nesse nonanucleotídeo que ocorre a clivagem
(TAATATT¯AC) do dsDNA e que se inicia a replicação viral por círculo rolante (FONTES
et al., 1994; LAUFS et al., 1995). A replicação ocorre de forma similar, independente do
componente genômico, ou seja, ocorre da mesma forma tanto para o DNA-A, como para o
DNA-B (LAUFS et al., 1995; FARIA; ZERBINI, 2000; STANLEY et al., 2005).
A clivagem do dsDNA na região comum é realizada pela Rep. Nessa região se
encontra uma sequência específica para a ligação desta proteína (FONTES; LUCKOW;
HANLEY-BOWDOIN, 1992; FONTES et al., 1994a) e regiões promotoras da RNA
polimerase tipo II de plantas, responsável pela transcrição dos genes virais (HANLEYBOWDOIN et al., 1999). A partir do momento em que Rep é ligada ao DNA viral e ocorre a
estabilização do complexo formado por Rep, REn e fatores do hospedeiro se inicia a
replicação por círculo rolante (GUTIERREZ, 1999). O reconhecimento pela proteína Rep é
considerado vírus-específico (HARRISON; ROBINSON, 1999; RAMOS et al., 2003). O
último estágio é a produção e a encapsidação do ssDNA genômico circular maduro em
partículas virais (GUTIERREZ, 1999).
2.6 Família Caulimoviridae
Os vírus incluídos na família Caulimoviridae são encapsidados em partículas não
envelopadas de morfologia isométrica (45-50 nm de diâmetro) ou baciliforme (35-50 nm de
diâmetro e 900nm). O genoma dos caulimovírus é constituído por uma molécula de DNA
semicircular de fita dupla com cerca de 7,2-9,2 kb (FAUQUET et al., 2005; GEERING;
HULL, 2012), uma região intergênica poli (A) presente em alguns membros da família, e
descontinuidades de fita simples ou gaps em sítios específicos de ambas as fitas (HARPER
et al., 2002).
30
Figura 3. Representação da partícula viral de morfologia isométrica e baciliforme da família caulimoviridae.
Fonte: Gypse Database 2.0
Angiospermas das classes Eudicotiledônea e Monocotiledônea são as hospedeiras
naturais das espécies da família Caulimoviridae. A transmissão natural do vírus ocorre via
vetor (hemipteras das famílias Aleyrodidae, Aphididae, Cicadellidae e Pseudococcidae),
contato entre plantas hospedeiras, por semente e polén, dependendo do gênero/espécie.
Técnicas de inoculação mecânica e enxertia também podem acarretar a transmissão destes
virus (FAUQUET et al., 2005). Os sintomas característicos na planta atribuídos aos
Caulimoviridae podem variar de acordo com o hospedeiro, a espécie viral envolvida, e
condições climáticas, sendo os mais comumente observados: clareamento de nervuras,
estrias, mosaico, manchas necróticas, linhas e manchas cloróticas, nanismo, má formação
foliar e enrolamento de folíolos (GEERING; HULL, 2012).
De acordo com a organização genômica, gama de espécies hospedeiras, tipo de inseto
vetor, diferenças na sequência de nucleotídeos do domínio reverse transcriptase/RNase H
(RT/RNaseH), o ICTV divide a família Caulimoviridae oito gêneros: Badnavirus,
Caulimovirus,
Cavemovirus,
Petuvirus,
Rosadnavirus,
Solendovirus,
Soymovirus
e
Tungrovirus (GEERING; HULL, 2012).
Os caulimovírus são considerados pararetrovírus, vírus com dsDNA que replicam
através de um intermediário de RNA (BHAT et al., 2016). O processo de replicação, em
geral, envolve duas fases: (1) fase nuclear: a partícula viral chega à célula, sofre
desencapsidação por ação de proteinases celulares e libera o dsDNA genômico que é
transportado para o núcleo onde as descontinuidades do DNA são reparadas e “minicromossomos” são formados. O dsDNA é então transcrito pela RNA polymerase II do
31
hospedeiro (DE KOCHKO et al.,1998); (2) fase citoplasmática: O RNA transcrito é
traduzido, resultando nos produtos proteicos relacionados aos genes virais existentes
(FÜTTERER et al., 1997; POOGGIN et al., 1999). O RNA pré-genômico é retrotranscrito
pela transcriptase reversa no citoplasma produzindo novos dsDNA genômicos (MEDBERRY
et al., 1990). Os dsDNA genômicos são encapsidados, produzindo assim novos vírions. Os
genomas desses vírus também contêm uma sequência complementar ao tRNAMet da planta
que corresponde ao sítio de iniciação da replicação do DNA. Geralmente, este sítio está
localizado dentro ou adjacente à região intergênica (região não-codificante) e é designado
como nucleotídeo um (DE KOCHKO et al.,1998).
Diferente dos retrovírus, membro de Caulimoviridae não se integram no genoma da
hospedeira para completar seu ciclo de replicação, por não ser capaz de codificar uma
integrase. Apesar da ausência da integrase o DNA dos caulimovírus pode integrar
passivamente no genoma da hospedeira, porém o mecanismo é pobremente compreendido.
Tais sequências são conhecidas como sequencias endógenas de pararetrovirus (Endogenous
Pararetroviral Sequences - EPRVs) e são a classe mais abundante de sequências virais
endógenas em diferentes espécies de plantas (GAYRAL; ISKRA-CARUANA, 2009).
Quase todas as sequências endógenas de caulimovírus possuem um padrão de arranjo
similar com repetições em tandem, duplicações internas, fragmentações e inversão do genoma
viral. A maioria das EPRVs resulta em genomas virais parciais e não funcionais, porém várias
integrações contêm toda extensão do genoma viral, com ORFs funcionais. (GAYRAL;
ISKRA-CARUANA, 2009; TEYCHENEY; GEERING, 2011). Sequências virais podem
ocorrer dispersas no genoma de plantas, originárias de uma infecção viral anterior que se
fixou na linhagem germinativa. Tais sequências podem então ser ativadas resultando na
liberação do genoma viral funcional que infectará o hospedeiro (GAYRAL; ISKRACARUANA, 2009).
Essas sequências são integradas no genoma hospedeiro e podem dar origem a vírus
epissomais (NDOWORA et al., 1999) sendo provenientes de eventos de infecções antigas
(HARPER et al., 2005) ou sequências representativas intermediárias entre caulimovírus e
retrotransposons LTR (BOUSALEM; LLORENS et al., 2009). Sequências endógenas de
Caulimoviridae foram descritas em 27 espécies de nove diferentes famílias de plantas e
derivam dos gêneros Caulimovirus, Petuvirus, Badnavirus, Solendovirus e dos gêneros
tentativos Orendovirus e Florendovirus (TEYCHENEY; GEERING, 2011; MUSHEGIAN;
ELENA, 2015; DIOP et al., 2017).
32
Existem evidências de que algumas sequências endógenas são capazes de iniciar a
infecção, em determinadas condições. Os melhores exemplos são Banana streak OL virus
(BSOLV) (NDOWORA et al., 1999), Tobacco vein clearing virus (TVCV) (LOCKHART et
al., 2000), Petunia vein clearing virus (PVCV) (STAGINNUS; RICHERT-PÖGGELER,
2006) e Banana streak GF virus (BSGFV) (GAYRAL; ISKRA-CARUANA, 2009).
A
presença de sequências endógenas de badnavírus no genoma da hospedeira tem tornado um
desafio a diagnose, taxonomia, movimento seguro de germoplasma e o controle das doenças
causadas pelos badnavírus (BHAT et al., 2016).
2.7 Gênero Badnavirus
Com 40 espécies identificadas, o gênero Badnavirus é mais numeroso da família
Caulimoviridae e o segundo em número de espécies entre os fitovírus com genoma de DNA
(ICTV, 2017). A espécie tipo do gênero Badnavirus é Commelina yellow mottle virus
(ComYMV), detectada pela primeira vez em Commelina diffusa L., na ilha de Guadalupe, no
Caribe (MIGLIORI; LASTRA, 1978). Seus representantes possuem partículas baciliformes
não envelopadas com 95-130nm de comprimento e 24-35nm de largura (FAUQUET et al.,
2005; GEERING; HULL et al., 2012). O genoma de badnavírus geralmente contém uma
única molécula de dsDNA de cerca de 7200-7600 pb que forma um círculo aberto
interrompido por descontinuidades sítio-específicas e que podem conter uma região
intergênica poli A (MEDBERRY; LOCKHART; OLSZEWSKI, 1990).
O genoma viral usualmente codifica três “Open Reading Frames” (ORFs) principais e
contém geralmente três descontinuidades (gaps) em sítios específicos, contudo em alguns
casos podem estar presentes quatro ORFs adicionais (BOUHIDA et al., 1993; HAGEN et al.
1993; GEERING; HULL, 2012). As ORFs I e II codificam respectivamente para a as
proteínas P1 (20,8 kDa) de função desconhecida e P2 (23 kDa) cuja função está associada á
encapsidação do vírion (CHENG et al., 1996; JACQUOT et al., 1996). A terceira ORF
(ORF3) codifica uma poliproteína de 208 a 216 kDa que é proteoliticamente clivada e gera,
dentre outros produtos, a proteína de movimento, a proteína do capsídeo viral, a aspartato
protease (AP), responsável pela clivagem da poliproteína, a transcriptase reversa (reverse
transcriptase RT) e a Ribonuclease H1 (MEDBERRY et al., 1990; TZAFRIR et al., 1997;
HARPER; HULL, 1998; GEERING; HULL, 2012).
33
Figura 4. (A) Representação esquemática da organização genômica de Commelina yellow mottle virus (CoYMV)
espécie-tipo do gênero Badnavirus. O círculo completo representa o genoma de DNA de fita dupla. As setas
largas indicam a posição das ORFs I, II e III. (B) Representação linear do mapa genômico de badnavírus
mostrando a identificação dos domínios: domínios de movimento (M), motivo de ligação ao RNA (BR), região
conservada de cisteína (CYS), aspartato protease (PR), transcriptase reversa (RT) e ribonuclease H (RH)
(BRIDDON et al., 1999).
A
B
Badnavirus constituem um importante grupo de fitovírus que tem emergido como
sérios patógenos para muitas culturas tropicais, especialmente banana, pimenta, cana-deaçúcar, taro e inhame. Relatos de perdas econômicas associadas a diferentes espécies de
badnavírus em diversas culturas variam entre 10% a 90%. No geral a gama de hospedeiros
desse vírus é restrita, delimitada a uma ou duas famílias botânicas. Os sintomas causados por
infecção de badnavírus são variados e na maioria dos casos incluem mosqueado clorótico,
estrias necróticas, deformação e redução do tamanho dos entrenós levando ao
desenvolvimento de nanismo (BHAT et al., 2016).
A disseminação de badnavírus ocorre principalmente por propagação vegetativa e
algumas poucas espécies como Commelina yellow mottle virus (ComYMV), Kalanchoe topspotting virus (KTSV), Piper yellow mottle virus (PYMoV), Cocoa swollen shoot virus
(CSSV) e Taro bacilliform virus (TaBV) também podem ser transmitidas por sementes
(HEARON et al., 1984; QUAINOO et al., 2008; HAREESH; BHAT, 2010; DEESHMA et al.,
2014; BHAT et al., 2016. A transmissão horizontal de badnavírus ocorre na maioria dos casos
através de várias espécies de cochonilha. As espécies Gooseberry vein banding virus
34
(GVBaV), Rubus yellow net virus (RYNV) e Spiraea yellow leaf spot virus (SYLSV) são
transmitidas por afídeos (BHAT et al., 2016).
No Brasil, infecções causadas por badnavirus já foram descritas em abacaxi
(SANTOS, 2013), bananeira (BRIOSO et al., 2012), bougainvillea (RIVAS et al., 2005);
inhame (LIMA et al., 2013); cana-de-açúcar (SILVA et al., 2015). Estudos realizados com as
culturas de abacaxi, inhame e cana-de-açúcar em Alagoas e outros estados do Nordeste do
país, revelaram que a incidência e variabilidade de badnavírus nessa região é elevada (LIMA
et al., 2013; SANTOS, 2013; SILVA et al., 2015)
2.8 Diversidade de Begomovírus e Badnavírus em plantas daninhas/silvestres da família
Fabaceae no Brasil
O primeiro registro de um begomovírus infectando uma hospedeira da família
Fabaceae no país foi realizado por Costa em 1965, o qual demonstrou que o vírus que causa o
mosaico dourado do feijoeiro (Bean golden mosaic virus, BGMV) é transmitido pela moscabranca Bemisia tabaci (COSTA et al., 1965). O mosaico dourado do feijoeiro é uma das mais
devastadoras doenças para o cultivo de feijoeiro no continente Americano, e desde 1970, o
BGMV vêm causando perdas entre 40 a 100% da produção de Phaseolus spp no Brasil.
(FARIA; MAXWELL, 1999; ARAGÃO, 2013). O BGMV é o begomovírus prevalente nas
áreas de cultivo de feijoeiro da região central do país, mas na região Nordeste suas populações
vêm sendo gradualmente substituídas por begomovírus nativo de plantas daninhas (RAMOSSOBRINHO et al., 2014).
A ocorrência de infecção por begomovírus em plantas daninhas da família Fabaceae
foi relatada pela primeira vez no país em 2006, nas espécies Desmodium sp. e Macroptilium
lathyroides. No entanto, as espécies de begomovírus associadas a estas plantas não foram
identificadas (ASSUNÇÃO et al., 2006).
Uma pesquisa realizada para determinar a diversidade, variabilidade de espécies e
estrutura de populações de begomovírus infectando leguminosas não cultivadas, revelou a
presença de seis espécies: Euphorbia yellow mosaic virus - EuYMV proveniente de
Macroptilium atropurpureus); Centrosema yellow spot virus - CenYSV infectando
Centrosema brasilianum); BGMV, Macroptilium yellow net virus - MaYNV, Macroptilium
yellow vein virus – MaYVV obtidos a partir de M. lathyroides e Macroptilium yellow spot
virus – MaYSV, causando infecção em M. lathyroides, Calopogonium mucunoides,
Canavalia sp. Os resultados desse estudo revelaram que estas hospedeiras daninhas são
35
reservatórios de vários begomovírus, e podem desempenhar um importante papel como fonte
de inóculo e fonte de novos vírus para plantas cultivadas (SILVA et al., 2012). Acredita-se
que begomovírus que infectam plantas daninhas/silvestres no Brasil tem sido horizontalmente
transferidos para plantas cultivadas, e que na nova hospedeira eles rapidamente evoluem por
recombinação e pseudorecombinação, dando origem a novas espécies (CASTILLOURQUIZA et al., 2008; FERNANDES et al., 2009).
A espécie MaYSV tem sido frequentemente encontrada infectando naturalmente
leguminosas daninhas e cultivadas como Macroptilium spp., C. mucunoides, Canavalia spp.,
Desmodium glabrum, feijão comum e feijão-fava nos estados de Alagoas, Paraíba,
Pernambuco e Sergipe (SILVA et al., 2012; LIMA et al., 2013; RAMOS-SOBRINHO et al.,
2014; FONTENELE et al., 2016). Nos últimos anos, MaYSV parece estar deslocando
populações de BGMV em feijão comum e feijão-fava nessas regiões. Evidências corroboram
com esses fatos como por exemplo: Em 2005, apenas BGMV foi obtido de feijão-fava nos
estados de Alagoas e Pernambuco. Contudo, em 2011, MaYSV foi o begomovírus mais
frequentemente obtido a partir de feijão-fava, feijão comum e M. lathyroides em Alagoas.
Enquanto BGMV e MaYVV foram menos prevalentes, e indicando a rápida emergência de
MaYSV em hospedeiras fabáceas em Alagoas (RAMOS-SOBRINHO et al., 2014).
Já
pesquisas realizadas em áreas de cultivo de feijão comum em 2013 no estado de Pernambuco,
também identificaram a prevalência de MaYSV, sendo a espécie BGMV encontrada em
apenas uma amostra, em infecção mista com MaYSV (FARIA et al., 2016). No entanto,
MaYSV não tem sido detectado em cultivos de feijoeiro na região central do Brasil. BGMV é
o vírus prevalente, ocorrendo em importantes áreas de produção situadas nas regiões Sul,
Sudeste e Centro-Oeste do país (RAMOS-SOBRINHO et al., 2014).
Pesquisas realizadas para identificar vírus associados a plantas daninhas da família
Fabaceae no Brasil, indicam que similar ao que é observado para begomovírus provenientes
de plantas cultivadas, a diversidade e variabilidade de espécies de begomovírus nessas
hospedeiras é bastante alta (SILVA et al., 2012; LIMA et al., 2013; RAMOS-SOBRINHO et
al., 2014). A alta variabilidade genética nas populações de MaYSV se deve principalmente a
eventos de recombinação interespecífica com outros begomovírus provenientes de plantas
daninhas e cultivadas (SILVA et al., 2012; LIMA et al., 2013; RAMOS-SOBRINHO et al.,
2014). Enquanto a que a variabilidade genética nas populações de BGMV é baixa (FARIA;
MAXWELL, 1999; RAMOS-SOBRINHO et al., 2014). Adicionalmente, BGMV possui
populações estruturadas com base em região geográfica e nos hospedeiros e as populações de
MaYSV não (RAMOS-SOBRINHO et al., 2014).
36
A emergência de isolados altamente variáveis de MaYSV pode complicar seriamente
o manejo dessas viroses em Phaseolus spp, que são importantes culturas que compõem a base
da alimentação dos brasileiros. O bombardeamento de clones infecciosos de MaYSV
demosntrou que esse vírus foi capaz de causar mosaico dourado e distorção foliar em feijão
‘Olathe Pinto”, soja e plantas de feijão GM resistentes a BGMV (FUENTES et al., 2016;
PRINS et al., 2008).
Quanto aos badnavírus, até o momento, estes não foram relatados infectando nenhuma
hospedeira daninha/silvestre da família Fabaceae. A função de plantas daninhas na
epidemiologia de doenças causadas por badnavírus é muito pouco estudada. Lockhart et al.,
(1996), observou que plantas daninhas não são importantes para sobreviência e/ou
disseminação de isolados de Banana streak virus (BSV) que causam a estria da bananeira.
Uma das explicações para que isto ocorra é que a maioria das hospedeiras infectadas por
espécies de badnavírus são propagadas vegetativamente o que facilita o acúmulo e
disseminação desses vírus (GEERING; HULL, 2012).
37
3
MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Coleta do material vegetal
Amostras foliares C. brasilianum apresentando sintomas indicativos de infecção por
vírus foram coletadas em Maceió (AL), em 26 de março de 2017. O material vegetal foi
armazenado como exsicata e em frezeer à - 80°C até o momento das análises, no Laboratório
de Fitopatologia Molecular e Virologia Vegetal do Centro de Ciências Agrárias da
Universidade Federal de Alagoas.
3.2 Detecção e caracterização dos genomas parciais de Begomovírus e Badnavírus
O DNA total foi extraído a partir de cada amostra vegetal segundo protocolo de Lodhi
(1994). O DNA obtido foi submetido à ampliação por Polymerase Chain Reaction (PCR),
para detecção dos vírus pertencentes aos gêneros Begomovirus e Badnavirus, utilizando os
pares de oligonucleotídeos universais e degenerados, respectivamente, PAL1v1978 (5’GCATCTGCAGGCCCACATYGTTCTTLYCCNG-3’)
(5’AATACTGCAGGGCTTYCTRTACATRGG-3’),
ATGCCITTYGGIITIAARAAYGCICC-3’)
PAR1c496
BadnaFP
e
BadnaRP
(5’(5’-
CCAYTTRCAIACISCICCCCAICC-3’) (ROJAS et al., 1993; YANG et al., 2003).
As reações foram realizadas em volume total de 60 µL, contendo 6 µL de tampão 10X
(KCl 100 mM, Tris-HCl 100 mM pH 9,0, Triton-X 1%), 4,8 µL de dNTPs 2,5 mM, 1,8 µL de
MgCl 50 mM, 3 µL de cada oligonucleotídeo (10 µM), 1 U da Taq DNA Polimerase, 1 µL de
2 DNA (10 a 100 ng) e 40 µL de água ultrapura. As condições de amplificação para detecção
de begomovirus as condições foram: desnaturação inicial de 94°C por 2 min, 94 °C por 1 min,
52 °C por 1 min, 72 °C por 2 min. Os ciclos foram repetidos 30 vezes exceto o passo inicial e
a extensão final a 72 °C por 10 min. Já para a detecção de badnavírus, as condições foram:
desnaturação inicial de 94 °C por 4 min, 94 °C por 30 s, 50 °C por 30 s, 72 °C por 30 s. Os
ciclos foram repetidos 35 vezes exceto o passo inicial e a extensão final a 72 °C por 10 min.
Após a amplificação, os produtos foram analisados em gel de agarose a 0,8%, em
tampão TBE (Tris-Borato, EDTA 0,5M, pH 8,0), corado com brometo de etídeo e visualizado
sobre luz ultravioleta.
Para caracterização, os produtos da amplificação foram purificados utilizando-se o kit
38
GFX PCR DNA and Gel Band Purification (GE Healthcare). O sequenciamento foi realizado
comercialmente (Macrogen Inc., Seul, Coréia do Sul), diretamente a partir dos produtos de PCR
purificados.
3.3 Análise de sequências e demarcação de espécies
Sequências nucleotídicas correspondentes às sequências parciais do componente
genômico DNA-A dos begomovírus e domínio RT/RNaseH do genoma dos badnavírus foram
montadas utilizando-se o programa CodonCode Aligner v. 4.1.1 (www.codoncode.com). As
sequências obtidas foram inicialmente analisadas com o algoritmo BLASTn (ALTSCHUL et
al.,
1990)
e
o
banco
de
dados
de
nucleotídeos
não-redundante
GenBank
(www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank) para determinar as espécies virais com as quais elas
compartilham maior identidade de sequência. As sequências similares obtidas a partir do
GenBank (Tabela 1) foram utilizadas para demarcação de espécie dos novos isolados de
begomovírus e badnavírus utilizando-se o programa Sequence Demarcation Tool v. 1.2
(MUHIRE et al., 2013), com base no nível limite de 80% estabelecido pelo ICTV para
badnavírus (GEERING; HULL, 2012) e 91% para begomovírus (BROWN et al., 2015).
39
Tabela 1. Sequências de badnavirus e begomovirus obtidas a partir do banco de dados não-redundantes
GenBank.
Espécies/ Acrônimos
Código de acesso no
Família
Genbank
Banana streak CA virus (BSCAV)
HQ593111
Caulimoviridae
Banana streak IM vírus (BSIMV)
HQ593112
Caulimoviridae
Banana streak OL virus (BSOLV)
NC003381
Caulimoviridae
Banana streak UA virus (BSUAV)
HQ593107
Caulimoviridae
Banana streak UI vírus (BSUIV)
HQ593108
Caulimoviridae
Banana streak UL vírus (BSULV)
HQ593109
Caulimoviridae
Banana streak UM vírus (BSUMV)
HQ593110
Caulimoviridae
Banana streak virus Acuminata Yunnan
DQ092436
Caulimoviridae
AY750155
Caulimoviridae
Bean golden mosai virus (BGMV)
KJ939753
Geminiviridae
Bean golden mosaic virus isolate BR:Arp1:05
KJ939707
Geminiviridae
EU034539
Caulimoviridae
BR_Mac1_17
Obtido neste estudo
Caulimoviridae
BR_Mac2_17
Obtida neste estudo
Geminiviridae
Cacao swollen shoot virus (CSSV)
NC001574
Caulimoviridae
Canna yellow mottle virus (CaYMV)
MF074075
Caulimoviridae
Centrosema yellow spot virus ( CenYSV)
JN419002
Geminiviridae
Citrus yellow mosaic virus (CiYMV)
NC003382
Caulimoviridae
Commelina yellow mottle vírus (ComYMV)
NC001343
Caulimoviridae
Cowpea golden mosaic virus (CPGMV)
AF188708
Geminiviridae
Cycad leaf necrosis virus (CyNLV)
EU853709
Caulimoviridae
Dioscorea bacilliform AL virus (DBALV)
KX008573
Caulimoviridae
Dioscorea bacilliform RT virus (DBRTV1)
KX008574
Caulimoviridae
Dioscorea bacilliform RT virus (DBRTV2)
KX008577
Caulimoviridae
Dioscorea bacilliform virus (DBSNV)
DQ822073
Caulimoviridae
Dioscorea rotundata endogenous virus eDBV5
KF829974
Caulimoviridae
Dioscorea rotundata endogenous virus eDBV8
KF829997
Caulimoviridae
Dracaena mottle virus (DrMV)
DQ473478
Caulimoviridae
(BSYNV)
Banana streak virus strain Acuminata Vietnam
(BSVNV)
(BGMV)
Bougainvillea spectabilis chlorotic vein-banding
virus (BsCVBV)
40
Fig badnavirus 1 (FBV1)
JF411989
Caulimoviridae
Gooseberry vein banding virus (GVBAV)
HQ852248
Caulimoviridae
Grapevine roditis leaf discoloration-associated
HG940503
Caulimoviridae
virus (GRLDaV)
Caulimoviridae
Grapevine vein-clearing virus (GVGC)
JF301669
Caulimoviridae
Kalanchoe top-spotting virus (KTSV)
NC004540
Caulimoviridae
Macroptilium common mosaic vIrus
KX691396
Geminiviridae
KX691397
Geminiviridae
KJ939906
Geminiviridae
KJ939902
Geminiviridae
Mulberry badnavirus 1 (MBV-1)
LN651258
Caulimoviridae
Musa acuminata endogenous Badnavirus
KF386728
Caulimoviridae
Pagoda yellow mosaic associated virus
(PYMAV)
KJ013302
Caulimoviridae
Pelargonium vein banding virus (PVBV)
GQ428155
Caulimoviridae
Pineapple bacilliform comosus virus (PBCoV)
GU121676
Caulimoviridae
Piper yellow mottle virus (PYMoV)
KJ873042
Caulimoviridae
Rubus yellow net virus (RYNV)
KM078034
Caulimoviridae
Spiraea yellow leaf spot virus (SYLSV)
AF299074
Caulimoviridae
Sugarcane bacilliform Guadeloupe D vírus
(SCBGCV)
Sugarcane bacilliform Ireng Maleng virus
FJ439817
Caulimoviridae
NC003031
Caulimoviridae
Sugarcane bacilliform Mor vírus (SCBMOV)
NC_008017
Caulimoviridae
Sugarcane bacilliform virus clone 10
FJ824814
Caulimoviridae
JN377535
Caulimoviridae
JN377537
Caulimoviridae
JN377536
Caulimoviridae
JN377534
Caulimoviridae
(MaCmMV)
Macroptilium common mosaic virus isolate
ALM9_2A (MaCmMV)
Macroptilium yellow vein virus (MaYVV)
isolate BR:Pai26:11
Macroptilium yellow vein virus isolate
BR:Pai22:11
(SCBIMV)
(SCBGAV)
Sugarcane bacilliform virus isolate BB (SCBVBB)
Sugarcane bacilliform virus isolate BRU
(SCBV-BRU)
Sugarcane bacilliform virus isolate BT (SCBVBT)
Sugarcane bacilliform virus isolate Iscam
(SCBV-Iscam)
41
Sweet potato pakakuy virus (SPVa)
FJ560943
Caulimoviridae
Sweetpotato badnavirus B (SPBb)
FJ560944
Caulimoviridae
Taro bacilliform virus (TaBV)
AF357836
Caulimoviridae
Turmeric mild chlorosis virus (TuMClV)
AJ810081
Caulimoviridae
Yacon necrotic mottle virus (YNMoV)
KM229702
Caulimoviridae
3.4 Análise filogenética
Alinhamentos múltiplos de sequências nucleotídicas provenientes de C. brasilianum e
outros isolados disponíveis no GenBank (Tabela 1) foram preparados e ajustados
manualmente para o conjunto de dados de sequência parcial do DNA-A dos begomovírus e
domínio RT/RNaseH dos badnavírus utilizando-se o algoritmo MUSCLE (EDGAR, 2004),
disponível no MEGA6 (TAMURA et al., 2013). O alinhamento do conjunto de dados de
sequência parcial do DNA-A foi usado para determinar o relacionamento filogenético dos
begomovírus pelo método de Máxima Verossimilhança usando o software MEGA 5.05
(TAMURA et al., 2013). O melhor modelo de substituição de nucleotídeos para cada grupo
foi determinado com a ferramenta Find Best DNA/Protein Models (ML) e a confiabilidade de
cada ramo determinada por bootstrap de 1000 replicações.
Para o conjunto de dados RT/RNAseH dos badnavirus, o relacionamento filogenético
foi realizado por inferência Bayesiana no web portal CIPRES (MILLER et al., 2010) usando
MrBayes v. 3.2.3 (RONQUIST et al., 2012). O melhor modelo de substituição (GTR + I) de
nucleotídeos foi determinado para cada conjunto de dados usando MrModeltest 2.3
(POSADA; BUCKLEY, 2004) de acordo com o Akaike Information Criterion (AIC).
Análises foram rodadas por 10 milhões de gerações usando quatro cadeias e amostrando a
cada 1.000 gerações, para um total de 10.000 árvores. As primeiras 2.500 árvores foram
descartadas como uma fase de burn-in. Probabilidades posteriores (RANNALA; YANG,
1996) foram determinadas a partir de uma árvore consenso majority-rule gerada com as 7.500
árvores remanescentes.
3.5 Análises de recombinação
Os conjuntos de dados da sequência parcial do DNA-A dos begomovírus e domínio
RT/RNaseH dos badnavírus obtidos de C. brasilianum foram também submetidos à análise de
42
detecção de evolução em rede, utilizando o método Neighbor-Net implementado no programa
SplitsTree v. 4.10 (HUSON; BRYANT, 2006).
A determinação dos locais (breakpoints) de recombinação e identificação de prováveis
sequências parentais foram realizadas utilizando os métodos RDP, Geneconv, Boot-scan,
Maximum Chi Square, Chimaera, SisterScan e 3Seq implementados no pacote RDP v. 4.0
(MARTIN et al., 2015). Nesta análise, o alinhamento do conjunto de ambos conjuntos de
dados foi analisado com definições padrão para os diferentes métodos e a significância
estatística foi inferida por um P-valor menor que o Bonferroni corrigido de 0,05. Somente
eventos de recombinação detectados no mínimo por quatro diferentes métodos foram
considerados confiáveis.
43
4
RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Análises de sequências e demarcação de espécie
A amplificação por PCR utilizando o par de oligonucleotídeos BadnaFP/BadnaRP
direcionou a amplificação de um fragmento contendo aproximadamente 580 pares de base
(pb) que corresponde ao domínio RT/RNaseH do genoma dos badnavírus. Enquanto o par de
oligonucleotídeos PAL1v1978/PAR1C496 direcionou a amplificação de um fragmento de
aproximadamente 1200pb que compreende a região comum e as extremidades amino terminal
dos genes Rep e Cp do genoma dos begomovírus (Figura 5). Esses resultados revelam a
ocorrência natural de infecção mista por Badnavirus e Begomovirus em C. brasilianum.
Figura 5. Produto da PCR visualizado em gel de agarose a 0,8%. Onde M: marcador molecular KASVI; 1:
fragmento de aproximadamente 1,2kb referente a região comum e as extremidades amino terminal dos genes
Rep e Cp do genoma dos begomovírus; 2: fragmento de aproximadamente 580 pb referente ao domínio
RT/RNaseH do genoma dos badnavírus; 3: Controle negativo.
1500 pb
1000 pb
500 pb
1200pb
579pb
44
As análises BLASTn e comparações de sequências pareadas utilizando SDT
confirmaram a infeção mista por Badnavirus e Begomovirus em C. brasilianum (Figuras 6 e
7). O isolado BR_Mac1_17 compartilhou maior identidade nucleotídica (67,3%) com o
badnavírus Grapevine roditis leaf discoloration-associated virus (GRLDaV), obtido em
amostras foliares de uva, na Grécia. (MALIOGKA, et al., 2015). De acordo com o critério de
> 80% de identidade de sequência nucleotídica no domínio RT/RNAse H estabelecido pelo
ICTV (GEERING; HULL, 2012), o isolado BR_Mac1_17 corresponde a uma provável nova
espécie do gênero Badnavirus, para qual foi proposto o nome Centrosema bacilliform virus
(CenBV). Este também constitui o primeiro relato de ocorrência de infecção natural por
badnavírus em planta daninha e na família Fabaceae no Brasil.
Figura 6. Matriz bidimensional representando porcentagem de identidade de comparações pareadas de
sequências nucleotídicas do domínio RT/RNAse H do isolado BR_Mac1_17 com amostras de badnavirus
disponíveis no GenBank.
45
Figura 7.Matriz bidimensional representando porcentagem de identidade de comparações pareadas de sequências
nucleotídicas do DNA-A do isolado BR_Mac2_17 com amostras de begomovírus disponíveis no GenBank.
Relatos de detecção de badnavírus em plantas daninhas são escassos, até o momento
poucas espécies foram descritas e caracterizadas, por exemplo, Commelina yellow mottle
virus isolado de Commelina difusa, que é a espécie tipo do gênero Badnavirus (GEERING;
HULL, 2012) e Red clover bacilliform virus (RCBV) obtida de Trifolium pratense na
República Tcheca (FRÁNOVÁ et al., 2012). Dois badnavírus sem espécie definida foram
obtidos das plantas daninhas da família Asteraceae, Ambrosia psilostachya (MELCHER et al.,
2008) e Sclerocarpus africanus presente em plantações de inhame na Nigéria (ASALA et al,
2014). Quanto a ocorrência de badnavírus em plantas da família Fabaceae, apenas as espécies
RCBV (FRÁNOVÁ et al., 2012) e Wisteria badnavirus 1 (WBV1) isolado da planta
ornamental Wisteria sinensis na China (LI et al., 2017), têm sido descritas.
O isolado BR_Mac2_17 apresentou maior identidade variando de 91,8% [KJ939707] a
92% [KJ939753] com dois isolados do begomovírus Bean golden mosaic virus obtidos de
feijão-fava (Phaseolus lunatus) provenientes dos municípios de Arapiraca e Palmeira dos
Índios, Alagoas (RAMOS-SOBRINHO et al., 2014). O ICTV determina que begomovírus
que compartilham > 91% de identidade de sequência de nucleotídeos do genoma completo
pertencem a mesma espécie (BROWN et al., 2015). O fragmento de 1,2 kb amplificado pelo
par de oligonucleotídeos PAL1v1978/PAR1C496, corresponde a aproximadamente metade da
46
sequência do genoma viral do DNA-A (2,6 kb), sugerindo que BR_Mac2_17 seja um
begomovírus da espécie BGMV. Até o presente momento, a espécie Centrosema yellow spot
virus (CenYSV), era o único begomovírus descrito em C. brasilianum (SILVA et al., 2012).
A obtenção da sequência do genoma completo é essencial para revelar o real estado
taxonômico isolado BR_Mac2_17, no entanto este processo se encontra em andamento.
No Brasil, BGMV tem sido um importante patógeno infectando feijoeiro (Phaseolus
spp.) desde 1970 (COSTA, 1976; FARIA; MAXWELL, 1999), causando perdas entre 40 e
100% (MORALES, 2006). As leguminosas (Fabaceae) feijão comum (P. vulgaris), feijão
fava (P. lunatus) e planta daninha Macroptilium lathyroides são hospedeiras naturais de
BGMV na região nordeste, incluindo o Estado de Alagoas (SILVA et al., 2012; RAMOSSOBRINHO et al., 2014). Até o momento, não existe relato da ocorrência de infecção natural
de C. brasilianum por BGMV no Brasil e no mundo. No entanto, em um estudo realizado em
Cuba, 44 acessos de Centrosema spp. foram testados para resistência a infecção por BGMV e
26 deles foram suscetíveis, na sua maioria da espécie C. pubensces (SCHULTZE-KRAFT,
1990). Portanto, este consiste no primeiro relato da infecção natural de C. brasilianum por
BGMV em todo o mundo e amplia a gama de hospeiras desse virus.
Os sintomas apresentados na planta de C. brasilianum co-infectada pelas espécies
CenBV e BGMV foram de mosaico e enrolamento foliar (Figura 8). Mosaico amarelo é o
sintoma comumente causado por BGMV em plantas infectadas de feijão (Phaseolus spp.) e
daninhas da família fabaceae (FARIA; MAXWELL, 2000; SILVA et al., 2012; RAMOSSOBRINHO et al., 2014). Enquanto os sintomas mais frequentes causados por badnavírus são
clorose interveinal, mosqueado e estrias cloróticas (GEERING; HULL 2012). Portanto, os
sintomas de mosaico e enrolamento foliar causado por co-infecção de CenBV e BGMV em C.
brasilianum indica a possível ocorrência de sinergismo entre as duas espécies virais. A
expressão dos sintomas devido a uma infecção viral depende de vários fatores, como o nível
de resistência do hospedeiro, o estágio de crescimento da planta, espécie de vírus ou cepas e
condições ambientais. (PICÓ; DÍEZ; NUEZ, 1996).
47
Figura 8. Planta de C. brasilianum exibindo sintomas de mosaico e enrolamento foliar (seta vermelha) causados
pela de infecção mista com os vírus CenBV e BGMV.
Na natureza, infeções mistas de plantas por vírus são comuns e dois ou mais virus
podem causar sinergismo onde formas mais severas de sintomas são expressas pela planta.
Em situações de sinergismo, a concentração do vírus, o movimento do vírus ou ambas podem
ser aumentados (ZHANG et al., 2001). No entanto, para confirmar o efeito sinérgico da
infeção mista na expressão de sintomas em C. brasilianum torna-se necessário realizar um
experimento de transmissão experimental para diferenciar os sintomas que cada vírus causa
quando em infecção simples na hospedeira e em plantas indicadoras.
Infecções mistas também são importantes para evolução de vírus porque fornece a précondição para recombinação, mecanismo que pode contribuir para o surgimento de isolados
virais mais severos ou novas espécies de vírus (PADIDAM et al., 1999; SANZ et al., 2000;
RIBEIRO et al., 2003, MARTIN et al., 2011; SYLLER, 2012). Recombinação tem sido
demonstrado como o principal fator que contribui para a variabilidade de vírus de DNA
(MARTIN et al., 2011).
4.2 Análises Filogenéticas
Na filogenia inferida por análise de Inferência Bayesiana o conjunto de dados
RT/RNaseH revelou que o isolado BR_Mac1_17 (CenBV) ocupou um ramo independente na
árvore o qual está mais proximamente relacionado com as espécies Dracaena mottle virus
(DrMV) e Pelargonium vein banding virus (PVBV), que infectam Dracaena sanderiana
(Liliaceae), Pelargonium peltatum (Geraniaceae) bem como alguns membros das famílias
Amaranthaceae e Solanaceae (BRUNT et al, 1997). Este resultado não corrobora com o
observado nas análises parwise a qual indicou que a espécie Grapevine roditis leaf
discoloration-associated virus (GRLDaV) é mais próxima da espécie tentativa CenBV. O fato
de CenBV, apresentar baixa identidade de sequência e não apresentar relacionamento
48
filogenético com badnavirus endógenos, indica que esse vírus está ocorrendo de forma
epissomal na amostra de C. brasilianum da qual foi obtido. Estas incongruências encontradas
nas análises pairwise e filogenéticas podem refletir na ocorrência de possíveis eventos de
recombinação entre as espécies.
Figura 9. Análise filogenética de inferência Bayesiana baseada na sequência da região RT/RNaseH da ORF III
do genoma dos badnavírus mais similares obtidos no GenBank.BR_Mac1_17 foi isolado neste estudo.
Na árvore ML para o conjunto de dados de sequência parcial do DNA-A, o isolado
BR_Mac2_17 (BGMV) agrupou juntamente com os dois isolados de BGMV obtidos de P.
lunatus em Alagoas (Figura 10).
Esses resultados reforçam a hipótese que o isolado
BR_Mac2_17 pertence a espécie BGMV.
49
Figura 10. Análise filogenética de Máxima Verossimilhança baseada na sequência parcial do DNA-A do genoma
dos begomoírus mais similares obtidos no GenBank BGMV, MaYVV, MaCmMV, CPGMV e CenYSV.
BR_Mac2_17 foi isolado neste estudo.
Análises de evolução em rede foram utilizadas para melhor investigar possíveis
eventos de recombinação ocorrendo no isolado de CenBV obtido nesse estudo. A análise
revelou que CenBV (BR_Mac1_17), forma uma rede interligada com YNMoV e TuMClV
(Figura 11), indicando possíveis eventos de recombinação antigos ocorreram entre eles e que
posteriormente esta espécie teria seguido sua evolução por ocorrência de mutações. A
proximidade entre YNMoV e CenBV foi observada pelas análises filogenéticas. No entanto,
não foi possível determinar os breakpoints de recombinação e identificação das possíveis
espécies parentais envolvidas provavelmente devido ao pequeno tamanho da sequência
analisada (~580nt).
50
Figura 11. Análise reticulada do isolado BR_Mac1_17 para eventos de recombinação.
Contudo, sequências nucleotídicas da região parcial dos domínios RT/RNaseH
(579pb), presentes na ORF III, vem sendo amplamente utilizadas para identificação de
espécies pertencentes ao gênero Badnavirus (GUIMARÃES et al., 2015; SILVA et al., 2015;
MULLER et al., 2011). Oligonucleotídeos universais descritos por Yang et al. (2003) são
bastante eficientes na amplificação dessa região genômica nos badnavírus. Um estudo prévio
para determinar o posicionamento taxonômico e efeito da recombinação e entre isolados do
gênero Badnavirus, demonstrou que a sequência parcial da região RT/RNaseH (579pb) é
suficiente para demarcação da maioria das espécies de badnavírus atualmente descritas, sendo
ineficiente apenas na diferenciação das espécies de SCBV e BSV obtidas de banana e canade-açúcar que compartilham mais de 80% de identidade nucleotídica para esta região
(JORDÃO, 2015).
Poucos são os estudos sobre evolução de espécies da família Caulimoviridae, no
entanto, tem sido demonstrado frequente ocorrência de recombinação intraespecífica entre
espécies de Cauliflower mosaic virus (CaMV) (FROISSART et al., 2005); e recombinação
51
intra/interespecíficas entre os badnavírus Banana streak virus (BSV) e Sugarcane bacilliform
mosaic virus (SCBMV) (SHARMA et al., 2015).
Evidência de evolução em rede também foi observada entre BR_Mac2_17 (BGMV) e
outros isolados de BGMV, sugerindo um evento de recombinação intraespecífica (Figura 12).
Na análise RDP o isolado BR_Mac2_17 não foi identificado como um recombinante. No
entanto, breakpoints de recombinação ocorrendo na região que codifica para os genes Rep de
outros dois isolados de BGMV, indicou o isolado BR_Mac2_17 como doador parental
(Tabela 2). Confirmando o evento detectado pela análise de evolução em rede.
Figura 12. Análise reticulada do isolado BR_Mac2_17 para eventos de recombinação. Onde observa-se eventos
de recombinação intraespecífica com BGMV,
Tabela 2. Eventos de recombinação detectados entre diferentes isolados de espécies de begomovirus.
Pontos de recombinação
Eventos
Início
Fim
1
690
749
2
672
780
Recombinante
Sequências Parentais
Métodos*
Valor P
Secundária
Principal
KJ939753_BGMV
Desconhecido
BR_Mac2_17
RGBMCSP
6,05SE-04
KJ939707_BGMV
Desconhecido
BR_Mac2_17
RGBMSPL
6,05SE-04
*= R, RDP; G, GENECONV; B, Bootscan; M, Maxchi; C, Chimaera; S, SiScan; L, LARD; P, PhylPro.
52
Estudos tem demonstrado que a espécie BGMV possui baixa variabilidade genética
em hospedeiras da família Fabaceae como P. vulgaris e P. lunatus (fava), (FARIA;
MAXWELL, 1999; RAMOS-SOBRINHO et al., 2014) e que este fato reflete um reduzido
grau de eventos de recombinação ocorrendo no seu genoma (RAMOS-SOBRINHO et al.,
2014). Apesar de poucos eventos de recombinação serem encontrados ao longo do genoma
dessa espécie, hotspots de recombinação são frequentemente encontrados na região que
codifica para os genes Rep e Cp e tem identificado BGMV e outros begomovírus nativos de
plantas daninhas como Macroptilium lathyroides e Sida spp. como doadores parentais
(SILVA et al., 2012; RAMOS-SOBRINHO et al., 2014). Mais uma evidência da importância
de hospedeiras daninhas na sobrevivência e evolução de BGMV.
Dessa forma, os resultados encontrados nesse estudo indicam que C. brasilianum
constitui um reservatório de badnavírus e begomovírus. Estudos adicionais são necessários
para demonstrar se esta daninha desempenha um papel ativo como fonte de inóculo primário
ou como uma fonte de novos virus para plantas cultivadas.
53
5 CONCLUSÕES
Constatou-se a ocorrência de infecção viral mista de vírus pertencentes aos gêneros
Badnavirus e Begomovirus na planta daninha Centrosema brasilianum
O isolado BR_Mac1_17 é uma provável nova espécie do gênero Badnavirus para qual
foi designado o nome tentativo Centrosema bacilliform virus.
Fortes evidências sugerem que o isolado BR_Mac2_17 pertence a espécie Bean
golden mosaic virus
A espécie C. brasilianum pode atuar como reservatórios de espécies badnavírus e
begomovírus
Estudos adicionais são necessários para demonstrar se C. brasilianum desempenha um
papel ativo como fonte de inóculo ou fonte contínua de novos vírus para plantas cultivadas.
54
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