Incidência e caracterização molecular de badnavirus em banco de Germoplasma de Inhame (Dioscorea Spp.) no Brasil

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE ALAGOAS
CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS
PROGRAMA DE PÓS GRADUAÇÃO EM PROTEÇÃO DE
PLANTAS

JEAN PHELLIPE MARQUES DO NASCIMENTO

INCIDÊNCIA E CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE BADNAVIRUS EM
BANCOS DE GERMOPLASMA DE INHAME (Dioscorea spp.) NO BRASIL

Rio Largo
2014

JEAN PHELLIPE MARQUES DO NASCIMENTO

INCIDÊNCIA E CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE BADNAVIRUS EM BANCOS
DE GERMOPLASMA DE INHAME (Dioscorea spp.) NO BRASIL

Dissertação de Mestrado apresentada ao
Programa de Pós Graduação em Proteção de
Plantas do Centro de Ciências Agrárias da
Universidade Federal de Alagoas como
requisito parcial para obtenção do grau de
Mestre em Proteção de Plantas.
Orientador(a): Prof. Dra. Iraildes Pereira
Assunção

Rio Largo
2014

JEAN PHELLIPE MARQUES DO NASCIMENTO

INCIDÊNCIA E CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE BADNAVIRUS EM BANCOS
DE GERMOPLASMA DE INHAME (Dioscorea spp.) NO BRASIL

Dissertação

apresentada

Curso

Mestrado em Proteção de Plantas, do Centro
de Ciências Agrárias da Universidade Federal
de Alagoas. Aprovada pela seguinte Banca
Examinadora:

Prof. Dra. Iraildes Pereira Assunção - Universidade Federal de Alagoas (Orientadora)

Banca Examinadora:

Prof. Dr. Gaus Silvestre de Andrade Lima – Universidade Federal de Alagoas
(Examinador)

Prof. Dr. Roberto Ramos Sobrinho – Bolsista PRODOC/CAPES/UFAL (Examinador)

Rio Largo
2014

Dedico este trabalho aos meus pais Mauro Marques do
Nascimento e Elizabete Marques da Silva, pelo amor
incondicional e por me ensinar a caminhar com dignidade,
caráter e sempre estarem me apoiando na busca dos meus
objetivos. Dedico também à minha namorada Murielle
Iasminne pois têm sido durante todo este tempo uma
pessoa mais que especial em minha vida.

AGRADECIMENTOS

A Deus, por me proporcionar a oportunidade de cumprir os meus objetivos, e pela condição
de permanecer até o final;
À minha namorada Murielle Iasminne de Oliveira Silva, pois esteve comigo em mais um
momento importante de minha vida, me apoiando, pelo seu carinho, compreensão e grande
amor principalmente durante as dificuldades;
Ao meu irmão Edgar Marques do Nascimento, apoio em todos os momentos;
A Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela concessão
de bolsa, essencial para a completa realização do curso e deste trabalho;
A Universidade Federal de Alagoas (UFAL), por meio do Programa de Pós Graduação em
Proteção de Plantas do Centro de Ciências Agrárias (CECA);
A minha orientadora Prof (a). Dr. Iraildes Assunção e ao Prof. Dr. Gaus Andrade, pela
oportunidade, confiança, amizade, paciência e por todos os ensinamentos durante este
período;
Ao Dr. Roberto Ramos Sobrinho pela assistência nas análises dos dados, e o ensinamento
durante este momento;
A Dra. Sarah Cavalcanti pela paciência e assistência durante a escrita da dissertação;
A todos os Professores que compõem o curso de mestrado em Proteção de Plantas da
Universidade Federal de Alagoas, pelos ensinamentos;
Àos amigos Anderson, Anilde, Lourdes Regina, Rosângela, Nelson, Izael, Fred, Emerson e
Andrezo pela amizade, companheirismo, momentos de descontração e diversão;
Aos amigos do Laboratório de Fitopatologia Molecular CECA-UFAL, Jane Cléa,
Jaqueline Figueiredo, Edlene, Aline, Mayra Ferro, Lucas Jobim, Lucas Fonseca, Dra.
Joyce Lima, Renato Nascimento e Dra. Márcia Carine pelo apoio, amizade e auxílio
durante a realização deste trabalho;
Agradeço a todos os pesquisadores responsáveis pelos Bancos de germoplasmas que
cederam as amostras de inhame utilizadas neste trabalho.
A todos que de alguma forma contribuíram para a realização deste trabalho, afinal
ninguém é forte sozinho!

RESUMO GERAL
A cultura do inhame desempenha grande importância na alimentação em regiões da África,
onde são observados altos índices de produção. No Brasil, a região Nordeste destaca-se
como principal produtora, onde serve como fonte de alimento e auxília na geração de
emprego e renda de muitas famílias. Vários problemas fitossanitários, afetam a cultura do
inhame, dentre os quais podemos destacar as viroses. Badnavírus causam doenças em
culturas de grande importância econômica, tal como observado em banana e cana de
açúcar, e infecções por estes virus têm sido observadas no inhame em diversas regiões
produtoras. Em todo o mundo são relatadas pelo ICTV duas espécies de badnavirus
causando infecções em inhame, o Dioscorea bacilliform alata virus (DBALV) e o
Dioscorea bacilliform sansibarensis virus (DBSNV). O gênero Badnavirus (família
Caulimoviridae) engloba vírus de plantas com genoma de DNA circular de fita dupla
(dsDNA), replicam por meio de um intermediário de RNA, e possuem a capacidade de
integração do seu DNA no genoma do hospedeiro. Este fato é importante pois a descoberta de
sequências virais presentes no genoma de plantas de inhame alerta para a maior cautela no
que diz respeito ao intercâmbio de germoplasma, evitando assim a disseminação viral. As
informações acerca de badnavirus em inhame no Brasil ainda são escassas, portanto são de
extrema importância estudos que venham contribuir para uma melhor compreensão da
ocorrência e distribução destes vírus no país. Sendo assim, o objetivo do presente trabalho
foi determinar a incidência e caracterizar molecularmente badnavírus em bancos de
germoplasma de inhame no Brasil. As amostras de inhame foram obtidas a partir dos
bancos de germoplasma da Escola Superior de Agricultura Luiz (ESALQ/USP),
Universidade Federal de Viçosa (UFV) e Universidade Federal do Recôncavo Baiano
(UFRB). A incidência media de badnavírus nas amostras de inhame dos bancos de
germoplasmas avaliados foi de 75,3%. As análises de comparações pareadas e filogenética
de 42 sequências de nucleotídeos da região da RT/RNAse/H revelaram que as duas espécies
de badnavírus atualmente aceitas pelo ICTV foram detectadas nos acessos avaliados. Além
das espécies espissomais foram encontradas também sequências endógenas que
apresentaram porcentagem de identidade de nucleotídeos variando entre 89% a 100% com
endogenous Dioscorea bacilliform virus (eDBV) dos grupos 9 e 12. Os resultados aqui
obtidos corroboram com a hipótese de ampla disseminação do DBALV em áreas produtoras
de inhame e registra o primeiro relato do DBSNV infectando inhame no Brasil.
Palavras-chave: Badnavirus, inhame, banco de germoplasma, sequências endógenas.

GENERAL ABSTRACT

The culture of yam plays great importance in power in regions of Africa where high
production rates are observed. In Brazil, the Northeast stands out as the main producer, which
serves as a food source and helps in generating employment and income for many families.
Several disease problems, affect the culture of yam, among which we can highlight the
viruses. Badnavirus cause diseases in crops of economic importance, such as observed in
banana and sugarcane, and infections with these viruses have been observed in yam
production in various regions. Worldwide are reported by ICTV two species badnavirus
causing infections in yams, Dioscorea alata bacilliform virus (DBALV) and Dioscorea
bacilliform virus sansibarensis (DBSNV). The Badnavirus genus (family Caulimoviridae)
comprises plant genome to double-stranded circular DNA (dsDNA), replicate through an
RNA intermediate, and have the capacity to integrate their DNA into the host genome virus.
This fact is important since the discovery of viral sequences present in the genome taro alert
to the utmost caution as regards the exchange of germplasm, thus preventing viral spread. The
information about badnavirus in yam in Brazil are still scarce, so are extremely important
studies that may contribute to a better understanding of the occurrence and distribution of
these viruses in the country. Thus, the objective of this study was to determine the incidence
and molecularly characterize badnavirus in yam germplasm banks in Brazil. The yam samples
were obtained from the germplasm collections of the Escola de Agriculture Luiz
(ESALQ/USP), Universidade Federal de Viçosa (UFV) and Universidade Federal do
Reconcavo Baiano (UFRB). The average incidence of Badnavirus in samples of yam
germplasm banks evaluated was 75.3 %. Analyses of paired comparisons and phylogenetic
sequences of 42 nucleotides of the RT/RNase/H region revealed that the two species currently
accepted by ICTV Badnavirus were detected in the evaluated accessions. Beyond espissomais
species were also found endogenous sequences that showed the percentage of nucleotide
identity ranging from 89% to 100% with endogenous Dioscorea bacilliform virus (eDBV)
groups 9 and 12. The findings agree with the hypothesis of widespread dissemination of
DBALV yam -producing areas and records the first report of DBSNV infecting yam in Brazil.
Key Word: Badnavirus, yam, Germplasm bank, Endogenous sequences.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1. (A) Representação esquemática da organização genômica de Commelina yellow
mottle virus (CoYMV) membro tipo do gênero Badnavirus. O círculo completo representa
o genoma de DNA de fita dupla. As setas largas indicam a posição das ORFs 1, 2 e 3. (B)
Representação linear do mapa genômico de badnavírus mostrando a identificação dos
domínios: domínios de movimento (M), motivo de ligação ao RNA (BR), região
conservada de cisteína (CYS), aspartato protease (PR), transcriptase reversa (RT),
Ribonuclease H (RH) (BRIDDON et al., 1999).....................................................................18

Figura 2. Matriz bidimensional representando a porcentagem de identidade de
comparações pareadas de sequências nucleotídicas da região RT/RNase/H dos isolados
obtidos aqui com espécies de badnavirus disponíveis no GenBank...................................28

Figura 3. Árvore filogenética de Máxima Verossimilhança baseada em sequências da
região RT/RNase/H de isolados de Badnavirus que infectam inhame obtidos neste
trabalho e outras espécies disponíveis no GenBank. O Rice tungro bacilliform virus
(RTBV), gênero Tungrovirus, foi utilizado como outgroup..................................................30

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Espécies, acessos e locais de procedência das amostras de inhame utilizadas
neste estudo..............................................................................................................................21

Tabela 2. Lista dos badnavirus utilizados para as comparações de sequências e análise
filogenética, com seus respectivos acrônimos e números de acesso no GenBank.............23

Tabela 3. Incidência de Badnavirus em amostras de inhame dos bancos de germoplasma
no Brasil...................................................................................................................................25

Tabela 4. Isolados utilizados nas análises comparações pareadas e filogenética..............26

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÂO......................................................................................................10
1.1 Aspectos gerais da cultura do inhame...................................................................10
1.2 Família Caulimoviridae................... ................................................................... .15
1.3 Gênero Badnavirus ...............................................................................................17
1.4 Banco de germoplasma..........................................................................................19
2. MATERIAL E MÉTODOS..................................................................................21
2.1 Obtenção das Amostras.........................................................................................21
2.2 Extração de DNA, amplificação da região RT/RNase/H e sequenciamento.........21
2.3 Comparação de sequências e análises filogenética e de recombinação...............22
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO..........................................................................25
3.1 Amplificação da região RT/RNase/H e sequenciamento......................................25
3.2 Comparação de sequências e análises filogenética e de recombinação.................27
4. CONCLUSÕES......................................................................................................34
5. REFERÊNCIAS............................................................................................35

1 INTRODUÇÃO

1.1 Aspectos gerais da cultura do inhame

O inhame (Dioscorea spp.) é uma planta monocotiledônea, herbácea, trepadeira, de
hábito anual ou perene que pertence à família Dioscoreaceae. É constituída de caules delgados
a robustos, formando muitas vezes um emaranhado sobre outras plantas, podendo também
ocorrer espécies eretas e herbáceas (PEDRALLI, 2002). A cultura do inhame desponta hoje
como a quarta cultura de tubérculos e raízes mais importante do mundo, ficando atrás somente
da cultura da batata (Solanum tuberosum L.), mandioca (Manihot esculenta Crantz) e batatadoce (Ipomoea batatas L.) (FAO, 2012).
O gênero Dioscorea teve uma ampla dispersão mundial no final do período Cretáceo,
de onde evoluiu para diferentes direções no Novo e no Velho Mundo, o que culminou na
origem de espécies distintas. Muitas variedades de inhame foram introduzidas na América do
Sul por intermédio dos portugueses e espanhóis no século XVI durante a colonização
(LEBOT, 2009; SIQUEIRA, 2009). Hoje o inhame é cultivado principalmente na África, mas
também está presente na Ásia, partes da América do Sul, bem como Caribe e ilhas do Pacífico
Sul (ASIEDU; SARTIE, 2010).
O inhame constitui um dos principais alimentos em regiões tropicais (MAFRA, 1986)
e a produção mundial atingiu no ano de 2012 cerca de 57,3 milhões de toneladas (FAO,
2012). A Nigéria destaca-se como o maior produtor (37,0 milhões de t), seguida por Gana (6,6
milhões de t), Costa do Marfim (5,6 milhões de t) e Benin (2,3 milhões de t), enquanto o
Brasil ocupa a décima segunda posição (244,1 mil t). Na América Latina, o Brasil é o segundo
maior produtor dessa cultura, com uma área colhida de 25 mil ha, ficando atrás apenas da
Colômbia (FAO, 2012). A região Nordeste é responsável pela maior produção de inhame no
país, com 38,2 mil t, onde os estados da Paraíba, Pernambuco, Alagoas, Bahia e Maranhão
destacam-se como os principais produtores dessa Dioscoreaceae na região (IBGE, 2008).
Entre as 600 espécies do gênero Dioscorea, estima-se que ocorram no Brasil entre 150
e 200, sendo a maioria pouco estudada (PEDRALLI, 2002). Apenas 10 são cultivadas, por
produzirem túberas comestíveis: Dioscorea alata L., D. cayenensis Lam., D. rotundata Poir.,
D. esculenta (Lour) Burk, D. bulbifera L, D. numularia Lam, D. pentaphylla L, D. hispida
Dennst, D.trifida L. e D. dumetorum (Kunth) Pax. (ASIEDU; SARTIE, 2010).

O inhame é um produto agrícola de alto valor econômico para os mercados interno e
externo, que movimenta e beneficia a economia das zonas produtoras. A importância
alimentar do inhame decorre do seu alto valor nutritivo e energético (SANTOS; MACÊDO,
2002), pois é rico em carboidratos e vitaminas do complexo B (MOURA, 2005), vitamina A,
ácido ascórbico e grãos de amido. Grande parte da produção de inhame é destinada ao
mercado interno e a outra parte é exportada, principalmente para a Europa (SANTOS, 2002).
Associado a isso, está o crescimento das exportações do produto, o que aumenta as
expectativas e o interesse dos agricultores no cultivo dessa hortaliça, principalmente em
função dos melhores preços oferecidos pelos exportadores. No entanto, para que haja retorno
econômico da atividade, faz-se necessário estruturar a cadeia produtiva, promover melhoria
dos sistemas de produção, da qualidade do produto, oferta constante e preços competitivos,
fatores estes que estão associados aos conhecimentos técnicos e tecnologias disponíveis para a
condução adequada da cultura (SANTOS, 2002).
O inhame é propagado por túberas-semente ou seções da túbera, pois o uso de
sementes verdadeiras como propágulos é restrita a estações de pesquisa, principalmente em
programas de melhoramento da cultura (ASIEDU; SARTIE, 2010). Os agricultores obtêm as
túberas-semente pela seleção de túberas pequenas (300 a 500g) de cada colheita (muitas vezes
estas são aquelas produzidas por plantas doentes), usando túberas da segunda colheita de
maturação precoce, que produzem múltiplas túberas, ou pelo corte da túbera em pedaços
(AIGHEWI; ASIEDU; AKORODA, 2003).
Embora seja considerada, na maioria dos casos, uma cultura de subsistência, o inhame
tem grande importância sócio-econômica no cenário da agricultura familiar no Nordeste do
Brasil, com um significativo potencial de desenvolvimento, contribuindo para alimentação
humana, beneficiando populações carentes, além de ser fonte de renda para pequenos e
médios produtores (SANTOS; MACÊDO, 2002). No entanto, sua produtividade ainda
continua baixa, em torno de 11.000 kg/ha decorrente do manejo inadequado da cultura, do uso
de túberas-semente de inferior qualidade agronômica, principalmente em função da
indisponibilidade de material de melhor qualidade (SANTOS, 1996; SANTOS et al., 2007).
No mercado brasileiro têm destaque duas cultivares de inhame: Da Costa
(D.cayennensis), é recomendada para o plantio comercial e é a única exportada, e São Tomé
(D. alata), plantada em menor escala e menos cultivada na região Nordeste. A cultivar Da
Costa é a mais plantada, produzindo túberas com elevado valor econômico (MOURA, 2005;
SANTOS et al., 2007).

A cultivar Da Costa é originária do Oeste da África e foi introduzida nas Américas
pelos escravos. Apresenta túberas cilíndricas e de tamanho variável, geralmente de 1 a 10 kg
(SANTOS, 2002). É bastante plantada em Pernambuco e Paraíba, podendo chegar a 40 t/ha.
Há pouco interesse de comercialização no mercado de São Paulo, embora com plena
aceitação no mercado nordestino e internacional. Há ocorrência de cultivos comerciais no
Agreste e Sertão nordestinos, sob regime de irrigação, com destino ao mercado externo
(SIQUEIRA, 2009), sendo os Estados Unidos, Reino Unido, Países Baixos, Canadá e França
os principais importadores (MESQUITA, 2002).
A cultivar São Tomé é originária do continente Asiático, possui túberas cilíndricas,
com polpa normalmente branca (SANTOS, 1996; SIQUEIRA, 2009). Esta cultivar é pouco
cultivada no Nordeste devido a alta susceptibilidade a doenças fúngicas. Os Estados de São
Paulo, Minas Gerais, Rio de Janeiro e Espírito Santo são grandes proutores de São Tomé,
onde é ainda conhecida por cará, e utilizado para consumo direto e industrializado (MOURA,
2006).
O inhame é afetado por uma variedade de pragas e doenças nas fases de pré e póscolheita. Doenças e pragas de inhame foram relatadas na maioria das áreas de plantio e
constituem um dos principais entraves para a produção, armazenamento e exportação
(MANTELL, 1993).
Apesar de o inhame ser plenamente adaptado às condições edafo-climáticas do
Nordeste brasileiro e ser uma cultura de fácil manejo (MAFRA, 1986), as doenças são
limitantes à produção, pois podem reduzir a produtividade e o valor unitário das túberas
destinadas ao comércio interno e à exportação (MOURA, 1997; SANTOS, 1996).
A queima das folhas, conhecida também como pinta preta, causada por Curvularia
eragrostidis (Henn.) J.A. Mey. é responsável por prejuízos elevados à cultura do inhame no
Nordeste brasileiro, chegando a reduzir em 35 a 40% o peso das túberas comerciais
(EMATER/IPA, 1985; SANTOS, 2002). Quando incide sobre plantas jovens, que possuem
folhas em desenvolvimento, o crescimento da hospedeira é afetado e a presença de folhas
necrosadas e retorcidas constituem quadro típico de crestamento com nanismo. As perdas,
nesses casos, são sempre elevadas. O sintoma secundário ou reflexo é o pequeno tamanho das
túberas comerciais e túberas sementes (MOURA, 2005).
A

antracnose,

causada

pelo

fungo

Glomerella

cingulata

(Colletotrichum

gloeosporioides Penz.), afeta principalmente a espécie D. alata, causando sintomas de
manchas foliares de coloração marrom avermelhada nas folhas e caule, que podem coalescer

formando grandes áreas necrosadas e, consequentemente, reduzir de forma expressiva a
produção de túberas (COELHO, 2002).
As podridões causadas por Penicillium sclerotigenum (Yamamoto) e Rhizopus oryzae
(Went e Prinsen Geerl) afetam túberas em diferentes situações (MOURA, 1987, 2002). A
podridão-verde (P. sclerotigenum) ocorre durante armazenamento e transporte de túberas de
D. cayennensis e D. alata, sendo a segunda mais resistente (OLIVEIRA et al., 2006). O fungo
penetra sempre através de ferimentos (MOURA et al., 1976). A doença é favorecida pelas
condições de armazenamento e as perdas, muitas vezes, são elevadas nas exportações. A
podridão-aquosa (Rhizopus oryzae) ocorre quando túberas-comerciais no solo estão
submetidas a ambiente saturado de água, principalmente quando a colheita é retardada,
formando-se túberas muito maduras, em épocas chuvosas. Nessas circunstâncias as perdas são
sempre altas (MOURA, 1987).
A cultura também pode ser afetada pela rizoctoniose causada por Rhizoctonia solani
(Kühn), que foi relatada pela primeira vez infectando caule de plantas de inhame no Brasil por
Silva et al. (2000).
Um importante problema fitossanitário da cultura do inhame no Brasil é a doença
casca preta causada pelos nematóides Scutellonema bradys (Steiner e LeHew) Andrássy ou
Pratylenchus coffeae (Zimmermann) Filipjev e Stekhovem, que incide sobre túberascomerciais e túberas-sementes. A importância desta doença é justificada pela constante
disseminação do patógeno, proporcionada pela permanente comercialização de túberassementes contaminadas, e principalmente pelas dificuldades inerentes ao controle (SANTOS,
2007). As túberas sementes também têm alto índice de infestação por Meloidogyne incognita
(Kofoid e White) Chitwood, M. javanica (Treub) Chitwood e M. arenaria (Neal) Chitwood,
nematóides das galhas de raízes que são responsáveis pela meloidoginose, conhecida
vulgarmente por bolba do inhame. No comércio interno, túberas parasitadas por Meloidogyne
spp. têm o valor unitário reduzido em 50%, em média, e são excluídas nas seleções para
exportação. Infestações múltiplas envolvendo um nematóide causador da casca preta e outro
da meloidoginose são frequentes (MOURA, 2002; SANTOS, 2007).
As viroses são de particular importância uma vez que este é comercialmente
propagado vegetativamente por meio de pequenas túberas ou pedaços de túberas, resultando
no acúmulo e perpetuação dos vírus (KENYON et al., 2001; SEAL; MULLER, 2007). A
propagação vegetativa, através de túberas-sementes, facilita a sobrevivência, disseminação e o
acúmulo de agentes virais em cultivos sucessivos. Como consequência do acúmulo de vírus

no material propagativo, as plantas perdem o vigor e produzem túberas de qualidade reduzida
(AMUSA et al., 2003).
Doenças virais no inhame foram inicialmente identificadas em Serra Leoa e em Porto
Rico em 1936 (COOK, 1978). Descrições subsequentes de infecção por vírus ocorreram em
1957 (MIEGE, 1957) e em 1961 (ROBERTSON, 1961). Sintomas de mosaico moderado a
grave foram posteriormente relatados em D. rotundata na Nigéria (TERRY, 1976). Vírus têm
sido relatados infectando diferentes espécies de inhame em todas as regiões em que a cultura
foi estabelecida (ALEMAN-VERDAGUER et al., 1997; GOUDOU-URBINO et al., 1996;
HUGHES, 1997; ODU et al., 2004; PHILLIPS et al., 1999; SEAL; MULLER, 2007;
THOUVENEL; FAUQUET, 1979).
Os sintomas associados a doenças causadas por vírus variam dependendo do agente
envolvido, mas em geral incluem: clorose foliar severa, mosaico, cordão-de-sapato, clorose
internerval, nanismo, distorção foliar, dentre outros. Estes sintomas, que afetam
principalmente a folhagem, levam a uma redução na capacidade fotossíntética da planta
infectada com efeitos deletérios sobre a produção, qualidade das túberas e em algumas
situações causam a morte das plantas (THOUVENEL; DUMONT, 1988).
Diversas viroses têm sido descritas na cultura por membros dos gêneros Potyvirus,
Badnavirus, Cucumovirus e Potexvirus. Destacam-se pela importância e distribuição
geográfica os vírus dos gêneros Potyvirus (família Potyviridae) e Badnavirus (família
Caulimoviridae) (ODU et al., 2006; PHILLIPS et al., 1999; SEAL; MULLER, 2007; YANG
et al., 2003). Duas espécies do gênero Potyvirus são bem caracterizadas: o Yam mosaic virus
(YMV) e o Yam mild mosaic virus (YMMV). O primeiro foi descrito originalmente na Costa
do Marfim (MOURA, 2006), e é considerado o vírus de maior importância econômica para
esta cultura (MUNFORD; SEAL, 1997).
O primeiro badnavírus caracterizado em inhame foi um isolado infectando D. alata
obtido na Nigéria, designado como Dioscorea alata bacilliform virus (DaBV) (PHILLIPS et
al., 1999). Posteriormente, SEAL; MULLER (2007) em estudos sobre a diversidade
molecular de Badnavirus que infectam inhame nas ilhas sul do Pacífico, identificaram uma
nova espécie: Dioscorea sansibarensis bacilliform virus (ENI, et al., 2008; KENYON et al.,
2008; SEAL; MULLER, 2007).
Atualmente apenas duas espécies de badnavírus que infectam Dioscorea spp. são
reconhecidas pelo ICTV: Dioscorea bacilliform AL virus (DBALV) e Dioscorea bacilliform
SN virus (DBSNV), provenientes de D. alata e D. sansibarensis, respectivamente
(GEERING; HULL, 2012). No entanto, estudos realizados na África e Sul do Pacífico

sugerem alta diversidade de Badnavirus em inhame e a possível presença de até doze espécies
(ENI et al., 2008). O DBALV causa distorção foliar severa e é o badnavírus mais amplamente
distribuído, sendo encontrado em infecções simples e/ou mistas com potyvírus (PIORIBEIRO et. al., 2005; YANG et al., 2003).

1.2 Família Caulimoviridae
A família Caulimoviridae engloba vírus de plantas que possuem o genoma formado
por DNA de fita dupla (dsDNA), com tamanho de 7,2 a 9,2 Kb (FAUQUET et al., 2005;
GEERING; HULL, 2012), são classificados como pararetrovírus (vírus de DNA que utilizam
a transcriptase reversa no ciclo de replicação) e que são diferentes dos retrovírus por
possuírem seu genoma de DNA e por se integrarem de forma irregular dentro do genoma do
hospedeiro não sendo necessário a integração para a replicação (TEMIN, 1985). Os vírus
dessa família apresentam suas partículas não envelopadas e podem ser de morfologia
isométrica ou baciliforme, onde as partículas isométricas apresentam 50-52 nm de diâmetro,
enquanto as partículas baciliformes (30 nm de diâmetro e 130 -150 nm de comprimento)
(GEERING; HULL, 2012). O genoma possui uma região intergênica poli A, que em alguns
casos pode estar ausente, e também possui descontinuidades de fita simples ou gaps em sítios
específicos localizados em ambas as fitas (HARPER et al., 2002). O genoma dos
caulimovírus varia quanto a quantidade de ORFs (Open Reading Frame - sequências de
leitura aberta), podendo ser encontrada de uma a oito, sendo a sua organização genômica uma
das principais características utilizadas para distinguir os diferentes gêneros incluídos nessa
família.
Os critérios adotados para divisão dos gêneros pertencentes a esta família estão
relacionados com o inseto vetor, gama de hospedeiro, organização do genoma e
relacionamento filogenético. De acordo com o International Committee on Taxonomy of
Viruses (ICTV), são reconhecidos sete gêneros pertencendo a família Caulimoviridae;
Badnavirus, Caulimovirus, Cavemovirus, Petuvirus, Solendovirus, Soymovirus e Tungrovirus.
Membros desta família são encontrados amplamente distribuídos geograficamente, e as
espécies dos gêneros Tungrovirus e Badnavirus em sua grande maioria estão localizadas nas
regiões tropicais e subtropicais (GEERING; HULL, 2012).
Plantas

Angiospermas

(Monocotiledôneas

Dicotiledôneas)

constituem

hospedeiros naturais de espécies da família Caulimoviridae, que a depender do gênero, pode
ter sua transmissão natural por meio do inseto vetor (Aleyrodidae, Aphididae, Cicadellidae e

Pseudococcidae: ordem Hemiptera) ou por meio do contato entre plantas hospedeiras,
transmissão por sementes ou ainda através do pólen e por propagação vegetativa. Transmissão
via técnicas de inoculação mecânica e enxertia também podem ocorrer (FAUQUET et al.,
2005).
A variedade de sintomas causados por badnavírus é grande, destacando-se mosaico,
clareamento de nervuras, clorose entre nervuras e estrias, todos eles relacionados à espécie
viral em questão, ao hospedeiro e também às condições climáticas (GEERING; HULL, 2012).
A replicação dos caulimovírus, no seu hospedeiro inicia com a transcrição do RNA a
partir do DNA viral no núcleo seguido de transcrição reversa do RNA formado para gerar
dsDNA (DNA fita dupla) no citoplasma. No genoma desses vírus há a presença de uma
sequência complementar ao tRNAMet da planta, ao qual atribui a função de ser um sítio de
iniciação da replicação do DNA, e este sítio pode estar localizado dentro ou adjacente à região
intergênica (região não-codificante) e é geralmente conhecido como nucleotídeo 1 (DE
KOCHKO et al.,1998).
Diferente do observado nos retrovírus, os pararetrovírus vegetais não se integram ao
genoma do hospedeiro para se replicar, não sendo necessário então o genoma destes vírus
codificar a proteína integrase. Sequências virais podem estar presentes de maneira dispersa no
genoma de plantas hospedeiras, sendo estas originárias de uma infecção viral anterior, e são
conhecidas como sequencias endógenas de pararetrovirus (Endogenous Pararetroviral
Sequences - EPRVs), além do fato de ser uma classe abundante de sequências virais
endógenas em diferentes espécies de plantas (GAYRAL; ISKRA-CARUANA, 2009).
EPRVs de membros da família Caulimoviridae cada vez mais tem sido identificadas
estando presente no genoma de muitas espécies de plantas hospedeiras para estes vírus
(GEERING; SCHARASCHKIN; TEYCHENEY, 2010). Estas EPRVs caracterizam-se por
apresentar um padrão de arranjo similar com repetições em tandem, duplicações internas,
fragmentações e inversão do genoma viral. Estas sequências de pararetrovírus podem resultar
em genomas virais parciais e não funcionais, mas também podem ser ativadas ocasionando
liberação do genoma viral funcional que causará infecção no hospedeiro (GAYRAL; ISKRACARUANA, 2009).

Alguns estudos apontam a capacidade destas EPRVs iniciarem um evento de infecção
sob determinadas condições tais como cultura de tecidos e outros fatores de estresse (DAHAL
et al., 2000; DALLOT et al., 2001), como observado em Banana streak OL virus (BSOLV)
(NDOWORA et al., 1999), Banana streak GF virus (BSGFV) (GAYRAL; ISKRACARUANA, 2009), Petunia vein clearing virus (PVCV) (STAGINNUS; RICHERTPÖGGELER, 2006) e Tobacco vein clearing virus (TVCV).

1.3 Gênero Badnavirus

De todos os membros da família Caulimoviridae, o gênero Badnavirus apresenta-se
como o mais numeroso e caracteriza-se por apresentar partículas baciliformes com 95-130 nm
de comprimento e 24-35 nm de diâmetro (FAUQUET et al., 2005), seu genoma contém uma
única molécula dsDNA com tamanho aproximado de 7200-7600 pb, formando um círculo
aberto que é interrompido por descontinuidades sítio-específicas e que pode conter uma
região intergênica poli A (MEDBERRY; LOCKHART; OLSZEWSKI, 1990). Dos gêneros
de vírus que causam doenças em plantas, Badnavirus é o segundo maior dentre os que
possuem genoma composto por DNA, superado apenas pelos Begomovirus (BOUHIDA;
LOCKHART; OLSZEWSKI, 1993; HAGEN et al., 1993).
Commelina yellow mottle vírus (CoYMV) é a espécie tipo deste gênero, sendo obtida
de Commelina difusa Burm. F., em Guadaloupe (MIGLIORI, 1978). Os badnavírus codificam
para três principais ORFs (Figura 1A), e contém geralmente três descontinuidades (gaps) em
sítios específicos (BOUHIDA; LOCKHART; OLSZEWSKI, 1993; HAGEN et al., 1993;
HARPER; HULL, 1998). As ORFs I e II permanecem com suas funções desconhecidas, no
entanto, sabe-se que a proteína da ORF I do CoYMV está relacionada com vírions imaturos,
enquanto que a ORF II é relacionada tanto a vírions imaturos como maduros (CHENG;
YANG; YEH, 1996). A ORF3 codifica uma poliproteína, e esta contém domínios funcionais
rico em cisteína (CYS), motivo de ligação ao RNA (RB), aspartato protease (PR), e replicase
viral [transcriptase reversa, (RT) e ribonuclease, (RH)] (Figura 1B), todos idênticos para os
membros da família Caulimoviridae (MEDBERRY; LOCKHART; OLSZEWSKI, 1990;
LACO; BEACHY, 1994; HARPER; HULL, 1998).

Figura 1. (A) Representação esquemática da organização genômica de Commelina yellow mottle virus
(CoYMV) membro tipo do gênero Badnavirus. O círculo completo representa o genoma de DNA de fita dupla.
As setas largas indicam a posição das ORFs 1, 2 e 3. (B) Representação linear do mapa genômico de badnavírus
mostrando a identificação dos domínios: domínios de movimento (M), motivo de ligação ao RNA (BR), região
conservada de cisteína (CYS), aspartato protease (PR), transcriptase reversa (RT), Ribonuclease H (RH)
(BRIDDON et al., 1999).

Badnavirus são relatados em uma ampla gama de culturas hospedeiras, muitas das
quais economicamente importantes tais como o arroz (Oryza sativa L.) (OMURA et al.,
1983), a cana-de-açúcar (Saccharum officinarum L.) (LOCKHART; AUTREY, 1988), banana
(Musa spp.) (LOCKHART; OLSZEWKI, 1993), cacau (Theobroma cacao L.) (BRUNT et al.,
1996), citros (AHLAWAT et al., 1996), pimenta (LOCKHART et al, 1997), inhame
(Dioscorea spp.) (PHILLIPS et al., 1999) e o taro (Colocasia esculenta (L.) Schott.) (YANG
et al., 2003). O vetor responsável pela transmissão de espécies do gênero Badnavirus são
cochonilhas Planococcus citri (Hemiptera: Pseudococcidae) e a detecção do vírus pode
ocorrer em plantas exibindo sintomas ou em plantas assintomáticas (GAUHL; PASBERGGAUHL; HUGHES, 1997).
A identificação de badnavírus é feita por meio de amplificação parcial do genoma
utilizando a técnica de PCR (“Polymerase Chain Reaction” = Reação em cadeia da
Polimerase), sendo que esta técnica é limitada, pois não é capaz de distinguir entre sequências
integradas ao genoma e cópias epissomais dos vírus na planta hospedeira (BOUSALEM et al.,
2009).

Uma característica comum para diferentes badnavírus é a grande variabilidade
presente no seu genoma. Diante disso, a maioria dos pares de primers para PCR utilizados
para sua detecção foram desenhados a partir de três regiões conservadas que estão presentes
na ORF III (MEDBERRY; LOCKHART; OLSZEWSKI, 1990), das quais representam o
domínio tRNAMet e as regiões da RNase H e RT (LOCKHART; OLSZEWSKI, 1993;
GEERING et al., 2000). A alta variabilidade genética apresentada por badnavírus, bem como
a descoberta da integração de Banana streak virus (BSV) no genoma da planta, demonstra
que ainda há muitas limitações e dificuldades no que diz respeito a testes confiáveis de
diagnóstico, o que acarreta em dificuldades para o intercâmbio internacional de germoplasma.
A integração de partes do genoma de BSV em espécies de Musa foi primeiramente apontado
por Lafleur; Lockhart e Olszewski (1996) através de hibridização, e demonstrado
adicionalmente por técnicas moleculares e citogenéticas por Harper et al. (1999). Geering et
al. (2000) sugerem que sequências integradas de BSV podem estar ligadas ao genoma A ou B
de Musa e que a distribuição dos integrantes de BSV podem estar restritos a determinadas
espécies do hospedeiro, pois uma infecção em banana pode ser originada a partir de
sequências integradas de badnavírus (NDOWORA et al., 1999).

1.4 Bancos de germoplasma

Dentro de uma espécie é possível observar a presença de variações que podem ser
decorrentes de ações do ambiente, ou então devido a diferenças genéticas. Para estudos que
envolvem melhoramento de plantas, a variação genética constitui um componente de extrema
importância (BESPALHOK et al., 2007).
Os genótipos de uma espécie são responsáveis por fornecera fonte de variabilidade
disponível para o melhoramento de genético de plantas, e pode ser definido como um
germoplasma (RONZELLI-JUNIOR, 1996). O local onde os germoplasmas estão
armazenados são os bancos de germoplasmas (BG).
Bancos de germoplasma podem ser definidos como os locais que possuem as
condições necessárias para a conservação e preservação dos recursos genéticos de uma
determinada espécie vegetal (FAO, 2013). Suas atividades envolvem a aquisição de material
genético (intercâmbio, coleta, criação e doação), regeneração e multiplicação dos materiais
genéticos, caracterização e documentação dos acessos, conservação e monitoramento das
coleções, além da distribuição de material (MINISTÉRIO DA AGRICULTURA, 2014).

Segundo Martin (2002) os BGs tem como objetivo preservar a diversidade dos
recursos genéticos das espécies cultivadas e suas espécies relacionadas, bem como corrigir a
uniformidade gerada por práticas de melhoramento, que tem levado à redução na base
genética das plantas cultivadas, tornando-as mais expostas frente ao ataque de patógenos para
o qual não possuem resistência.
A depender de sua função, é possível distinguir dois tipos de BG: os bancos base e os
bancos ativos. Bancos base objetivam a preservação dos recursos (coleção de base) por um
longo período de tempo (tempo superior a 50 anos), enquanto bancos ativos tem por objetivo
reunir e intercambiar material, regenerar, caracterizar e conservar os recursos fitogenéticos,
visando a disponibilidade de germoplasma e informações de qualidade para fitomelhoradores
e/ou outros usuários (MINISTÉRIO DA AGRICULTURA, 2014). Bancos de germoplasma
para as mais diversas culturas de importância econômica estão disponíveis em todo o mundo,
e nele podem ser encontradas informações que auxiliam pesquisadores e produtores.
Para a cultura do inhame o Instituto Internacional de Agricultura Tropical (IITA)
localizado na Nigéria, e responsável por pesquisas direcionadas ao inhame, possui a maior
coleção de germoplasma de Dioscorea spp. no mundo, onde possui mais de 3000 acessos, dos
quais muitos oriundos da própria região. A coleção possui acessos de 8 espécies: D. rotundata
(67%), D. alata (25%), D. dumetorum (1.6%), D. cayenensis (2%), D. bulbifera (2%), D.
mangenotiana (0.25%), D. esculenta (0.7%) e D. praehensilis (0.3%) (IITA, 2010). Devido à
grande importância de plantas da família Dioscoreaceae para as regiões da África, o IITA
busca o desenvolvimento de novas variedades de inhame com características agronômicas
desejadas e com qualidade, bem como melhorar os sistemas de cultivo em busca de atender a
demanda da região (IITA, 2010).
A produção de inhame no campo tem sido altamente limitada em função da ocorrência
de doenças causadas por fungos, nematoides, bactérias e vírus. De todos, os vírus são
particularmente importantes pois, além de causar redução significativa na produção de
tubérculos e interferir na sua qualidade, eles restringem o intercâmbio internacional de
germoplasma (ASALA et al., 2012). Estudos com o objetivo de investigar a presença de vírus
em acessos de inhame, e as implicações de sua presença no que diz respeito à troca segura de
germoplasmas têm sido descritos na literatura (KENYON et al., 2008; BOUSALEM et al.,
2009). Diante do exposto, o objetivo deste trabalho foi determinar a incidência de Badnavirus
em amostras de inhame em bancos de germoplasmas no Brasil através de PCR e caracterizálos por meio do sequenciamento da região RT/RNase/H.

2. MATERIAIS E MÉTODOS

2.1 Obtenção das Amostras

Amostras de inhame foram obtidas a partir dos bancos de germoplasma da Escola
Superior de Agricultura Luiz de Queiroz (ESALQ/USP), Universidade Federal de Viçosa
(UFV) e Universidade Federal do Recôncavo Baiano (UFRB) (Tabela 1).
Tabela 1. Espécies, acessos e locais de procedência das amostras de inhame utilizadas neste
estudo.

Banco de Germoplasma

Espécie

ESALQ/USP

Dioscorea bulbifera

ESALQ/USP

Dioscorea cayenensis

ESALQ/USP

Dioscorea trifida

Dioscorea alata

Dioscorea rotundata

Dioscorea alata

Dioscorea trifida

Universidade Federal de
Viçosa - UFV
Universidade Federal do
Recôncavo Baiano UFRB
Universidade Federal do
Recôncavo Baiano UFRB
Universidade Federal do
Recôncavo Baiano UFRB

N° de Acessos
44

2.2 Extração de DNA, amplificação da região RT/RNase/H e sequenciamento

A extração do DNA total foi feita a partir da utilização de 100 a 200 mg de tecido
foliar provenientes de plantas de inhame de acordo com protocolo descrito por Doyle &
Doyle, 1991. Alíquotas de DNA foram utilizadas para as reações de amplificação por PCR
(Polymerase Chain Reaction). Os dois oligonucleotídeos utilizados neste trabalho foram
BadnaFP

(5’ATGCCITTYGGIITIAARAAYGCICC-3’)

BadnaRP

(5’CCAYTTRCAIACISCICCCCAICC-3’) (Yang et al., 2003), os quais amplificam região

genômica compreendendo os domínios RT/RNase/H da ORF 3 do genoma de vários
badnavírus já descritos.
Foram realizadas reações iniciais em volume total de 15 μL para avaliar a presença ou
ausência de badnavírus. As amostras com resultados positivos foram então submetidas
novamente a PCR desta vez com volume total de 60 μL contendo, 6 μL de tampão 10X (KCl
100 mM; Tris-HCl 100 mM pH 9,0; Triton-X 1%), 4,8 μL de dNTPs 2,5 mM, 1,8 μL de
MgCl2 50 mM, 3 μL de cada oligonucleotídeo 10 μM, 0,2 μL de Taq DNA Polimerase (1U),
1 μL de DNA (10 a 100 ng) e 40,2 μL de água ultrapura. As condições de amplificação foram:
desnaturação inicial a 94°C por 4 min, seguida de 94°C por 30 s, 50°C por 30 s e 72°C por
30s. Os ciclos foram repetidos 35 vezes exceto para o passo inicial e a extensão final a 72°C
por 10 min. Após a reação de amplificação, uma alíquota dos produtos de PCR foi aplicada
em gel de agarose a 1,2% e submetidos à eletroforese em tampão TAE (Tris-Ácido acético,
EDTA 0,5M pH 8,0) por aproximadamente uma hora. Após, o gel foi corado com brometo de
etídeo e visualizado sob luz ultravioleta. Os produtos de PCR foram purificados utilizando o
kit GFX ™ PCR DNA and Gel Band Purification Kit (GE Healthcare) e enviados para serem
sequenciados na Macrogen Inc. (Seul, Coréia do Sul).

2.3 Comparação de sequências, análise filogenética e de recombinação

As sequências foram inicialmente editadas usando o programa CodonCode Aligner
(CodonCode Corporation®) para gerar a sequência consenso de cada um dos nossos isolados.
Posteriormente, as sequências obtidas foram então submetidas ao algoritmo BLASTn
(Nucleotide Basic Local Alignment Search Tool) (ALTSCHUL et al., 1990).
Foram feitas comparações pareadas entre as sequências obtidas e sequências de
badnavírus disponíveis no GenBank (Tabela 2) com auxílio da ferramenta Species
Demarcation Tool, v. 1.0 (SDT) (MUHIRE et al., 2013), e estimada a percentagem
deidentidade das sequências de nucleotídeos entre os isolados. Obedecendo aos critérios do
ICTV para delimitação de espécies dentro do gênero Badnavirus, onde diferenças entre as
sequências na região RT/RNase/H maiores que 20%, indicam para vírus de espécies distintas
(GEERING; HULL, 2012).

23
Tabela 2. Lista dos badnavirus utilizados para as comparações de sequências e análise filogenéticas, com seus
respectivos acrônimos e números de acesso no GenBank

Espécies

Acrônimo

N° de acesso no GenBank

Dioscorea bacilliform
sansibarensis virus

DBSNV

DQ22073

Dioscorea bacilliform
alata virus
Dioscorea bacilliform
alata virus

DBALV

AM072673

DBALV

AM072707

Dioscorea bacilliform
alata virus

DBALV

AM503392

Dioscorea bacilliform
virus
endogenous Dioscorea
bacilliform virus

DBV

AM944586

eDBV

KF829956

endogenous Dioscorea
bacilliform virus

eDBV

KF829978

endogenous Dioscorea
bacilliform virus
endogenous Dioscorea
bacilliform virus

eDBV

KF829987

eDBV

KF829975

Commelina yellow
mottle virus
Cacao swollen shoot
virus
Sugarcane bacilliform
IM virus

CYMV

NC001343

CSSV

NC001574

SBIMV

NC003031

Banana streak OL virus

BSOLV

NC003381

Citrus yellow mosaic
virus

CYMV

NC003382

Taro bacilliform virus

TBV

NC004450

Kalanchoe top-spotting
virus

KTSV

NC004540

Banana streak Mysore
virus

BSMV

NC006955

Banana streak GF virus

BSGFV

NC007002

Banana streak virus

BSV

NC007003

Sugarcane bacilliform
Mor virus
Dracaena mottle virus
Bougainvillea
spectabilis chlorotic
vein-banding virus
Pelargonium vein
banding virus

SBMORV

NC008017

DMV
BSCVBV

NC008034
NC011592

PVBV

NC013262

Sugarcane bacilliform
virus

SBV

NC013455

Rice tungro bacilliform
virus

RBTV

X57924

As sequências foram alinhadas utilizando o algoritmo MUSCLE (EDGAR, 2004),
implementado no software MEGA 5 (Molecular Evolutionary Genetics Analysis) (TAMURA
et al., 2011) e submetidas à análise filogenética de Máxima Verossimilhança (MV) (RIDLEY,
2006) utilizando-se o modelo de substituição de nucleotídeos General Time Reversible com
distribuição gama (GTR+G). A confiabilidade da árvore gerada foi obtida a partir de análise
boostrap com 1000 repetições.
Análise para detectar eventos de recombinação e possíveis sequências parentais foi
realizada utilizando-se o software RDP v.4.36 (Recombination Detection Program)
(MARTIN; RYBICKI, 2000).

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

3.1 Amplificação da região RT/RNase/H e sequenciamento

Um total de 235 amostras foram analisadas das quais 177 foram PCR positivas para
badnavírus, com a amplificação de um fragmento de aproximadamente 580pb e isto
representou uma incidência média de 75,3%. Amostras a partir do banco de germoplasma da
UFRB apresentaram maior incidência (87,5%) (Tabela 3).
Tabela 3. Incidência de Badnavirus em amostras de inhame dos Bancos de germoplasma do Brasil.

Nº amostras
testadas

Amostras PCR
positivas

Incidência de
badnavirus

169

129

76,3%

Universidade Federal de
Viçosa/UFV

Universidade Federal do
Recôncavo Baiano/UFRB

Banco de germoplasma

ESALQ/USP

68%

87,5%

Do total de amostras amplificadas para badnavírus, 113 amostras compreendendo os
três locais de procedência (ESALQ/USP, UFV e UFRB) foram enviadas para
sequenciamento, um total de 42 sequências foram obtidas (Tabela 4).
Foi observada alta incidência de badnavirus nos três bancos de germoplasma
avaliados. Estes resultados corroboram os encontrados por Lima et al., (2013), que
observaram 93,7% de incidência de badnavírus ocorrendo em plantios comerciais de inhame
na região Nordeste do Brasil. Em ambos estudos a avaliação da incidência foi realizada com
base em PCR, técnica que apesar de não ser capaz de discriminar sequências de badnavírus
integradas ao genoma da planta das sequências epissomais, constitui-se em uma ferramenta de
uso rotineiro para detecção dos vírus desse gênero (DELANOY et al., 2003). Portanto, devese considerar que esta elevada incidência encontrada pode não demonstrar o que ocorre na
realidade. Por exemplo, uma alta incidência (81%) foi observada quando realizada a
indexação de badnavirus via PCR em genótipos de inhame do banco de germoplasma do

Tabela 4. Isolados utilizados nas análises comparações pareadas e filogenética.

Espécie

Hospedeiro

Origem

CA41
RX4
RX2
DC262D
DB351
DB65
RX1
STI5
DC310
CARA5
DC21C
DC2940
PEZ1
PEZ2
MOE5
MIMO5
PEZ3
JAPE4
FLO4
MOE2
DC572
DCT3
JAPE2
JAPE3
PEZ4
DC13D
DC268
DC252
FLO3
DC85
DC201
FLO1
DC69
DC86
DC96
DC56C
DC56
DCT1
CARA3
DCT2
DB379B

Dioscorea alata
Dioscorea alata
Dioscorea alata
Dioscorea cayenensis
Disocorea bulbifera
Disocorea bulbifera
Dioscorea alata
Dioscorea alata
Dioscorea cayenensis
Dioscorea alata
Dioscorea cayenensis
Dioscorea cayenensis
Dioscorea alata
Dioscorea alata
Dioscorea alata
Dioscorea alata
Dioscorea alata
Dioscorea alata
Dioscorea alata
Dioscorea alata
Dioscorea cayenensis
Dioscorea alata
Dioscorea alata
Dioscorea alata
Dioscorea alata
Dioscorea cayenensis
Dioscorea cayenensis
Dioscorea cayenensis
Dioscorea alata
Dioscorea cayenensis
Dioscorea cayenensis
Dioscorea alata
Dioscorea cayenensis
Dioscorea cayenensis
Dioscorea cayenensis
Dioscorea cayenensis
Dioscorea cayenensis
Dioscorea alata
Dioscorea alata
Dioscorea alata
Disocorea bulbifera

UFRB*
UFV*
UFV
ESALQ/USP*
ESALQ/USP
ESALQ/USP
UFV
UFV
ESALQ/USP
UFV
ESALQ/USP
ESALQ/USP
UFV
UFV
UFV
UFV
UFV
UFV
UFV
UFV
ESALQ/USP
UFV
UFV
UFV
UFV
ESALQ/USP
ESALQ/USP
ESALQ/USP
UFV
ESALQ/USP
ESALQ/USP
UFV
ESALQ/USP
ESALQ/USP
ESALQ/USP
ESALQ/USP
ESALQ/USP
UFV
UFV
UFV
ESALQ/USP

*ESALQ/USP - Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz/Universidade de São Paulo; UFV Universidade Federal de Viçosa; UFRB - Universidade Federal do Recôncavo Baiano.

Centre de Coopération Internationale en Recherche Agronomique Pour le Développement CIRAD. Entretanto quando o mesmo grupo de amostras foi indexado para badnavirus via
PAS-ELISA, foi detectada apenas 60% de incidência, demonstrando que o PCR amplificou
sequências endógenas além das sequências epissomais (SEAL et al., 2014). Para evitar a
detecção de sequências endógenas, Silveira et al. (2008) realizaram a indexação biológica de
Banana streak virus (BSV) via transmissão por colhonilha em acessos de bananeira do banco
de germoplasma da Embrapa Mandioca e Fruticultura. Os resultados demonstraram uma
incidência de apenas 20% a qual é bem menor que 87,5% determinada por PCR (SILVEIRA
et al., 2008; SANT’ANA, 2013). Este resultado pode ser explicado em decorrência de uma
baixa eficiência na taxa de transmissão realizada pelo inseto vetor

3.2 Comparação de sequências, e análise filogenética e de recombinação

Análise de comparações de sequências par-a-par revelaram que cinco sequências
descritas neste trabalho apresentaram identidade de 83-98% (Figura 2) com isolados de
Dioscorea bacilliform AL virus (números de acessos AM503392, AM072707 e AM072673),
utilizando o critério para demarcação de espécies estabelecido pelo ICTV, enquanto que 36
sequências apresentaram identidade de 89-100% (Figura 2) com sequências de badnavirus
endógenos (EPRVs) ou também chamados de endogenous Dioscorea bacilliform vírus
(eDBV) conforme nomenclatura proposta por Staginnus et al., (2009). Destas sequências, 34
apresentaram identidades com eDBVs do grupo 9 (número de acesso KF829987 e KF829975)
conforme classificação proposta por Kenyon et al. (2008), e com um isolado de Dioscorea
bacilliform virus (DBV – número de acesso AM944586), enquanto que duas possuíram
identidades com eDBVs do recém criado grupo 12 (proposto por UMBER et al. 2014), cujo
os números de acesso são KF829956 e KF829978 (Figura 2). Foi observado ainda que a
sequência DB379B, obtida a partir de amostras de Dioscorea bulbifera apresentou identidade
de 85% (Figura 2) com Dioscorea bacilliform sansibarensis virus (DBSNV - número de
acesso no Genbank DQ822073) já relatado infectando inhame na África (SEAL; MULLER,
2007). Este constitui o primeiro relato de DBSNV no Brasil, uma vez que trabalhos realizados
até então haviam relatado a espécie DBALV como prevalente (ANDRADE, 2007; LIMA et
al. 2013).

Figura 2. Matriz bidimensional representando a porcentagem de identidade de comparações pareadas de
sequências nucleotídicas da região RT/RNase dos badnavirus deste estudo com outras espécies de
badnavirus disponíveis no GenBank.

Os resultados da análise filogenética mostraram que 42 isolados descritos aqui
formaram quatro grupos distintos. No grupo I 34 isolados obtidos de D. cayenensis e D. alata
procedentes dos bancos de germoplasma da ESALQ/USP e UFV, respectivamente, agruparam
com badnavirus endógenos do grupo 9 (eDBV9) (KENYON et al. 2008) e com um isolado de
DBV (Figura 3). No grupo II, apenas dois isolados oriundos da espécie D. bulbifera obtidos
do banco de germoplasma da ESALQ/USP agruparam-se com isolados de badnavírus
endógenos do recém criado grupo 12 (eDBV12) (Figura 3) (UMBER et al. 2014).
No grupo III, cinco isolados obtidos de D. alata e D. cayenensis procedentes dos três
bancos de germoplasma foram agrupados com três isolados de DBALV (Figura 3), uma
espécie já relatada infectando inhame no Brasil (ANDRADE, 2007), enquanto que no grupo
IV um isolado obtido de D. bulbifera procedente do banco de germoplasma da ESALQ/USP
agrupou com o DBSNV (Figura 3), uma espécie até então não relatada no Brasil.
As duas espécies de badnavírus (DBALV e DBSNV infectando inhame) atualmente
aceitas pelo ICTV foram encontradas nos acessos dos bancos de germoplasma avaliados.
O primeiro relato de DBALV em inhame no Brasil foi realizado por Andrade (2007)
nos estados da Bahia e Pernambuco. Posteriormente, um estudo sobre a variabilidade genética
de badnavirus que ocorrem em Dioscorea spp. provenientes de áreas produtoras dos estados
de Alagoas, Paraíba e Pernambuco, sugeriram que DBALV seria a única espécie de
badnavírus ocorrendo em inhame na região Nordeste do Brasil (LIMA et al., 2013;
GUIMARÃES, 2013). Nessa região, DBALV foi detectado em D. alata e D. cayenensis,
encontrando-se amplamente distribuído e sua prevalência devendo-se provavelmente à
proximidade das áreas de cultivo e constante troca de material propagativo (túberas
infectadas) entre as áreas (LIMA et al., 2013). Pesquisas sobre incidência e distribuição de
vírus que infectam inhame em países da África e Sul do Pacífico revelaram que DBALV
também é a espécie prevalente de badnavírus nas áreas de plantio comercial dessa cultura
(BOUHIDA et al., 1993; ENI et al., 2008; KENYON et al., 2008; BOUSALEM et al., 2009;
ASALA et al, 2012; TOUALY et al., 2014).

Figura 3. Árvore filogenética de Máxima Verossimilhança baseada em sequências da região RT/RNase de
isolados de Badnavirus que infectam inhame obtidos neste trabalho e outras espécies de Badnavirus
disponíveis no GenBank. O Rice tungro bacilliform virus (RTBV), gênero Tungrovirus, foi utilizado como
outgroup.

O isolado DB359, obtido de D. bulbifera proveniente do banco de germoplasma da
ESALQ/USP pertence à espécie DBSNV. Esta espécie foi inicialmente descrita em D.
sansibarensis apresentando sintomas de deformação foliar e clorose, em Benin, África
(SEAL; MÜLLER, 2007). Posteriormente, o DBSNV foi encontrado também infectando
espécies de D. alata e D. rotundata na Nigéria, Gana, Togo e Benin (ENI et al. 2008). Este
constitui o primeiro relato de DBSNV infectando inhame no Brasil, uma vez que trabalhos

realizados até então apontaram apenas a ocorrência da espécie DBALV nas áreas de cultivo
de inhame no país (ANDRADE, 2007; LIMA et al., 2013; GUIMARÃES, 2013). Este
também constitui o primeiro relato de DBSNV na hospedeira D. bulbifera, sugerindo que
assim como DBALV, a espécie DBSNV não possui espécies hospedeiras específicas.
Apesar do ICTV reconhecer apenas DBALV e DBSNV como as únicas espécies de
badnavírus em inhame, estudos baseados em PCR indicam que a diversidade desses
badnavírus na África e Sul do Pacífico é alta, sugerindo a ocorrência de ao menos 10 outras
espécies infectando Dioscorea spp. (KENYON et al., 2008; BOUSALEM et al., 2009). Esta
alta diversidade deve-se em parte a presença de um grande número de espécies de inhame nas
áreas de cultivo, a exemplo D. alata, D. cayenensis, D. rotundata, D. sansibarensis na África
e D. bulbifera, D. dumedorum, D. numularia e D. penthaphylla no sul do Pacífico (PHILLIPS
et al., 1999; ENI et al., 2008 KENYON et al., 2008; BOUSALEM et al., 2009). Além disso,
esta grande diversidade também pode refletir a alta variabilidade dentro das espécies dos
badnavírus de inhame. Por exemplo, a frequência de mutação estimada para populações de
DBALV provenientes do Nordeste do Brasil é em torno de 10-4, semelhante àquelas
encontradas para outros vírus com genoma de DNA e RNA (GUIMARÃES, 2013).
Os demais isolados obtidos neste estudo demonstraram alta identidade com sequências
de badnavírus endógenos (eDBV), dos quais 34 isolados agruparam com eDBVs do grupo 9
(KENYON et al., 2008) e com um isolado de Dioscorea bacilliform vírus – DBV do Benin
(número de acesso AM944586), enquanto que dois isolados agruparam com eDBVs do recém
criado grupo 12 (UMBER et al., 2014). O isolado de DBV (BN4dr/AM944586) utilizado
neste estudo foi descrito por Eni et al., (2008) como sendo membro de uma possível nova
espécie de badnavirus que infecta inhame em regiões da África ocidental, e posteriormente foi
agrupado como pertencendo a eDBVs do grupo 9 conforme classificação definida por Kenyon
et al., (2008). Portanto, para a correta classificação dessas sequências como eDBVs integradas
no genoma do inhame ou sequências epissomais, testes adicionais como PAS-ELISA, ISEM e
Southern Blotting (SEAL et al., 2014) devem ser realizados para confirmar precisamente sua
presença nos acessos dos bancos de germoplasma avaliados e verificar a probabilidade dessas
sequências serem ativadas, culminando em possíveis infecções.
A presença de sequências virais endógenas (EPRVs) integradas em genomas de
plantas tem sido relatada para uma variada gama de famílias de plantas das quais podem ser
citadas banana, petúnia, arroz e tabaco (GEERING et al., 2010; ISKRA-CARUANA et al.,
2010). Para espécies da família Dioscoreaceae relatos destas sequências integradas em seu
genoma ainda são escassos. A análise de sequências de amostras de inhame obtidas na região

do sul do Pacífico, indicaram uma possível presença de sequências integradas em genomas de
inhame (KENYON et al., 2008). Bousalem et al. (2009) analisaram 121 sequências
provenientes de inhame obtidos de regiões do Caribe, América do Sul e África e detectaram
presença de 12 diferentes espécies dentro do gênero Badnavirus, admitindo-se também a
possibilidade da presença de EPRVs no genoma das espécies utilizadas no estudo.
Recentemente foi realizada a confirmação e caracterização de sequências endógenas de
badnavirus do inhame (eDBV) integradas no genoma de espécies de inhame pertencentes ao
complexo D. cayenensis-rotundata (SEAL et al., 2014; UMBER et al., 2014). No entanto, a
natureza infecciosa dos eDBV relatados para inhame ainda não está totalmente estabelecida.
Há poucos relatos de EPRVs capazes de gerar partículas infecciosas (CHABANNES
et al., 2013), pois a maioria das EPRVs que foram identificados até então são considerados
como não infecciosos (CHABANNES; ISKRA-CARUANA, 2013; GEERING et al., 2010).
Há ainda relatos de que EPRVs podem conferir vantagens ao seu hospedeiro, fornecendo
resistência aos seus vírus cognatos (HULL et al., 2000; ISKRA-CARUANA et al., 2014;
NOREEN et al., 2007). A detecção confiável de espécies de badnavírus de inhame representa
um desafio, uma vez que é necessário utilizar ferramentas que venham a distinguir sequências
epissomais das sequências integradas. A técnica de PCR, bem como a abordagem sorológica
tem sido amplamente utilizadas como testes para detecção de badnavirus em amostras de
inhame (ENI et al., 2008; ENI et al., 2013; ASALA et al., 2012; TOUALY et al., 2014).
Contudo, não podem ser aplicadas para detecção de sequências endógenas pelo fato de não
fornecer uma diferenciação quanto sequências epissomais ou integradas. PCR-Imunocaptura
foi a primeira técnica descrita como sendo capaz de realizar distinção entre sequências
epissomais das EPRVs de BSV (HARPER et al., 1999), porém para inhame a utilização desta
técnica não forneceu resultados confiáveis (SEAL et al., 2014). Uma abordagem alternativa
utilizando RCA (Rolling circle amplification) como método de diferenciação de sequências
epissomais das sequências integradas de BSV em cultivares de banana (Musa spp.), sendo
possível inclusive detectar de maneira diferencial sequências integradas de Sugarcane
bacilliform virus em cana de açúcar e Cauliflower mosaic vírus em nabo (JAMES et al.,
2010), mostrou-se bastante eficiente. Como acontece para BSV, esta técnica pode ser utilizada
para detecção de formas epissomais de badnavirus no inhame.
Os resultados obtidos neste trabalho, demonstram a presença de DBALV e DBSNV
nos bancos de germoplasma avaliados. A presença de DBALV pode ser explicada pelo fato de
que os acessos de D. alata e D.caynensis disponíveis nos BGs foram, em grande parte,
oriundos da região Nordeste, para a qual altos níveis de incidência de DBALV são

encontrados. No entanto, não se pode descartar a hipótese de que DBALV chegou aos BGs
por meio de transmissão pelo inseto vetor, visto que os acessos são mantidos em condições de
campo sem proteção contra esses insetos.
Embora este seja o primeiro relato de DBSNV infectando inhame no Brasil, não se
pode afirmar que sua existência no país seja recente, uma vez que até então os estudos de
incidência de badnavírus que infectam o inhame estavam restritos apenas à região Nordeste,
onde é relatada prevalência do DBALV. Diante dessa constatação, torna-se de extrema
importância à continuidade de estudos que possam fornecer informações mais precisas sobre a
ocorrência de DBSNV em áreas produtoras do país, afim de fim de possibilitar o uso de
medidas de controle efetivas visando evitar sua futura dispersão para áreas livres dessa
espécie.
Apesar de Bousalem et al., (2009) relatarem a detecção de um evento de recombinação
entre dois isolados avaliados em seu estudo (DeBV-B e DeBV-A) ambos sendo obtidos de D.
alata, as análises realizadas com as amostras não detectou nenhum evento de recombinação.
A não detecção de possíveis eventos de recombinação pode estar relacionada com a pequena
região genômica analisada para esse estudo.

4. CONCLUSÕES

Os resultados obtidos neste estudo indicam que o DBALV encontra-se amplamente
disseminado no território brasileiro. Adicionalmente, a detecção de DBSNV refuta a hipótese
de que DBALV é a única espécie de badnavírus infectando inhame no Brasil. No entanto,
estudos adicionais são necessários para determinar com precisão a incidência e distribuição de
DBSNV nas áreas de cultivo de inhame do país.
Os resultados indicam também a possível presença de sequências endógenas no
genoma das amostras de inhame utilizadas neste estudo. Contudo, a presença destas
sequências endógenas necessita de maiores confirmações.
A presença de vírus em acessos de bancos de germoplasmas sinaliza para a
necessidade de uma maior preocupação acerca do manejo adequado, a fim de se garantir
plantas livres de vírus, permitindo assim um intercâmbio seguro, e em longo prazo a
distribuição de material sadio para o agricultor.

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