Marcondes Inácio
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE ALAGOAS
CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM
AGRONOMIA – PRODUÇÃO VEGETAL
UFAL
CECA
MARCONDES INÁCIO DA SILVA
EMBRIOGÊNESE SOMÁTICA INDIRETA DE DUAS VARIEDADES RB DE
CANA-DE-AÇÚCAR
RIO LARGO – AL
2012
MARCONDES INÁCIO DA SILVA
EMBRIOGÊNESE SOMÁTICA INDIRETA DE DUAS VARIEDADES RB DE
CANA-DE-AÇÚCAR
Dissertação apresentada à Universidade Federal de
Alagoas, como parte das exigências do Programa de
Pós – Graduação em Agronomia, para obtenção do
título de Mestre em Produção Vegetal.
Orientador: Prof. Dr. Eurico Eduardo Pinto de Lemos
RIO LARGO – AL
2012
EMBRIOGÊNESE SOMÁTICA INDIRETA DE DUAS VARIEDADES RB DE
CANA-DE-AÇÚCAR
MARCONDES INÁCIO DA SILVA
Dissertação defendida e aprovada em 27 de março de 2012 pela banca examinadora:
Orientador:
_______________________________________________
Prof. Ph.D. Eurico Eduardo Pinto de Lemos
Unidade Acadêmica CECA/UFAL
Examinadores:
_______________________________________________
Drª Ana da Silva Lédo
EMBRAPA TABULEIROS COSTEIROS
_______________________________________________
Prof. Dr. Júlio Alves Cardoso Filho
Unidade Acadêmica CECA/UFAL
_______________________________________________
Profª. Drª Leila de Paula Resende
Unidade Acadêmica CECA/UFAL
Ao meu Deus, por sempre ter me dado força, garra e sabedoria para conquistar meus
principais objetivos.
Aos meus queridos pais, José Manoel e Alda,
pelo amor, ensinamentos e orientações cruciais para minha formação como cidadão.
DEDICO
À minha namorada, Ariana, pelo amor, incentivo e compreensão durante o mestrado.
Ao meu irmão, Ubaquinã José, pelo apoio e solidariedade.
A todos os familiares e amigos que me incentivaram e torceram por mais essa
conquista da minha vida.
OFEREÇO
AGRADECIMENTOS
À Universidade Federal de Alagoas, ótima instituição de ensino, que me
proporcionou a oportunidade de ingressar no mestrado em produção vegetal e concluir
mais esse sonho;
Ao meu orientador, Prof. Dr. Eurico Eduardo Pinto de Lemos, pelos
ensinamentos e orientações prestadas neste mestrado, além da amizade estabelecida;
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES),
pela concessão da bolsa de mestrado;
Ao Prof. MSc. Geraldo Veríssimo de Souza Barbosa, pela contribuição e apoio
nas coletas dos materiais vegetais para realização dos experimentos;
Ao Prof. MSc. Iedo Teodoro, por ter cedido material vegetal para condução das
pesquisas.
Ao Prof. Dr. Paulo Vanderlei Ferreira, pelas orientações relativas às análises
estatísticas realizadas neste trabalho.
À Profa. Drª. Leila de Paula Rezende, pelas suas orientações e amizade
concedida;
Ao Prof. Dr. Júlio Alves Cardoso Filho, pela amizade e contribuição;
Aos Professores: Dr. João Correia Araújo Neto e Vilma Marques Ferreira, pela
amizade, incentivo e ensinamentos.
Aos técnicos e funcionários do Programa de Melhoramento Genético da Canade-açúcar pelo apoio na condução das pesquisas e amizade;
Aos servidores do Laboratório de Biotecnologia Vegetal, Gilvânia Moreira da
Silva e Hélio do Carmo Lima, pelo apoio e auxílio nas atividades laboratoriais.
Aos servidores do Programa de Pós-graduação do CECA/UFAL pela gentileza,
prestatividade e amizade durante o curso.
Aos amigos: Edivânia de Lima Salvador, Giórgenns Klerysson Bezerra Silva,
Israel de Almeida Canuto, Lamartine Silva Ferreira Júnior, Luiz Sérgio da Costa
Duarte Filho, Maria Quitéria Cardoso dos Santos, Rychardson Rocha de Araújo,
Rafael José Correia de Lima, Taciana de Lima Salvador, Tatiana de Lima Salvador e
Welber Xavier, pela grande amizade, apoio e momentos de descontração
compartilhados.
A todos os professores, funcionários e colegas do mestrado de Agronomia do
CECA/UFAL.
A todos que contribuíram direta ou indiretamente para concretização deste
objetivo.
MUITO OBRIGADO!
“A mente que se abre a uma nova ideia jamais
voltará ao seu tamanho original”.
Albert Einstein
RESUMO GERAL
A cana-de-açúcar (Saccharum officinarum L.) é cultivada em torno de 80 países do
mundo, a qual é responsável por suprir aproximadamente 70% da demanda mundial por
açúcar e ser uma alternativa na produção de combustível renovável. A embriogênese
somática é uma ferramenta valiosa para os programas de melhoramento genético,
podendo auxiliar nos estudos de fisiologia, genética e bioquímica. Este trabalho
objetivou estabelecer as melhores concentrações de: sacarose; 2,4-D e carvão ativado,
no processo de embriogênese somática para as variedades RB92579 e RB99395 de
cana-de-açúcar. As variáveis analisadas foram: porcentagem de calos embriogênicos,
qualidade dos calos embriogênicos e número de plantas regeneradas a partir dos
embriões somáticos. Ápices caulinares, com 8 a 10 meses de idade, foram coletados,
desinfestados e excisados até a obtenção do meristema apical envolvido por primórdios
foliares. No primeiro experimento, foi avaliado o efeito de quatro concentrações de
sacarose: 10, 20, 30 e 40 g L-1; no segundo experimento, o efeito de quatro
concentrações de 2,4-D: 0, 3, 6 e 9 mg L-1; e no terceiro experimento, o efeito de quatro
concentrações de carvão ativado: 0; 0,75; 1,50 e 2,25 g L-1. A concentração de 30 g L-1
de sacarose no meio de cultura foi indicada como a mais viável para as variedades
estudadas no desenvolvimento de calos embriogênicos na fase escura. Os explantes
cultivados sem 2,4-D ficaram marrons, não formaram calos e morreram após a terceira
semana de cultivo. As concentrações de 3 mg L-1 de 2,4-D, utilizadas nos meios de
cultura MS, foram as mais viáveis para as variedades RB92579 e RB99395 na formação
e qualidade dos calos embriogênicos, assim como, no número de plantas regeneradas. O
carvão ativado estimulou a germinação precoce parcial dos embriões ainda no escuro
induzindo a rizogênese sobre os calos e reduzindo a qualidade dos mesmos. Houve uma
correlação alta e positiva entre a qualidade dos calos embriogênicos e o número de
plantas regeneradas. A resposta da variedade RB99395 ao processo de embriogênese
somática foi superior a da variedade RB92579 nos três experimentos realizados,
indicando que essa variedade tem maior potencial embriogênico.
Palavras-chave: Saccharum officinarum, cultura de tecidos, embriões somáticos.
GENERAL ABSTRACT
The sugar cane (Saccharum officinarum L.) is cultivated in about 80 countries around
the world, which is responsible for supplying approximately 70% of world demand for
sugar and for being an alternative to produce renewable fuel. Somatic embryogenesis is
a valuable tool for breeding programs, which could benefit studies of physiology,
genetics and biochemistry. This work aimed to establish the best concentrations of
sucrose, 2,4-D and activated charcoal in the somatic embryogenesis of two varieties
(RB92579 and RB99395) of sugar cane. The variables evaluated were: percentage of
embryogenic calli, quality of embryogenic calli and number of regenerated plants from
somatic embryos. The soft-end stem of 8 to 10 months-old plants were collected,
disinfested and excised to obtain the apical meristem surrounded by few leaves
primordia. In the first experiment, it was evaluated the effect of four concentrations of
sucrose: 10, 20, 30 and 40 g L-1; in the second experiment, the effect of four
concentrations of 2,4-D: 0, 3, 6 and 9 mg L-1; and in the third experiment, the effect of
four concentrations of activated charcoal: 0; 0,75; 1,50 and 2,25 g L-1. The
concentration of 30 g L-1 sucrose in the culture medium was indicated as the most
feasible for the varieties in the development of embryogenic callus in the dark phase.
The explants cultured in absence of 2,4-D were brown, did not produce callus and died
after three weeks in vitro. The concentration of 3 mg L-1 of 2,4-D added to the culture
medium was designated as the best treatment to formation and quality of embryogenic
calli, as well as the number of regenerated plants in both varieties. The activated
charcoal stimulated an abnormal early germination of the embryos in the dark inducing
root formation on the callus and reducing their quality. There was a high positive
correlation between the quality of callus and the number of regenerated plants. The
response to somatic embryogenesis of the variety RB99395 was significantly better than
in the variety RB92579.
Keywords: Saccharum officinarum, tissue culture, somatic embryos.
LISTA DE FIGURAS
CAPÍTULO 1
Pág.
Figura 1.
Processo de coleta, limpeza e excisão dos explantes para introdução à
técnica da embriogênese somática. A) – Ápices caulinares coletados
de canas com 8 a 10 meses de idade; B) – Palmitos extraídos dos
ápices caulinares e tratados em solução de hipoclorito de sódio a
0,66% (v/v); C) – Excisão do meristema apical envolvido por
primórdios foliares com aproximadamente 10 mm de comprimento
por 2 mm de diâmetro (indicado pela seta) ........................................... 40
Figura 2.
Escala de notas desenvolvida para avaliar a qualidade dos calos
embriogênicos de cana-de-açúcar, após oito semanas de cultivo no
escuro ....................................................................................................
Figura 3.
42
Tipos de calos obtidos durante o processo de embriogênese somática
sob o efeito de diferentes concentrações de sacarose no meio de
cultura: A) – Embriogênico: amarelado, duro e compacto; B) - Não
embriogênico: brilhante e mucilaginoso ...............................................
Figura 4.
45
A) - Pigmentos verdes de clorofila sobre os calos embriogênicos,
indicando a germinação dos embriões somáticos; B) - Plantas,
originadas dos embriões somáticos, em crescimento após três
semanas de cultivo no claro; C) - Calos não embriogênicos com
pigmentos arroxeados de antocianina, indicando que não há embriões
em processo de germinação ..................................................................
Figura 5.
45
Diferença estatística, de acordo com o teste F (p<0,001), entre as
duas variedades de cana-de-açúcar, cultivadas em diferentes
concentrações de sacarose; A) - em relação à porcentagem de calos
embriogênicos; B) – em relação à qualidade dos calos embriogênicos;
C) – em relação ao número de plantas regeneradas ..............................
Figura 6.
47
Análises de regressão mostrando os efeitos das concentrações de
sacarose sobre as variedades RB92579 e RB99395, no processo de
embriogênese somática; A) - em relação à qualidade dos calos
embriogênicos; B) – em relação ao número de plantas regeneradas ....
Figura 7.
Equação de 1º grau mostrando a correlação existente entre a
48
qualidade dos calos embriogênicos e o número de plantas
regeneradas............................................................................................
49
CAPÍTULO 2
Pág.
Figura 1.
Processo de coleta, limpeza e excisão dos explantes para introdução à
técnica da embriogênese somática. A) – Ápices caulinares coletados
de canas com 8 a 10 meses de idade; B) – Palmitos extraídos dos
ápices caulinares e tratados em solução de hipoclorito de sódio a
0,66% (v/v); C) – Excisão do meristema apical envolvido por
primórdios foliares com aproximadamente 10 mm de comprimento
por 2 mm de diâmetro (indicado pela seta) ........................................... 56
Figura 2.
Escala de notas desenvolvida para avaliar a qualidade dos calos
embriogênicos de cana-de-açúcar, após oito semanas de cultivo no
escuro ....................................................................................................
Figura 3.
58
Intumescimento e proliferação de células nas extremidades (distal ED e proximal - EP) de explantes meristemáticos de cana-de-açúcar
após 15 dias de cultivo em meio de cultura indutor de embriogênese
somática com 3 mg L-1 de 2,4-D ........................................................... 61
Figura 4.
Escurecimento e morte dos tecidos de explante de cana-de-açúcar
após 20 dias de cultivo em meio de cultura de indução à
embriogênese somática sem 2,4-D ........................................................ 61
Figura 5.
Calos não embriogênico (CNE) e intermediário (CI) após três
semanas de cultivo em fotoperíodo de 16 horas e meio de cultura de
germinação de embriões somáticos. A) – CNE necrosado; B) - CI
com regeneração de plantas na área embriogênica e pigmentos
antociânicos na área não embriogênica ................................................. 62
Figura 6.
Análise de regressão mostrando os efeitos das concentrações de 2,4D sobre as variedades RB92579 e RB99395, no processo de
embriogênese somática em relação à porcentagem de calos
embriogênicos .......................................................................................
Figura 7.
Análises de regressão mostrando os efeitos das concentrações de 2,4D sobre cada variedade estudada, no processo de embriogênese
63
somática, para a qualidade dos calos embriogênicos e para o número
de plantas regeneradas ..........................................................................
Figura 8.
65
Equação de 1º grau mostrando a correlação existente entre a
qualidade dos calos embriogênicos e o número de plantas
regeneradas............................................................................................
65
CAPÍTULO 3
Pág.
Figura 1.
Processo de coleta, limpeza e excisão dos explantes para introdução à
técnica da embriogênese somática. A) – Ápices caulinares coletados
de canas com 8 a 10 meses de idade; B) – Palmitos extraídos dos
ápices caulinares e tratados em solução de hipoclorito de sódio a
0,66% (v/v); C) – Excisão do meristema apical envolvido por
primórdios foliares com aproximadamente 10 mm de comprimento
por 2 mm de diâmetro (indicado pela seta) ........................................... 72
Figura 2.
Escala de notas desenvolvida para avaliar a qualidade dos calos
embriogênicos de cana-de-açúcar, após oito semanas de cultivo no
escuro ....................................................................................................
Figura 3.
74
Calo embriogênico da variedade RB99395, pouco desenvolvido (nota
1), originado do tratamento com 1,50 g L-1 de carvão ativado. A
presença de raízes adventícias sobre a sua superfície (marcadas pelas
setas) indica a germinação precoce de alguns embriões somáticos
ainda na fase escura ............................................................................... 77
Figura 4.
Emissão de plantas em calo embriogênico da variedade RB92579
originado do tratamento de maturação de embriões somáticos com
1,50 g L-1 de carvão ativado .................................................................. 78
Figura 5.
Diferença estatística, de acordo com o teste F, entre as duas
variedades de cana-de-açúcar, cultivadas em diferentes concentrações
de carvão ativado; A) – em relação à porcentagem de calos
embriogênicos (p<0,005); B) – em relação à qualidade dos calos
embriogênicos (p<0,030); C) – em relação ao número de plantas
regeneradas (não significativo) .............................................................
Figura 6.
Análises de regressão mostrando os efeitos das concentrações de
80
carvão ativado sobre as variedades RB92579 e RB99395, no processo
de maturação dos embriões somáticos; A) – em relação à
porcentagem de calos embriogênicos; B) – em relação à qualidade
dos calos embriogênicos; C) – em relação ao número de plantas
regeneradas ............................................................................................ 81
Figura 7.
Equação de 1º grau mostrando a correlação existente entre a
qualidade dos calos embriogênicos e o número de plantas
regeneradas............................................................................................. 82
LISTA DE TABELAS
CAPÍTULO 1
Pág.
Tabela 1.
Resumo da análise de variância para a porcentagem de calos
embriogênicos, qualidade dos calos embriogênicos e número de
plantas regeneradas ................................................................................
46
CAPÍTULO 2
Pág.
Tabela 1.
Resumo da análise de variância para a porcentagem de calos
embriogênicos, qualidade dos calos embriogênicos e número de
plantas regeneradas ...............................................................................
Tabela 2.
63
Desdobramento da análise de variância para a qualidade dos calos
embriogênicos e o número de plantas regeneradas ............................... 64
CAPÍTULO 3
Pág.
Tabela 1.
Resumo da análise de variância para a porcentagem de calos
embriogênicos, qualidade dos calos embriogênicos e número de
plantas regeneradas ................................................................................
79
SUMÁRIO
Pág.
INTRODUÇÃO GERAL.......................................................................................
17
2. REVISÃO DE LITERATURA.......................................................................... 19
2.1. A Cana-de-açúcar e o melhoramento genético ............................................
19
2.2. Cultura de tecidos ...........................................................................................
20
2.3. Embriogênese somática ..................................................................................
22
2.4. Fatores que afetam a embriogênese somática ..............................................
24
2.4.1. Ácido 2,4 diclorofenoxiacético (2,4-D) .......................................................
25
2.4.2. Carvão ativado .............................................................................................
25
2.4.3. Sacarose ........................................................................................................
27
3. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.............................................................
28
CAPÍTULO 1: Efeito da sacarose na embriogênese somática indireta de
duas variedades RB de cana-de-açúcar ...............................................................
37
RESUMO................................................................................................................. 37
ABSTRACT............................................................................................................. 38
INTRODUÇÃO....................................................................................................... 39
MATERIAIS E MÉTODOS..................................................................................
40
RESULTADOS E DISCUSSÃO............................................................................ 44
CONCLUSÕES....................................................................................................... 50
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.................................................................
51
CAPÍTULO 2: Efeito do 2,4-D na embriogênese somática indireta de duas
variedades RB de cana-de-açúcar ........................................................................
53
RESUMO................................................................................................................. 53
ABSTRACT............................................................................................................. 54
INTRODUÇÃO....................................................................................................... 55
MATERIAIS E MÉTODOS..................................................................................
56
RESULTADOS E DISCUSSÃO............................................................................ 60
CONCLUSÕES....................................................................................................... 66
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.................................................................
67
CAPÍTULO 3: Efeito do carvão ativado na embriogênese somática indireta
de duas variedades RB de cana-de-açúcar ..........................................................
69
RESUMO................................................................................................................. 69
ABSTRACT............................................................................................................. 70
INTRODUÇÃO....................................................................................................... 71
MATERIAIS E MÉTODOS..................................................................................
72
RESULTADOS E DISCUSSÃO............................................................................ 76
CONCLUSÕES....................................................................................................... 83
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.................................................................
84
17
INTRODUÇÃO GERAL
A transformação genética, a fusão de protoplastos, entre outras, são tecnologias
importantes que os programas de melhoramento genético podem adotar para a obtenção
de variedades agronomicamente superiores. Contudo, para que essas tecnologias
possam ser aplicadas, é necessário que haja um sistema de produção de mudas bastante
eficiente, sendo uma excelente alternativa as técnicas da cultura de tecidos (DESAI et
al., 2004).
Uma das estratégias para o cultivo in vitro é a embriogênese somática, processo
pelo qual células diplóides ou somáticas desenvolvem estruturas semelhantes a
embriões zigóticos, por meio de sequência ordenada de estádios embriogênicos
característicos, sem ocorrência de fusão dos gametas (LITZ e GRAY, 1995; JIMÉNEZ,
2001).
As auxinas são apontadas como as principais substâncias responsáveis pelo
desencadeamento dos processos embriogênicos. Geralmente, esses fitohormônios
induzem a formação de calos nos explantes e, em seguida, os calos são induzidos à
embriogênese retirando-se ou reduzindo-se a concentração de auxina do meio de cultivo
(SANI e MUSTAPHA, 2010); ou utilizando-se promotores de maturação de embriões
como o carvão ativado, o ácido abscísico, o polietilenoglicol entre outros.
O carvão ativado é bastante utilizado como agente potencializador das respostas
de maturação da embriogênese somática. Por adsorver substâncias inibitórias do meio
de cultivo ou produtos tóxicos liberados pelos explantes, propicia o desenvolvimento de
embriões, podendo ser utilizado em diferentes culturas entre as concentrações de 0,2% a
3% (PASQUAL et al., 2001).
Além dos reguladores de crescimento, dos sais, das vitaminas e maturadores, os
açúcares também são importantes na composição dos meios de cultura. A sacarose no
meio de cultivo in vitro influencia vários processos metabólicos nas culturas e apresenta
efeito sobre o crescimento e diferenciação dos tecidos (SKREBSKY et al., 2004).
A cana-de-açúcar (Saccharum officinarum L.) é estudada em inúmeros
programas de melhoramento genético. Em Alagoas, o Programa de Melhoramento
Genético da Cana-de-açúcar (PMGCA) da Universidade Federal de Alagoas desenvolve
variedades, mais produtivas e resistentes aos fatores bióticos e abióticos, que são
liberadas para o setor sucroalcooleiro.
18
Através dos protocolos de regeneração de plantas in vitro a partir da
embriogênese somática, o uso da biotecnologia pode ser mais uma alternativa eficiente
para o PMGCA à obtenção de novas variedades além dos processos convencionais de
melhoramento genético.
Este trabalho objetivou estabelecer as melhores concentrações dos componentes:
sacarose; auxina sintética 2,4-D; e carvão ativado, adicionados ao meio de cultivo
indutor de embriogênese somática para as variedades de cana-de-açúcar RB92579 e
RB99395.
19
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 A Cana-de-açúcar e o melhoramento genético
A cana-de-açúcar, espécie semiperene, alógama, pertencente a classe das
monocotiledôneas, família Poaceae e ao gênero Saccharum (ROSSATO JÚNIOR,
2009), é originária do Sudeste Asiático, entretanto, é cultivada numa ampla faixa de
latitudes e altitudes que variam desde o nível do mar até mil metros acima desse nível
(MAGALHÃES, 1987).
Em torno de 80 países das regiões tropical, semitropical e subtropical do mundo
cultivam a cana-de-açúcar, principalmente pela sua capacidade de armazenar, no colmo,
altas concentrações de sacarose, a qual é responsável por suprir aproximadamente 70%
da demanda mundial por açúcar e ser uma alternativa na produção de combustível
renovável, o etanol (TEW e COBILL, 2008).
A cana-de-açúcar, misturada com a uréia, também pode ser utilizada como uma
forragem destinada à alimentação animal. Além de apresentar uma excelente
palatabilidade, que aumenta a aceitação pelo animal, essa espécie é muito rica em
energia, a qual varia de acordo com o teor de sacarose presente no colmo (LIMA
JÚNIOR et al., 2010).
Introduzida no Brasil no período colonial, transformou-se em uma das principais
culturas de importância sócio-econômica para o país, sendo ele, não apenas o maior
produtor mundial dessa commodity, como também, o primeiro do mundo na produção
de açúcar e etanol (MAPA, 2012).
O Brasil, atualmente, possui uma área plantada, de cana-de-açúcar, em torno de
8,3 milhões de hectares, distribuídos em vários Estados, sendo que as principais regiões
de cultivo são Sudeste, Centro-Oeste, Nordeste e Sul (CONAB, 2011), permitindo duas
safras ao ano por conta das condições climáticas. Portanto, durante o ano todo o Brasil
produz açúcar e etanol para os mercados interno e externo (UNICA, 2012).
Em vista da grande importância mundial dessa monocotiledônea, ela está
inserida em inúmeros programas de melhoramento genético em todo o mundo,
sobretudo com o intuito principal de aumentar a produtividade, pois se além dos tratos
culturais não for dada uma alta qualidade genética, o aumento da produção não pode ser
alcançado (CESNIK e MIOCQUE, 2005).
20
A cana tradicionalmente cultivada, Saccharum officinarum, foi melhorada
através de uma série de cruzamentos entre algumas espécies selvagens do gênero
Saccharum, como consequência, as variedades de cana-de-açúcar, atuais, são altamente
poliploides e aneuploides, com um número de cromossomos que varia de 100 a 130
(VETTORE et al., 2003).
As variedades “modernas”, ou seja, os híbridos interespecíficos (Saccharum
spp), resultantes do melhoramento genético, mais resistentes aos agentes bióticos e
melhor adaptadas às diversas condições ambientais, são utilizadas há décadas pelos
produtores e são responsáveis pela expansão da cultura pelo mundo (MATSUOKA et
al., 1999).
Através de melhoramento genético contínuo, a cana de açúcar se tornou uma das
culturas mais eficientes do mundo na captação e conversão da energia solar em energia
química (TEW e COBILL, 2008). Os programas de melhoramento genético têm
relatado ganhos de produção de açúcar na ordem de 1 a 2% ao ano e têm atribuído a
maior parte deste aumento à genética (EDMÉ et al., 2005).
As principais pesquisas de biotecnologia realizadas na cana-de-açúcar possuem
foco na engenharia genética para obtenção de canas transgênicas; identificação de
marcadores moleculares, associados às características agronômicas; e propagação clonal
em biofábricas (LAKSHMANAN et al., 2005).
O emprego da biotecnologia no melhoramento genético da cana-de-açúcar
depende de protocolos de regeneração in vitro a partir da cultura de tecidos, incluindo a
embriogênese somática (CIDADE et al., 2006). A integração das técnicas de
transformação genética e cultura de tecidos tem sido fundamental nos ganhos genéticos,
a partir de genótipos superiores (LAKSHMANAN et al., 2005).
Embora a aplicação da biotecnologia para a melhoria genética das características
da cana-de-açúcar ter um impacto significativo sobre os rendimentos agrícolas e
produção industrial, o desenvolvimento de metodologias de engenharia genética com
base na cultura de tecidos para obter variedades melhoradas não é ainda um processo de
rotina nos programas de melhoramento (TIEL et al., 2006).
2.2 Cultura de Tecidos
A cultura de tecidos vegetais pode ser entendida como um conjunto de técnicas
que permite o cultivo de células, tecidos ou órgãos isolados da planta mãe em condições
21
de elevada assepsia e com rigoroso controle nutricional, de luminosidade e temperatura,
em meio de cultura in vitro (GEORGE et al., 2008).
Um dos primeiros fundamentos que possibilitou a existência da cultura de
tecidos foi a teoria da totipotência celular formulada, no século 19, por Matthias
Schleiden e Theodor Schwann (CID, 2001). A teoria propõe que qualquer célula vegetal
tem potencial genético para formar uma nova planta com carga genética igual à planta
matriz, ou seja, um clone. Essa capacidade se manifesta quando a célula está sob
condições especiais de estímulo (CID, 2001).
A cultura de tecidos pode dá suporte técnico a diversas áreas como a bioquímica,
para estudo e elucidação de rotas metabólicas; a fisiologia vegetal, para estudos de
crescimento e desenvolvimento das plantas; a fitopatologia, para estudos de toxinas, por
exemplo; a citogenética, para estudos de cromossomos ou aberrações cromossômicas;
entre outras áreas (CID, 2001).
O sucesso da aplicação desta técnica depende de uma série de fatores, que
necessitam ser controlados adequadamente durante o processo, como meio de cultura,
estado fisiológico da planta mãe de onde é retirado o explante e, sobretudo, da
capacidade morfogênica do genótipo (DELPORT et al., 2001; SAHARAM et al., 2004;
COSTA et al., 2007).
O crescimento e a morfogênese de células e tecidos in vitro são regulados pela
interação e pelo balanço entre as substâncias adicionadas ao meio de cultura e por
aquelas produzidas de forma endógena pelas células dos explantes (CHAPLA et al.,
2009).
Os primeiros estudos de cultura de tecidos em cana-de-açúcar foram realizados
na década de 60 com a regeneração de plântulas a partir de calos (LIU, 1983). Anos
mais tarde, Ho e Vasil (1983) conseguiram obter embriões somáticos a partir de
segmentos de folhas jovens de cana.
Dentro de um programa de melhoramento vegetal, a cultura de tecidos pode ser
empregada de diversas maneiras. No melhoramento de espécies que apresentam
problemas de dormência de sementes, pode-se utilizar a técnica de germinação in vitro;
quando o desenvolvimento do fruto é um processo prolongado, pode-se utilizar a cultura
de embriões imaturos, na germinação, para acelerá-la entre outras aplicações
(ANDRADE, 2002).
A cultura de tecidos, embora não atue diretamente na obtenção de cultivares, dá
suporte às fases desse processo. Por exemplo, o desenvolvimento de protocolos
22
eficientes de propagação de plantas, através das técnicas de cultivo in vitro, é necessário
para a transformação genética (LITZ e GRAY, 1995; DESAI et al., 2004). As principais
características agronômicas manipuladas na transformação genética de cana-de-açúcar
são a resistência ao ataque de insetos, fungos e viroses; a tolerância aos herbicidas; o
aprimoramento da qualidade das fibras entre outras (GALLO-MEAGHER et al., 2000).
Entre as principais vantagens da propagação in vitro estão a rapidez em relação a
outros métodos de propagação vegetativa, a produção de mudas livres de vírus e outros
patógenos, além da possibilidade de sua utilização quando a propagação por técnicas
convencionais for muito difícil de ser realizada (HO e VASIL, 1983; LITZ e GRAY,
1995).
Um dos caminhos da produção de plantas in vitro é a embriogênese somática, a
qual diz respeito a formação de embriões a partir de tecidos somáticos (RAEMAKERS
et al., 1995) ou, segundo Litz e Gray (1995), a partir de células únicas, evitando a
ocorrência de quimeras.
2.3 Embriogênese somática
Embriogênese somática, adventícia ou assexual são termos usualmente
empregados para designar o processo pelo qual células ou tecidos somáticos se
desenvolvem através de diferentes estágios embriogênicos dando origem a um embrião,
que, por sua vez, irá originar uma planta, sem que ocorra a fusão de gametas
(WILLIAMS e MAHESWARAN, 1986).
Durante esse processo, os embriões somáticos passam por estágios similares
àqueles observados na embriogênese zigótica, caracterizando-se, também, como uma
estrutura bipolar (HO e VASIL, 1983; RAEMAKERS et al., 1995), onde em uma
extremidade serão diferenciadas as células do sistema radicular e, na extremidade
oposta, serão diferenciadas as células que originarão as folhas e os ramos (NABORS et
al., 1983; TERMIGNONI, 2005).
As embriogêneses somática e zigótica apresentam elevado nível de semelhança
tanto na morfologia do embrião, como no padrão de expressão de genes e proteínas,
qualificando a embriogênese somática como um modelo efetivo para estudos em
diferentes
estádios de
LINACERO et al., 2001).
desenvolvimento do embrião
(ZIMMERMAN, 1993;
23
A embriogênese somática é uma técnica de grande aplicabilidade para os estudos
básicos relacionados, desde, à fisiologia, genética e bioquímica do desenvolvimento
embrionário, até a propagação clonal em massa, visando a conservação e o
melhoramento genético das espécies (YEUNG, 1995; STEINER et al., 2008).
A embriogênese somática pode ser direta ou indireta. Na forma direta, os
embriões somáticos são formados a partir de células que já estão determinadas e
competentes para o desenvolvimento embriogênico, antes da condição de explante, sem
a ocorrência da fase de calo. Na forma indireta, primeiro há uma fase de redeterminação
das células diferenciadas do explante, seguida da ativação da divisão e proliferação
celular, que levam à formação do calo e, na segunda fase, ocorre o desenvolvimento dos
embriões a partir de determinadas células do calo (WILLIAMS e MAHESWARAN,
1986; SWEBY et al., 1994; GAJ, 2004).
Diferentes tipos de calos podem ser induzidos durante a embriogênese somática
indireta, a saber: os calos embriogênicos que são de coloração amarelada, compactos e
com aspecto duro; e os calos não embriogênicos que podem ser semitranslúcidos ou
brilhantes, friáveis ou mucilaginosos (LAKSHMANAN, 2006).
Além da diferença morfológica, esses calos diferem entre si pelo potencial de
regeneração de plantas (NABORS et al., 1983). O calo denominado embriogênico
apresenta a formação de pequenos embriões somáticos capazes de regenerarem plantas
completas, com raiz e parte aérea, visto que os mesmos são bipolares. Enquanto que o
calo não embriogênico é aquoso e sem consistência e não apresenta a capacidade de
regenerar plantas (NABORS et al., 1983; RASHID e QURAISHI, 1989).
O tipo de calo e o seu potencial regenerativo, é influenciado por vários fatores
incluindo: tipo de explante, genótipo, composição do meio e a seleção do tecido para
subcultivo (RINES et al., 1992).
As fases da embriogênese somática indireta estão fortemente associadas aos
reguladores de crescimento vegetal (WILLIAMS & MAHESWARAN, 1986),
principalmente as auxinas e as citocininas, que estão envolvidas na regulação do
crescimento e diferenciação celular (FEHÉR et al., 2003).
Entre as duas formas de realização da embriogênese somática, a via direta é
menos utilizada nas espécies, enquanto que, a via indireta é descrita para a maioria das
espécies de importância econômica, a exemplo da cana-de-açúcar (RAEMAKERS et
al., 1995). Segundo Gaj (2004), entre 124 protocolos de indução de embriogênese
somática em diferentes espécies, apenas 30% é da forma direta.
24
A embriogênese somática é uma ferramenta valiosa para o melhoramento de
espécies vegetais de importância comercial (GONZÁLEZ et al., 2012). Esta técnica
vem sendo utilizada para a obtenção de plantas transgênicas (PRAKASH e
VARADARAJAN, 1992; GAMA, 1993) e sementes sintéticas (SCHULTHEIS et al.,
1990).
A embriogênese somática tem a capacidade de ser induzida a partir de
protoplastos, suspensões celulares e culturas de calos, isso formou a base para uma
efetiva exploração da engenharia genética para o melhoramento de cana-de-açúcar
(LAKSHMANAN et al., 2005).
2.4 Fatores que afetam a embriogênese somática
A técnica da embriogênese somática envolve o estabelecimento de um explante
na cultura, a proliferação de calos subsequentes (no caso da forma indireta), e a
iniciação de embriões somáticos (VON ARNOLD et al., 2002). Mas para que isso
aconteça muitas variáveis devem ser ajustadas nesse processo.
Para que ocorra a embriogênese somática é necessário que a célula ou o tecido
vegetal sofra uma indução, pois as células somáticas não são naturalmente
embriogênicas (NAMASIVAYAM, 2007). É das células competentes, ou seja, aquelas
que se mostram sensíveis aos fatores de indução e capazes de desenvolver a
embriogênese somática, que se formam os embriões (GAJ, 2004).
A técnica mais usual para indução da competência embriogênica consiste na
exposição dos explantes a concentrações adequadas de auxinas durante períodos de
tempo variáveis (HO e VASIL, 1983).
Entre as metodologias aplicadas na indução da embriogênese somática, há
variações na composição dos meios de cultura, no tipo ou na concentração dos
reguladores de crescimento, bem como no controle do ambiente da sala de cultivo e na
densidade das células (PREECE, 1995).
O genótipo dos explantes também é uma variável extremamente relevante, no
processo de formação de embriões somáticos, pois cada genótipo estudado pode
apresentar requerimentos distintos de cultivo para a indução de estruturas embriogênicas
(PREECE, 1995).
Além do material genético, é importante definir a fonte de explante a ser
utilizada e a época da coleta, uma vez que vários tecidos da mesma planta ou tecidos em
25
diferentes estágios de desenvolvimento podem resultar em diferentes respostas à
indução da embriogênese (HO e VASIL, 1983; LITZ e GRAY, 1995).
2.4.1 Ácido 2,4 diclorofenoxiacético (2,4-D)
Dentre os reguladores de crescimento envolvidos na cultura de tecidos, a classe
das auxinas é considerada a mais importante na indução e regulação da embriogênese
somática por serem responsáveis pela desdiferenciação e rediferenciação das células
(COOKE et al., 1993; GUERRA et al., 1999).
O 2,4-D é um regulador de crescimento da classe das auxinas utilizado na
maioria dos estudos de cultura de células e tecidos embriogênicos (FEHÉR et al., 2003),
em várias espécies, como a canela sassafrás (SANTA-CATARINA et al., 2001), batata
doce (MAGALHÃES et al., 2006), aveia branca (BISPO et al., 2007), murici-pequeno
(NOGUEIRA et al., 2007), entre outras.
Em cana-de-açúcar, este análogo da auxina também provou ser o mais eficiente
na indução de calos embriogênicos (LAKSHMANAN et al., 2006). A alta
especificidade do 2,4-D à indução de calos na cana-de-açúcar pode ser atribuída à
presença de supostos receptores de 2,4-D presente na superfície da membrana celular do
explante (SANI e MUSTAPHA, 2010).
O 2,4-D pode ser requerido em concentrações elevadas ou por períodos
relativamente longos para iniciar a sequência de eventos que desencadeiam a
embriogênese (VON ARNOLD e ERIKSSON, 1981).
Nos processos embriogênicos, aqueles explantes que são cultivados sem 2,4-D
não se desenvolvem, ficam amarronzados e necrosam totalmente dentro de poucos dias
de cultivo (TIEL et al., 2006; SANI e MUSTAPHA, 2010).
A presença de uma auxina para a indução de calos embriogênicos é
imprescindível, entretanto a maturação e germinação dos embriões ocorrem na ausência
ou em concentrações muito baixas dessa substância (HALPERIN e WETHERELL,
1964).
2.4.2 Carvão ativado
O carvão ativado, embora não seja um fitormônio, é utilizado frequentemente na
cultura de tecidos com o objetivo de regular o crescimento das plantas (GEORGE,
26
1996). Na embriogênese somática tem importância na maturação dos embriões
somáticos.
A embriogênese somática indireta pode ser dividida em duas fases básicas: a
fase de indução de calos e a fase de maturação de embriões. A primeira ocorre em meio
de cultura com elevadas concentrações de auxina, principalmente o 2,4-D; a segunda
ocorre em meio com baixa ou nenhuma concentração de auxina e/ou com agentes
maturadores de embriões como o ácido abscísico (ABA), agentes osmóticos e carvão
ativado (STEINER et al., 2008).
O carvão ativado, utilizado em culturas in vitro, tem a propriedade de adsorver
substâncias inibitórias como reguladores de crescimento residuais, compostos fenólicos
presentes nos explantes, etileno, entre outras, potencializando as respostas de maturação
dos embriões somáticos (MACEDO, 2010).
Compostos fenólicos geralmente são designados como substâncias inibidoras do
desenvolvimento dos explantes, os quais devem ser evitados ou eliminados das culturas
in vitro (PAN e STADEN, 1998).
A embriogênese somática indireta de cana-de-açúcar é bastante afetada pela
exsudação dos compostos fenólicos produzidos pelos explantes (LORENZO et al.,
2001). Esses compostos quando entram em contato com o oxigênio sofrem reações de
oxidação e resultam em produtos tóxicos, que ocasionam o escurecimento e a necrose
dos explantes, prejudicando o desenvolvimento dos calos (RODRIGUES, 2003).
A adição do carvão ativado aos cultivos embriogênicos promove o
desenvolvimento dos calos provavelmente por absorver do meio de cultura os
compostos fenólicos (FRIDBORG et al., 1978), as auxinas e citocininas
(WEATHERHEAD et al., 1978) que inibem o desenvolvimento dos embriões
somáticos.
Alguns métodos para impedir a acumulação de compostos fenólicos nas culturas
in vitro têm sido recomendados. O método mais amplamente utilizado é a transferência
dos explantes para meio fresco (PAN e STADEN, 1998). No entanto o risco de
contaminação e o risco de mutações pelo aumento de subculturas é um problema. A
utilização do carvão ativado nas culturas pode minimizar esse problema (PAN e
STADEN, 1998).
Além disso, alguns autores relatam que o carvão ativado liberam substâncias
naturalmente presentes na sua estrutura, que são benéficas para o crescimento da cultura
in vitro (PAN e STADEN, 1998).
27
Diversos autores têm utilizado o carvão ativado nos processos embriogênicos em
várias espécies de importância econômica, como soja (BUCHHEIM et al., 1989), cacau
(VENTURIERI e VENTURIERI, 2004), Piscea abies (PULLMAN et al., 2005), canade-açúcar (MACEDO, 2010), entre outras.
2.4.3 Sacarose
A sacarose é o carboidrato mais utilizado na cultura de tecidos e suas ações
sobre os explantes são bastante variadas. Esse carboidrato é utilizado mais comumente
entre as concentrações de 2 e 3% (OZIAS-AKINS e VASIL, 1982).
Variações na concentração de sacarose no meio de cultura afetam as condições
osmóticas e o metabolismo da planta in vitro, influenciando o crescimento e a
diferenciação das culturas (KUMAR et al., 1984).
Na embriogênese somática, a sacarose tem sido a fonte de carbono mais
empregada, embora outros mono e dissacarídeos também possam ser utilizados
(MACIEL et al., 2003). Tem a capacidade de restaurar o potencial embriogênico das
culturas através do aumento de sua concentração (JONES, 1974).
Vários autores já demonstraram os efeitos positivos da adição de sacarose em
culturas embriogênicas de diferentes espécies de plantas como citros (BUTTON, 1978),
cacau (TEIXEIRA et al., 2002; SANTANA et al., 2010), cana-de-açúcar (TAPIA et al.,
1999).
As concentrações de sacarose estimulam a formação de calos embriogênicos
(LU et al., 1982), influenciam nos processos de iniciação e diferenciação dos embriões
somáticos (GUERRA et al., 1999) e reduzem a frequência de anormalidades de
desenvolvimento tais como a formação de embriões secundários, a fasciação e a
formação de policotilédones (AMMIRATO e STEWARD, 1971).
A sacarose, quando utilizada em altas concentrações na técnica da embriogênese
somática, parece ter efeito comparável ao produzido pelo ácido abscísico (ABA) (LITZ
e JARRET, 1991), isto é, desenvolvendo um papel regulatório aos estresses envolvendo
perda de água (LINACERO et al., 2001). Uma vez que, nos últimos estádios da
maturação do embrião há perda de água levando à dessecação e ao início do programa
de dormência (LINACERO et al., 2001).
28
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37
CAPÍTULO 1
Efeito da sacarose na embriogênese somática indireta de duas variedades RB de
cana-de-açúcar
RESUMO
A sacarose tem sido o carboidrato mais utilizado na embriogênese somática,
influenciando nos processos de indução, maturação e diferenciação dos embriões
somáticos. Os efeitos positivos da adição desse carboidrato nos meios de cultivo de
embriões somáticos têm sido demonstrados em diferentes espécies de plantas, inclusive
na cana-de-açúcar. Este trabalho teve por objetivo determinar as melhores
concentrações dessa fonte de carbono no processo de embriogênese somática para as
variedades RB92579 e RB99395. Ápices caulinares, com 8 a 10 meses de idade, foram
coletados e levados para o laboratório, onde foram higienizados e dissecados até a
obtenção do meristema apical envolvido por primórdios foliares. Os explantes foram
colocados em meios de cultura indutores de embriogênese somática compostos por
quatro concentrações de sacarose: 10, 20, 30 e 40 g L-1. A porcentagem de calos
embriogênicos e a qualidade dos calos embriogênicos foram avaliadas após oito
semanas no escuro; o número plantas regeneradas a partir dos embriões somáticos, após
sete semanas no claro. A variedade RB99395 se comportou de forma superior em todas
as variáveis estudadas. O número de plantas regeneradas na fase clara, nas duas
variedades, teve correlação alta e positiva com a qualidade dos calos embriogênicos
formados na fase escura. A concentração de 30 g L-1 de sacarose no meio de cultura foi
indicada como a mais viável para as variedades estudadas no desenvolvimento de calos
embriogênicos na fase escura.
Palavras-chave: Saccharum officinarum, micropropagação, cultura de tecidos.
38
Effect of sucrose on indirect somatic embryogenesis of two RB varieties of
sugarcane
ABSTRACT
Sucrose has been the most widely used carbohydrate in somatic embryogenesis,
influencing its processes of induction, maturation and differentiation. The positive
effects of the use of this carbohydrate in the culture media have been demonstrated in
different plant species including sugar cane. This study aimed to determine the best
concentration of this carbon source in the process of somatic embryogenesis for the
sugar cane varieties RB92579 and RB99395. The soft-end stems of 8-10 months-old
plants were collected in the field and taken to the laboratory where they were cleaned
and dissected to obtain the apical meristem surrounded by few leaves primordia. These
explants were placed in culture media with four concentrations of sucrose, 10, 20, 30
and 40 g L-1. The percentage and the quality of embryogenic calli were evaluated after
eight weeks in the dark; the number of regenerated plants was evaluated after seven
weeks in a 16 hours photoperiod. The variety RB99395 behaved superior in all the
variables studied. The number of regenerated plants in the light phase, in both varieties
had high positive correlation with the quality of the embryogenic calli formed during
the dark phase. The concentration of 30 g L-1 sucrose in the culture medium was
indicated as the most feasible for both varieties to develop embryogenic callus in the
dark phase.
Keywords: Saccharum officinarum, micropropagation, tissue culture.
39
INTRODUÇÃO
Os componentes básicos dos meios de cultura envolvem os macro e micro
nutrientes, os açúcares, as vitaminas e os reguladores de crescimento. A sacarose tem
sido o carboidrato mais utilizado na embriogênese somática, suas concentrações
influenciam nos processos de indução, maturação e diferenciação dos embriões
somáticos (GUERRA et al., 1999; TAPIA et al., 1999).
Essa fonte de carbono é alvo de muitos estudos na cultura de tecidos, vários
autores já demonstraram os efeitos positivos da adição de sacarose nos meios de cultivo
de embriões somáticos em diferentes espécies de plantas (HU e FERREIRA, 1998;
TAPIA et al., 1999; TORRES et al., 2005).
Button (1978) observou que a sacarose promove bom crescimento de calos
embriogênicos em citros; Teixeira et al. (2002) e Santana et al. (2010) relataram o efeito
benéfico da sacarose na formação de embriões em cacau; Tapia et al. (1999) também
observaram o efeito positivo da sacarose na indução e maturação de embriões somáticos
de cana-de-açúcar.
Apesar de a sacarose ser altamente metabolizável, tem-se comprovado que as
altas concentrações desse açúcar atuam como um agente osmótico (ROCA et al., 1991),
suprimindo o desenvolvimento dos explantes possivelmente pela redução da absorção
de água e de nutrientes do meio de cultura.
A sacarose, quando utilizada em altos níveis na técnica de embriogênese
somática, parece ter efeito comparável ao produzido pelo ácido abscísico (LITZ e
JARRET, 1991). Esse fitormônio é amplamente utilizado para estimular o processo de
maturação dos embriões somáticos (SALAJOVA et al., 1999).
Este trabalho teve por objetivo determinar as melhores concentrações dessa
substância no processo de embriogênese somática para as variedades RB92579 e
RB99395 utilizadas no Programa de Melhoramento Genético da Cana-de-açúcar do
CECA-UFAL, de modo a ampliar os conhecimentos sobre a relação entre essa fonte de
carbono e o desenvolvimento dos calos embriogênicos.
40
MATERIAIS E MÉTODOS
Ápices caulinares de cana-de-açúcar das variedades RB92579 e RB99395, com
8 a 10 meses de idade (Figura 1A), foram coletados em área experimental do Centro de
Ciências Agrárias (CECA/UFAL), localizado na BR 104 Norte, Km 85, Rio Largo –
AL e em seguida levados para o Laboratório de Biotecnologia Vegetal (BIOVEG), do
CECA, onde o experimento foi realizado.
No BIOVEG, os ápices foram reduzidos até a obtenção do palmito, isto é, um
conjunto de folhas jovens enroladas concentricamente no ápice caulinar das plantas. Os
palmitos, com cerca de 15 cm de comprimento e 2 cm de diâmetro, contendo o último
nó sobre o qual está localizado o meristema apical (Figura 1B), foram inicialmente
lavados em água corrente e enxaguados em água destilada. Na câmara de fluxo laminar,
foram desinfestados em solução de hipoclorito de sódio a 0,66% (v/v) por 20 minutos e
enxaguados com água destilada estéril por três vezes. Sobre ladrilhos autoclavados, os
palmitos foram excisados individualmente, utilizando-se pinça e bisturi, até a obtenção
do meristema apical envolvido por alguns primórdios foliares (Figura 1C).
Figura 1. Processo de coleta, limpeza e excisão dos explantes para introdução à
técnica da embriogênese somática. A) – Ápices caulinares coletados de canas com 8
a 10 meses de idade; B) – Palmitos extraídos dos ápices caulinares e tratados em
solução de hipoclorito de sódio a 0,66% (v/v); C) – Excisão do meristema apical
envolvido por primórdios foliares com aproximadamente 10 mm de comprimento
por 2 mm de diâmetro (indicado pela seta). Fotos: Marcondes Inácio da Silva.
A
Localização
do último nó
B
C
Os explantes, com aproximadamente 10 mm de comprimento por 2 mm de
diâmetro, foram introduzidos, horizontalmente, em frascos de vidros (10 x 8 cm)
contendo 30 mL de meio de cultura, composto pelos sais e vitaminas MS
41
(MURASHIGE e SKOOG, 1962), suplementado com 3 mg L-1 de 2,4-D, 50 mg L-1 de
arginina e 50 mL L-1 de água de coco, no qual foram testadas quatro concentrações de
sacarose: 10, 20, 30 e 40 g L-1. Todos os meios de cultura foram gelificados com 2,5 g
L-1 de gelrite, autoclavados a 121 ºC e a 1 atm por 20 minutos com pH previamente
ajustado em 5,8. O delineamento experimental foi inteiramente casualizado em esquema
fatorial 2x4 (2 variedades x 4 concentrações de sacarose) com 3 repetições. Cada
parcela foi composta por seis frascos contendo um explante em cada um.
Para a indução de calos embriogênicos, os explantes foram mantidos no escuro
sob temperatura de 25 ± 1 ºC em estufa de crescimento (tipo BOD), durante oito
semanas, sendo que, nas últimas três semanas, os explantes foram transferidos para
meio de cultura com 0,25 mg L-1 de 2,4-D para a maturação dos embriões, mantidas as
concentrações de sacarose dos tratamentos e os outros componentes utilizados.
Para impedir que a oxidação dos explantes, provocada pela exsudação dos
compostos fenólicos, avançasse para todo o meio de cultura e provocasse maior
nocividade ao desenvolvimento dos calos, a cada quatro dias, até os primeiros 20 dias
de cultivo, os explantes eram reposicionados dentro dos frascos de cultura, de modo que
os explantes permanecessem em áreas “limpas” do meio de cultura.
Após as oito semanas nos meios de indução à embriogênese somática, os calos
embriogênicos foram transferidos para meio de cultura MS enriquecido com 0,1 mg L-1
de cinetina, 0,2 mg L-1 de benzilaminopurina (BAP) e 30 g L-1 de sacarose, sob
temperatura de 25 ± 1 ºC e fotoperíodo de 16 horas com intensidade luminosa de 50
µmol/m2 s-1, durante três semanas para a germinação dos embriões somáticos. Em
seguida, as culturas foram transferidas para meio MS suplementado com 1 mg L-1 de
Ácido Giberélico (GA3) e 30 g L-1 de sacarose, mantidas as condições de temperatura e
luminosidade, onde permaneceram por mais quatro semanas para o crescimento das
plantas.
A porcentagem de calos embriogênicos e a qualidade dos calos embriogênicos
foram avaliadas no final da fase escura; o número de plantas regeneradas a partir dos
embriões somáticos, após a fase clara. Para a avaliação da qualidade dos calos
embriogênicos foi desenvolvida uma escala de notas variando de 0 a 4 (Figura 2).
42
Figura 2. Escala de notas desenvolvida para avaliar a qualidade dos calos
embriogênicos de cana-de-açúcar, após oito semanas de cultivo no escuro. Fotos:
Marcondes Inácio da Silva
43
Os dados obtidos das variáveis foram avaliados estatisticamente por meio de
análise de variância e ajustados a curvas de regressão. Os dados das notas relativas às
qualidades dos calos embriogênicos foram transformados em √(x+0,5), os demais dados
não foram transformados. Todas as análises foram realizadas pelo programa estatístico
SISVAR (FERREIRA, 2008).
44
RESULTADOS E DISCUSSÃO
A fase inicial da formação de calos na cana-de-açúcar foi caracterizada por uma
intensa oxidação dos explantes, especialmente aqueles da variedade RB99395. A
oxidação desses explantes provavelmente ocorreu pelo fato da cana-de-açúcar
apresentar teores elevados de compostos fenólicos nos seus tecidos (PAYET et al.,
2005; DUARTE-ALMEIDA et al., 2006).
Os fenóis exsudados pelas células lesionadas, em contato com o oxigênio sofrem
reações de oxidação e resultam em produtos tóxicos, ocasionando o escurecimento e a
necrose dos explantes (RODRIGUES, 2003). Esses fenóis interferem negativamente na
formação de calos, principalmente nas três primeiras semanas; Beruto et al. (1996)
constataram que a não regeneração de calos em Ranunculus asiaticus L. foi devido ao
alto índice de polímeros fenólicos; semelhantemente, estudos de embriogênese somática
em diferentes genótipos de cacau realizados por Santana et al. (2010) mostraram que
grande parte dos explantes necrosados não formaram calo, provavelmente pelo efeito
inibitório apresentado pelos compostos fenólicos no crescimento de tecidos.
Neste trabalho, o efeito prejudicial dos fenóis foi minimizado quando os
explantes foram reposicionados a cada quatro dias, até o 20º dia, dentro dos frascos de
cultura, de forma que a oxidação da área lesionada não abrangesse todo o meio de
cultura e assim os explantes permanecessem em áreas “limpas” do meio.
As primeiras alterações visíveis nos explantes iniciaram na segunda semana,
com o intumescimento dos tecidos seguido de intensa proliferação de células. O
aumento da massa de calos foi mais expressivo depois da terceira semana; Lorenzo et
al. (2001), verificaram que a exsudação de fenóis em explantes meristemáticos de canade-açúcar ocorria com maior intensidade nos primeiros 20 dias de cultivo; ou seja,
possivelmente durante essa fase inicial os fenóis limitaram a formação de calos.
Nos
tratamentos
estudados
neste
experimento
foram
obtidos
calos
embriogênicos e calos não embriogênicos (Figura 3). Os calos embriogênicos, quando
foram colocados na presença de luz (fotoperíodo de 16 horas), sofreram alterações
morfológicas visíveis logo na primeira semana de cultivo. Tais alterações incluíram o
aparecimento de pigmentos esverdeados, indicando a presença de clorofila nos embriões
maduros e a sua consequente germinação e crescimento, originando plantas (Figura 4 A,
B). Por outro lado, os calos não embriogênicos apresentaram pigmentos arroxeados,
indicando a presença de antocianinas sobre a área calejada, esses calos não originaram
45
plantas (Figura 4C). Resultados semelhantes foram descritos por Macedo (2010) em
estudos de maturação de calos embriogênicos e não embriogênicos de cana-de-açúcar.
Figura 3. Tipos de calos obtidos durante o processo de embriogênese somática sob o
efeito de diferentes concentrações de sacarose no meio de cultura: A) –
Embriogênico: amarelado, duro e compacto; B) - Não embriogênico: brilhante e
mucilaginoso. Fotos: Marcondes Inácio da Silva.
A
B
Figura 4. A) - Pigmentos verdes de clorofila sobre os calos embriogênicos,
indicando a germinação dos embriões somáticos; B) - Plantas, originadas dos
embriões somáticos, em crescimento após três semanas de cultivo no claro; C) Calos não embriogênicos com pigmentos arroxeados de antocianina, indicando que
não há embriões em processo de germinação. Fotos: Marcondes Inácio da Silva.
A
B
C
46
De acordo com a análise de variância (Tabela 1), não houve interação
significativa entre as variedades e as concentrações de sacarose estudadas no processo
de embriogênese somática, em relação às três variáveis analisadas, indicando que esses
dois fatores são independentes e, portanto, devem ser analisados separadamente.
As
variedades
RB92579
e
RB99395
de
cana-de-açúcar
diferiram
significativamente, pelo teste F, em relação à porcentagem de calos embriogênicos
formados (p<0,001), à qualidade dos calos embriogênicos (p<0,001) e ao número de
plantas regeneradas a partir dos embriões somáticos (p<0,001).
As regressões linear e quadrática e o desvio de regressão não tiveram efeitos
significativos para a porcentagem de calos embriogênicos. Por outro lado, as regressões
linear e quadrática tiveram efeitos altamente significativos tanto para a qualidade dos
calos embriogênicos (p<0,001 e p<0,016), respectivamente, como para o número de
plantas regeneradas (p<0,001 e p<0,001), respectivamente. Para essas variáveis, o
desvio de regressão não teve efeito significativo (Tabela 1).
Tabela 1. Resumo da análise de variância para a porcentagem de calos embriogênicos,
qualidade dos calos embriogênicos e número de plantas regeneradas.
Causa de variação
GL
Quadrados médios e (Probabilidades)
Nº de plantas
Porcentagem de CE
Qualidade dos CE
regeneradas
15000,0000 (p<0,001)
1,6705 (p<0,001)
3143,4070 (p<0,001)
185,9267 ns
0,1969 (p<0,001)
873,3704 (p<0,001)
334,6680 ns
0,4918 (p<0,001)
2167,5001 (p<0,001)
185,9267 ns
0,0935 (p<0,016)
357,7963 (p<0,001)
37,1853 ns
0,0054 ns
94,8148 ns
ns
ns
185,9267
0,0152
41,7902 ns
2302,2228 (p<0,001)
0,3296 (p<0,001)
841,2698 (p<0,001)
139,4450
0,0129
24,1111
Variedades (F1)
1
Conc. de sacarose (F2)
(3)
Reg. Linear
1
Reg. Quadrática
1
Desvio de regressão
1
Interação F1 x F2
3
Tratamentos
7
Resíduo
16
Total
23
CV (%)
15,74
NOTA: (ns) - não significativo: p>0,05.
6,92
14,88
De acordo com o teste F (p<0,001), a variedade RB99395 se comportou de
forma superior em todas as variáveis estudadas (Figura 5). Esses resultados
confirmaram o que inúmeros autores já relataram sobre a influência do genótipo na
resposta embriogênica dos explantes (GANDONOU et al., 2005; CIDADE et al., 2006;
LAKSHMANAN et al., 2006).
47
Porcentagem de calos embriogênicos
Figura 5. Diferença estatística, de acordo com o teste F (p<0,001), entre as duas
variedades de cana-de-açúcar, cultivadas em diferentes concentrações de sacarose;
A) - em relação à porcentagem de calos embriogênicos; B) – em relação à qualidade
dos calos embriogênicos; C) – em relação ao número de plantas regeneradas.
a
100
75
b
50
25
0
RB92579
Qualidade dos calos embriogênicos
A
4
a
3
2
b
1
0
RB92579
B
RB99395
a
45
Número de plantas regeneradas
RB99395
30
b
15
0
C
RB92579
RB99395
48
Os aumentos da qualidade dos calos embriogênicos e do número de plantas
regeneradas das variedades RB92579 e RB99395, em função das concentrações de
sacarose aplicadas no meio de cultivo, foram melhor explicados pelas equações de 1º
grau (Figura 6).
Figura 6. Análises de regressão mostrando os efeitos das concentrações de sacarose
sobre as variedades RB92579 e RB99395, no processo de embriogênese somática;
A) - em relação à qualidade dos calos embriogênicos; B) – em relação ao número de
plantas regeneradas.
Número de plantas regeneradas
A
B
50
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
y = 11,750000 + 0,850000x
R2 = 0,8273
10
20
30
Concentrações de sacarose (g L-1)
40
As duas variáveis analisadas apresentaram comportamentos semelhantes, em
ambas observou-se que as maiores concentrações de sacarose (30 e 40 g L-1), durante a
fase de indução e maturação de calos, promoveram os melhores resultados. Entretanto,
as regressões mostraram que a partir da concentração de 30 g L-1 de sacarose o aumento
na qualidade dos calos e no número de plantas regeneradas já não foi tão expressivo. A
relação custo/ benefício foi maior na concentração de 30 g L-1, ou seja, foi a mais viável
neste estudo. Provavelmente, concentrações superiores a 40 g L-1 iriam causar efeitos
49
decrescentes no desenvolvimento dos explantes dessas variedades. Altas concentrações
de sacarose reduzem o potencial osmótico do meio de cultura, podendo dificultar a
absorção dos nutrientes.
Por outro lado, Tapia et al. (1999) estudando calos embriogênicos da variedade
Cp 5243 de cana-de-açúcar demonstraram que os meios de cultura enriquecidos com 60
g L-1 de sacarose e 1 mg L-1 de ANA promoveram melhores resultados nos processos de
indução e maturação dos embriões somáticos. Essa variação entre os trabalhos pode ter
ocorrido em função dos genótipos utilizados em cada um deles.
Houve correlação alta e positiva entre a qualidade dos calos embriogênicos e o
número de plantas regeneradas, ou seja, quanto melhor foi a qualidade dos calos
embriogênicos maior foi o número de plantas formadas na fase clara (Figura 7).
Número de plantas regeneradas
Figura 7. Equação de 1º grau mostrando a correlação existente entre a qualidade dos
calos embriogênicos e o número de plantas regeneradas.
70
60
y = - 0,912 + 14,849x
R² = 0,9904
50
40
30
20
10
0
0
1
2
3
Qualidade dos calos embriogênicos
4
50
CONCLUSÕES
A porcentagem de calos embriogênicos formados, a qualidade desses calos
embriogênicos e o número de plantas regeneradas a partir dos embriões somáticos são
características inerentes a cada variedade.
A concentração de 30 g L-1 de sacarose no meio de cultura é indicada como a
mais viável para as variedades estudadas no desenvolvimento de calos embriogênicos
na fase escura.
O escurecimento dos explantes, devido a exsudação dos compostos fenólicos,
pode ser controlado com o reposicionamento frequente dos mesmos até a formação de
calos embriogênicos.
Há uma correlação alta e positiva entre a qualidade dos calos embriogênicos e o
número de plantas regeneradas para as variedades RB92579 e RB99395 de cana-deaçúcar.
51
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53
CAPÍTULO 2
Efeito do 2,4-D na embriogênese somática indireta de duas variedades RB de canade-açúcar
RESUMO
A embriogênese somática é uma ferramenta que pode auxiliar nos estudos básicos de
fisiologia e bioquímica, transformação genética, fusão de protoplastos e propagação
clonal da cana-de-açúcar. As auxinas sintéticas ácido 2,4 diclorofenoxiacético (2,4-D),
ácido naftaleno acético (ANA), picloram e dicamba são reguladores de crescimento
bastante utilizados nesse processo. Entre esses, o 2,4-D é o mais utilizado na indução à
embriogênese somática de cana-de-açúcar. Concentrações inadequadas desse regulador
de
crescimento
podem
limitar
a
formação
dos
calos
embriogênicos
e,
consequentemente, de embriões. Este trabalho teve por objetivo determinar as melhores
concentrações de 2,4-D no processo de embriogênese somática para as variedades
RB92579 e RB99395 de cana-de-açúcar. Ápices caulinares, com 8 a 10 meses de idade,
foram coletados e levados para o laboratório, onde foram higienizados e dissecados até
a obtenção do meristema apical envolvido por primórdios foliares. Os explantes foram
colocados em meios de cultura MS compostos por quatro concentrações de 2,4-D: 0, 3,
6 e 9 mg L-1. A porcentagem de calos embriogênicos e a qualidade dos calos
embriogênicos foram avaliadas após oito semanas no escuro; e o número de plantas
regeneradas, após sete semanas no claro. Os explantes cultivados sem 2,4-D ficaram
marrons, não formaram calos e morreram após a terceira semana de cultivo. As
concentrações de 3 mg L-1 de 2,4-D, utilizadas nos meios de cultura MS, foram as mais
viáveis para as variedades RB92579 e RB99395 na formação e qualidade dos calos
embriogênicos, assim como, no número de plantas regeneradas.
Palavras-chave:
embriogênicos.
Saccharum
officinarum,
regulador
de
crescimento,
calos
54
Effect of 2,4-D in indirect somatic embryogenesis of two RB varieties of sugarcane
ABSTRACT
Somatic embryogenesis is a tool that can help with basic studies of physiology and
biochemistry, genetic transformation, protoplast fusion and clonal propagation of sugar
cane. The synthetic auxin 2,4 dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D), naphthalene acetic
acid (NAA), picloram and dicamba are growth regulators widely used in this process.
Among these, 2,4-D is the most used in the induction of somatic embryogenesis of
sugar cane. Inadequate concentrations of this growth regulator may limit the formation
of embryogenic callus and, consequently, of embryos to be formed. This study aimed to
determine the best concentrations of 2,4-D on somatic embryogenesis process for the
varieties RB92579 and RB99395 of cane sugar. Soft-end stems of 8-10 months-old
plants were collected in the field and taken to the laboratory where they were cleaned
and dissected to obtain the apical meristem surrounded by few leaves primordia. The
explants were placed in MS culture media containing four concentrations of 2,4-D: 0, 3,
6 and 9 mg L-1. The percentage and the quality of the embryogenic calli were evaluated
after eight weeks in the dark; and the number of regenerated plants was evaluated after
seven weeks in a 16 hour photoperiod. The explants cultured without 2,4-D were
brown, did not present callus and died after the third week of cultivation. The
concentration of 3 mg L-1 of 2,4-D added to the culture medium was designated as the
best treatment to formation and quality of embryogenic calli, as well as the number of
regenerated plants in both varieties.
Keywords: Saccharum officinarum, growth regulator, embryogenic calli.
55
INTRODUÇÃO
A embriogênese somática é uma ferramenta biotecnológica que pode ser
utilizada em inúmeras situações nos programas de melhoramento genético da cana-deaçúcar. Essa técnica pode auxiliar nos estudos básicos de fisiologia e bioquímica,
transformação genética, fusão de protoplastos e propagação clonal (PRAKASH e
VARADARAJAN, 1992; YEUNG, 1995; STEINER et al., 2008).
O sucesso dessa técnica depende do controle de muitas variáveis, como espécie,
estado fisiológico e idade da planta matriz, nutrientes e reguladores de crescimento do
meio nutritivo (JIMÉNEZ, 2005). As auxinas sintéticas: ácido 2,4 diclorofenoxiacético
(2,4-D), ácido naftaleno acético (ANA), picloram e dicamba são reguladores de
crescimento bastante utilizados nos processos embriogênicos.
Segundo Jiménez (2005), o 2,4-D é a auxina mais utilizada na indução à
embriogênese somática de muitas espécies. Altas concentrações dessa auxina alteram,
rapidamente, o metabolismo das células dos explantes, resultando no desenvolvimento
de calos (DUDITS et al., 1995).
Vários autores têm demonstrado o efeito positivo do 2,4-D na indução de calos e
embriogênese somática de cana-de-açúcar (TIEL et al., 2006; SANI e MUSTAPHA,
2010). Nesses estudos tem-se observado variações na recomendação da melhor
concentração de 2,4-D a ser utilizada em função do genótipo estudado.
Concentrações inadequadas dessa auxina podem limitar o desenvolvimento dos
explantes na formação dos calos embriogênicos. Sendo assim, tornam-se necessários
novos estudos para determinação da concentração ótima desse regulador de crescimento
para cada genótipo de cana estudado.
O presente trabalho teve por objetivo determinar as melhores concentrações de
2,4-D no processo de embriogênese somática para as variedades RB92579 e RB99395,
utilizadas no Programa de Melhoramento Genético da Cana-de-açúcar do CECAUFAL.
56
MATERIAIS E MÉTODOS
Ápices caulinares de cana-de-açúcar das variedades RB92579 e RB99395, com
8 a 10 meses de idade (Figura 1A), foram coletados em área experimental do Centro de
Ciências Agrárias (CECA/UFAL), localizado na BR 104 Norte, Km 85, Rio Largo –
AL e em seguida levados para o Laboratório de Biotecnologia Vegetal (BIOVEG), do
CECA, onde o experimento foi realizado.
No BIOVEG, os ápices foram reduzidos até a obtenção do palmito, isto é, um
conjunto de folhas jovens enroladas concentricamente no ápice caulinar das plantas. Os
palmitos, com cerca de 15 cm de comprimento e 2 cm de diâmetro, contendo o último
nó sobre o qual está localizado o meristema apical (Figura 1B), foram inicialmente
lavados em água corrente e enxaguados em água destilada. Na câmara de fluxo laminar,
foram desinfestados em solução de hipoclorito de sódio a 0,66% (v/v) por 20 minutos e
enxaguados com água destilada estéril por três vezes. Sobre ladrilhos autoclavados, os
palmitos foram excisados individualmente, utilizando-se pinça e bisturi, até a obtenção
do meristema apical envolvido por alguns primórdios foliares (Figura 1C).
Figura 1. Processo de coleta, limpeza e excisão dos explantes para introdução à
técnica da embriogênese somática. A) – Ápices caulinares coletados de canas com 8
a 10 meses de idade; B) – Palmitos extraídos dos ápices caulinares e tratados em
solução de hipoclorito de sódio a 0,66% (v/v); C) – Excisão do meristema apical
envolvido por primórdios foliares com aproximadamente 10 mm de comprimento
por 2 mm de diâmetro (indicado pela seta). Fotos: Marcondes Inácio da Silva.
A
Localização
do último nó
B
C
Os explantes, com aproximadamente 10 mm de comprimento por 2 mm de
diâmetro, foram introduzidos, horizontalmente, em frascos de vidros (10 x 8 cm)
contendo 30 mL de meio de cultura, composto pelos sais e vitaminas MS
57
(MURASHIGE e SKOOG, 1962), suplementado com 50 mg L-1 de arginina, 30 g L-1 de
sacarose e 50 mL L-1 de água de coco, no qual foram testadas quatro concentrações de
2,4-D: 0, 3, 6 e 9 mg L-1. Todos os meios de cultura foram gelificados com 2,5 g L-1 de
gelrite, autoclavados a 121 ºC e a 1 atm por 20 minutos com pH previamente ajustado
em 5,8. O delineamento experimental foi inteiramente casualizado em esquema fatorial
2x4 (2 variedades x 4 concentrações de 2,4-D) com 3 repetições. Cada parcela foi
composta por seis frascos contendo um explante em cada um.
Para a indução de calos embriogênicos, os explantes foram mantidos no escuro
sob temperatura de 25 ± 1 ºC em estufa de crescimento (tipo BOD), durante oito
semanas, sendo que, nas últimas três semanas, os explantes de todos os tratamentos
foram transferidos para meio de cultura com 0,25 mg L-1 de 2,4-D, mantidos os demais
reagentes e as suas respectivas concentrações, para a maturação dos embriões.
Para impedir que a oxidação dos explantes, provocada pela exsudação dos
compostos fenólicos, avançasse para todo o meio de cultura e provocasse maior
nocividade ao desenvolvimento dos calos, a cada quatro dias, até os primeiros 20 dias
de cultivo, os explantes eram reposicionados dentro dos frascos de cultura, de modo que
os explantes permanecessem em áreas “limpas” do meio de cultura.
Após as oito semanas nos meios de indução à embriogênese somática, os calos
embriogênicos foram transferidos para meio de cultura MS enriquecido com 0,1 mg L-1
de cinetina, 0,2 mg L-1 de benzilaminopurina (BAP) e 30 g L-1 de sacarose, sob
temperatura de 25 ± 1 ºC e fotoperíodo de 16 horas com intensidade luminosa de 50
µmol/m2 s-1, durante três semanas para a germinação dos embriões somáticos. Em
seguida, as culturas foram transferidas para meio MS suplementado com 1 mg L-1 de
Ácido Giberélico (GA3) e 30 g L-1 de sacarose, mantidas as condições de temperatura e
luminosidade, onde permaneceram por mais quatro semanas para o crescimento das
plantas.
A porcentagem de calos embriogênicos e a qualidade dos calos embriogênicos
foram avaliadas no final da fase escura; o número de plantas regeneradas a partir dos
embriões somáticos, após a fase clara. Para a avaliação da qualidade dos calos
embriogênicos foi desenvolvida uma escala de notas variando de 0 a 4 (Figura 2).
58
Figura 2. Escala de notas desenvolvida para avaliar a qualidade dos calos
embriogênicos de cana-de-açúcar, após oito semanas de cultivo no escuro. Fotos:
Marcondes Inácio da Silva
59
Os dados obtidos das variáveis foram avaliados estatisticamente por meio de
análise de variância e ajustados a curvas de regressão. Os dados das notas relativas às
qualidades dos calos embriogênicos foram transformados em √(x+0,5), os demais dados
não foram transformados. Todas as análises foram realizadas pelo programa estatístico
SISVAR (FERREIRA, 2008).
60
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Nas primeiras semanas da indução de calos, observou-se uma intensa oxidação
nos explantes, provavelmente pelo fato dessa espécie apresentar teores elevados de
compostos fenólicos nos seus tecidos (PAYET et al., 2005; DUARTE-ALMEIDA et al.,
2006). Os fenóis, exsudados pelas células lesionadas, quando entram em contato com o
oxigênio, sofrem reações de oxidação e resultam em produtos tóxicos, ocasionando o
escurecimento e a necrose dos explantes (RODRIGUES, 2003). Esses fenóis interferem
negativamente na formação de calos, principalmente nas primeiras três semanas. Beruto
et al. (1996) constataram que a não regeneração de calos em Ranunculus asiaticus L. foi
devido ao alto índice de polímeros fenólicos; semelhantemente, estudos de
embriogênese somática em diferentes genótipos de cacau realizados por Santana et al.
(2010) mostraram que grande parte dos explantes necrosados não formaram calo,
provavelmente pelo efeito inibitório apresentado pelos compostos fenólicos no
crescimento de tecidos.
Todavia, o efeito prejudicial dos fenóis, neste trabalho, foi minimizado quando
os explantes foram reposicionados a cada quatro dias, até o 20º dia, dentro dos frascos
de cultura, de forma que a oxidação da área lesionada não abrangesse todo o meio de
cultura e assim os explantes permanecessem em áreas “limpas” do meio.
Observou-se que a grande maioria dos explantes iniciou o processo de
intumescimento e proliferação das células a partir da segunda semana de cultivo. As
extremidades dos explantes, principalmente a distal, são as áreas onde o
desenvolvimento dos calos é desencadeado, ou seja, áreas onde as células sofrem o
ferimento durante a excisão (Figura 3).
A massa de calos aumentou significativamente entre a terceira e quinta semana
de cultivo, provavelmente pela redução da exsudação dos fenóis neste período. Lorenzo
et al. (2001), estudando a micropropagação de cana-de-açúcar, constataram que os
explantes meristemáticos exsudavam compostos fenólicos intensamente até os 20 dias
iniciais de cultivo. Sugere-se que os fenóis limitam o desenvolvimento dos calos nesse
período.
61
Figura 3. Intumescimento e proliferação de células nas extremidades (distal - ED e
proximal - EP) de explantes meristemáticos de cana-de-açúcar após 15 dias de
cultivo em meio de cultura indutor de embriogênese somática com 3 mg L-1 de 2,4D. Fotos: Marcondes Inácio da Silva.
EP
EP
ED
RB92579
ED
RB99395
Os explantes cultivados sem 2,4-D ficaram marrons, não formaram calos e
morreram após a terceira semana de cultivo (Figura 4), resultados semelhantes foram
relatados por Sani e Mustapha (2010) estudando calogênese em explantes de cana-deaçúcar. Por outro lado, todos os outros tratamentos apresentaram alta formação de calos
embriogênicos. Segundo Tiel et al. (2006) concentrações baixas de 2,4-D induzem a
formação de calos embriogênicos em cana-de-açúcar.
Figura 4. Escurecimento e morte dos tecidos de explante de cana-de-açúcar após 20
dias de cultivo em meio de cultura de indução à embriogênese somática sem 2,4-D.
Foto: Marcondes Inácio da Silva.
Todos os calos embriogênicos regeneraram plantas quando foram colocados na
presença de luz (fotoperíodo de 16 horas). O aparecimento de pigmentos esverdeados,
62
logo na primeira semana de cultivo, foram indícios da germinação dos embriões
somáticos. Por outro lado, os calos não embriogênicos não formaram plantas nas
mesmas condições dadas, esses calos necrosaram ou apresentaram pigmentos
antociânicos (Figura 5). Gill et al. (2004) e Macedo (2010) verificaram esse mesmo fato
estudando culturas não embriogênicas de cana-de-açúcar. Alguns calos obtidos
apresentaram áreas embriogênicas e não embriogênicas, esses calos foram classificados
por Gandonou et al. (2005) como um tipo intermediário, e quando foram transferidos
para o claro regeneraram plantas apenas nas áreas embriogênicas (Figura 5B).
Figura 5. Calos não embriogênico (CNE) e intermediário (CI) após três semanas de
cultivo em fotoperíodo de 16 horas e meio de cultura de germinação de embriões
somáticos. A) – CNE necrosado; B) - CI com regeneração de plantas na área
embriogênica e pigmentos antociânicos na área não embriogênica. Fotos: Marcondes
Inácio da Silva.
Área
embriogênica
A
B
De acordo com o teste F da análise de variância (Tabela 1), a interação entre as
variedades de cana-de-açúcar e as concentrações de 2,4-D adicionadas ao meio de
cultura indutor de embriogênese somática não teve efeito significativo para a
porcentagem de calos embriogênicos, indicando que, em relação a essa variável, esses
dois fatores são independentes e, portanto, devem ser analisados separadamente.
Entretanto, em relação à qualidade dos calos embriogênicos e ao número de plantas
regeneradas,
as
interações
foram
significativas,
com
p<0,036
e
p<0,002,
respectivamente, requerendo o desdobramento da ANAVA para estudo dessas variáveis.
63
Tabela 1. Resumo da análise de variância para a porcentagem de calos embriogênicos,
qualidade dos calos embriogênicos e número de plantas regeneradas.
Causa de variação
GL
Quadrados médios e (Probabilidades)
Nº de plantas
Porcentagem de CE
Qualidade dos CE
regeneradas
46,2038 ns
0,3309 (p<0,001)
1204,1664 (p<0,001)
13381,2038 (p<0,001)
1,1764 (p<0,001)
2049,6790 (p<0,001)
24086,1668 (p<0,001)
----------------------------------------13381,2038 (p<0,001)
----------------------------------------2676,2408 (p<0,001)
----------------------------------------169,4138 ns
0,0478 (p<0,036)
217,1049 (p<0,002)
5814,0080 (p<0,001)
0,5719 (p<0,001)
1143,5026 (p<0,001)
138,6112
0,0131
27,3981
Variedades (F1)
1
Concent. de 2,4-D (F2) (3)
Reg. Linear
1
Reg. Quadrática
1
Desvio de regressão
1
Interação F1 x F2
3
Tratamentos
7
Resíduo
16
Total
23
CV (%)
16,62
NOTA: (ns) - não significativo: p>0,05.
8,37
20,94
Em relação à porcentagem de calos embriogênicos, as variedades RB92579 e
RB99395 não diferiram estatisticamente, pelo teste F, em função das concentrações de
2,4-D aplicadas no meio de indução à embriogênese somática, indicando que as duas
variedades tiveram resultados muito próximos. Por outro lado, as regressões linear e
quadrática e o desvio de regressão tiveram efeitos altamente significativos (p<0,001).
Contudo, o modelo quadrático foi o que melhor explicou o comportamento dessa
variável sobre as variedades RB92579 e RB99395 em função das concentrações de 2,4D utilizadas (Figura 6).
Os aumentos de concentrações desse regulador de crescimento, entre 3 e 9 mg L1
, não proporcionaram acréscimos no percentual de calos embriogênicos formados.
Houve uma estabilização dos resultados nessas concentrações, indicando, obviamente,
que a concentração de 3 mg L-1 de 2,4-D foi a mais viável, economicamente, para essa
variável (Figura 6).
Porcentagem de calos embriogênicos
Figura 6. Análise de regressão mostrando os efeitos das concentrações de 2,4-D
sobre as variedades RB92579 e RB99395, no processo de embriogênese somática em
relação à porcentagem de calos embriogênicos.
100
75
y = 4,722500 + 33,057500x - 2,623611x 2
R² = 0,9333
50
25
0
0
3
6
Concentrações de 2,4-D (mg L-1)
9
64
Em relação à qualidade dos calos embriogênicos e ao número de plantas
regeneradas, as concentrações de 2,4-D utilizadas tanto na variedade RB92579 como na
RB99395, na indução da embriogênese somática, tiveram modelos de regressão (linear
e quadrático) e desvio de regressão, significativos de acordo com o teste F (Tabela 2).
Os modelos quadráticos foram os que melhor explicaram os efeitos das concentrações
de 2,4-D sobre cada variedade estudada tanto para a qualidade dos calos embriogênicos
como para o número de plantas regeneradas (Figura 7).
Tabela 2. Desdobramento da análise de variância para a qualidade dos calos
embriogênicos e o número de plantas regeneradas.
Causa de variação
GL
Variedades
Concentrações de 2,4-D : RB92579
Reg. linear (conc. 2,4-D : RB92579)
Reg. quadrática (conc. 2,4-D : RB92579)
Desvio de reg. (conc. 2,4-D : RB92579)
Concentrações de 2,4-D : RB99395
Reg. linear (conc. 2,4-D : RB99395)
Reg. quadrática (conc. 2,4-D : RB99395)
Desvio de reg. (conc. 2,4-D : RB99395)
Resíduo
1
(3)
1
1
1
(3)
1
1
1
16
Quadrados médios e (Probabilidades)
Nº de plantas
Qualidade dos CE
regeneradas
0,3309 (p<0,001) 1204,1664 (p<0,001)
0,4100 (p<0,001)
562,2562 (p<0,001)
0,5352 (p<0,001)
230,7574 (p<0,010)
0,5154 (p<0,001) 1127,7872 (p<0,001)
0,1794 (p<0,002)
328,2240 (p<0,003)
0,8142 (p<0,001) 1704,5277 (p<0,001)
1,4595 (p<0,001) 1135,3498 (p<0,001)
0,8809 (p<0,001) 3924,0833 (p<0,001)
0,1021 (p<0,013)
54,1499 ns
0,0131
27,3981
Nota: (ns) – não significativo: p>0,05.
A concentração de 3 mg L-1 de 2,4-D, utilizada na variedade RB92579 na
indução da embriogênese somática, promoveu os melhores resultados de qualidade dos
calos embriogênicos e número de plantas regeneradas, sendo a mais viável para essa
variedade (Figura 7AB). Em relação à variedade RB99395, a concentração de 6 mg L-1
de 2,4-D induziu resultados tecnicamente superiores às demais concentrações, no
entanto, do ponto de vista econômico, a concentração de 3 mg L-1, também, foi a mais
viável para a qualidade dos calos embriogênicos e número de plantas regeneradas da
variedade RB99395 por apresentar uma menor relação custo/ benefício (Figura 7CD).
Resultados semelhantes foram obtidos por Sani e Mustapha (2010) que,
estudando a embriogênese somática em genótipos de cana-de-açúcar verificaram que a
produção de calos embriogênicos foi significativamente superior quando os meios de
cultura foram suplementados com 2,5 e 3 mg L-1 de 2,4-D.
65
Número de plantas regeneradas
Figura 7. Análises de regressão mostrando os efeitos das concentrações de 2,4-D
sobre cada variedade estudada, no processo de embriogênese somática, para a
qualidade dos calos embriogênicos e para o número de plantas regeneradas.
60
y = 2,338889 + 11,001852x - 1,077161x2
R² = 0,8054
40
20
0
0
A
B
3
6
Concentrações de 2,4-D (mg L-1) : RB92579
9
Número de plantas regeneradas
60
40
y = 0,949999 + 20,983333x - 2,009259x2
R² = 0,9894
20
0
0
C
D
3
6
Concentrações de 2,4-D (mg L-1) : RB99395
9
Os resultados apresentados demonstraram que houve correlação alta e positiva
entre a qualidade dos calos embriogênicos e o número de plantas regeneradas, isto é, os
calos embriogênicos com notas superiores originaram maior número de plantas quando
submetidos à fase clara (Figura 8).
Número de plantas regeneradas
Figura 8. Equação de 1º grau mostrando a correlação existente entre a qualidade dos
calos embriogênicos e o número de plantas regeneradas.
80
y = -4,574 + 18,456x
R² = 0,9487
60
40
20
0
0
1
2
3
Qualidade dos calos embriogênicos
4
66
CONCLUSÕES
As concentrações de 3 mg L-1 de 2,4-D, utilizadas nos meios de cultura MS, são
mais viáveis para as variedades RB92579 e RB99395 na formação e qualidade dos calos
embriogênicos, assim como, no número de plantas regeneradas a partir dos embriões
somáticos.
A ausência do 2,4-D nos meios de cultura MS não induz a formação de calos
embriogênicos.
O escurecimento dos explantes, devido a exsudação dos compostos fenólicos,
pode ser controlado com o reposicionamento frequente dos mesmos até a formação de
calos embriogênicos.
Há uma correlação alta e positiva entre a qualidade dos calos embriogênicos e o
número de plantas regeneradas para as variedades RB92579 e RB99395 de cana-deaçúcar.
67
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69
CAPÍTULO 3
Efeito do carvão ativado na embriogênese somática indireta de duas variedades
RB de cana-de-açúcar
RESUMO
O carvão ativado, quando utilizado em culturas de calos embriogênicos, adsorve
substâncias inibitórias como reguladores de crescimento residuais, compostos fenólicos
presentes nos explantes, etileno, entre outras substâncias, potencializando as respostas
de maturação dos embriões somáticos. Este trabalho teve por objetivo avaliar o efeito do
carvão ativado na maturação dos embriões somáticos das variedades RB92579 e
RB99395 de cana-de-açúcar. Ápices caulinares, com 8 a 10 meses de idade, foram
coletados e levados para o laboratório, onde foram higienizados e dissecados até a
obtenção do meristema apical envolvido por primórdios foliares. Os explantes foram
introduzidos em meio de cultura, indutor de calos, onde permaneceram por cinco
semanas no escuro. Os calos formados foram submetidos a quatro tratamentos com
carvão ativado (0; 0,75; 1,50 e 2,25 g L-1), onde permaneceram por mais três semanas,
no escuro, para a maturação dos embriões. A porcentagem de calos embriogênicos e a
qualidade dos calos embriogênicos foram avaliadas após as oito semanas no escuro; e o
número de plantas regeneradas, após sete semanas subsequentes no claro. O carvão
ativado estimulou a germinação precoce parcial dos embriões ainda no escuro causando
o aparecimento apenas das raízes sobre os calos. A qualidade dos calos embriogênicos
da variedade RB99395 foi superior a da variedade RB92579, mas essa diferença não
influenciou significativamente o número de plantas regeneradas. De uma maneira geral,
os aumentos das concentrações de carvão ativado, reduziram a porcentagem de calos
embriogênicos, a qualidade dos calos embriogênicos e o número de plantas regeneradas
nas duas variedades.
Palavras-chave: Saccharum officinarum, compostos fenólicos, culturas embriogênicas.
70
Effect of activated charcoal in indirect somatic embryogenesis of two RB varieties
of sugarcane
ABSTRACT
Activated charcoal, when used in callus cultures can adsorb inhibitory substances as
growth regulators and residual phenolic compounds present in the explants, among
other substances, enhancing the responses of maturation of somatic embryos. This study
aimed to evaluate the effect of activated charcoal in the maturation of somatic embryos
of the varieties RB92579 and RB99395 of sugar cane. Soft-end stems of 8-10 monthsold plants were collected and taken to the lab where they were cleaned and dissected to
obtain the apical meristem surrounded by few leaves primordia. The explants were
placed in a culture medium for callus induction in the dark where remained for five
weeks. The calli formed in the first five weeks were subjected to four treatments with
activated charcoal (0; 0,75; 1,50 and 2,25 g L-1), where they remained for more three
weeks in the dark for the maturation of embryos. The quality of the embryogenic and
non-embryogenic calli and the number of formed embryos were evaluated after eight
weeks in the dark; and the number of regenerated plants after seven weeks in 16 hours
photoperiod. The activated charcoal reduced the phenolic compounds in the culture
media. The activated charcoal stimulated the early partial germination of the somatic
embryo, causing the appearance of roots in the callus. The quality of the somatic
embryos produced by the variety RB99395 was superior to the RB92579, but this
difference did not significantly affect the number of regenerated plants. The use of
activated charcoal reduced the percentage and the quality of embryogenic calli and the
number of regenerated plants in both varieties.
Keywords: Saccharum officinarum, phenolic compounds, embryogenic cultures.
71
INTRODUÇÃO
O carvão ativado tem inúmeras aplicações na cultura de tecidos, principalmente
nos processos de organogênese e embriogênese somática das plantas, no entanto, a
adição inadequada dessa substância aos meios de cultivo pode produzir efeitos
prejudiciais às culturas in vitro (PAN e STADEN, 1998).
A embriogênese somática indireta é compreendida em duas etapas: a primeira é
uma fase de indução de calos em meio de cultura contendo teores elevados de uma
auxina e a outra, uma fase de maturação dos embriões somáticos em meio de cultura
contendo baixa concentração de auxina e/ou um agente maturador tal qual o carvão
ativado, o polietilenoglicol, o ácido abscísico, entre outros (STEINER et al., 2008).
Diversos autores têm utilizado o carvão ativado nos processos embriogênicos em
várias espécies de importância econômica, como soja (BUCHHEIM et al., 1989), cacau
(VENTURIERI e VENTURIERI, 2004), Piscea abies (PULLMAN et al., 2005), canade-açúcar (MACEDO, 2010), entre outras.
Esse elemento, quando utilizado em culturas in vitro, adsorve substâncias
inibitórias como reguladores de crescimento residuais, compostos fenólicos presentes
nos explantes, etileno, entre outras substâncias, potencializando as respostas de
maturação dos embriões somáticos (MACEDO, 2010).
Este trabalho teve por objetivo avaliar o efeito do carvão ativado na produção e
maturação de embriões somáticos das variedades de cana-de-açúcar RB92579 e
RB99395 utilizadas no Programa de Melhoramento Genético da Universidade Federal
de Alagoas.
72
MATERIAIS E MÉTODOS
Ápices caulinares de cana-de-açúcar das variedades RB92579 e RB99395, com
8 a 10 meses de idade (Figura 1A), foram coletados em área experimental do Centro de
Ciências Agrárias (CECA/UFAL), localizado na BR 104 Norte, Km 85, Rio Largo –
AL e em seguida levados para o Laboratório de Biotecnologia Vegetal (BIOVEG), do
CECA, onde o experimento foi realizado.
No BIOVEG, os ápices foram reduzidos até a obtenção do palmito, isto é, um
conjunto de folhas jovens enroladas concentricamente no ápice caulinar das plantas. Os
palmitos, com cerca de 15 cm de comprimento e 2 cm de diâmetro, contendo o último
nó sobre o qual está localizado o meristema apical (Figura 1B), foram inicialmente
lavados em água corrente e enxaguados em água destilada. Na câmara de fluxo laminar,
foram desinfestados em solução de hipoclorito de sódio a 0,66% (v/v) por 20 minutos e
enxaguados com água destilada estéril por três vezes. Sobre ladrilhos autoclavados, os
palmitos foram excisados individualmente, utilizando-se pinça e bisturi, até a obtenção
do meristema apical envolvido por alguns primórdios foliares (Figura 1C).
Figura 1. Processo de coleta, limpeza e excisão dos explantes para introdução à
técnica da embriogênese somática. A) – Ápices caulinares coletados de canas com 8
a 10 meses de idade; B) – Palmitos extraídos dos ápices caulinares e tratados em
solução de hipoclorito de sódio a 0,66% (v/v); C) – Excisão do meristema apical
envolvido por primórdios foliares com aproximadamente 10 mm de comprimento
por 2 mm de diâmetro (indicado pela seta). Fotos: Marcondes Inácio da Silva.
A
Localização
do último nó
B
C
Os explantes, com aproximadamente 10 mm de comprimento por 2 mm de
diâmetro, foram introduzidos, horizontalmente, em frascos de vidros (10 x 8 cm)
contendo 30 mL de meio de cultura, composto pelos sais e vitaminas MS
73
(MURASHIGE e SKOOG, 1962), 3 mg L-1 de 2,4-D, 50 mg L-1 de arginina, 30 g L-1 de
sacarose e 50 mL L-1 de água de coco, onde permaneceram por cinco semanas.
Após esse período de indução de calos, as culturas foram transferidas para meios
de cultivo compostos dos sais e vitaminas MS, arginina, sacarose, água de coco (nas
mesmas concentrações anteriores) e 0,25 mg L-1 de 2,4-D, onde permaneceram por mais
três semanas; nesse meio foram adicionadas quatro concentrações de carvão ativado: 0;
0,75; 1,50 e 2,25 g L-1 para estudo da maturação dos embriões.
Durante essas oito semanas de cultivo, o material permaneceu no escuro, sob
temperatura de 25 ± 1 ºC em estufa de crescimento (tipo BOD). Todos os meios de
cultura foram gelificados com 2,5 g L-1 de gelrite e autoclavados a 121 ºC e a 1 atm por
20 minutos com pH previamente ajustado em 5,8. O delineamento experimental foi
inteiramente casualizado em esquema fatorial 2x4 (2 variedades x 4 concentrações de
carvão ativado) com 3 repetições. Cada parcela foi composta por seis frascos contendo
um explante em cada um.
Para impedir que a oxidação dos explantes, provocada pela exsudação dos
compostos fenólicos, avançasse para todo o meio de cultura e provocasse maior
nocividade ao desenvolvimento dos calos, a cada quatro dias, até os primeiros 20 dias
de cultivo, os explantes eram reposicionados dentro dos frascos de cultura, de modo que
os explantes permanecessem em áreas “limpas” do meio de cultura.
Após as oito semanas nos meios de indução à embriogênese somática, os calos
embriogênicos foram transferidos para meio de cultura MS enriquecido com 0,1 mg L-1
de cinetina, 0,2 mg L-1 de benzilaminopurina (BAP) e 30 g L-1 de sacarose, sob
temperatura de 25 ± 1 ºC e fotoperíodo de 16 horas com intensidade luminosa de 50
µmol/m2 s-1, durante três semanas para a germinação dos embriões somáticos. Em
seguida, as culturas foram transferidas para meio MS suplementado com 1 mg L-1 de
Ácido Giberélico (GA3) e 30 g L-1 de sacarose, mantidas as condições de temperatura e
luminosidade, onde permaneceram por mais quatro semanas para o crescimento das
plantas.
A porcentagem de calos embriogênicos e a qualidade dos calos embriogênicos
foram avaliadas no final da fase escura; o número de plantas regeneradas a partir dos
embriões somáticos, após a fase clara. Para a avaliação da qualidade dos calos
embriogênicos foi desenvolvida uma escala de notas variando de 0 a 4 (Figura 2).
74
Figura 2. Escala de notas desenvolvida para avaliar a qualidade dos calos
embriogênicos de cana-de-açúcar, após oito semanas de cultivo no escuro. Fotos:
Marcondes Inácio da Silva
75
Os dados obtidos das variáveis foram avaliados estatisticamente por meio de
análise de variância e ajustados a curvas de regressão. Os dados das notas relativas às
qualidades dos calos embriogênicos foram transformados em √(x+0,5), os demais dados
não foram transformados. Todas as análises foram realizadas pelo programa estatístico
SISVAR (FERREIRA, 2008).
76
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os explantes de cana-de-açúcar mantidos no meio de indução de calos
apresentaram escurecimento, provavelmente devido à oxidação dos compostos fenólicos
exsudados. Esse acontecimento já foi previamente descrito em cana-de-açúcar por Payet
et al. (2005) e Duarte-Almeida et al. (2006). Os fenóis exsudados pelas células
lesionadas, quando entram em contato com o oxigênio, sofrem reações de oxidação e
resultam em produtos tóxicos, que podem ocasionar o escurecimento e a necrose dos
explantes (RODRIGUES, 2003).
Os compostos fenólicos prejudicam a formação de calos embriogênicos em
cana-de-açúcar, principalmente nas três primeiras semanas de cultivo, quando há uma
maior exsudação de fenóis nesta espécie (LORENZO et al., 2001). Beruto et al. (1996)
constataram que o alto índice de polímeros fenólicos não permitiram a regeneração de
calos em Ranunculus asiaticus L. De modo semelhante, estudos de embriogênese
somática em diferentes genótipos de cacau realizados por Santana et al. (2010)
mostraram que grande parte dos explantes necrosados não formaram calos,
provavelmente pelo efeito inibitório apresentado pelos compostos fenólicos no
crescimento de tecidos.
Neste trabalho, o efeito prejudicial dos fenóis foi minimizado quando os
explantes foram reposicionados a cada quatro dias dentro dos frascos de cultura, de
forma que a oxidação da área lesionada não se espalhasse para todo o meio de cultura e,
assim, os explantes permanecessem em áreas “limpas” do meio. Além disso, a adição de
carvão ativado durante a maturação dos embriões somáticos parece ter contribuído para
a redução desses compostos no meio de cultura. Segundo Tiel et al. (2006) o carvão
ativado contribui para redução de compostos fenólicos exsudados por explantes de
cana-de-açúcar.
A maioria dos explantes submetidos à indução de calos nas duas variedades
estudadas, neste trabalho, teve um ganho expressivo de massa embriogênica,
principalmente entre a terceira e quinta semana de cultivo, coincidindo com a fase em
que, de acordo com alguns estudos, a exsudação de fenóis pelos explantes de cana-deaçúcar diminui consideravelmente (PAN e STADEN, 1998; LORENZO et al., 2001).
Alguns tratamentos com carvão ativado, utilizados durante a maturação dos
embriões somáticos (últimas três semanas de cultivo no escuro), estimularam o
aparecimento de raízes sobre a superfície dos calos em ambas as variedades estudadas
77
(Figura 3). O carvão ativado tem a característica de adsorver solutos e substâncias do
meio de cultura, inclusive os reguladores de crescimento (THOMAS, 2008). Logo, a
sua adição ao protocolo usual de indução embriogênica pode ter interferido no balanço
de reguladores de crescimento do meio, estabelecendo um padrão diferente na
germinação de alguns embriões somáticos.
Essa germinação precoce ocorreu nas últimas semanas da fase escura, quando o
usual seria que os embriões germinassem somente após terem sido transferidos para o
ambiente claro, o que pode ter favorecido o desenvolvimento de raízes e não da parte
aérea. Na maioria das espécies vegetais o crescimento de raízes é amplamente
favorecido pela ausência de luz (RADMANN et al., 2003; VIEIRA et al., 2007).
Zaghmout e Torello (1998), em trabalho realizado com festuca vermelha (Poaceae),
observaram que o pré-tratamento dos calos embriogênicos com carvão ativado
aumentou a germinação precoce dos embriões somáticos devido à adsorção do 2,4-D e
outras substâncias.
Figura 3. Calo embriogênico da variedade RB99395, pouco desenvolvido (nota 1),
originado do tratamento com 1,50 g L-1 de carvão ativado. A presença de raízes
adventícias sobre a sua superfície (marcadas pelas setas) indica a germinação precoce
de alguns embriões somáticos ainda na fase escura. Foto: Marcondes Inácio da Silva.
Em todos os tratamentos estudados houve o desenvolvimento de calos
embriogênicos, com destaque para os tratamentos sem a adição de carvão ativado
(Figura 6A). Como já foi mencionado, a provável adsorção dos nutrientes e reguladores
de crescimento, pelo carvão ativado, inibiu o desenvolvimento de calos e a evolução da
embriogênese somática nas duas variedades de cana.
78
Quando os calos embriogênicos foram transferidos para o claro, as primeiras
alterações visíveis surgiram logo na primeira semana: observou-se o aparecimento de
pontos pigmentados de verde revelando a presença de clorofila e indicando a
germinação completa (parte aérea e raízes) dos embriões somáticos.
Os embriões somáticos originados de calos submetidos aos tratamentos com
carvão ativado que haviam enraizado precocemente no escuro produziram plantas
aparentemente normais quando transferidos para o claro (Figura 4). Por outro lado, os
calos não embriogênicos, isto é, calos brilhantes e mucilaginosos, não produziram
qualquer tipo de organogênese mesmo tendo surgido nas mesmas condições que os
calos embriogênicos. Em vez disso, necrosaram ou apresentaram pigmentos arroxeados
como antocianinas. Culturas não embriogênicas de cana-de-açúcar e de outras espécies
apresentam calos com estrutura morfológica semelhante (GILL et al., 2004; MACEDO,
2010).
Figura 4. Emissão de plantas em calo embriogênico da variedade RB92579
originado do tratamento de maturação de embriões somáticos com 1,50 g L-1 de
carvão ativado. Foto: Marcondes Inácio da Silva.
De acordo com o teste F da análise de variância, não houve interação
significativa entre as variedades de cana-de-açúcar e as concentrações de carvão ativado
utilizadas neste trabalho de embriogênese somática, em relação às três variáveis
analisadas, indicando que esses fatores são independentes e, portanto, devem ser
analisados separadamente (Tabela 1).
79
As
variedades
RB92579
e
RB99395
de
cana-de-açúcar
diferiram
estatisticamente, pelo teste F, em relação à porcentagem de calos embriogênicos
(p<0,005) e à qualidade dos calos embriogênicos (p<0,030), por outro lado, essas
variedades não diferiram estatisticamente em relação ao número de plantas regeneradas
(Tabela 1).
Apenas a regressão quadrática teve efeito significativo para a porcentagem de
calos embriogênicos (p<0,005). Por outro lado, as regressões linear e quadrática tiveram
efeitos altamente significativos tanto para a qualidade dos calos embriogênicos como
para o número de plantas regeneradas, com p<0,001 (Tabela 1).
Tabela 1. Resumo da análise de variância para a porcentagem de calos embriogênicos,
qualidade dos calos embriogênicos e número de plantas regeneradas.
Causa de variação
GL
Quadrados médios e (Probabilidades)
Nº de plantas
Porcentagem de CE
Qualidade dos CE
regeneradas
2963,7038 (p<0,005)
0,0578 (p<0,030)
64,4629 ns
1296,1115 (p<0,016)
0,2183 (p<0,001)
780,6049 (p<0,001)
924,6301 ns
0,3860 (p<0,001)
1608,4480 (p<0,001)
2963,7038 (p<0,005)
0,2580 (p<0,001)
733,3519 (p<0,001)
0,0008 ns
0,0107 ns
0,0148 ns
ns
ns
123,9515
0,0259
73,8333 ns
1031,9847 (p<0,005)
0,1129 (p<0,001)
375,3968 (p<0,001)
277,7783
0,0102
36,9398
Variedades (F1)
1
Concent. de carvão(F2) (3)
Reg. Linear
1
Reg. Quadrática
1
Desvio de regressão
1
Interação F1 x F2
3
Tratamentos
7
Resíduo
16
Total
23
CV (%)
22,22
NOTA: (ns) - não significativo: p>0,05.
7,76
28,20
A variedade RB99395 apresentou resultados melhores que a variedade RB92579
na porcentagem de calos embriogênicos e na qualidade dos calos embriogênicos (Figura
5AB). Embora a variedade RB99395 tenha apresentado melhores calos embriogênicos
do que a variedade RB92579, o número de plantas regeneradas não foi
significativamente influenciado por isso (Figura 5C). A habilidade para indução de
calos embriogênicos pode ser influenciada pelo genótipo (GANDONOU et al., 2005;
CIDADE et al., 2006; LAKSHMANAN, et al., 2006). Todavia, a maioria dos
protocolos estabelecidos tem induzido razoável nível de embriogênese somática em
várias cultivares de cana-de-açúcar (LEMOS, 2009).
80
Porcentagem de calos embriogênicos
Figura 5. Diferença estatística, de acordo com o teste F, entre as duas variedades de
cana-de-açúcar, cultivadas em diferentes concentrações de carvão ativado; A) – em
relação à porcentagem de calos embriogênicos (p<0,005); B) – em relação à
qualidade dos calos embriogênicos (p<0,030); C) – em relação ao número de plantas
regeneradas (não significativo).
100
a
75
b
50
25
0
RB92579
RB99395
Qualidade dos calos embriogênicos
A
4
3
2
a
b
1
0
RB92579
B
RB99395
Número de plantas regeneradas
45
30
a
a
15
0
C
RB92579
RB99395
Os resultados de porcentagem de calos embriogênicos, de qualidade de calos
embriogênicos e de número de plantas regeneradas das variedades RB92579 e
RB99395, em função das concentrações de carvão ativado utilizadas no processo de
81
maturação dos embriões somáticos, foram melhor explicados por equações de 2º grau
(Figura 6).
Porcentagem de calos embriogênicos
Figura 6. Análises de regressão mostrando os efeitos das concentrações de carvão
ativado sobre as variedades RB92579 e RB99395, no processo de maturação dos
embriões somáticos; A) – em relação à porcentagem de calos embriogênicos; B) –
em relação à qualidade dos calos embriogênicos; C) – em relação ao número de
plantas regeneradas.
100
75
50
y = 94,452500 - 51,852222x + 19,755556x2
R² = 1
25
0
0
0,75
1,5
Concentrações de carvão ativado (g L-1)
A
2,25
Número de plantas regeneradas
B
C
40
35
y = 38,066666 - 31,874074x + 9,827161x2
30
R2 = 1
25
20
15
10
5
0
0
0,75
1,5
Concentrações de carvão ativado (g L-1)
2,25
82
Neste estudo, os acréscimos do carvão ativado nos meios de cultivo, durante a
maturação dos embriões, provocaram redução no desenvolvimento e germinação dos
embriões somáticos, na fase clara, nas variedades RB92579 e RB99395 de cana-deaçúcar. Os tratamentos sem carvão ativado proporcionaram os melhores resultados para
as variáveis estudadas (Figura 6).
De uma maneira geral, os aumentos das concentrações de carvão ativado,
reduziram a porcentagem de calos embriogênicos, a qualidade dos calos embriogênicos
e o número de plantas regeneradas (Figura 6). Resultados diferentes foram relatados por
Macedo (2010) em culturas embriogênicas de cana-de-açúcar da variedade SP-803280,
onde na concentração de 1,5 g L-1 de carvão ativado a taxa de diferenciação de embriões
foi ótima. Essa variação de resultados entre os dois trabalhos pode ser atribuída,
novamente, à influência do genótipo.
De acordo com a figura 7, houve correlação alta e positiva entre a qualidade dos
calos embriogênicos e o número de plantas regeneradas, indicando que quanto melhor
foi a qualidade dos calos maior foi o número de plantas regeneradas na fase clara
(Figura 7).
Figura 7. Equação de 1º grau mostrando a correlação existente entre a qualidade dos
calos embriogênicos e o número de plantas regeneradas.
Número de plantas regeneradas
80
70
y = -3,944 + 18,486x
R² = 0,9788
60
50
40
30
20
10
0
0
1
2
3
Qualidade dos calos embriogênicos
4
83
CONCLUSÕES
A adição de carvão ativado ao meio de embriogênese reduz a porcentagem de
calos embriogênicos, a qualidade de calos embriogênicos e o número de plantas
regeneradas, na fase clara, das variedades RB92579 e RB99395 de cana-de-açúcar, não
sendo indicada o seu uso nessas variedades.
O carvão ativado estimulou a germinação precoce parcial dos embriões ainda no
escuro causando o aparecimento apenas das raízes sobre os calos.
O escurecimento dos explantes, devido a exsudação dos compostos fenólicos,
pode ser controlado com o reposicionamento frequente dos mesmos até a formação de
calos embriogênicos.
Há uma correlação alta e positiva entre a qualidade dos calos embriogênicos e o
número de plantas regeneradas das variedades RB92579 e RB99395 de cana-de-açúcar.
84
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