Caracterização de Isolados de Colletotrichum spp. Oriundos de Tomateiro

Caracterização de Isolados de Colletotrichum spp. Oriundos de Tomateiro.pdf
Documento PDF (840.1KB)

Exibir conteúdo Baixar

UNIVERSIDADE FEDERAL DE ALAGOAS
CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS
PÓS-GRADUAÇÃO EM PROTEÇÃO DE PLANTAS
CECA

UFAL

Livoney Barbosa de Oliveira Goes

CARACTERIZAÇÃO DE ISOLADOS DE Colletotrichum spp. ORIUNDOS DE
TOMATEIRO

Rio Largo
2013

LIVONEY BARBOSA DE OLIVEIRA GOES

CARACTERIZAÇÃO DE ISOLADOS DE Colletotrichum spp. ORIUNDOS DE
TOMATEIRO
Dissertação apresentada à Universidade
Federal de Alagoas como parte das exigências
do programa de Pós-Graduação em Proteção
de Plantas, para obtenção do título de Mestre
em Proteção de Plantas.

Orientador: Dr. Gildemberg Amorim Leal
Júnior.

Rio Largo
2013

Catalogação na fonte
Universidade Federal de Alagoas
Biblioteca Central
Divisão de Tratamento Técnico
Bibliotecária Responsável: Fabiana Camargo dos Santos
G598c

Goes, Livoney Barbosa de Oliveira.
Caracterização de isolados de Colletotrichum spp. oriundos de tomateiro /
Livoney Barbosa de Oliveira Goes. – 2013.
54 f. : il.
Orientador: Gildemberg Amorim Leal Júnior.
Dissertação (Mestrado em Proteção de plantas) – Universidade Federal de
Alagoas. Centro de Ciências Agrárias. Rio Largo, 2013.
Bibliografia: f. 50-54.
1. MicroTom. 2. Antracnose. 3. Micro-tomateiro – Resistência.
I. Título.
CDU: 632.931.1

LIVONEY BARBOSA DE OLIVEIRA GOES

CARACTERIZAÇÃO DE ISOLADOS DE Colletotrichum spp. ORIUNDOS DE
TOMATEIRO

Dissertação apresentada ao Curso de Mestrado
em Proteção de Plantas, do Centro de Ciências
Agrárias da Universidade Federal de Alagoas em
14 de Agosto do ano de 2013. Aprovada pela
seguinte Banca Examinadora:

Prof. Dr. Gildemberg Amorim Leal Júnior - Universidade Federal de Alagoas (Orientador)

Banca Examinadora:

Prof. Dr. Gaus Silvestre de Andrade Lima - Universidade Federal de Alagoas (Examinador)

Dr. Jean Herllington Araújo Monteiro - Universidade Federal de Alagoas (Examinador)

Rio Largo
2013

AGRADECIMENTOS

À Universidade Federal de Alagoas (UFAL) e à unidade acadêmica Centro de
Ciências Agrárias (CECA) pela possibilidade de cursar a pós-graduação em Proteção de
Plantas.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela
concessão da bolsa.
A todos os Professores do Programa de Pós-graduação com os quais tive a
oportunidade de aprender e amadurecer enquanto profissional durante todo o mestrado.
Aos colegas da Pós-Graduação pela tranquilidade, empenho e repartição de
conhecimento durante a jornada árdua enfrentada nas disciplinas.
Ao Dr. Gildemberg Amorim Leal Júnior pela confiança, dedicação e paciência
durante todo o desenvolvimento do presente trabalho.
Aos colegas da Clínica Fitossanitária CECA/UFAL e no Laboratório de Virologia
Molecular pelo apoio, além dos dias divertidos e produtivos de sempre. Em especial ao Dr.
Jean Herllington Araújo Monteiro pelas valorosas contribuições e ensinamentos.
Ao Laboratório de Melhoramento de Plantas CENA/USP pelo gentil acolhimento e
treinamento. Em especial ao Dr. Eduardo de Andrade Bressan pelo tempo dedicado.
À Secretaria do curso de Pós-Graduação pelo profissionalismo e agilidade na
resolução dos assuntos burocráticos durante os últimos dois anos.

A todos que contribuíram de alguma forma para esse resultado

Agradeço!

RESUMO

A quebra da resistência conferida por genes R e o surgimento de linhagens resistentes a
fungicidas tem onerado e dificultado o controle de doenças fúngicas na agricultura. Assim
uma resistência mais duradoura tem sido pesquisada e as bases das resistências do hospedeiro
e do não-hospedeiro podem fornecer soluções para o problema. Muito dos processos base
desses tipos de resistência ainda necessitam de investigação e interpretação, o que é promissor
quando se empregam patossistemas envolvendo espécies modelos com facilidades para o uso
de técnicas de genética reversa. O hospedeiro Solanum lycopersicum cv. MicroTom é um
excelente modelo vegetal para esse tipo de estudo, pois além de todas as vantagens exibidas
por Arabidopsis thaliana é representativa agronomicamente. O patógeno Colletotrichum spp.
além de ser responsável pela antracnose em muitas culturas tem sido intensivamente estudado
e já são disponíveis ferramentas para genética reversa. Desse modo, objetivando propor o
patossistema Colletotrichum sp. – MicroTom como modelo para estudos de resistências do
hospedeiro e do não-hospedeiro. O presente estudo testou a interação de diferentes espécies
de Colletotrichum contra S. lycopersicum cv. MicroTom e espécies distintas
filogeneticamente pertencente aos grupos rosides (Phaseolus lunatus) e monocotiledôneas
(Musa sp.). Inicialmente foi feita a identificação das espécies de Colletotrichum isoladas de
tecidos doentes de S. lycopersicum, P. lunatus e Musa sp. por características morfoculturais.
Depois foram pesquisadas diferenças no padrão eletroforético da amplificação da sequência
ITS do rDNA. Os fatores enzimáticos de patogenicidade foram testados mediante infiltração
em folhas de MicroTom com proteínas fúngicas secretadas em meio de cultivo líquido. A
determinação de patógenos específicos ao tomateiro e não patógenos foi realizada com
inoculação de estruturas fúngicas sobre folhas de MicroTom, P. lunatus e Musa sp. Os
resultados sugerem que o isolados de C. gloeosporioides (1 e 2), C. truncatum e C. musae
analisados são promissores para estudos das resistências do hospedeiro e do não-hospedeiro
com MicroTom sob diferentes abordagens. Visto que os referidos isolados comportaram-se de
maneira contrastante nos testes realizados, principalmente nos de patogenicidade os quais
revelaram a adaptação de cada isolado a Solanaceae, Fabaceae e Musaceae respectivamente
No entanto são necessários estudo detalhados de microscopia, e expressão gênica para melhor
caracterização esses tipos de resistência exibida pelo MicroTom aos patógenos citados.
Palavras-chave: MicroTom. Antracnose. Resistência.

ABSTRACT

The breaking of the resistance conferred by R genes and the emergence of strains resistant to
fungicides has impaired the control of fungal diseases in agriculture. Therefore a more
durable resistance is been searched, the bases of host and non-host resistence may provide
solutions to this problem. Much of the basic processes of these resistence still need further
research and interpretation, which is promising when employing fungal and plant models with
has facilities for the use of reverse genetic techniques. Solanum lycopersicum cv. MicroTom
is an excellent model for this study, because it is a representative crop in addition to exhibit
the same advantages of Arabidopsis thaliana. Colletotrichum, responsible for anthracnose in
many cultures, has been extensively studied and has already developed tools for reverse
genetic. Thus, in order to propose the pathosystem Colletotrichum spp. - MicroTom as a
model for studies of host and non-host resistance. This study tested the interaction of different
species of Colletotrichum against MicroTom, Phaseolus lunatus and Musa sp. representing
asteroids, rosides and monocots. First the fungal morphological characterization it was
supported by rDNA sequence analyses. Enzymatic factors of pathogenicity were tested by
infiltrating MicroTom`s leaves with fungal proteins secreted in liquid medium. The
pathogenicity test was described by inoculation with fungal structures on S. lycopersicum, P.
lunatus and Musa sp. The results suggest that C. gloeosporioides cultures 1 and 2, C.
truncatum and C. musae constitute along with MicroTom excellent pathosystems for studying
host and non-host resistance under different approaches. Because these isolates showed a
contrasting features in the pathogenicity tests, which revealed the adaptation to Solanaceae
Fabaceae and Musaceae. However detailed studies of microscopy and gene expression are
needed to better characterize these types of resistance exhibited.
Keywords: MicroTom. Anthracnose. Resistence.

LISTA DE FIGURAS
Figura 1 –
Figura 2 –

Figura 3 -

Figura 4 Figura 5 –
Figura 6 –
Figura 7 –

Figura 8 Figura 9 Figura 10 -

Figura 11 -.

Figura 12 –
.
Figura 13 Figura 14 –
Figura 15 –

Resumo de estratégias de infecção empregadas por algumas espécies de
Colletotrichum.
Comportamento do isolado CF15 frente a diferentes meios de cultivo. Letras
minúsculas iguais nas colunas não diferem estatisticamente no teste de Tukey
(p < 0.05). A – Taxa de crescimento micelial em sete dias (dms = 0,39 CV%
= 1,45). B - Produção média de conídios no décimo dia (dms = 1,6 CV% =
12,89).
Colônias de Colletotrichum spp. aos 10 dias de crescimento sobre BDA a
25oC e 12h de luz. A – CF13 - C. gloeosporioides (C.g.1), B – CF15- C.
coccodes (C.c.), C – CF16, D – CF17- C. gloeosporioides (C.g.2), E – JL- C.
acutatum (C.a.), F – C. truncatum (C.t.), G – C. musae (C.m.).
Conídios e apressórios de Colletotrichum x400. A e B – C.c, C e D – C.a., E
e F – C.m.
Quadro-resumo
das
características
analisadas
para
identificar
morfometricamente os isolados de Colletotrichum.
DNA genômico submetido a duas horas de eletroforese 3V*cm-1 em gel de
agarose 0,8%.
Produto de PCR visualizado após duas horas de eletroforese 3V*cm-1 em gel
de agrose 1,5%. Utilizou-se a combinação de iniciadores ITS 3 e 4 para C.g.1
e C.g.2 e ITS 1 e 4 para os demais. A direita amplificação realizada somente
C.c, visto a ausência de amplificação na primeira PCR.
Folhas de Micro-Tom infiltradas com meio de cultivo líquido onde cresceram
Colletotrichum spp.. A – ADE. B – BDA+C.g.2, C – YCBnp10+C.c.).
Folhas Micro-Tom após 168 h da inoculação com discos de BDA contendo
micélio. A- testemunha, B – C.c., C – CF16, D – C.g.2, E – C.a., F – C.t..
Frutos de tomateiro inoculados com discos de BDA contendo micélio. A –
testemunha, B – C.g.1, C – C.c., D – CF16, E – C.g.2, F – C.a., G – C.t., H –
C.m..
Teste de patogenicidade sobre folhas (A) e frutos (B) destacados de
tomateiro. Letras minúsculas iguais nas colunas não diferem estatisticamente
no teste de Tukey (p < 0.05). A – dms = 2,53 CV% = 14,95. B – dms = 5,63
CV% = 26,58
Patogenicidade a folhas de fava inoculados com discos de BDA contendo
micélio. A – testemunha, B – C.g.1, C – C.c., D – CF16, E – C.g.2, F – C.a.,
G – C.t., H – C.m..
Patogenicidade a frutos de bananeira inoculados com discos de BDA
contendo micélio. A – testemunha, B – C.g.1, C – C.c., D – CF16, E – C.g.2,
F – C.a., G – C.t., H – C.m..
Patogenicidade a folhas de Phaseolus lunatus e frutos de Musa sp. Letras
minúsculas iguais nas colunas não diferem estatisticamente no teste de Tukey
(p < 0.05). A - dms = 3,5 CV% = 15,28. B - dms = 1,04 CV% = 33,63.
Quadro-resumo da caracterização multifásica empregada para as espécies de
Colletotrichum spp.

17
27

30
31
33
33

35
38
39

SUMÁRIO

INTRODUÇÃO .................................................................................................

REVISÃO DE LITERATURA ........................................................................

2.1

Resistência do não-hospedeiro .........................................................................

2.2

MicroTom como planta modelo .......................................................................

2.3

Colletotrichum spp. como microrganismo modelo .........................................

MATERIAL E MÉTODO ................................................................................

3.1

Obtenção de isolados adaptados e não-adaptados a MicroTom ...................

3.2

Produção de plantas MicroTom .......................................................................

3.3

Produção otimizada de conídios ......................................................................

3.4

Identificação de isolados de Colletotrichum ....................................................

3.4.1

Morfocultural ....................................................................................................

3.4.2

Molecular rDNA (ITS) ......................................................................................

3.5

Caracterização dos isolados de Colletotrichum ...............................................

3.5.1

Teste de infiltração ............................................................................................

3.5.2

Teste de patogenicidade ....................................................................................

3.5.3

Avaliação da resistência ....................................................................................

RESULTADOS E DISCUSSÃO ......................................................................

4.1

Obtenção de isolados adaptados e não-adaptados a MicroTom ...................

4.2

Produção otimizada de conídios ......................................................................

4.3

Identificação de isolados de Colletotrichum ....................................................

4.3.1

Morfocultural ....................................................................................................

4.3.2

Molecular rDNA (ITS) ......................................................................................

4.4

Caracterização dos isolados de Colletotrichum ...............................................

4.4.1

Teste de infiltração ............................................................................................

4.4.2

Teste de patogenicidade ....................................................................................

4.4.3

Avaliação da resistência ...................................................................................

CONSIDERAÇÕES FINAIS ...........................................................................

CONCLUSÃO ...................................................................................................

REFERÊNCIAS ................................................................................................

INTRODUÇÃO
A íntima relação entre plantas e patógenos levou à co-evolução de complexas

estratégias para ataque e defesa (EL OIRDI, 2011). O alto nível de complexidade da resposta
das plantas ao ambiente biótico é o produto da co-evolução entre elas e seus agressores
(PIETERSE; DICKE, 2007). No processo, os patógenos adquiriram vários fatores de
virulência, incluindo proteínas efetoras que bloqueiam a resistência basal da planta
(resistência do não-hospedeiro –NHR), as plantas por sua vez desenvolveram uma segunda
linha de defesa relacionada com os genes de resistência (BORGES, 2012). Os mecanismos de
resistência vegetal a patógenos adaptados são bem compreendidos e estudados. O papel das
moléculas efetoras e dos padrões moleculares associados a patógenos (padrões moleculares
associados a patógenos - PAMPs) já está bem documentado para muitas espécies, como
também os seus receptores específicos, e os genes de resistência vegetal (JONES; DANGL
2006).
Entretanto, a interação entre plantas e patógenos não-adaptados (NHR) é pouco
definida (FAN; DOERNER 2012). Essa predileção e quantidade maior de estudos sobre
interações compatíveis podem ser explicada, em parte, pois a resistência qualitativa é
facilmente observada nos hospedeiros, são distinguíveis dois fenótipos: resistente e suscetível
seguindo a herança mendeliana (FEYS; PARKER 2000; GLAZEBROOK 2001; HULBERT
et al., 2001). É a resistência mediada por genes R. Em contraste a resistência quantitativa é
caracterizada por um contínuo no fenótipo que vai desde a alta suscetibilidade à alta
resistência, graças às recombinações dentro da progênie. Tal resistência é controlada por mais
que um gene e pode ser fortemente influenciada por fatores ambientais (PAJEROWSKA et
al., 2005).
A NHR geralmente não apresenta sinais visuais quando manifestada, e está associada
a mecanismos pré-formados e com produção de compostos secundários, e em alguns casos, é
possível ocorrer resposta de hipersensibilidade (LIPKA et al., 2008). A resistência do nãohospedeiro envolve reconhecimento parcial dos microrganismos não-patogênicos que ativam
mecanismos de proteção similares aos ativados por estresses abióticos ou bióticos
(REIGNAULT; SANCHOLLE 2005). Os modelos atuais sugerem que as barreiras de defesa
existem para prevenir a colonização de patógenos não-adaptados em plantas não-hospedeiras
e vão desde as defesas pré-formadas físicas e químicas até a ativação da defesa após o
reconhecimento do patógeno (FAN; DOERNER, 2012). Essas defesas iniciais desencadeiam
na planta a NHR ou imunidade inata como também é conhecida.

Devido às particularidades desse tipo de defesa, tem sido alvo na busca por uma
resistência mais duradoura alternativa a já empregada resistência do tipo gene-a-gene. As
espécies de Colletotrichum têm sido usadas nesses estudos contra hospedeiros não
representativos para as espécies agrícolas. Disso emerge a proposição de S. lycopersicum cv.
MicroTom como planta modelo para estudos de interação e resistência do não-hospedeiro.
A cultivar adéqua-se a proposta por apresentar protocolos adaptados para estudo da
genética reversa e possui uma gama de mutantes correlatos com os da planta modelo A.
thaliana, e enquadrar-se como planta de interesse comercial. O sistema Micro-Tom e
Colletotrichum é promissor devido ao fungo empregar diferentes estratégias nutricionais e ser
patogênico a vários órgãos vegetais em diferentes fases fenológicas, sendo um patógeno de
interesse econômico para a cultura. O sistema por adotar dois organismos modelos permite
manipulações em ambos os organismos para o estudo da resistência não específica.
O tomate é e continuará sendo um dos mais populares vegetais do mundo mesmo
com perdas agrícolas e redução na produtividade ocasionada por doenças. O melhoramento de
plantas moderno tem produzido cultivares novas resistentes a doenças, no entanto, a
emergência de novas raças de patógenos em um curto espaço de tempo muitas vezes quebra a
resistência em um curto período. Uma variedade de fungicidas efetivos contra doenças do
tomateiro foi desenvolvida, mas a ocorrência de linhagens resistentes a fungicidas acaba por
anula-la. Assim entra-se num ciclo de desenvolvimento de cultivares com resistência
específica versus novas raças virulentas ou, novos fungicidas versus linhagens resistentes.
Isso sugere que as interações tomate-patógeno ainda necessitam de investigação detalhada dos
mecanismos que conferem uma resistência ampla e duradoura. Os resultados podem ter
relevância genérica para as interações planta-patógeno (ARIE et al., 2007)
Pelo exposto, o presente trabalho pretende caracterizar o sistema Solanum
lycopersicum versus Colletotrichum spp. como modelo para o estudo da resistência do nãohospedeiro.

REVISÃO BIBLIOGÁFICA

2.1 Resistência do não-hospedeiro
As interações planta-patógeno podem ser explicadas por dois momentos
evolucionariamente associados. O primeiro inclui interações entre os mecanismos
constitutivos gerais de defesa vegetal e fatores de virulência produzidos pelo patógeno. No
segundo a planta desenvolve a resistência adquirida depois do reconhecimento inicial do
patógeno.
Quando não adaptado à patogênese determinado microrganismo não é efetivo em
superar as defesas físicas e químicas inatas do vegetal, logo está configurada uma interação de
não-hospedeiro. Essas defesas podem ser divididas entre aquelas presentes antes da interação
com o microrganismo e aquelas formadas depois desse evento, são as chamadas defesas pré e
pós-formadas, respectivamente.
As defesas pré-formadas incluem todas aquelas que, passivamente, impedem ou
atrasam o acesso do microrganismo aos tecidos vegetais. Por outro lado as defesas pósformadas resultam numa continuidade da defesa inicial após o acesso do microrganismo ao
interior vegetal, esta já ativa e com a participação de genes envolvidos na defesa mediada por
ácido salicílico (salicilic acid - SA; FAN; DOERNER, 2012) e outros hormônios vegetais
como o ácido jasmônico (jasmonic acid - JA) e o etileno (etilene - ET).
Compostos de origem microbiana, bem como originados da degradação inicial dos
tecidos vegetais são reconhecidos pela planta desencadeando a resposta imune primária. Os
perfis ou padrões moleculares conservados (Microbial ou Pathogen-Associated Molecular
Patterns; MAMPs ou PAMPs) presentes nos microrganismos, são reconhecidos por
receptores de superfície do tipo LRR (Leucine Rich Repeat) associados a domínios quinase,
responsáveis pelo desencadeamento de fosforilações promotoras de resposta em cascata
(JONES; DANGL, 2006; NÜRNBERGER; KEMMERLING, 2006).
Os receptores do tipo LRR possuem um envolvimento crítico na resposta de
resistência do não-hospedeiro. Esses receptores são também chamados de Receptores de
Reconhecimento de Padrão (PRRs), e não pertencem as classes dos genes de resistência
envolvidos com a resposta HR (NUMBERGER et al., 2004).
A resposta inicial desencadeada (PAMP-Triggered Immunity-PTI) pode ser
bloqueada em parte ou inteiramente por efetores produzidos pelos patógenos (EffectorTriggered Susceptibility-ETS), estes efetores quando reconhecidos por receptores associados
aos genes de resistência geram uma segunda resposta (Effector-Triggered Immunity-ETI), a
de hipersensibilidade ou HR (JONES; DANGL, 2006). Essa segunda forma de resistência

(genes R) do modelo “gene-a-gene” evoluiu possivelmente devido às defesas basais serem
insuficientes em cultivares suscetíveis para evitar os efeitos danosos dos efetores patogênicos
(JONES; DANGL, 2006; NÜRNBERGER; KEMMERLING, 2006).
Os patógenos desenvolveram inúmeras estratégias para suprimir ou burlar a resposta
de defesa vegetal ou ainda induzir a suscetibilidade no hospedeiro, empregando mecanismos
baseados em agentes específicos de características bioquímicas diversas para escapar do
reconhecimento. Usualmente eliciadores, tais como carboidratos, glicoproteínas, proteínas,
peptídeos, e toxinas produzidas pelo patógeno são reconhecidos por receptores comumente
situados na membrana plasmática (WOLPERT et al., 2002; SHIRAISHI et al., 1997).
Após o reconhecimento desses eliciadores o vegetal ou ativa os mecanismos da
resistência sistêmica adquirida (RSA) pelo incremento nos níveis de ácido salicílico (AS) e
proteínas relacionadas à patogênese (proteínas-RP) contra patógenos necrotróficos
(BOSTOCK et al., 2001; AGRIOS, 2005) ou ativa a resistência sistêmica induzida (RSI) via
ácido jasmônico (JA) e etileno (ET) como sinal molecular (van LOON et al., 1998;
SIDDIQUI; SHAUKAT, 2004).
O caráter multiestratificado da resistência não especifica determinado pelas camadas
de mecanismos de proteção constitutivos e induzíveis tem sido alvo na busca de resistência
mais duradoura e de amplo espectro contrapondo os resultados já obtidos com a resistência
específica do tipo gene-a-gene. Os patógenos abordados são principalmente fungos bitróficos
como, por exemplo, as diferentes espécies causadoras de ferrugens e míldios. No entanto os
estudos têm sido estendidos para fungos necrotróficos e hemibitróficos. Entre os candidatos a
fungos hemibiotroficos temos as espécies de Colletotrichum.
Uma vez que alguns espécimes desse gênero fúngico já tiveram seu genoma
sequenciado, aliado à variedade de estilo de vida que vai desde a hemibiotrofia intracelular a
necrotrofia subcuticular tornam esses fungos candidatos a modelo biológico. Colletotrichum
já tem sido utilizado no estudo de NHR com Medicago truncatula (JAULNEAU et al., 2010)
uma leguminosa proposta como modelo para estudo de interação com rizóbio, isso porque se
dispõe de ferramentas biotecnológicas desenvolvidas para o estudo da genética reversa.
Comumente os estudos com os patógenos biotróficos tem utilizado a planta modelo
Arabidopsis thaliana e outras de interesse agronômico como trigo, arroz, café, Vicia fabae.
Os estudos apresentam uma diversidade de espécies abordadas e devido ao caráter
multiestratificado e gênico do fenômeno é necessário um sistema microrganismo-planta que
apresente vantagens no uso de ferramentas para estudo da resistência e que os resultados
abranjam o contexto das espécies cultivadas.

A transição tem sido feita para espécies de Bracicaceae por aproveitar as facilidades
do modelo A. thaliana e contrapor o fato daquele modelo não apresentar pontos positivos para
representar plantas cultivadas. As pesquisas com gramíneas encontram na planta modelo
Brachypodium respaldo para o estudo da resistência em gramíneas. No entanto falta um
modelo para as planta dicotiledôneas podemos citar Medicago truncatula para as leguminosas
do grupos das asterides faltando um representante para o grupo das rosides, logo podemos
propor Solanum lycopresicum cv. Micro Tom.

2.2 MicroTom como planta modelo
Arabidopsis thaliana e Lotus corniculatus são excelentes modelos vegetais para
pesquisas de base devido ao genoma conhecido e relativamente pequeno, bem como à
passividade de manipulação genética pela inserção de tDNA (transcript DNA, ARIE et al.,
2007; ARABIDOPSIS GENOME INITIATIVE, 2000). O uso de mutantes desse tipo em
pesquisas contribuiu consideravelmente para avanços do entendimento das interações plantapatógeno (KUNKEL; BROOKS, 2002; GLAZEBROOK, 2001; ARIE et al., 2007). No
entanto, A. thaliana possui limitações para o estudo de alguns aspectos dessa interação. Como
por exemplo, o fruto tipo vagem não a torna um modelo ideal para estudar patógenos de frutos
carnosos. Muitos insetos e microrganismos usados em conjunção com Arabidopsis tem
limitada relevância sob condições de campo (HARVEY et al., 2007). Por exemplo, os
Ascomicetos, que incluem os patógenos fúngicos predominantes nas lavouras, não são bem
representados dentre os patógenos conhecidos de Arabidopsis (ARIE et al., 2007). Alguns
sintomas e perdas no rendimento, observados em espécie cultiváveis, não são observados em
A. thaliana. Logo outros modelos vegetais para estudos de interação planta-patógeno são
necessários (TAKAHASHI et al., 2005; ARIE et al., 2007).
O repolho chinês (Brassica napa ou B. campestres) tem sido usado como alternativa
a Arabidopsis por ser da mesma família botânica. Porém o cultivo do repolho chinês é restrito
aos países do Leste Asiático, portanto tem valor limitado como modelo genérico (ARIE et al.,
2007). Espécies vegetais não-brassicácea, tais como Nicotiana attenuata, e Solanum nigrum
tem constituído excelentes modelos em estudos ecológicos da defesa vegetal em nível
molecular, incluso com o desenvolvimento de ferramentas moleculares e possibilidade de
ensaios em outras condições que não somente as da bancada do laboratório (KESSLER et al.,
2004; BALDWIN et al., 2006; SCHMIDT et al., 2004). Solanum lycopersicum cv Micro-Tom
é um bom modelo vegetal representante de Solanaceae e outras famílias botânicas com frutos
carnosos tipo baga (SCOTT; HARBAUGH, 1989).

Essa cultivar anã de tomate produz frutos maduros em aproximadamente dois meses
após a semeadura e é facilmente transformado com genes exógenos usando um sistema de
transformação mediado por Agrobacterium (MEISSNER et al., 1997). Enhancer trapping,
gene trapping, e sistemas de desligamento gênico baseados nos elementos tranponíveis Ac/Ds
e tDNA são descritos para Micro-Tom (MEISSNER et al., 1997). Já são conhecidos mutantes
hormonais da cultivar Micro-Tom, são eles: brt (pouco sensível a citocinina); dgt (pouco
sensível a auxina); not (deficiente em ABA); epi (super produtor de etileno); Nr (insensível a
etileno); procera (hipersensível a giberelina); gib3 (deficiente em giberelina); jai-1 (pouco
sensível a jasmonato).
Micro-Tom responde a uma ampla gama de patógenos fúngicos tanto quanto
cultivares comerciais de tomate. Takahashi et al. (2005) testando suscetibilidade de MicroTom a dezesseis patógenos bem conhecidos, observou que dez deles foram patogênicos a
Micro-Tom. No entanto não foram experimentadas respostas diferenciais de espécies fúngicas
intra-gênero sobre o modelo vegetal.
O modelo satisfaz os interesses científicos e agronômicos pelo fato de que tomateiro
é um dos vegetais mais populares do mundo e é bem caracterizado geneticamente
(EMMANUEL; LEVY, 2002).
No século XVI o tomate foi levado à Europa pelos exploradores espanhóis e depois o
melhoramento levou ao tomate atualmente cultivado (ARIE et al., 2007). O Brasil é o oitavo
maior produtor de tomate do mundo, tendo este comódite rendido 1,6 trilhões de dólares em
2011 (FAO, 2011). No entanto, seu cultivo mundial sofre com a abundância de doenças
causadas por diversos microrganismos são cerca de 60 doenças e mais de 110 espécies de
patógenos descritos (JONES et al., 1991). De acordo com The Phytopathological Society of
Japan (2000) naquele país, 41 fungos, 10 bactérias, 1 fitoplasma, 15 viroses, e 14 nematoides
são relatados como patógenos de tomate, muitos dos quais estão largamente distribuídos pelo
mundo. Lopes e Ávila (2005) elencaram quinze doenças fúngicas, sete bacterioses e sete
viroses afetando a produção de tomate no Brasil.
A maioria das espécies selvagens é usada como fonte de genes de resistência no
melhoramento moderno de tomate, pois são relativamente resistentes contra doenças (ARIE et
al., 2007). O L. peruvianum e L. chilense coletadas no Chile são atualmente resistentes ao
míldio e Alternaria alternata (OKABE et al., 2005). Muitas das características de resistência
a doenças, carregadas por muitas cultivares de tomate, foram introduzidas a partir de espécies
selvagens em cruzamento com S. lycopersicum (AIRES et al., 2007).

As características morfológicas, representatividade entre as plantas cultivadas,
disponibilidade de ferramentas desenvolvidas para estudos de genética reversa e a resposta a
uma ampla gama de patógenos tornam Micro-Tom um excelente modelo para estudos em
NHR.
Takahashi et al. (2005) testando suscetibilidade de Micro-Tom a dezesseis patógenos
bem conhecidos, observou que dez dos microrganismos causaram doença. Neste e em outros
estudos não foram avaliado espécies do gênero Colletotrichum.

2.3 Colletotrichum spp. como microrganismo modelo
O gênero Colletotrichum é um grande grupo dentro dos Ascomicetos, contem muitas
espécies que causam antracnose em uma gama de culturas e plantas ornamentais (BAILEY;
JEGER, 1992). Os sintomas são visíveis desde plântulas à planta adulta acometendo ramos,
folhas, inflorescências e frutos, é doença mais severa em regiões tropicais e subtropicais
(MENEZES, 2006).
As espécies de Colletotrichum infectam seus hospedeiros usando estratégias
similares, as quais iniciam com a deposição e o reconhecimento dos conídios sobre a
superfície do hospedeiro. Logo após a germinação dos conídios há a formação de estruturas
especializadas na infecção incluindo tubo germinativo, apressório melanizado, hifa primária
intracelular, e hifa secundária necrotrófica (LIAO et al., 2012; BHADAURIA et al., 2011;
BAILEY; JEGER, 1992). Por muitos anos espécies desse gênero são utilizadas em estudos de
interação fungo-planta, pois consistem em excelentes modelos para estudar as bases da
patogenicidade (PERFECT et al., 1999; BAILEY; JEGER, 1992).
O gênero Colletotrichum apresenta plasticidade na forma de obter nutrientes do
hospedeiro durante a colonização, nos estágios iniciais da infecção geralmente comporta-se
com biotrófico, obtendo nutrientes das células vivas do hospedeiro, e nas fases tardias da
doença nutre-se necrotroficamente, assimilando nutrientes depois de ter matado a célula
hospedeira (BHADAURIA et al., 2011). Por isso são citados como fungos hemibiotróficos,
existem relatos do comportamento endofítico não patogênico para algumas espécies do gênero
(LU et al., 2004; PHOTITA et al., 2005; PROMPUTTHA et al., 2007)
Algumas espécies estão comumente associadas a determinados hospedeiros, por
exemplo, C. lindemuthianum a leguminosas, principalmente a feijão comum (Phaseolus
vulgaris), C. musae, a frutos de bananeira (Musa spp.). Por outro lado C. gloeosporioides e C.
acutatum, podem ocorrer em diferentes famílias de hospedeiros (MENEZES, 2006).

O gênero Colletotrichum Corda (Teleomorfo: Glomerella Stonem.) é caracterizado
por frutificações setosas, denominadas acérvulos, nas quais conídios hialinos são produzidos
em massa alaranjada ou creme. Também podem ser formadas em ramificações laterais do
micélio (MENEZES, 2006). Os conídios produzidos nos acérvulos estão envolvidos por uma
matriz gelatinosa constituída de polissacarídeos e proteínas solúveis em água. Essa matriz,
provavelmente, protege os conídios da dissecação, aumentando a eficiência de germinação e
penetração no tecido hospedeiro. (MENEZES, 2006).
A germinação dos conídios ocorre somente na presença de água livre ou em elevada
umidade relativa (>90%). Na extremidade do tubo germinativo do conídio há formação de um
apressório, estrutura que pode também ser produzida na extremidade de hifas (MENEZES,
2006). No processo de infecção, o apressório adere à superfície do hospedeiro e por meio do
acúmulo de glicerol desenvolve uma pressão de turgor que o permite penetrar a camada
cuticular do hospedeiro com um fino peg de penetração ou infiltração e iniciar a colonização
dos tecidos vegetais (PERFECT et al., 1999; MENEZES, 2006) inicialmente com a
diferenciação do peg de penetração em uma hifa globulosa e biotrófica (BHADAURIA et al.,
2011), em C. truncatum está hifa primária permanece contida na primeira célula epidérmica
infectada durante toda a fase biotrófica (O’CONNELL et al., 1993).
Após a fase biotrófica o fungo muda para a fase necrotrófica que está associada com
a produção de uma fina hifa secundária que ramifica-se intra e inter-celularmente, matando e
decompondo os tecidos hospedeiro sendo esta mudança crítica no desenvolvimento da doença
(BHADAURIA et al., 2011).
A maioria das espécies de Colletotrichum exibe a estratégia de infecção
hemibiotrófica bifásica, embora a duração da fase biotrófica seja variável e esteja ausente em
muitas interações. Isto é exemplificado pelo processo de infecção de C. lindemuthianum em
feijão (Phaseolus vulgaris) depois da penetração as hifas fúngicas crescem no lumem celular
sem penetrar no protoplasto do hospedeiro, ou seja, elas crescem entre as membranas
plasmáticas e as paredes celulares (BAILEY; JEGER, 1992).

Figura 1 – Resumo de estratégias de infecção empregadas por algumas espécies de
Colletotrichum
Espécie de Colletotrichum

Planta hospedeira

Patógenos hemibiotróficos
C. lindemuthianum

Phaseolus vulgaris

C. graminicola

Zea mays

C. trucathum

Pisum sativum

C. gloeosporioides

Medicago sativa
Stylosanthes guianenses
Stylosanthes scabra

C. orbiculare

Cucumis sativus

C. destructivum

Vigna unguiculata

C. trifolii

Medicago sativa

C. sublineolum

Sorghum bicolor

Patógenos necrotróficos
C. capsici

Gossypium hirsutum
Vigna unguiculata

C. circinans

Allium cepa

C musae

Musa spp

C. gloeosporioides

Carica papaya
Muscadinia rotundifolia
Persea americana

Patógenos com ambas as estratégias de infecção
C. gloeosporioides

Citrus spp.
Stylosanthes spp.

Fonte: PERFECT et al. (1999)
.

Depois de colonizar uma ou mais células hospedeiras, a HI, que é biotrófica,
subsequentemente dá origem às hifas necrotróficas (LATUNDE-DADA et al., 1996). Em
muitas interações com Colletotrichum ainda não se sabe se ocorre uma fase biotrófica
(PERFECT et al., 1999).
Devido a características de infecção algumas espécies de Colletotrichum estão
comumente associadas a determinados hospedeiros (MENEZES, 2006). Ainda assim plantas
que não são considerados hospedeiras de C. acutatum podem servir como uma fonte de
inóculo potencial para a infecção de morango e permitir a sobrevivência do patógeno entre
estações (FREEMAN et al., 2001). Neste sentido, é importante dizer que uma simples espécie
pode causar doença em vários hospedeiros, como também, um único hospedeiro pode ser

atacado por várias espécies de Colletotrichum, as quais induzem sintomas semelhantes aos da
antracnose (MENEZES, 2006).
Disso depreende-se a importância da correta identificação da espécie associada a
doença naquele hospedeiro. A identificação da espécie de Colletotrichum é realizada por
aspectos da cultura e características morfológicas e dimensões dos conídios e apressórios.
Estes poucos caracteres analisados para separar espécies e subespécies podem ser imprecisos
para tal (CAI et al., 2011; KO KO et al., 2011) devido a grande plasticidade dessas
características frente a variações ambientais (PHOTITA et al., 2005).
Nas últimas duas décadas várias técnicas têm sido sugeridas como ferramentas
auxiliares à taxonomia morfológica de fungos. A saber, o uso de marcadores moleculares
principalmente DNA (WILLIAMS et al., 1990) além de padrões eletroforéticos de proteínas e
isoenzimas (PATERSON; BRIDGE, 1994). A identificação da espécie somente com base
morfológica, torna–se um tanto difícil devido à variabilidade na expressão dos caracteres
adotados, exigindo, portanto, a aplicação conjunta de outros métodos que possibilitem uma
diferenciação correta entre espécies (MENEZES, 2006), vários autores tem feito progressos
usando essa abordagem multifásica para a identificação de espécies de Colletotrichum
(WEIR; JOHNSTON 2010; WIKEE et al., 2011; YANG et al., 2011).

3 MATERIAL E METODOS
3.1 Obtenção de isolados adaptados e não-adaptados a MicroTom
Objetivando reunir uma coleção de isolados fúngicos candidatos a patógenos
adaptados a S. lycopersicum, realizou-se o isolamento direto e indireto a partir dos tecidos de
folhas de tomateiro S. lycopersicum e frutos de jiloeiro (S. gilo) com sintomas típicos de
antracnose. Tais tecidos foram obtidos, respectivamente, de plantas em lavouras do município
de Cacimbinhas, e em feiras-livres do município de Maceió, ambos em Alagoas.
Porções da zona de transição entre tecido sadio e doente foram desinfetadas
superficialmente em hipoclorito de sódio (NaOCl) [10 000µg*mL-1] durante 3 min, seguida
por duas lavagens sucessivas com água destilada estéril (ADE), e depositadas em placas de
Petri contendo meio BDA (batata 20%, dextrose 2%, aguar 1,5%) acrescido de 0,1% de
Tetraciclina.
As colônias resultantes, após incubação de cinco dias a 25oC ± 2 e 12h de
luminosidade, foram individualizadas em outras placas de Petri contendo BDA. Dessa vez
foram incubadas durante 10 dias a 27oC. Dessas placas foram preparadas suspensões conidiais
mediante a adição de 20mL de ADE seguida de leve esfregaço sobre o meio de cultivo. A
suspensão de conídios resultante foi filtrada em quatro dobras de compressa cirúrgica estéril e
então foi ajustada para a concentração de 103 conídios.mL-1.
Cem µL dessa suspensão ajustada foram espalhados sobre meio AA (aguar 1,5%,
água) em placas de Petri, as quais foram então incubadas no escuro a 25oC. Em intervalos
regulares de uma hora as placas foram examinadas ao microscópio, e os conídios germinados
foram individualmente transferidos para placas de Petri contendo meio BDA. Foram
considerados geminados os conídios que emitiram tubo germinativo de tamanho igual ou
superior ao seu comprimento.
Assim, após incubação a 27oC e 12h de luminosidade, obteve-se colônias
monospóricas de cada isolado. Estas foram então repicadas para tubos inclinados contendo
BDA os quais foram armazenados a 4oC ao abrigo da luz. Os cultivos monospóricos também
foram preservados imersos em ADE, e mantidos ao abrigo da luz à temperatura ambiente.
Candidatos a isolados não patogênicos foram obtidos da coleção de fungos da
Clínica Fitossanitária do Centro de Ciências Agrárias (CECA) vinculada à Universidade
Federal de Alagoas (UFAL).

3.2 Produção de plantas Micro-Tom
Para produzir plântulas a serem usadas em experimentos que requeriam a inoculação
de Solanum lycopersicum cv Micro-Tom, após semeadura sobre substrato Plantmax® e
vermiculita (1:1), as plântulas geradas foram transferidas para vasos com capacidade para 300
mL contendo a mesma formulação de substrato acrescida de1g de NPK (10:10:10)/L e 4g de
calcário dolomítico (Ca e Mg)/L. As plantas foram então mantidas em casa de vegetação sob
temperatura de 20oC ± 8 recebendo 1g de NPK (10:10:10)/L de substrato em intervalos de 15
dias. A irrigação foi realizada em intervalos de 48h ± 24 mantendo a umidade do substrato
próximo à capacidade de campo.
Todas as sementes foram gentilmente doadas pelo Dr. Lázaro Eustáquio Pereira
Peres (Universidade de São Paulo, Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz,
Piracicaba - SP).

3.3 Produção otimizada de conídios
A fim de obter um protocolo para produção de inóculo foram testados os meios de
cultivo sólidos: Batata-Dextrose-Agar (BDA; 20% batata, 2% dextrose), Aveia-Agar (AvA;
7,5% Aveia em flocos), Yeast Carbon Base–Agar (YCB; 1,17% yeast carbon base), Mathur’s
modificado (MS; 0,1% extrato de levedura, 0,1% bactopeptona, 1% sacarose, 0,25%
MgSO4·7H2O, 0,27% KH2PO4), Agar-V8 (AV8; 10% suco V8, 0,2% CaCO3), Agar-Malte
(AM; 2% extrato de malte, 2% dextrose, 0,1% peptona). Todos os meios de cultivo continham
1,5% de agar.
O isolado CF15 de Colletotrichum foi repicado para os cinco diferentes meios de
cultivo em três repetições biológicas. As quais foram incubadas escuro à temperatura de 25oC
± 2 durante dez dias. O diâmetro do micélio crescido, de cada repetição biológica, foi então
aferido ao sétimo dia de crescimento. Desse modo então a taxa de crescimento micelial foi
calculada através da equação: TC(mm*dia-1)= D*N-1, onde, D = Diâmetro médio atual e N =
Número de dias após a inoculação.
Decorridos 10 dias de crescimento micelial foi avaliada a produção de conídios. Para
tanto uma suspensão conidial foi preparada com 10mL de água destilada estéril, seguida de
contagem ao hemacitômetro. As médias aritméticas entre as repetições foram calculadas, para
cada tratamento de ambos os experimentos, e estas foram submetidas a uma análise de
variância pelo teste de Tukey no nível de 5% de probabilidade. Tal teste foi aplicado usando a
sequencia lógica do programa de computador Assistat 7.6 Beta.

3.4 Identificação dos isolados de Colletotrichum
3.4.1 Morfocultural
Para poder observar as características da colônia bem como obter esporos para
morfometria, cada isolado monospórico foi repicado para placas de Petri contendo meio BDA
e incubados durante 10 dias no escuro a temperatura de 27oC. Decorrido esse tempo, as
colônias formadas foram fotografadas e informações quanto à forma, textura e coloração
foram coletadas. Dessas colônias foram preparadas suspensões de conídios as quais foram
ajustadas para a concentração de 103 conídios.mL-1.
Uma gota de 50µL de cada suspensão foi depositada sobre lâmina de vidro para
microscopia em cinco repetições. As lâminas contendo as gotas foram então submetidas à
condição de câmara úmida até a germinação dos conídios e formação de apressórios. Os
conídios germinados foram então fixados mediante a adição de uma gota de lactofenol (ácido
lático, H2O, fenol, glicerina 1:1:1:2; 0,5% de azul de algodão) mais solução de Shear (H2O,
glicerina, etanol 95% 5:2:3; acetato de potássio 3%) e montados entre lâmina e lamínula.
Cinquenta conídios e apressórios foram medidos bidimensionalmente (comprimento,
largura e relação entre ambas) ao microscópio de luz acoplado ao sistema de captura de
imagem. As medições sobre as imagens capturadas foram feitas com o programa de
computador Bel MicroImage Analizer 2.3. De posse desses dados foram calculados a média e
o desvio padrão.

3.4.2 Molecular rDNA (ITS)
Visando ratificar a identificação morfológica e bioquímica por padrões
eletroforéticos de proteínas, procedeu-se para viabilizar o sequenciamento e comparação entre
as sequencias ITS dos isolados de Colletotrichum com as já depositadas em bancos de dados
dessa natureza. Para tanto cinco discos de BDA (batata 20%, dextrose 2% e agar 1,5%)
contendo micélio de cada isolado foram inoculados em 100mL do meio BD (20% batata, 2%
dextrose) durante sete dias, a temperatura de 25 ±2oC, e 12 horas de luz, com agitação
contínua de 30rpm.
A coleta micelial de cada isolado foi feita por filtração seguida por duas lavagens
sucessivas com ADE (água destilada esterilizada) gelada. Todo micélio foi então pulverizado
na presença de nitrogênio líquido e armazenado à temperatura de -80oC para uso futuro.
Aproximadamente 1g da massa micelial congelada foi pulverizada na presença de
nitrogênio líquido. Na sequência foi adicionado 650µL de tampão de extração (3%CTAB,
1,4M NaCl, 20mM EDTA, 100mM Tris/HCl pH 8, 1% PVP) a cerca de 0,1g de tecido

micelial macerado. A mistura foi homogeneizada e incubada a 65oC durante uma hora com
vigorosas agitações a cada dez minutos.
A desproteinização foi feita mediante três lavagens com uma mistura de clorofórmio
e álcool isoamílico (CIA) 24:1. Os ácidos nucleicos foram precipitados pela adição de 650µL
de isopropanol gelado. O precipitado foi lavado com etanol 70%, seco à 37oC e ressuspendido
em 30µL de tampão de eluição (TE - 10 mM Tris, 1 mM EDTA acrescido de RNAse) pH 8.0.
A concentração de DNA em cada amostra foi aferida em fluorômetro e uma alíquota foi
ajustadas para 10ng*µL-1.
Aproximadamente 25ng de DNA foram usados em cada reação de PCR (polimerase
chain reaction), além dos pares de iniciadores: ITS 1 e 4 e ITS 3 e 4. A reação de PCR foi
realizada com o seguinte ciclo termal: 94oC por 3min., seguido por 35 ciclos de denaturação a
94oC por 1min., anelamento a 58oC por 30s e alongamento a 72oC por 1min, com uma etapa
final de extensão a 72oC por 7min. Parte dos produtos da PCR foram corados com Sybr green
e após eletroforese de 3V*cm-1 durante pelo menos duas horas em gel de agarose 1,5%, foram
visualizados por transluminação em luz ultravioleta.
A parte restante dos amplificados foram então precipitados pela adição de igual
volume de isopropanol gelado e centrifugação a 13 000 rpm à 4oC. O precipitado foi lavado
com etanol 70% e seco por não mais que 10 min a 37oC. Só então foi ressuspendido em água
MilliQ. Após tal procedimento a concentração do precipitado foi aferida via florômetro e
eletroforese em gel de agarose 2%. O DNA amplificado foi então diluído à concentração de
8ng*µL-1 e estocado a -80oC para sequenciamento futuro.

3.5 Caracterização dos isolados de Colletotrichum
3.5.1 Teste de infiltração
Para investigar a produção de enzimas ou toxinas extracelulares produzidas pelos
diferentes isolados, estes foram crescidos em meio de cultivo líquido rico em carboidratos e
em outros meios de cultivo pobres suplementados com diferentes fontes de nitrogênio.
De cada isolado fúngico, cinco discos de BDA contendo micélio aos cinco dias de
crescimento foram inoculados em 100 mL do meio BD (20% batata, 2% dextrose), YCB ta10,
YCBta2 (1,17% Yeast carbon base, 10 e 2µM tartarato de amônio (C4 H12 N2 O6)), YCBnp10,
YCBnp2 (1,17% Yeast carbon base, 10 e 2µM nitrato de potássio (KNO3)) durante sete dias, a
temperatura de 25 ±2oC, sob fotoperíodo de 12 horas, com suave agitação contínua de 30rpm.
A massa micelial foi filtrada e o meio líquido (40mL) contendo as proteínas
secretadas foi coletado. Após centrifugação a 10 000 rpm, 4ºC durante 30 minutos o

precipitado foi descartado e o sobrenadante foi armazenado a -20oC. Dos meios líquidos de
cultivo foram retiradas alíquotas de 1mL os quais foram contidos, individualmente, em
seringas descartáveis de 3mL utilizadas para infiltrar três folíolos por planta de Micro-Tom
aos 55 dias pós semeadura. Cada folíolo conteve três pontos de infiltração. As plantas foram
inspecionadas diariamente, durante sete dias, em busca de alterações físicas nas adjacências
dos pontos de infiltração.

3.5.2 Teste de patogenicidade
Para confirmar e/ou conhecer o comportamento patogênico ou não de cada isolado
sobre S. lycopersicum, os isolados monospóricos foram cultivados em meio BDA durante sete
dias. Depois foram sacados discos do meio contendo micélio da zona de crescimento ativo
dos isolados. Tais discos foram inoculados sobre penta perfuração em folhas e frutos
destacados de tomateiro. Todos foram previamente desinfetados superficialmente mediante
lavagem com água e sabão seguida de imersão durante 20 minutos em solução NaOCl
[300µg*mL-1] e duplo enxague em ADE.
Um chumaço de algodão embebido em ADE foi envolto na extremidade proximal do
pecíolo foliar, a qual foi depositada sobre placa de Petri assim como os frutos. Os órgãos
inoculados foram mantidos em câmara úmida durante sete dias, período no qual foram
examinados diariamente quanto à presença de cloroses, escurecimentos, necroses e lesões
deprimidas.
Foram inoculadas três órgãos (repetição biológica) por isolado fúngico (tratamento)
além de um controle negativo inoculado com discos de BDA asséptico. As parcelas que
exibiam um ou mais desses sinais foram monitoradas e o diâmetro da lesão foi medido às
72hai (horas após inoculação).
Às 168hai foram fotografados pontos de inoculação foliolar de cada tratamento. Para
tal empregou-se o microscópio estereoscópico conjugado ao sistema de captura de imagem. O
aumento empregado foi de aproximadamente 40 vezes. As imagens foram tratadas quanto a
brilho e contraste com o programa de computador Microsoft® Picture Manager 2010 14.0 e o
tamanho reconfigurado guardando as proporções da imagem original capturada. A média
aritmética entre as repetições foi calculada para cada tratamento e estas submetidas a uma
análise de variância pelo teste de Tukey no nível de 5% de probabilidade. Tal teste foi
aplicado usando a sequencia lógica do programa de computador Assistat 7.6 Beta.

3.5.3 Avaliação da resistência
Objetivando identificar indícios de que tipo de resistência acontece na interação entre
os isolados com monocotiledoneas (Musaceae) e rosides (Fabaceae) estes foram cultivados
em meio BDA durante sete dias. Depois foram sacados discos do meio contendo micélio da
zona de crescimento ativo de todos os isolados fúngicos. Tais discos foram inoculados sobre
penta perfuração de agulha em folhas destacadas de Phaseolus lunatus e em frutos destacados
de Musa sp.. Todos previamente desinfetados superficialmente mediante lavagem com água e
sabão seguida de imersão durante 20 minutos em solução NaOCl [300µg*mL-1] e duplo
enxague em ADE.
Os órgãos inoculados foram mantidos em câmara úmida durante dez dias, período no
qual foram examinados diariamente quanto à presença de cloroses, escurecimentos, lesões
deprimidas e necroses. As parcelas que exibiram um ou mais desses sintomas foram
monitoradas e medidas no progresso daqueles sintomas (diâmetro da lesão). A média
aritmética entre as repetições foi calculada para cada tratamento e estas submetidas a uma
análise de variância pelo teste de Tukey no nível de 5% de probabilidade. Tal teste foi
aplicado usando a sequencia lógica do programa de computador Assistat 7.6 Beta.

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Obtenção de isolados adaptados e não-adaptados a MicroTom
A prospecção de espécies de Colletotrichum adaptados a Solanaceae resultou na
obtenção de cinco isolados monospóricos. Desses, quatro (CF13, CF 15, CF16 e CF17) foram
isolados de uma única planta sintomática de tomateiro e o último deles (JL) isolado do fruto
sintomático de Solanum gilo.
A ocorrência, em um mesmo indivíduo hospedeiro, de mais de um isolado de
Colletotrichum com características morfofisiológicas distintas é amplamente relatada
(MENEZES, 2006; HYDE et al., 2009; SERRA et al., 2011). Dessa observação depreende-se
a plasticidade no estilo de vida do fungo quando em interação com aquele hospedeiro, podem
atuar sobre o vegetal como patógeno, endofítico, ou ainda sofrer as limitações relativas a
patógenos não adaptados (MENEZES, 2006; RANATHUNGE et al., 2012).
Respostas quanto ao estilo de vida e estratégia de infecção devem ser alcançadas
através de testes de patogenicidade a Solanaceae e a outras famílias botânicas distantes
filogeneticamente para entender mais sobre a complexa relação patógeno-hospedeiro moldada
durante coevolução. (EL OIRDI, 2011; PIETERSE; DICKE, 2007). Baseado na distância
filogenética com Solanaceae foram selecionados da coleção de fungos da Clínica
Fitossanitária do CECA, os isolados WT13 oriundo de folhas de Phaseolus lunatus (fava)
identificado como C. truncatum e CM obtido de frutos sintomáticos de Musa sp. (bananeira)
identificado como C. musae. Ambos foram submetidos a novo processo de identificação
morfológica e teste de patogenicidade a Solanum lycopersicum.

4.2 Produção otimizada de conídios
Os estudos de interação entre patógeno e hospedeiro requerem muitas vezes a
inoculação dos tecidos vegetais com estruturas infectantes do microrganismo. Quando se
investiga resistência do não-hospedeiro, a estrutura de dispersão do microrganismo é o
principal produto para a inoculação, uma vez que observando a interação e desenvolvimento
destas estruturas sobre o tecido vegetal é possível indicar onde a mesma não se adapta ao
hospedeiro. Para Colletotrichum a estrutura dispersiva é o conídio, na natureza estes são
produzidos preferencialmente em acérvulos, em condições artificiais são produzidos em
pseudoacérvulos ou nas pontas das hifas, depois do necessário crescimento micelial e expólio
de nutrientes.
O teste de taxa de crescimento micelial frente a diferentes meios de cultivo sólido
revelou que o meio de cultivo a base de Extrato de Malte (AM) proporcionou a maior taxa de

crescimento micelial para o isolado CF15, diferindo estatisticamente dos demais meios de
cultivo testados. O meio de cultivo Mathur’s (MS) não diferiu do AV8 enquanto este não
diferiu do BDA nem do Aveia (AvA). Contudo todos diferem de YCB o qual proporcionou a
menor taxa de crescimento micelial do isolado CF15 entre os meios de cultivo testados
(Figura 2).
A presença de uma fonte proteica na formulação dos meios de cultivo que obtiveram
os melhores resultados, AM – peptona e MS – bactopeptona, como também observado por
Couto e Menezes (2004) estudando o efeito da nutrição sobre crescimento micelial e
esporulação de C musae, essas observações apontam para a importância desse ingrediente em
experimentos onde é requerido um crescimento micelial rápido com esperada consequência
do incremento na massa seca. Muito embora, os protocolos habituais de produção micelial
para extração de biomoléculas sugiram o meio de cultivo Emerson (0,4% extrato delevedura,
1,5% amido, 0,1% K2HPO4, 0,05% MgSO4) (XIAO et al., 2004).
Couto e Menezes (2004) observaram a mesmo efeito sobre a produção de conídios da
maioria dos isolados utilizados naquele estudo. No entanto a quantificação da produção de
conídios no presente estudo mostrou que a maioria dos meios de cultivo não diferem
estatisticamente, exceto o meio de cultivo BDA o qual proporcionou uma produção de
conídios 26,8 vezes superior ao meio YCB (Figura 2B), o segundo melhor. Embora o
coeficiente de variação deste ensaio tenha ficado dentro de limites aceitáveis em experimentos
biológicos (12,89%).

Figura 2 – Comportamento do isolado CF15 frente a diferentes meios de cultivo. Letras minúsculas iguais
nas colunas não diferem estatisticamente no teste de Tukey (p < 0.05). A - Taxa de crescimento micelial em
sete dias (dms = 0,39 CV% = 1,45). B - Produção média de conídios no décimo dia (dms = 1,6 CV% =
12,89).

Fonte: AUTOR

4.3 Identificação dos isolados de Colletotrichum
4.3.1 Morfocultural
Para identificar inicialmente os isolados de Colletotrichum desse estudo foi utilizada
a caracterização morfocultural baseada em aspectos como cor e textura da colônia, além da
morfometria de conídios e apressórios, tais observações revelaram para o isolado CF13 uma
coloração salmão escurecida com micélio aéreo esbranquiçado, textura cotonosa pouco densa
e presença de corpos de frutificação associados a gotículas translúcidas, aparentemente
composta por água (Figura 3A). As dimensões médias dos conídios foram de 22,96µm ± 1

por 3,19µm ± 0,3 e dos apressórios de 16,26µm ± 2,5 por 7,07µm ± 0,6 (Figura 5). Essas
características identificaram o isolado como Colletotrichum gloeosporioides (C.g.1) segundo
Sutton (1980).
Ainda baseado no mesmo autor o isolado CF15 por exibir coloração branca
amarelada, acinzentado no centro da colônia, textura compacta aveludada (Figura 3B) e o
verso uniformemente branco amarelado, conídios retos e fusiformes constritos medianamente
com dimensões médias de 19,11µm ± 1,2 por 3,63µm ± 0,4 e apressórios medindo 14,71µm ±
1,3 por 7,7µm ± 1 (Figura 4A e B), e por ter sido isolado de uma Solanaceas, trata-se de
Colletotrichum coccodes.
As colônias do isolado CF16 apresentaram massa micelial branca e pouco densa
(Figura 3C), no entanto não foram produzidos conídios até o momento da avaliação. Por isso
não foi possível identificar tal isolado. Já o isolado CF17 apresentou micélio salmão
esbranquiçado (Figura 3D) de verso negro e textura compacta aveludada, os conídios
exibiram dimensões médias de 22,95µm ± 0,8 por 3,15µm ± 0,2, já nos apressórios foram de
16,83µm ± 2,4 por 6,99µm ± 0,5 (Figura 5). Assim, de acordo com Sutton (1980), trata-se de
C. gloeosporioides (C.g.2) assim como o isolado CF13, inicialmente ambos os isolados foram
separados devido a características culturais distintas após o isolamento enquanto ainda em
colônia multispórica. Uma vez que, segundo Photita et al. (2005) a caracterização baseada
somente em caracteres morfológicos muitas vezes não é descritiva para separar espécies de
Colletotrichum, outras abordagens e técnica devem ser empregadas com essa finalidade.
O isolado JL mostrou massa micelial cinza esbranquiçada de bordas salmão, textura
aveludada densa (Figura 3E) e o verso branco amarronzado mais escuro ao centro da colônia.
Somada a morfometria dos conídios 15,18µm ± 1,5 por 3,54µm ± 0,4 e apressórios 8,59 µm ±
0,5 por 5,96µm ± 0,4 (Figura 4C e D), logo o isolado Jiló foi compatíveis com Colletotrichum
acutatum (C.a.) (SUTTON, 1980).
Os isolados obtidos da Clínica Fitossanitária tiveram a identificação confirmada. O
Colletotrichum truncatum (C.t.) possui colônia negra acinzentada de bordas esbranquiçadas,
micélio aveludado e pouco denso (Figura 3F). Pseudoacérvulos puderam ser observados sob a
forma de granulações por toda superfície do meio de cultivo. Os conídios fortemente falcados
medindo 24,57µm ± 0,6 por 3,34µm ± 0,6, apressórios com dimensões de 16,33µm ± 0,8 por
8,23µm ± 0,4 (Figura 5) e a relação com Fabaceae confirmaram o isolado WT13 como C.
truncatum. O Colletotrichum musae (C.m.) mostrou micélio flocoso e porções salmão com
micélio submerso e outras brancas aveludadas (Figura 3G). Corpos de frutificação negros
foram observados no verso e reverso neste último também foi possível observar uma

mucilagem alaranjada sobre os corpos de frutificação. Tal mucilagem também foi observada
por Couto e Menezes (2004). Os conídios medindo 10,86µm ± 1,2 por 4,73µm ± 0,7 e os
apressórios com 9,14µm ± 1,4 por 7,19µm ± 1,2 (Figura 4E e F) confirmam a identificação.
Figura 3 - Colônias de Colletotrichum spp. aos 10 dias de crescimento sobre BDA a 25oC e 12h de luz. A –
CF13 - C. gloeosporioides (C.g.1), B – CF15- C. coccodes (C.c.), C – CF16, D – CF17- C. gloeosporioides
(C.g.2), E – JL- C. acutatum (C.a.), F – C. truncatum (C.t.), G – C. musae (C.m.).

Fonte: AUTOR

Figura 4 - Conídios e apressórios de Colletotrichum x400. A e B – C.c, C e D – C.a., E e F – C.m.

Fonte: AUTOR

Figura 5 – Quadro-resumo das características analisadas para identificar morfometricamente os isolados de Colletotrichum..
Isolado

Espécie

Abreviatura

Hospedeiro

Colônia

Conídio (µm)

Apressório (µm)

CF13

Colletotrichum
gloeosporioides

C.g.1

Solanum lycopersicum

Salmão e branca

22,96 ± 1 x 3,19 ± 0,3
C/L 7,28 ± 0,8

16,26 ± 2,5 x 7,07 ± 0,6
C/L 2,31 ± 0,4

CF15

C. coccodes

C.c.

S. lycopersicum

Branca amarelada e
cinza

19,11 ± 1,2 x 3,63 ± 0,4
C/L 5,32 ± 0,6

14,01 ± 1,3 x 7,72 ± 1
C/L 1,94 ± 0,3

CF16

S. lycopersicum

Branca

CF17

C. gloeosporioides

C.g.2

S. lycopersicum

Salmão e branca

22,95 ± 0,8 x 3,15 ± 0,2
C/L 7,33 ± 0,7

16,83 ± 2,4 x 6,99 ± 0,5
C/L 2,41 ± 0,3

C. acutatum

C.a.

S. gilo

Cinza e salmão

15,18 ± 1,5 x 3,54 ± 0,4
C/L 4,36 ± 0,7

8,59 ± 0,5 x 5,96 ± 0,4
C/L 1,44 ± 0,1

WT13

C. truncatum

C.t.

Phaseolus lunatus

Cinza e banca

24,57 ± 0,6 x 3,34 ± 0,6
C/L 7,67 ± 1,6

16,33 ± 0,8 x 8,23 ± 0,4
C/L 1,99 ± 0,1

C musae

C.m.

Musa sp.

Salmão e branca

10,87 ± 1,2 x 4,7 ± 0,7 C/L
2,3 ± 0,5

9,14 ± 1,4 x 7,19 ± 1,2
C/L 1,29 ± 0,2

Fonte: AUTOR

4.3.2 Molecular rDNA (ITS)
A identificação de Colletotrichum baseada apenas na morfologia, tamanho e forma
de conídios, aspecto e coloração da colônia, é problemática devido aos poucos caracteres
analisados para separar espécies e subespécies, os quais podem também ser imprecisos para
tal (CAI et al., 2011, KO KO et al., 2011). Aliada a isso a plasticidade de características
morfológicas influenciadas pelas variações ambientais e a existência de formas intermediárias
tornam os caracteres morfológicos inapropriados para sozinhos discernir entre espécies de
Colletotrichum (PHOTITA et al., 2005). Assim, técnicas moleculares oferecem métodos
alternativos à caracterização morfológica e fisiológica para estudos de taxonomia em
fitopatologia (BORMAN et al., 2008). Além de serem usadas em estudos ecológicos que
buscam identificar indivíduos ou clones dentro de populações (GLASS; DONALDSON,
1995). Esses estudos baseiam-se principalmente na análise das sequencias de nucleotídeos de
regiões conservadas do genoma fúngico.
A maioria das análises filogenéticas focam no DNA ribosomal (rDNA), que contem
repetições conjugadas de três genes (28S, 18S, e 5.8S) (GLASS; DONALDSON, 1995;
GIARETTA et al., 2010). Utilizando iniciadores ITS (internal transcribed spacer),
comparações entre as sequencias de DNA são usadas para inferir sobre relações
evolucionárias entre diferentes grupos fúngicos (BRUNS et al., 1992). Previamente à análise
de sequencias é necessária a extração e amplificação da região conservada alvo. O método de
extração empregado nesse estudo mostrou-se eficaz para todos os isolados (Figura 6). No
entanto a instabilidade do ácido nucleico pós-extração dificultou a reação de PCR para o
isolado CF15. Todos os isolados amplificaram com a combinação de iniciadores ITS 3 e 4, de
outro modo foi a combinação ITS 1 e 4 a qual não foi efetiva em amplificar a região alvo dos
isolados CF13 e CF17, ambos identificados morfologicamente como C. gloeosporioides
(Figura 7).

Figura 6 – DNA genômico submetido a duas horas de eletroforese 3V*cm-1 em gel de agarose 0,8%.

Fonte: AUTOR
Figura 7 – Produto de PCR visualizado após duas horas de eletroforese 3V *cm-1 em gel de agrose 1,5%.
Utilizou-se a combinação de iniciadores ITS 3 e 4 para C.g.1 e C.g.2 e ITS 1 e 4 para os demais. A direita
amplificação realizada somente C.c., visto a ausência de amplificação na primeira PCR.

Fonte: AUTOR

O fato de que os isolados C.g.1 e C.g.2 amplificaram com a combinação ITS 3 e 4
porém não com ITS 1 e 4 sugere algum problema no anelamento do iniciador ITS1, se por
não complementaridade reforça o observado por White et al. (1990) quando desenvolveram
iniciadores espécie-específicos baseados na sequencia de ITS1 para C. gloeosporioides. De
forma semelhante fez Sreenivasaprasad et al. (1996) para C, acutatum, no entanto a
amplificação com os iniciadores ITS 1 e 4 no presente estudo não demonstrou qualquer
problema para C.a., requerendo confirmação da caracterização morfológica.

No International Nucletoide Sequence Databases já há depositadas sequências ITS
de Colletotrichum e Glomerella e estes dados são frequentemente usados para o diagnóstico
de espécies do gênero (LOBUGLIO; PFISTER, 2008, CROUCH et al., 2009). No entanto o
ITS sozinho não pode ser usado para uma identificação confiável de espécie, principalmente
para as espécies do complexo C. gloeosporioides (CAI et al., 2009), estima-se que mais de
86% dos chamados C. gloeosporioides no GenBank divergem filogeneticamente do espécime
tipo (CANNON et al., 2008), provavelmente tratam-se de outras espécies de Colletotrichum.
Possivelmente a identificação molecular baseada na sequencia ITS de C.g.1 e C.g.2 seja
dificultada por esse fato.
4.4 Caracterização dos isolados de Colletotrichum
4.4.1 Teste de infiltração
Os fungos dispõem de um amplo arsenal enzimático extracelular que desempenha
um papel importante na patogênese permitindo a penetração e colonização do tecido
hospedeiro. (JARAMILLO, 2013; VALUEVA; MOSOLOV, 2004). O experimento objetivou
caracterizar os isolados pela reação do tecido vegetal quando infiltrado com proteínas ou
toxinas secretadas em meio de cultivo. Os resultados ajudam na caracterização da
patogenicidade, agressividade e tipo de interação entre fungo e planta. Assim avaliando a
atividade das proteínas fúngicas secretadas em meio de cultivo líquido contra o tecido foliar
de Micro-Tom observou-se a promoção de lesões no extrato de C.g.2 em meio rico em
carboidrato (BD+C.g.2, Figura 8B), e no extrato de C.c. tendo como fonte de nitrogênio
nitrato de potássio (YCBnp10+C.c., Figura 8C).

Figura 8 - Folhas de Micro-Tom infiltradas com meio de cultivo líquido onde cresceram Colletotrichum
spp.. A – ADE. B – BDA+C.g.2, C – YCBnp10+C.c.).

Fonte: AUTOR

A provável produção e excreção de toxinas ou de enzimas envolvidas na degradação
celular foi observada para isolado C.g.2 somente quando este cresceu em meio líquido BD
rico em carboidratos, podendo esse fenômeno indicar a influência do estado nutricional
fúngico sobre a patogenicidade do mesmo. O isolado C.c, produziu enzimas ou toxinas
quando cresceu em meio líquido pobre de composição semelhante ao meio sólido (YCB)
empregado no experimento de taxa de crescimento micelial onde apresentou o menor
crescimento (Figura 2A), suplementado com 10µM de KNO3. No mesmo meio com redução
da fonte de nitrogênio (2µM de KNO3) o isolado C.c. não exibiu o mesmo comportamento. O
estresse nutricional adicional causado pela redução de nitrogênio anulou a produção do fator
que causa morte do tecido. A redução de nitrogênio ou alteração da relação Carbono e
Nitrogênio teve efeito na produção dos elementos que causaram a morte do tecido infiltrado,
devendo esta relação nutricional ser explorada. Sugerindo o estresse causado pela falta de
nitrogênio que além do estresse nutricional a concentração da fonte de nitrogênio também
implica na produção das substâncias nocivas ao tecido vegetal.
De maneira geral a adaptação metabólica para aproveitar melhor uma ou outra fonte
de carboidrato é bastante variável, incluso entre isolados da mesma espécie como observado
por Barbosa et al (2002) estudando as melhores fontes de carboidrato e nitrogênio, além da
relação C/N ideal para crescimento e esporulação de isolados de Verticillium lecanii.

Mafacioli et al. (2008) estudando a variação na agressividade de C.gloeosporioides, isolado
de folhas de pupunha Bactris gasipaes monocotiledonea (Arecaceae), crescidos em diferentes
fontes de carboidrato verificaram que a agressividade foi maior quando o fungo foi nutrido
com amido em vez de glicose ou maltose. Tal fenômeno pode estar relacionado à dificuldade
de digestão e assimilação do amido, um polímero maior que à glicose e a maltose ou ainda o
amido é uma fonte mais energética e portanto nutri melhor o fungo, o qual produz conídios de
maior vigor e capacidade de suplantar as defesas basais do vegetal e causar doença.
No presente experimento relação semelhante não se aplica, pois a causa das lesões
foi provavelmente uma enzima ou toxina secretada no meio de cultivo líquido durante o
crescimento fúngico e não devido a conídios mais vigorosos. Isso aponta para uma possível
estratégia necrotrófica empregada por C.g.2 e C.c. quando, o primeiro, em condição
abundante em nutriente e o segundo em condição deficiente de nutrientes. Essa suposição
pode ser reforçada em um teste de patogenicidade sobre folhas e frutos de tomateiro, desse
modo espera-se que sobre folhas de tomateiro onde a reserva de amido tende a ser menor C.c.
seja mais agressivo ao passo que sobre frutos de tomateiro um órgão com reserva energética
maior C.g.2 seja mais agressivo.

4.4.2 Teste de patogenicidade
O teste foi realizado para confirmar o comportamento como patógeno adaptado e não
adaptados das diferentes espécies de Colletotrichum avaliadas nesse estudo correlacionando
com os resultados obtidos no teste de infiltração. Inicialmente procedeu-se ao teste de
patogenicidade sobre folhas e frutos de S. lycopersicum. O teste revelou que todos os isolados
(C.g.1, C.c., CF16, C.g.2 e C.a.) são patogênicos e portanto adaptados a colonizar folhas e
frutos de S. lycopersicum (Figuras 9 e 10). Considerando que os quatro primeiros foram
isolados da mesma planta a patogenicidade dos mesmos pode habilitá-los como modelo para
estudos focados no sinergismo entre as espécies de patógeno durante interação com um
hospedeiro. Tal abordagem de pesquisa tem sido requerida e ansiada, pois pode contribuir
para o conhecimento ecológico e mais próximo do que ocorre na natureza quando o
hospedeiro interage simultaneamente com vários patógenos e mutualistas (Morris et al.,
2007).
Uma gradação da agressividade sobre folhas foi observada. O isolado CF16 foi o
mais agressivo considerando o diâmetro absoluto da lesão, no entanto o mesmo não diferiu
estatisticamente de C.g.1 e C.g.2. Em um nível de agressividade menor estão C.c. e C.a. e no
extreme inferior estão C.t. e C.m. os quais não causaram doença sobre folhas de S.

lycopersicum (Figuras 9F e 10G e H). Sobre frutos, embora observada uma variação nos
valores absolutos do diâmetro médio de lesão entre C.c., CF16 e C.g.2 os quais produziram
lesões maiores que C.g.1 e C.a., não houve diferença estatística entre os cinco. O ensaio
confirma que C. trucantum (C.t.) e C. musae (C.m) são patógenos não-adaptados a S.
lycopersicum. A resistência do não-hospedeiro (NHR) de S. lycopersicum foi confirmada para
C.t. e C.m. os quais não causaram doença sobre folhas nem frutos, portanto mostraram-se nãoadaptados a colonizar tecidos testados de S. lycopersicum.
Os resultados do teste de patogenicidade quando confrontados com os do teste de
infiltração sugerem que a produção de enzimas hidrolíticas e toxinas não é essencial para a
patogenicidade das espécies C.g.1, CF16 e C.a.. As lesões ocasionadas por C.g.2 e C.c. no
teste de infiltração apontam para que ambos utilizem uma estratégia necrotrófica de nutrição e
consequente infecção revelando haver diferença intraespecífica nessa característica (C.g.1 e
C.g.2). Suspeitou-se que C.c seria mais agressivo sobre folhas e C.g.2 sobre frutos devido a
disponibilidade energética nos diferentes órgãos vegetais. Os resultados demonstraram o
contrário C.c. mostrou-se menos agressivo sofre folhas que C.g.2 em valores absolutos, muito
embora C.c e C.g.2 não tenham diferido estatisticamente (Figura 11).

Figura 9 - Folhas Micro-Tom após 168 h da inoculação com discos de BDA contendo micélio. Atestemunha, B – C.c., C – CF16, D – C.g.2, E – C.a., F – C.t..

Fonte: AUTOR

Figura 10 - Frutos de tomateiro inoculados com discos de BDA contendo micélio. A – testemunha, B –
C.g.1, C – C.c, D – CF16, E – C.g.2, F – C.a., G – C.t., H – C.m..

Fonte: AUTOR

Figura 11 - Teste de patogenicidade sobre folhas (A) e frutos (B) destacados de tomateiro. Letras
minúsculas iguais nas colunas não diferem estatisticamente no teste de Tukey (p < 0.05). A – dms = 2,53
CV% = 14,95. B – dms = 5,63 CV% = 26,58.

Fonte: AUTOR

4.4.3 Avaliação da resistência
No teste de patogenicidade sobre folhas e frutos de S. lycopersicum, C.t. e C.m.
comportaram-se como fungos não adaptados, isso os elege como espécies contrastantes a
aquelas patogênicas a tomateiro em estudos de interação planta-patógeno. Logo a seleção de
espécies adaptadas a Solanaceae e não adaptadas a Fabaceae e Musaceae, bem como a seleção
de espécies adaptadas às três famílias botânicas é de especial interesse para estudos de NHR

com abordagem ecológica e evolutiva, visto que a complexa relação de ataque e defesa entre
vegetais e microrganismos foi moldada mediante co-evolução (EL OIRDI, 2011).
A investigação de espécies adaptadas e não adaptadas a Fabaceae e Musaceae
procedeu-se com o teste de severidade a folhas de Phaseolus lunatus e frutos Musa sp., o qual
revelou que todas as espécies foram patogênicas a folhas de P. lunatus exceto C.g.1 e C.m.
Ambos não diferiram estatisticamente entre si e nem da testemunha não inoculada (Figuras 12
e 14A ). Contra frutos destacados de Musa sp. fica clara a patogenicidade apenas de C.m.
dentre as espécies testadas, apesar do alto coeficiente de variação 33,63% (Figuras 13 e 14B).
Os resultados apontam C.g.1 e C.a. como não adaptados a P. lunatus nem a Musa
sp., diferente de C.g.2 que foi patogênico a frutos de Musa sp. e, juntamente com CF16, foi
mais agressivo a folhas de P. lunatus superando C.t. fungo comumente relacionado a
Fabaceae (Figuras 12 e 14A). É importante salientar o aparente crescimento micelial de C.a.
restrito à superfície do tecido vegetal usando as reservas contidas no disco de BDA veículo de
inoculação, tal dúvida pode ser sanada mediante inoculação usando suspensão conidial como
inóculo. A patogenicidade a frutos destacados de Musa sp. notada para CF16 e C.g.2 pode ser
um falso positivo devido ao fato de que o disco de BDA contendo micélio foi depositado
sobre o látex exsudado do ferimento inicial. Portanto sugere-se que o experimento seja
repetido, desta vez controlando essa variável mediante remoção do exsudado antes da
inoculação.

Figura 12 – Patogenicidade a folhas de fava inoculados com discos de BDA contendo micélio. A –
testemunha, B – C.g.1, C – C.c., D – CF16, E – C.g.2, F – C.a., G – C.t., H – C.m..

Fonte: AUTOR

Figura 13 - Patogenicidade a frutos de bananeira inoculados com discos de BDA contendo micélio. A –
testemunha, B – C.g.1, C – C.c., D – CF16, E – C.g.2, F – C.a., G – C.t., H – C.m..

Fonte: AUTOR

Figura 14 – Severidade a folhas de Phaseolus lunatus e frutos de Musa sp. Letras minúsculas iguais nas
colunas não diferem estatisticamente no teste de Tukey (p < 0.05). A - dms = 3,5 CV% = 15,28. B - dms =
1,04 CV% = 33,63.

Fonte: AUTOR

5 CONSIDERAÇÕES FINAIS
Na ausência de luz e à temperatura de 25oC ± 2 objetivando produção de conídios a
serem empregados como fonte de inóculo, C.c. apresentou melhor desempenho no meio de
cultivo BDA. Contudo para a produção de biomassa fúngica para extração de biomoléculas
sugere-se empregar o meio Extrato de Malte desprovido de aguar (agente gelificante). No
entanto como considerado por Barbosa et al (2002) de maneira geral a adaptação metabólica
para aproveitar melhor uma ou outra fonte de carboidrato é bastante variável, incluso entre
isolados da mesma espécie, logo testes semelhantes devem ser realizados com o conjunto de
isolados que serão usados como modelo biológico afim de eleger o protocolo mais adequado
para os objetivos pretendidos.
A caracterização morfológica foi eficiente para todos os isolados exceto para CF16,
visto que o mesmo não produziu conídios em placa de Petri até o período de avaliação e as
características da colônia não foram suficientes para identificar a espécie.
É notória a necessidade de uma revisão taxonômica de muitas espécies de
Colletotrichum (HYDE et al., 2009). Paralelamente revisões sistemáticas foram propostas
para os maiores complexos de espécies de Colletotrichum, tais como C. acutatum, C.
boninense e C. gloeosporioides (lato sensu) (DAMM et al., 2012). Usando uma abordagem
multifásica progressos consideráveis foram feitos na delimitação de espécies desse gênero e
muitas novas espécies e designações de epíteto foram reportadas (WEIR; JOHNSTON 2010,
WIKEE et al., 2011, YANG et al., 2011). Tais trabalhos podem ser usados como referência na
identificação de C.g.1, C.g.2 e C.a..
A proposta de caracterização multifacetada, além da caracterização morfológica;
biométrica; fisiológica; bioquímica e baseada em ITS, outros pares de iniciadores para os
genes que codificam Actina, Glicerol-3-fostato-dehidrogenase (GPADH) e β-tubulina são
empregados para identificar e investigar a relação filogenética entre as espécies de
Colletotrichum, como feito por Noireung et al. (2012). Portanto sugere-se, além do
sequenciamento da região ITS amplificada para cada isolado e da caracterização
morfofisiológica, o sequenciamento e análise dos genes Actina, GPADH e β-tubulina dos
isolados.
Analisando o comportamento nos testes de patogenicidade a Solanum lycopersicum,
Phaseolus lunatus e Musa sp. Na sintomatoloiga CF16 foi semelhante a C.g.2 exceto sobre
folha de S. lycopersicum onde CF16 foi mais agressivo que C.g.2. Adicionalmente C.g.2 não
amplificou a sequencia de rDNA com os iniciadores ITS 1 e 4 diferentemente de CF16 que

por sua vez não produziu lesões no teste de infiltração com o tratamento BD como foi
produzido por C.g.
Embora o anelamento diferencial do ITS 1 entre estes isolados fornecer fortes
indícios de que trata-se de espécies diferentes, o padrão eletroforético pode ratificar a
distinção no nível de espécie dos referidos isolados. A identificação morfológica de C.g.1 e
C.g.2 como a mesma espécie é ratificada pela não amplificação com ITS 1 e 4. Por outro lado
C.g.2 produziu lesões durante o teste de infiltração e mostrou comportamento menos
específico aos hospedeiros e órgãos avaliados nos testes de patogenicidade. Isso pode indicar
uma separação deles em subespécies ou em raças fisiológicas distintas.

Figura 15 – Quadro-resumo da caracterização multifásica empregada para as espécies de Colletotrichum spp

Isolado

Hospedeiro

Identificação

Infiltração

Patogenicidade
S. lycopersicum

P. lunatus

Morfocultural

ITS

YCBnp10

Folha

Fruto

Folha

Musa sp.
Fruto

CF13

S. lycopersicum

C.g.1

3e4

CF15

S. lycopersicum

C.c.

1e4

+++

CF16

S. lycopersicum

1e4

+++

CF17

S. lycopersicum

C.g.2

3e4

+++

S. gilo

C.a.

1e4

WT13

P. lunatus

C.t.

1e4

Musa sp.

C.m.

1e4

+++

Fonte: AUTOR

As espécies C.t. e C.m. foram patogênicas somente a P. lunatus e Musa sp.
respectivamente, demonstrando a aptidão destes em servir como modelo de fungo não
adaptado a S. lycopersicum em estudos de NHR.
O teste de patogenicidade não confirmou a ideia de que C.c., por ter produzido lesões
no teste de infiltração com o tratamento pobre YCBn10, seria mais agressivo sobre folha do
que sobre fruto. Bem como a ideia de que C.g.2 seria mais agressivo sobre fruto de S.
lycopersicum, visto que produziu lesões no teste de infiltração com o tratamento rico BD.
Ademais uma bioprospecção de isolados de Colletotrichum patogênicos a outras
solanáceas e não patogênicos a fabáceas e musáceas é desejável para, juntamente com os
isolados ora estudados aqui, constituir um conjunto de espécimes modelo para estudos de
interação com S. lycopersicum cv. MicroTom, contribuindo para a elucidação de algumas
lacunas ainda existentes no conhecimento dos mecanismos envolvidos na NHR, como
também ser utilizadas como ponto de partida para novas soluções na proteção de plantas
cultivadas.

6 CONCLUSÃO
Diante dos resultados alcançados neste estudo pode-se apontar que os isolados C.g.1,
C.g.2, C.t e C.m. como espécies de Colletotrichum a serem empregadas em conjunto com S.
lycopersicum cv. MicroTom em estudos de interação e resistência do hospedeiro e do nãohospedeiro, pois C.g.1 demonstrou ser patógeno específico para S. lycopersicum, assim como
foram C.t. e C.m. não-patogênicos.

REFERÊNCIAS

AGRIOS, G.N. Plant Pathology. 5. ed. Elsevier, Burlington, 2005.
ARABIDOPSIS GENOME INITIATIVE. Analysis of the genome sequence of the flowering
plant Arabidopsis thaliana. Nature. v.408, p.796–815, 2000.
ARIE, T. et al. Tomato as a model plant for plant-pathogen interactions. Plant
Biotechnology. v.24, p.135-147, 2007.
BAILEY, J.A.; JEGER, M.J. (Ed.) Colletotrichum: biology, pathology and control. CAB
International,Wallingford, 1992.
BALDWIN, I.T. et al. Volatile signaling in plant–plant interactions: ‘‘Talking trees’’ in the
genomics era. Science. v.311, p.812–815, 2006.
BARBOSA, C.C. et al. Crescimento e esporulação de isolados de Verticillium lecanii
sob diferentes condições nutricionais. Pesquisa agropecuária brasileira. v.37, n.6, p.821829, 2002.
BHADAURIA, V. et al. EST mining identifies proteins putatively secreted by the anthracnose
pathogen Colletotrichum truncatum. BMC Genomics. v.12, p.327-343, 2011.
BORGES, A., et al. Changes in spatial and temporal gene expression. During incompatible
interaction between common bean and anthracnose pathogen. Journal of Plant Physiology.
v.169, p.1216-1220, 2012.
BOSTOCK, R.M. et al. Signal interactions in induced resistance to pathogens and insect
herbivores. European Journal of Plant Pathology. v.107, p.103–111, 2001.
BRUNS, T.D. et al. Evolutionary relationships within the fungi: analyses of nuclear small
subunit rRNA sequences. Molecular Phylogenetics Evolution. v.1, p.231–241, 1992.
CAI, L. et al. The need to carry out re-inventory of plant pathogens. Tropical Plant
Pathology. v.36, n.4, p.205-213, 2011.
______ et al. A polyphasic approach for studying Colletotrichum. Fungal Diversity. v.39,
p.183–204, 2009.
CANNON, P.F.; BUDDIE, A.G.; BRIDGE, P.D. The typification of Colletotrichum
gloeosporioides. Mycotaxon. v.104, p.189-204, 2008.
COUTO, E.F.; MENEZES, M. Caracterização fisiomorfológica de isolados de Colletotrichum
musae. Fitopatologia Brasileira. v.29, p.406-412. 2004.
CROUCH, J.A.; CLARKE, B.B.; HILLMAN, B.I. What is the value of ITS sequence data in
Colletotrichum systematics and species diagnosis? A case study using the falcate-spored
graminicolous Colletotrichum group. Mycologia. v.101, p.648-656, 2009.

DAMM, U. et al. The Colletotrichum boninense species complex. Studies Mycology. v.73,
p.1–36, 2012.
El OIRDI, M. et al. Botrytis cinerea Manipulates the Antagonistic Effects between Immune
Pathways to Promote Disease Development in Tomato The Plant Cell.. v.23, p.2405–2421,
2011.
EMMANUEL, E.; LEVY, A.A. Tomato mutants as tools for functional genomics. Current
Opinion Plant Biology. v.5, p.112–117, 2002.
FAN, J.; DOERNER, P. Genetic and molecular basis of nonhost disease resistance: Complex,
yes: Silver bullet, no. Current Opinion Plant Biology. v.15, p.400-406, 2012.
FAO - Food and Agriculture Organization (2011) <http://faostat.fao.org/> Acesso em 21
mai. 2013
FEYS, B. J.; PARKER, J. E. Interplay of signaling pathways in plant disease resistance.
Trends Genetics. v.16, p.449-455, 2000.
FREEMAN, S.; HOROWITZ, S.; SHARON, A. Pathogenic and nonpathogenic lifestyles in
Colletotrichum acutatum from strawberry and other plants. Phytopathology. v.91, p.986-992,
2001.
GIARETTA, D.R. ITS-rDNA phylogeny of Colletotrichum spp. causal agent of apple
glomerella leaf spot. Ciência Rural. v.40, n.4, p.806-812, 2010.
GLASS, N.L.; DONALDSON, G.C. Development of primers sets designed fou use with the
PCR to amplify conserved genes from filamentous Ascomycetes. Applied and
Environmental Microbiology. v.61, n.4, p.1323-1330, 1995.
GLAZEBROOK, J. Genes controlling expression of defense responses in Arabidopsis.
Current Opinion Plant Biology. v.4, p.301–308, 2001.
HARVEY, J.A. et al. Nutritional suitability and ecological relevance of Arabidopsis thaliana
and Brassica oleracea as foodplants for the cabbage butterfly, Pieris rapae. Plant Ecology.
v.189, p.117–126, 2007.
HULBERT, S. H., et al. Resistance gene complexes: Evolution and utilization. Annual
Review of Phytopathology. v.39, p.285-312, 2001.
HYDE K. D. et al. Colletotrichum – names in current use. Fungal Diversity. v.39, p.147–
182, 2009.
JARAMILLO, V.D.A. et al. Horizontal Transfer of a Subtilisin Gene from Plants into an
Ancestor of the Plant Pathogenic Fungal Genus Colletotrichum. Plos One. v.8, p.3, 2013.
JONES J. B. et al. (Ed) Compendium of tomato diseases. APS, St. Paul, 1991.
JONES, J.D.G.; DANGL, J.L. The plant immune system. Nature. v.444, p.323-329, 2006.

JAULNEAU, V. et al. Host and Nonhost Resistance in Medicago–Colletotrichum Interactions
Molecular Plant-Microbe Interactions. v.23, p. 1107–1117, 2010.
KESSLER, A.; HALITSCHKE, R.; BALDWIN, I.T. Silencing the jasmonate cascade:
induced plant defenses and insect populations. Science. v.305, p.665–668, 2004.
KO KO T.W. et al. The need for re-inventory of Thai phytopathogens. Chiang Mai Journal
of Science. v.38, p.1-13, 2011.
KUNKEL, B.N.; BROOKS, D.M. Cross talk between signaling pathways in pathogen
defense. Current Opinion Plant Biology. v.5, p.325–331, 2002.
LIAO, C.Y. et al. Characterization of three Colletotrichum acutatum isolates from Capsicum
spp. European Journal of Plant Pathology. v.133, p.599–608, 2012.
LIPKA U, FUCHS R, LIPKA V. Arabidopsis non-host resistance to powdery mildews
Current Opinion in Plant Biology. v.11, p.404-411, 2008.
LOBUGLIO, K.F.; PFISTER, D.H. A Glomerella species phylogenetically related to
Colletotrichum acutatum on Norway maple in Massachussetts. Mycologia, v.100, p.710-715,
2008.
LOPES, C.A.; ÁVILA, A.C. (Org) Doenças do tomateiro. Empresa Brasileira de Pesquisas
Agropecuárias. Embrapa Hortaliças. Ministério da agricultura, pecuária e abastecimento.
2005.
LU, G. et al. Diversity and molecular relationships of endophytic Colletotrichum isolates
from the Iwokrama forest reserve, Guyana. Mycological Research. v.108, p.53–63, 2004.
MAFACIOLI, R. et al.. Variabilidade patogênica e efeito de carboidratos no crescimento
micelial, esporulação e agressividade de Colletotrichum gloeosporioides da pupunheira.
Summa Phytopathologica. v.34, n.1, p.18-21, 2008
MEISSNER, R. et al. A new model system for tomato genetics. The Plant Journal. v.12,
p.1465–1472, 1997.
MENEZES, M. Aspectos Biológicos e Taxonômicos de Espécies do Gênero Colletotrichum.
Anais da Academia Pernambucana de Ciência Agronômica, v.3, p.170-179, 2006.
MORRIS, W.F. et al. Direct and interactive effects of enemies and mutualists on plant
performance: A meta-analysis. Ecology. v.88, p.1021–1029, 2007.
NOIREUNG, P.; et al. Novel species of Colletotrichum revealed by morfology and molecular
analysis. Mycologie.. v.33, n.3, p.347-362, 2012.
O’CONNELL, R.J. et al. Hemibiotrophic infection of Pisum sativum by Colletotrichum
truncatum. Plant Pathology. v.42, p.774-783, 1993.
OKABE A. et al. Genealogical analysis of Fusarium oxysporum isolates from wild
Lycopersicon spp. in Chile. Japanese Journal Phytopathology. v.71, p.218–219, 2005.

PAJEROWSKA, K.M.; PARKER,L.E.; GEBHARDT, C. Potato homologs of Arabidopsis
thaliana genes functional in defense signaling-identification, genetic mapping, and molecular
cloning. Molecular Plant-Microbe Interactions. v.18, n.10, p.1107–1119, 2005.
PATERSON, R.R.M.; BRIDGE, P.D. Biochemical Techniques for Filamentous Fungi.
Wallingford. C.A.C. International. 125 p., 1994.
PERFECT, S. et al. Colletotrichum: a model genus for studies on pathology and fungal-plant
interactions. Fungal Genetics and Biology. v.27, p.186–198, 1999.
PHOTITA W. et al. Morphological and molecular characterization of Colletotrichum species
from herbaceous plants in Thailand. Fungal Diversity. v.18, p.117–133, 2005.
PROMPUTTHA I. et al. A phylogenetic evaluation of whether endophytes become
saprotrophs at host senescence. Microbial Ecology. v.53, p.579–590, 2007.
PIETERSE, C.M.J.; DICKE, M. Plant interactions with microbes and insects: from molecular
mechanisms to ecology. Trends in Plant Science. v.12, n.12, p.564-569, 2007.
REIGNAULT P, SNCHOLLE M. Plant-pathogen interactions: will the understanding of
common mechanisms lead to the unification of concepts? Compte Rendues Biologies. v.328,
p.821-833, 2005.
SCHMIDT, D.D. et al. Solanum nigrum: A model ecological expression system and its tools.
Molecular Ecology. v.13, p.981–995, 2004.
SCOTT, J. W.; HARBAUGH, B.K. Micro-Tom – a miniature dwarf tomato. Florida
Agricultural Experimental Station Circular. v.370, p.1–6, 1989.
SERRA, I.M.R.S. et al. Diversidade fenotípica e patogênica de Colletotrichum, agente causal
de antracnose em mangueira, e identificação de espécie. Summa Phytopathologica. v.37,
n.1, p.42-51, 2011.
SIDDIQUI, I. A., SHAUKAT, S. S. Systemic resistance in tomato induced by biocontrol
bacteria against the root-knot nematode, Meloidegyne javanica is independent of salycilic
acid production. Journal of Phytopathology. v.152, p.48–54, 2004.
SREENIVASAPRASAD, S. et al. PCR-based detection of Colletotrichum acutatum on
strawberry. Plant Pathology. v.45, p.650-655, 1996.
SUTTON, B. C. Coelomycetes – Fingi Imperfect with pycnidia; acervuli and stromata.
Commonwealth Mycological Institute, Kew, Surrey, 1980.
TAKAHASHI, H. et al. Catalog of Micro-Tom tomato responses to common fungal,
bacterial, and viral pathogens. Journal of General Plant Pathology. v.71, p.8-22, 2005.
THE PHYTOPATHOLOGICAL SOCIETY OF JAPAN. Common names of plant diseases
in Japan. Japan Plant Protection Association, Tokyo, 2000.

VALUEVA, T.A.; MOSOLOV, V.V. Role of inhibitors of proteolytic enzymes in plant
defense against phytopathogenic microorganisms. Biochemistry. v.69, n.1, p.1305-1309,
2004.
van LOON, L.C., BAKKER, P.A.H.M., PIETERSE, C.M.J. Systemic resistance induced by
rhizosphere bacteria. Annual Review of Phytopathology. v.36, p.453–483, 1998.
WEIR, B.S., JOHNSTON, P.R. Characterization and neotypification of Gloeosporium kaki
Hori as Colletotrichum horii. Mycotaxon. v.111, p.209–219, 2010.
WHITE, T.J. et al. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for
phylogenetics. Pages 315-322 in: PCR Protocols: A Guide to Methods and Application.
M. A. Innis, D. H. Gelfand, J. J. Sninsky, and T. J. White, eds. Academic Press, San Diego,
CA, 1990.
WIKEE, S. et al. Colletotrichum species from Jasmine (Jasminum sambac). Fungal
Diversity. v.46, p.171–182, 2011.
WILLIAMS, J.G.K. et al. DNA polimorphysms amplified by arbitrary primers are useful as
genetic markers. Nucleic Acids Research. v.18, p.6531–6535, 1990.
YANG, Y. L. et al. Colletotrichum species on Orchidaceae in southwest China. Cryptogamie
Mycologie. v.32, p.229–253, 2011.
XIAO, C.L., MACKENZIE, S.J., LEGARD, D.E. Genetic and pathogenic analyses of
Colletotrichum gloeosporioides from strawberry and noncultivated hosts. Phytopathology.
v.94, p.446-453, 2004.

Proteção de Plantas

Campus de Engenharias e Ciências Agrárias

Universidade Federal de Alagoas