Diversidade de espécies e variabilidade genética de Begomovírus infectando cansanção (Cnidoscolus urens L.) no estado de Alagoas.
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE ALAGOAS
CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM
PROTEÇÃO DE PLANTAS
ALINE MARQUES MELO
DIVERSIDADE DE ESPÉCIES E VARIABILIDADE GENÉTICA DE
BEGOMOVÍRUS INFECTANDO CANSANÇÃO (Cnidoscolus urens
L.) NO ESTADO DE ALAGOAS
Rio Largo - AL
2015
ALINE MARQUES MELO
DIVERSIDADE DE ESPÉCIES E VARIABILIDADE GENÉTICA DE
BEGOMOVÍRUS INFECTANDO CANSANÇÃO (Cnidoscolus urens L.)
NO ESTADO DE ALAGOAS
Dissertação de Mestrado apresentada ao
Programa de Pós Graduação em Proteção de
Plantas do Centro de Ciências Agrárias da
Universidade Federal de Alagoas como requisito
parcial para obtenção do grau de Mestre em
Proteção de Plantas.
Orientador: Prof. Dr. Gaus Silvestre de Andrade
Lima.
Coorientadora: Profa. Dra. Sarah Jacqueline
Cavalcanti da Silva.
Rio Largo - AL
2015
Catalogação na fonte
Universidade Federal de Alagoas
Biblioteca Central
Divisão de Tratamento Técnico
Bibliotecário Responsável: Valter dos Santos Andrade
M528d
Melo, Aline Marques.
Diversidade de espécies e variabilidade genética de Begomovírus infectando
Cansanção (Cnidoscolus urens L.) no estado de Alagoas Aline Marques Melo. –
2015.
67 f. : il.
Orientador: Gaus Silvestre de Andrade Lima.
Coorientadora: Sarah Jacqueline Cavalcanti da Silva.
Dissertação (Mestrado em Proteção de Plantas) – Universidade Federal de
Alagoas. Centro de Ciências Agrárias. Rio Largo, 2015.
Bibliografia: f. 56-67.
1. Begomovírus. 2. Plantas daninhas. 3. Variabilidade genética.
4. Estruturação de população. 5. Euphorbiaceae. I. Título.
CDU: 632.38
ALINE MARQUES MELO
DIVERSIDADE DE ESPÉCIES E VARIABILIDADE GENÉTICA DE
BEGOMOVÍRUS INFECTANDO CANSANÇÃO (Cnidoscolus urens L.)
NO ESTADO DE ALAGOAS
Dissertação submetida ao corpo docente do
Programa de Pós Graduação em Proteção de
Plantas, do Centro de Ciências Agrárias da
Universidade Federal de Alagoas. E aprovada em
31 de Agosto de 2015.
Prof. Dr. Gaus Silvestre de Andrade Lima – Universidade Federal de Alagoas (Orientador)
Banca Examinadora:
Profa. Dra. Edna Peixoto da Rocha Amorim – Universidade Federal de Alagoas
(Examinadora)
Dr. Roberto Ramos Sobrinho – Pós-doutorando PNPD Intitucional /CAPES/ CECA-UFAL
(Examinador)
Rio Largo - AL
2015
AGRADECIMENTOS
A Deus, acima de tudo, por sempre me guiar em todos os momentos da minha trajetória e por
dar-me coragem para enfrentar todos os desafios;
Aos meus queridos pais, José Acácio Melo e Georgina Marques, pelo amor, incentivo e apoio
em todas as horas;
Aos meus irmãos Clara Marques, Gustavo Marques e George Marques por sempre estarem ao
meu lado;
A todos familiares e amigos que contribuíram para meu crescimento;
Aos professores Drs. Iraildes Pereira Assunção e Gaus Silvestre de Andrade pela
oportunidade, confiança, orientação, ensinamentos que foram fundamentais para minha
formação;
A Dra. Sarah Cavalcanti pela amizade, pelos ensinamentos, orientação e apoio durante minha
trajetória no mestrado;
Ao Dr. Roberto Ramos e o Dr. Leonardo Barbosa pela amizade e pelos ensinamentos;
Aos meus amigos Lucas Jobim, Mayra Machado, Nayana Bruschi e Janaíne Rossane pelo
companheirismo no dia-a-dia, pelos momentos de alegria, aprendizado e por tornarem tudo
mais prazeroso;
A todos do Laboratório de Fitopatologia Molecular e Virologia Vegetal: Maria Jussara, Fred,
Antônio, Lourdes Regina, Josi, Ana, Tamires, Laura, Jackeline Laurentino, Gilberlan, Daniel,
pela amizade, ajuda mútua e ensinamentos durante todo esse período;
A todos os professores do Programa de Pós-graduação em Proteção de Plantas CECA-UFAL
pelos conhecimentos passados, que contribuíram para a minha formação;
A todos os meus colegas do Programa de Pós-graduação em Proteção de Plantas do CECAUFAL;
A CAPES pela bolsa de mestrado concedida, o que me permitiu adquirir inúmeros
conhecimentos incluindo os fundamentais para a realização desse trabalho;
A todos aqueles que de alguma forma contribuíram para a realização deste trabalho.
Obrigada!
RESUMO
Doenças causadas por begomovírus (família Geminiviridae) são um sério problema para as
culturas nas regiões tropicais e subtropicais do mundo, incluindo o Brasil. Begomovirus
também estão associados com uma ampla gama de plantas daninhas, as quais são
consideradas reservatórios de vírus, bem como fontes de inoculo primário para epidemias em
culturas. Foi realizado um levantamento da planta daninha Cnidocolus urens (família
Euphorbiaceae) no estado de Alagoas. Um total de 34 amostras mostrando sintomas típicos de
infecção viral foram coletadas em quatro diferentes áreas do estado de Alagoas. O DNA total
foi extraído a partir de cada amostra e genomas virais completos foram amplificados
utilizando a DNA polimerase de fago phi29, clonado em vetores plasmidiais e completamente
sequenciado. Um total de 21 clones foram obtidos (19 DNA-A e 2 de DNA-B). Comparações
de sequências pareadas e análises filogenéticas indicaram a presença de duas novas espécies
cujos nomes propostos são: Cnidoscolus mosaic leaf deformation virus (CnMLDV) e
Cnidoscolus severe rugose virus (CnSRV). As duas novas espécies foram mais relacionadas
ao Passionfruit severe leaf distortion virus (PSLDV, FJ972767) isolado no estado da Bahia,
Brasil. O DNA-A das duas novas espécies apresentou organização genômica típica dos
begomovírus bissegmentados do Novo Mundo e mostraram <87% de identidade de sequência
entre si. Evidência de recombinação foi encontrada entre isolados de CnMLDV e CnSRV. Os
eventos de recombinação foram detectados nos genes CP, Rep e REn, tendo CnMLDV e
PSLDV como prováveis parentais. A análise da população do CnMLDV demonstra que a sua
variabilidade genética é muito alta. Valores dN/dS indicaram que a população CnMLDV pode
estar sob a influência de selecção purificadora ou que foi submetida a uma expansão recente,
de modo que a ocorrência de mutações não é suficiente para explicar completamente a sua
variabilidade genética. Conclui-se que a recombinação, assim como a mutação, são
importantes mecanismos evolutivos que atuam sobre a variabilidade genética da população
CnMLDV. Os resultados deste estudo indicam que C. urens pode desempenhar um papel
significativo, tanto como fonte de inóculo quanto como fonte de novos vírus emergentes.
Palavras-chave: Plantas daninhas. Estruturação de população. Euphorbiaceae.
ABSTRACT
Diseases caused by begomoviruses (family Geminiviridae) are a serious constraint to
cultivated plants in tropical and subtropical regions of the world, including Brazil.
Begomoviruses are also associated with a wide range of weeds, which are considered to be
begomovirus reservoir as well as primary inoculum sources for epidemics in crops. We have
carried out a survey of the weed Cnidocolus urens (family Euphorbiaceae) in the state of
Alagoas. A total of 34 samples showing typical symptoms of viral infection were collected in
four different areas of the Alagoas state. Total DNA was extracted from each sample and
complete viral genomes were amplified using the DNA polymerase from phage phi29, cloned
into plasmid vectors and completely sequenced. A total of 21 clones we obtained (19 DNA-A
and 2 DNA-B). Pairwise sequence comparisons and phylogenetic analysis indicated the
presence of two new begomovirus species whose proposed names are: Cnidoscolus mosaic
leaf deformation virus (CnMLDV) and Cnidoscolus severe rugose virus (CnSRV). The two
new species were more related to Passionfruit severe leaf distortion virus (PSLDV,
FJ972767) isolate from the Bahia state, Brazil. The DNA-A of the two new species had a
typical bipartite New World begomovirus genome organization and displayed < 87%
sequence identity each other. Evidence of recombination was found among isolates of
CnMLDV and CnSRV. The recombination events were detected in the CP, Rep and REn
genes, having CnMLDV and PSLDV as the putative parents. Analysis of the CnMLDV
population demonstrated that its genetic variability is very high. dN/dS values indicated that
the CnMLDV population may be under the influence of purifying selection or has undergone
a recent expansion, so that the occurrence of mutations is not sufficient to fully explain its
genetic variability. It is concluded that recombination, as well as mutation, are important
evolutionary mechanisms acting on genetic variability of the CnMLDV population. The
findings of this study indicate that C. urens can play a significant role, both as inoculum
source and as source of emerging novel viruses.
Key words: Weeds. Population structure. Euphorbiaceae.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 - Representação esquemática do genoma do Bean golden yellow mosaic virus
(BGYMV), espécie-tipo do gênero Begomovirus. .................................................................................14
Figura 2 - Replicação via ciclo rolante em geminivírus .......................................................................17
Figura 3 - Matriz bidimensional representando porcentagem de identidade de comparações
pareadas de sequências nucleotídicas do DNA-A coletadas nos estados de AL com amostras
de begomovírus disponíveis no GenBank.................................................................................32
Figura 4 - Sintomas em Cnidoscolus urens infectadas por dois novos begomovírus ..................33
Figura 5 - Análise filogenética de inferência Bayesiana baseada no DNA-A, mostrando a
formação de dois grupos principais ............................................................................................................38
Figura 6 - Análise filogenética de inferência Bayesiana baseada na ORF CP, mostrando a
formação de dois grupos principais ............................................................................................................39
Figura 7 - Análise filogenética de inferência Bayesiana baseada na ORF Rep, mostrando a
formação de dois grupos principais ............................................................................................................40
Figura 8 - Análise reticulada baseada no DNA-A dos isolados de CnMLDV e CnSRV obtidos
neste trabalho, junto com isolados depositados no GenBank .............................................................44
Figura 9 - Análise reticulada baseada na ORF CP dos isolados de CnMLDV e CnSRV obtidos
neste trabalho, junto com isolados depositados no GenBank .............................................................45
Figura 10 - Análise reticulada baseada na ORF Rep dos isolados de CnMLDV e CnSRV
obtidos neste trabalho, junto com isolados depositados no GenBank ..............................................46
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Open reading frames (ORFs), com seus respectivos números de aminoácidos (aa),
encontrados no DNA-A e DNA-B das espécies de begomovírus descritas neste trabalho ........34
Tabela 2 - Amostras de begomovírus provenientes do estado da Alagoas obtidas neste
trabalho......................................................................................................................................36
Tabela 3 - Sequências de begomovírus obtidas a partir do banco de dados não-redundante
Genbank.. ...........................................................................................................................................................37
Tabela 4 - Diversidade nucleotídica (π) em CnMLDV no DNA-A, e ORF’s CP e Rep. ...........42
Tabela 5 - Eventos de recombinação detectados entre os isolados de CnMLDV e CnSRV
obtidos neste trabalho e os begomovírus mais proximamente relacionados acessados do
Genbank..............................................................................................................................................................47
Tabela 6 - Sítios selecionados positiva e negativamente nas ORFs CP e Rep da população de
CnMLDV. ..........................................................................................................................................................50
SUMÁRIO
1
INTRODUÇÃO .................................................................................................................................10
2
REVISÃO DA LITERATURA ...................................................................................................11
2.1
A família Geminiviridae ....................................................................................................................11
2.2
Organização genômica dos Begomovirus ....................................................................................13
2.3
Replicação Viral ...................................................................................................................................15
2.4
Variabilidade e estrutura genética de populações de begomovírus .......................................18
2.4.1 Mutação ..................................................................................................................................................18
2.4.2 Recombinação.......................................................................................................................................19
2.4.3 Pseudorecombinação ..........................................................................................................................20
2.5
Diversidade de begomovírus infectando plantas cultivadas e plantas não-cultivadas no
11111Brasil .......................................................................................................................................................22
3
MATERIAL E MÉTODOS ...........................................................................................................28
3.1
Coleta do material vegetal .................................................................................................................28
3.2
Clonagem e sequenciamento do genoma completo de begomovirus ...................................28
3.3
Análise de sequências e demarcação de espécies .......................................................................29
3.4
Análise filogenética .............................................................................................................................29
3.5
Estrutura genética e índices de variabilidade. .............................................................................29
3.6
Análises de recombinação .................................................................................................................30
3.7
Análise de seleção ...............................................................................................................................30
4
RESULTADOS...................................................................................................................................31
4.1
Análises de sequências e demarcação de espécie .......................................................................31
4.2
Análises Filogenéticas. .......................................................................................................................35
4.3
Estrutura genética e índices de variabilidade...............................................................................41
4.4
Análise de Recombinação .................................................................................................................43
4.5
Análise de seleção ...............................................................................................................................49
5
DISCUSSÃO........................................................................................................................................51
6
CONCLUSÃO ....................................................................................................................................55
REFERÊNCIAS............................................................................................................56
10
1 INTRODUÇÃO
Os vírus pertencentes à família Geminiviridae possuem genoma constituído por DNA
circular de fita simples, encapsidados por uma proteína estrutural que confere à partícula viral
uma forma icosaédrica geminada (STANLEY et al., 2005). Essa família é formada pelos
gêneros Becurtovirus, Begomovirus, Curtovirus, Eragrovirus, Mastrevirus, Topocuvirus e
Turncurtovirus (VARSANI et al., 2014). Os begomovírus são compostos por um ou dois
componentes genômicos (DNA-A e DNA-B), são transmitidos pela mosca-branca Bemisia
tabaci e infectam plantas dicotiledôneas. No DNA-A encontram-se os genes envolvidos na
replicação e encapsidação do genoma viral, enquanto no DNA-B encontram-se os genes
responsáveis pelos movimentos intra e intercelular do vírus (LAZAROWITZ, 1992). No
Brasil, o feijoieiro e o tomateiro são as principais culturas afetadas por begomovírus. Em
feijão as perdas podem chegar a 100% e em tomate a redução chega a 60% na produtividade
(QUINTELA et al., 2008; MORALES; ANDERSON 2001; GIORDANO et al., 2005).
Além de infectarem plantas cultivadas, os begomovírus também podem infectar
hospedeiros não-cultivados, principalmente aqueles pertencentes às famílias Malvaceae,
Euphorbiaceae e Fabaceae (MORALES; ANDERSON, 2001). Estudos demonstraram que
begomovírus provenientes de plantas não-cultivadas podem ser transmitidos para espécies
cultivadas através do inseto vetor (CASTILLO-URQUIZA et al., 2007; COTRIM et al.,
2007).
A diversidade genética dos begomovírus que infectam plantas cultivadas e/ou nãocultivadas no Brasil é alta (AMBROZEVICIUS et al., 2002; CALEGARIO, 2004;
CASTILLO-URQUIZA, 2008; LIMA et al., 2013; ROCHA et al., 2013; RAMOSSOBRINHO et al., 2014) podendo ser resultante de eventos de recombinação e
pseudorecombinação entre os begomovírus em infecções mistas (AMBROZEVICIUS, et al,
2002, ZHOU et al., 1997; FONDONG et al., 2000). Devido à ocorrência desses eventos, é de
fundamental importância conhecer a estrutura e a diversidade genética das populações de
begomovírus para compreender as interações vírus/vetor/hospedeiros (GARCIA-ARENAL;
FRAILE; MALPICA, 2003; ROOSSINCK, 1997). Neste contexto, o presente trabalho teve
como objetivo determinar a diversidade de espécies e variabilidade genética de begomovírus
infectando cansanção (Cnidoscolus urens L.) no estado de Alagoas.
11
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 A família Geminiviridae
A família Geminiviridae é considerada uma das mais importantes e numerosas
famílias de vírus que infectam plantas, incluindo vírus com genoma de DNA fita simples
(ssDNA) circular envoltos por um capsídeo icosaédrico geminado, transmitidos a plantas
monocotiledôneas e dicotiledôneas via cigarrinha ou mosca-branca (BROWN et al., 2012;
VARSANI et al., 2014). Esta família contém mais de 325 espécies, distribuídas com base no
tipo de inseto vetor, gama de hospedeiros, organização genômica e relacionamento
filogenético em sete gêneros: Becurtovirus, Begomovirus, Curtovirus, Eragrovirus,
Mastrevirus, Topocuvirus e Turncurtovirus (VARSANI et al., 2014). Recentemente, foi
proposta a inclusão de um oitavo gênero, Capulavirus, para abrigar três geminivírus altamente
divergentes. Estes não possuem vetor conhecido, exceto a espécie Alfafa leaf curl virus, a
qual pode ser transmitida por Aphis craccivora, consistindo no primeiro relato da transmissão
de um geminivírus por afídeo (ROUMAGNAC et al, 2015).
O gênero Mastrevirus, espécie tipo Maize streak virus, inclui os geminivírus com um
componente genômico, transmitidos para plantas monocotiledôneas por diversas cigarrinhas
(Homoptera: Cicadellidae). O gênero Curtovirus contém os geminivírus com único
componente genômico, transmitidos por diversas cigarrinhas (Homoptera: Cicadellidae) a
plantas dicotiledôneas. O Beet curly top virus (BCTV) é a espécie-tipo. O gênero Topocuvirus
também apresenta um componenete genômico e tem como única espécie, o Tomato pseudocurly top virus (TPCTV), transmitida pela cigarrinha Micrutalis malleifera (Homoptera:
Auchenorrhyncha) a plantas dicotiledôneas (STANLEY et al., 2005). O gênero Becurtovirus
possui um componente genômico e tem como espécie tipo o Beet curly top Iran virus
(BCTIV), transmitido pela cigarrinha Circulifer haematoceps (Cicadellidae), existente no
Mediterrâneo e Oriente Médio. O gênero Turncurtovirus possui um único componente
genômico e uma única espécie, o Turnip curly top virus (TCTV), também transmitida pela
cigarrinha Circulifer haematoceps. Este difere dos becurtovírus na gama de espécies
hospedeiras e organização genômica. O gênero Eragrovirus possui uma única espécie
descrita, o Eragrostis curvula streak virus (ECSV), que também contém um componente
genômico, no entanto até o presente momento nenhum inseto vetor foi associado ao processo
de transmissão (VARSANI et al., 2014).
12
Dentre os membros de Geminiviridae, destaca-se o gênero Begomovirus, com mais de
200 espécies atualmente reconhecidas (BROWN et al., 2015). Este gênero possui espécies
com um componente (monossegmentados) ou dois componentes (bissegmentados)
genômicos, transmitidas pelo inseto vetor Bemisia tabaci (Homoptera: Aleyrodidae) para
plantas dicotiledôneas (STANLEY et al., 2005; FARIA et al., 2000) e tem como espécies tipo
o Bean golden yellow mosaic virus (BGYMV) (FAUQUET et al., 2008).
Os begomovírus são considerados emergentes, devido à alta incidência e severidade
das doenças que causam em diversas culturas de importância econômica nas regiões tropicais
e subtropicais do mundo (MORALES, ANDERSON, 2001; MORALES, 2006). São
exemplos de doenças emergentes que ocorrem mundialmente: o enrolamento foliar do
tomateiro na Europa e Bacia do Mediterrâneo, causado pelo complexo Tomato yellow leaf
curl virus (TYLCV); o mosaico da mandioca na África, causado pelas espécie African
cassava mosaic virus (ACMV) e East African cassava mosaic virus (EACMV); o
enrolamento foliar do algodoeiro na Ásia, causado pelo complexo Cotton leaf curl virus
(CLCuV) e as doenças de tomateiro no Brasil, causada por um complexo de diferentes
espécies de begomovírus (NAVAS-CASTILO, FIALO-OLIVÉ,
SÁNCHEZ-CAMPOS,
2011).
Os sintomas dos begomovírus em plantas são muito variáveis, pois dependem da
planta hospedeira, da fase da cultura em que ocorre a infecção e a espécie viral. Entretanto, os
sintomas mais frequentes são mosaico amarelo, deformação do limbo foliar, nanismo, entre
outros (PICÓ et al., 1996; MORALES; ANDERSON, 2001).
Os begomovírus podem ser distribuídos geograficamente em dois grupos: os do
“Velho Mundo” e os do “Novo Mundo”. Os begomovírus do “Velho Mundo” são encontrados
na Europa, Ásia, África e Austrália, em sua maioria monossegmentados e frequentemente
associados a moléculas de ssDNA circular denominadas, DNA satélites. Os DNA satélites
pertencem a duas diferentes classes: alfassatélites (DNA-1) e betassatélites (DNA β)
(BRIDDON, 2003; BRIDDON, STANLEY, 2006), os quais podem atuar em funções
essenciais para o vírus auxiliar, como ocorre no DNA-B dos begomovírus bissegmentados
(ROJAS et al., 2005).
Os betassatélites contêm uma ORF que codifica uma proteína responsável pela
indução de sintomas e que atua como supressora do silenciamento gênico pós-transcricional
(CUI et al., 2004; CUI et al., 2005; BRIDDON; STANLEY, 2006). Os alfassatélites contêm
uma ORF que codifica uma proteína associada à replicação (Rep), seguida de uma região rica
em adenina e uma estrutura em forma de grampo que inclui a origem de replicação (IDRIS et
13
al., 2003). Os alfassatélites são capazes de replicar autonomamente, porém requerem um vírus
auxiliar para infecção sistêmica da planta e transmissão por inseto (SAUNDERS; STANLEY,
1999; SAUNDERS et al., 2000; SAUNDERS; BEDFORD; STANLEY, 2002).
Já os begomovírus do “Novo Mundo” são encontrados nas Américas, na sua maioria,
bissegmentados (dois componentes genômicos – DNA-A e DNA-B) com aproximadamente
2,6 Kb cada (Figura 1). O DNA-A e o DNA-B só possuem uma única região com identidade
entre as sequências, denominada Região Comum (RC) (HANLEY-BOWDOIN et al., 1999).
Recentemente foi encontrada uma espécie de begomovírus, o Tomato leaf deformation virus
(ToLDeV), que não possui o componente DNA-B causando sintomas associados ao “Tomato
leaf curl disease” (ToLCD) no Peru e Equador. Este consistiu no primeiro relato de um
begomovírus monossegmentado nativo do Novo Mundo (MELGAREJO et al., 2013;
SÁNCHEZ-CAMPOS et al., 2013). Também foi demonstrada a ocorrência de DNAs
alfassatélites não é exclusiva do “Velho Mundo”. Estes foram descritos no “Novo Mundo”
associados aos begomovírus bissegmentados Cleome leaf crumple virus (ClLCrV), Euphorbia
mosaic virus (EuMV) e Melon chlorotic mosaic virus (MeCMV) (PAPROTKA; METZLER;
JESKE, 2010b; ROMAY et al., 2010).
2.2 Organização genômica dos Begomovirus
A maioria dos begomovírus das Américas possuem dois componentes genômicos
(DNA-A e DNA-B) que são encapsidados separadamente em partículas icosaédricas
geminadas. Ambos os componentes virais são necessários para o desenvolvimento de
infecção sistêmica na hospedeira. Os DNA-As e DNA-Bs cognatos, possuem uma região
conservada (RC) com aproximadamente 200pb, a qual compartilha acima de 90% de
identidade de sequência (LAZAROWITZ, 1992; LAZAROWITZ et al., 1992; FONTES et al.,
1994b). A RC abriga uma sequência de nove nucleotídeos (5’-TAATATT↓AC-3’), chamada
de nonanucleotídeo, que está presente em todos os geminivírus e onde se situa a origem de
replicação viral (OROZCO; HANLEY-BOWDOIN, 1996).
O componente DNA-A dos begomovírus codifica para as proteínas: Rep (“replication
associated protein”), TrAP (“trans activating protein”), REn (“replication enhancer protein”),
C4 e CP (“coat protein”). Esta última é transcrita no sentido viral e as outras 4 são transcritas
no sentido complementar (FARIA, ZERBINI, 2000), com estes genes sendo responsáveis pela
replicação e encapsidação viral. Já no DNA-B, estão localizados os genes responsáveis pelo
movimento do vírus no hospedeiro (célula-a-célula e a longa distância), codificando as
14
proteínas: NSP (“nuclear shuttle protein” ou BV1) no sentido viral, e MP (“moviment
protein” ou BC1) no sentido complementar (Figura 1; TIMMERMANS, DAS, MESSING,
1994; BROWN, 1997; FARIA et al., 2000).
Figura 1. Representação esquemática do genoma do Bean golden yellow mosaic virus (BGYMV), espécie-tipo
do gênero Begomovirus. Os círculos representam o genoma viral, com dois componentes (DNA-A e DNA-B) de
aproximadamente 2.600 nucleotídeos cada. Uma sequência de aproximadamente 200 nucleotídeos, denominada
região comum (CR), contém a origem de replicação viral, com uma estrutura em forma de grampo e uma
sequência invariável de nove nucleotídeos (TAATATT↓AC), conservada em todos os membros da família
Geminiviridae. A seta (↓) indica o sítio de início da replicação do DNA viral por círculo rolante. As setas azuis e
vermelhas indicam os genes virais e a direção em que ocorre a transcrição (viral e complementar,
respectivamente). Reproduzido de (GUTIERREZ et al., 2004).
A proteína capsidial (CP) tem a função de proteger o genoma viral contra degradação
e é fundamental para a transmissão e determina a especificidade do vírus pelo inseto vetor
(BRIDDON et al., 1990; HÖFER et al., 1997a).
A proteína Rep é fundamental para a replicação do ssDNA viral no núcleo da célula
hospedeira iniciando a replicação por círculo rolante (GUTIERREZ, 1999). A função desta
proteína é ligar ao sítio de início da replicação viral e clivar umas das fitas de DNA
(FONTES; LUCKOW; HANLEY-BOWDOIN, 1992).
A proteína transativadora da transcrição (TrAP), atua nos promotores de genes de
sentido viral (CP e NSP). Logo, os transcritos desses genes só irão estar presentes na célula
após a expressão da TrAP (SUNTER, BISARO, 1992). Outra possível função desta proteína
é de interagir e inativar enzimas que estão envolvidas na defesa do hospedeiro, como a ADK
(“adenosine kinase”) e SNF1 (“sucrose nonfermenting 1”) (SUNTER et al 2001).
A proteína REn é um fator acessório da replicação viral (PEDERSEN; HANLEYBOWDOIN, 1994). Logo, mesmo não sendo uma proteína fundamental para a replicação,
15
quando ela está presente ocorre um maior acúmulo de DNA viral na célula hospedeira
(ZERBINI; CARVALHO; MACIEL-ZAMBOLIM, 2000). Este evento pode ser explicado
devido ao fato de que a REn pode aumentar a afinidade da proteína Rep na origem de
replicação (HANLEY-BOWDOIN et al., 1999). Mesmo esta proteína não sendo fundamental
para a ocorrência de sintomas, mutações em seus genes podem estar relacionadas com o
retardamento ou atenuação destes (ELMER et al., 1988; ETESSAMI et al., 1991).
A proteína C4 é uma supressora de silenciamento gênico (VANITHARANI et al.,
2004), podendo determina severidade dos sintomas (JUPIN et al., 1995). Estudos realizados
com African cassava mosaic virus (ACMV) e Sri Lanka cassava mosaic virus (SLCMV)
demonstram que esta proteína está envolvida na supressão do silenciamento gênico
póstranscricional em plantas (VANITHARANI et al., 2004).
O componente DNA-B dos begomovírus codifica para duas proteínas: uma no sentido
viral (MP), relacionada com o movimento célula-a-célula do vírus por meio do aumento do
limite de exclusão dos plasmodesmas; e outra no sentido complementar (NSP), responsável
pelo transporte do DNA através do envelope nuclear (FARIA; ZERBINI, 2000; ZERBINI;
CARVALHO; MACIEL-ZAMBOLIN, 2000), realizando o transporte do vírus replicado no
núcleo de célula hospedeira para seu citoplasma (PALMER; RYBICKI, 1998). Ou seja, essas
duas proteínas atuam de forma a mediar o tráfego intra e intercelular do DNA viral
(SANDERFOOT; LAZAROWITZ, 1995), proporcinando ao vírus infectar sistematicamente a
planta.
2.3 Replicação viral
A primeira etapa do processo de infecção dos geminivírus é à entrada das partículas
virais na planta por meio da inoculação pelo inseto vetor. Uma vez o vírus dentro da planta
ele irá se desassociar de forma espontânea do capsídeo e será transportado até o núcleo da
célula hospedeira, onde ocorrerá a replicação do vírus (LAZAROWITZ, 1992; PALMER;
RYBICKI, 1998). Dentro do núcleo celular o ssDNA é convertido em um intermediário de
fita dupla (dsDNA) chamado de Forma Replicativa (FR). Não se sabe ao certo, mas essa
conversão ocorre provavelmente por meio de fatores do hospedeiro (STENGER et al., 1991;
STANLEY, 1995; ZERBINI; CARVALHO; MACIEL-ZAMBOLIN, 2000). A FR vai se
acumulando dentro da célula e serve como molde para a síntese de novos componentes
genômicos e na transcrição dos genes virais. A replicação desses vírus ocorre via mecanismo
16
de círculo rolante, semelhante ao utilizado pelos bacteriófagos ϕX174 e M13 (Figura 2;
STENGER et al., 1991; STANLEY, 1995).
A localização da origem de replicação (ori) é na RC dos dois componentes genômicos.
Neste local, existe uma sequência conservada em forma de grampo (“structurally conserved
element”, SCE) chamada de nonanucleotídeo, encontrada em todos os geminivírus e que
constitui o domínio funcional da origem de replicação (HEYRAUD-NITSCHKE et al., 1995;
OROZCO; HANLEY-BOWDOIN, 1998). É nesse nonanucleotídeo que ocorre a clivagem
(TAATATTAC) do dsDNA e que se inicia a replicação viral por círculo rolante (FONTES
et al., 1994; LAUFS et al., 1995). A replicação ocorre de forma similar, independente do
componente genômico, ou seja, ocorre da mesma forma tanto para o DNA-A, como para o
DNA-B (LAUFS et al., 1995; FARIA; ZERBINI, 2000; STANLEY et al., 2005).
A clivagem do dsDNA na região comum é realizada pela Rep. Nessa região se
encontra uma sequência específica para a ligação desta proteína (FONTES; LUCKOW;
HANLEY-BOWDOIN, 1992; FONTES et al., 1994a) e regiões promotoras da RNA
polimerase tipo II de plantas, responsável pela transcrição dos genes virais (HANLEYBOWDOIN et al., 1999). A partir do momento em que Rep é ligada ao DNA viral e ocorre a
estabilização do complexo formado por Rep, REn e fatores do hospedeiro se inicia a
replicação por círculo rolante (GUTIERREZ, 1999). O reconhecimento pela proteína Rep é
considerado vírus-específico (HARRISON; ROBINSON, 1999; RAMOS et al., 2003). O
último estágio é a produção e a encapsidação do ssDNA genômico circular maduro em
partículas virais (GUTIERREZ, 1999).
17
Figura 2. Replicação via ciclo rolante em geminivírus. ssDNA circular viral (em azul) é convertida em dsDNA
pela DNA polimerase da hospedeira (passo 1). A Rep (em vermelho) é expressa e se associa aos sítios de ligação
na origem de replicação (passo 2). À medida que a replicação ocorre a fita de DNA mais antiga é liberada
(passos 4 e 5). O genoma viral monomérico pode ser liberado (passo 6a) ou mais ciclos de replicação podem
ocorrer (passo 6b e 7). Monômeros ou dímeros de ssDNA (passos 6a e 7) podem ser convertidos em dsDNA pela
DNA polimerase do hospedeiro para que novos ciclos de replicação ocorram. O genoma viral produzido no
passo 6a pode também ser encapsidado. Sucessivas gerações de ssDNA são coloridas em azul, amarelo e rosa
(Figura extraída de MARTIN et al., 2011).
Apesar a replicação por círculo rolante ser a principal forma de replicação dos
geminivírus, existe outro mecanismo para que a replicação ocorra, conhecido como
Replicação Dependente de Recombinação (RDR), que foi sugerido com base na identificação
de intermediários de replicação viral do Abutilon mosaic virus (AbMV) que não poderiam ser
explicados pelo mecanismo de círculo rolante (JESKE et al., 2001). Estudos posteriores
demostraram que esses intermediários também foram encontrados em African cassava mosaic
virus (ACMV), Beet curly top virus (BCTV), Tomato golden mosaic virus (TGMV) e Tomato
yellow leaf curl virus (TYLCV) (PREISS e JESKE, 2003), indicando que a RDR é um
mecanismo comum entre esses vírus.
18
2.4 Variabilidade e estrutura genética de populações de begomovírus
A estrutura genética de populações de vírus de plantas refere-se à quantidade e à
distribuição da variabilidade genética dentro e entre subpopulações (GARCÍA-ARENAL et
al., 2001). Definir a estrutura genética é o primeiro passo para se estudar as populações virais,
pois a estrutura genética reflete a história evolutiva e o potencial da população para evoluir
(PINEL et al., 2003; MORENO et al., 2004; FONT et al., 2007). Populações de geminivírus,
incluindo os begomovírus, possuem um elevado grau de diversidade genética e a sua análise é
de fundamental importância para melhor compreender a evolução do vírus e sua interação
com a planta hospedeira. Eventos de mutação, recombinação e pseudorecombinação são as
principais fontes de variabilidade genética de vírus em plantas (GARCÍA-ARENAL;
FRAILE; MALPICA, 2003; SEAL; VAN DEN BOSCH; JEGER, 2006). Esta diversidade
acaba gerando oportunidades para que os vírus se adaptem a novos hospedeiros e a mudanças
nas condições ambientais (ROOSSINCK, 1997).
2.4.1 Mutação
A evolução de todos os vírus, assim como para os geminivírus, depende
primariamente de mutações (HARKINS et al., 2009). Mutações são alterações na molécula de
DNA por meio de substituições em pares de bases, e tais substituições originam mutações
pontuais. O impacto das mutações pontuais tem sido estudado nesse grupo de vírus sob
diferentes condições de seleção, como presença de um efeito gargalo, transferências
sucessivas entre hospedeiros sem emprego do vetor, e inoculação de plantas resistentes
(ISNARD et al., 1998).
Duffy e Holmes (2009) realizaram análises estruturadas no tempo de isolados de East
African cassava mosaic virus (EACMV) para estimar a taxa de evolução dessa espécie de
begomovírus. As taxas foram estimadas em 1,6x10-3 e 1,33x10-4 substituições/sítio/ano para o
DNA-A e DNA-B, respectivamente. A região que codifica a proteína CP apresentou 1,37x10-3
subs/sítio/ano e a região que codifica a proteína associada à replicação mostrou 1,24x10 -3
subs/sítio/ano. As regiões codificadoras presentes no DNA-B, ORFs BV1 e BC1,
apresentaram 2,77x10-4 e 3,45x10-4, respectivamente. Os autores concluíram que as mutações
observadas refletem mais uma rápida dinâmica mutacional do que uma frequência de
evolução adaptativa. Contudo, validaram esses altos níveis de heterogeneidade apenas para o
DNA-A e a ORF AV1. Foi observado então que a taxa de evolução indicada para essa espécie
19
de begomovírus, entre 10-3 e 10-5, corroboram em geral aquelas determinadas
experimentalmente para Mayze streak virus (MSV) e Tomato yellow leaf curl China virus
(TYLCCNV) (GE et al., 2007; HARKINS et al., 2009). Dados obtidos por Rocha e
colaboradores (2013), analisando begomovírus brasileiros bipartidos, mostraram altas
frequências de mutação, e que as regiões do genoma que apresentam maiores valores são da
região intergênica e do gene CP.
Mutantes para a proteína Rep do Tomato golden mosaic virus (TGMV) e do Cabbage
leaf curl virus (CaLCuV) que não permitem a interação com a proteína pRB, inoculados em
protoplastos de fumo (Nicotiana tabacum) e em plantas N. benthamiana apresentaram até
100% de frequência de reversão de mutações, evidenciando a capacidade de populações de
geminivírus de evoluir rapidamente para alterar mudanças deletérias em seu genoma
(ARGUELLO-ASTORGA et al., 2007).
2.4.2 Recombinação
Recombinação é o processo pelo qual segmentos de uma fita de DNA ou RNA
tornam-se incorporados na fita de um indivíduo diferente durante o mecanismo de replicação
(PADIDAM; BEACHY; FAUQUET, 1999). Além de exercer um papel vital na manutenção e
na reparação das moléculas de DNA (CROMIE et al., 2001), a recombinação é
evolutivamente importante, uma vez que defende o genoma do acúmulo de mutações
deletérias (KEIGHTLEY; OTTO, 2006). Portanto, ao permitir o surgimento de novas
combinações genéticas, a recombinação, mais do que reverter as consequências dessas
mutações deletérias, também fornece ao organismo opções evolutivas que apenas através de
mutações não seriam possíveis (CRAMERI et al., 1998). Este evento é bastante comum em
geminivírus (PADIDAM; BEACHY; FAUQUET, 1999) e parece contribuir grandemente
para a diversificação genética dos begomovírus aumentando seu potencial evolutivo e
adaptação local (MONCI et al., 2002). É provável que esse mecanismo esteja diretamente
relacionado ao surgimento de algumas das espécies virais mais importantes para a agricultura
mundial (ZHOU et al., 1997; MONCI et al., 2002; GARCIA-ANDRES et al., 2007).
A recombinação destaca-se como um dos mais importantes mecanismos evolutivos em
begomovírus (LEFEUVRE et al., 2007, LIMA et al., 2013; MARTIN et al., 2011) sendo
responsável pela alta variabilidade genética observada em populações de begomovirus que
infectam plantas não-cultivadas (LIMA et al., 2013; RAMOS-SOBRINHO et al., 2014). Já
quando se trata de plantas cultivadas, eventos de recombinação têm sido diretamente
20
implicados na emergência de novas doenças e epidemias como, por exemplo, a epidemia
devastadora do mosaico da mandioca (Manihot esculenta), causada pelo recombinante
EACMV em Uganda e países vizinhos (PITA et al., 2001); as epidemias do complexo
TYLCV na Bacia Ocidental do Mediterrâneo, com o surgimento dos recombinantes Tomato
yellow leaf curl Malaga virus (TYLCMalV) e Tomato yellow leaf curl Axarquia virus
(TYLCAxV) nos campos de tomate na Espanha; e as epidemias de Cotton leaf curl virus
(CLCuV) no Paquistão causadas por um complexo de espécies incluindo diversos
begomovírus recombinantes (IDRIS; BROWN, 2002; MONCI et al., 2002).
Três fatores podem contribuir significativamente para a ocorrência de eventos de
recombinação. Primeiro, infecções mistas, um pré-requisito para que eventos de
recombinação ocorram (PADIDAM et al., 1995; UMAHARAN et al., 1998). Segundo, estes
vírus replicam via “forma replicativa” dsDNA produzindo um grande número de cópias do
genoma. Terceiro: o biótipo B de B. tabaci é um inseto polífago e apresenta um alto grau de
adaptação e dispersão (BEDFORD et al., 1994). Como resultados, têm-se recombinações
virais e observação de novas plantas hospedeiras sendo infectadas.
Os mecanismos precisos que controlam a recombinação em begomovírus permanecem
desconhecidos (PADIDAM; BEACHY; FAUQUET, 1999). No entanto, é conhecido que
sítios recombinantes não são uniformemente distribuídos ao longo do genoma com a
existência de sítios frequentes (“hot spots”) e infrequentes (“cold spots”) de recombinação
(STANLEY, 1995; FAUQUET et al., 2005; GARCIA-ANDRES et al., 2007; LEFEUVRE et
al., 2007). Análises de bioinformática para detectar vírus recombinantes ocorrendo
naturalmente revelaram que a origem de replicação viral é um sítio frequente de
recombinação (HANLEY-BOWDOIN et al., 1999). A comparação de sequência de
begomovírus mono e bissegmentados depositadas no GenBank até maio de 2006 (123 e 116
sequências, respectivamente) indicou que a região do gene Rep que codifica a porção Nterminal da proteína Rep, assim como a região intergênica adjacente (RC) são frequentemente
intercambiadas durante a replicação. Também foram identificados sítios frequentes de
recombinação localizados na região intergênica entre os genes CP e Ren (LEFEUVRE et al.,
2007).
2.4.3 Pseudorecombinação
A existência de dois componentes genômicos na maioria dos begomovírus promove
um mecanismo alternativo, conhecido como pseudorecombinação, pelo qual a troca de
21
material genético pode ocorrer sem necessidade de recombinação intermolecular, ocorrendo
apenas a troca de componentes genômicos entre dois vírus distintos (SUNG; COUTTS, 1995;
ANDRADE et al., 2006). A formação de pseudorecombinantes viáveis entre espécies distintas
é mais difícil, sendo mais comum a pseudorecombinação entre estirpes de uma mesma
espécie de begomovírus (HOFER, et al. 1997a; UNSELD, 2000; GARRIDO-RAMIREZ et al,
2000).
Experimentos com pseudorecombinação são ferramentas úteis no estudo de funções de
genes e podem revelar relações filogenéticas, como é o caso da mistura de componentes
genômicos do BGYMV e do Bean golden mosaic virus (BGMV), que possuem identidade
inferior a 75% em suas sequências de nucleotídeos e não formam pseudorecombinantes
infecciosos (GILBERTSON et al., 1993a). Por outro lado, pseudorecombinantes formados a
partir da mistura de componentes genômicos de dois isolados de BGYMV mostraram-se
infecciosos. Quando inoculada, a mistura formada a partir de DNA-A do isolado da
Guatemala (BGYMV-GA) e DNA-B do isolado da República Dominicana (BGYMV-DR) foi
capaz de induzir os mesmos sintomas apresentados pelos parentais, enquanto o
pseudorecombinante recíproco induziu sintomas atenuados e tardios. Esses resultados
demonstram que geminivírus com regiões comuns suficientemente similares podem formar
pseudorecombinantes infecciosos, mas ressaltam que frequentemente os pseudorecombinantes
recíprocos apresentam diferenças na eficiência de replicação e infecção sistêmica (FARIA et
al., 1994). Esse fato foi também observado para o African cassava mosaic virus (ACMV) e
TGMV (STANLEY et al., 2005; VON ARNIM; STANLEY, 1992).
Andrade et al. (2006) descreveram a espécie Tomato yellow spot virus (ToYSV)
originalmente isolado de tomate, mas filogeneticamente próximo aos vírus isolados de Sida
sp. Apesar disso, o ToYSV foi capaz de formar pseudorecombinantes com vírus de tomate.
Pseudorecombinantes infectivos formados entre o DNA-A de ToYSV e o DNA-B de Tomato
crinkle leaf yellow virus (TCrLYV) induziram sintomas severos em N. benthamiana. Esse
potencial para formar pseudorecombinantes foi, em parte, atribuído ao fato de que a origem
de replicação de ambos os componentes possui a sequência do sítio de ligação da Rep
idêntica. Contudo, esse não foi o caso para outro pseudorecombinante viável formado entre o
DNA-A de Tomato golden mosaic virus (TGMV) e o DNA-B de ToYSV, os quais possuem a
sequência do sítio de ligação da Rep diferente. Estes resultados reforçam a idéia que a
formação de pseudorecombinantes viáveis não se baseia apenas nas relações filogenéticas e
nas sequências conservadas dos iterons.
22
Entretanto, especificidade da ligação da proteína Rep aos iterons é considerada a
principal determinante da formação de pseudo-recombinantes viáveis entre diferentes
espécies/estirpes de begomovírus (ARGÜELLO-ASTORGA et al., 1994; EAGLE; OROZCO;
HANLEY-BOWDOIN, 1994; FONTES et al., 1994; CHATTERJI et al., 1999; ANDRADE et
al., 2006a; BULL et al., 2007). Outro fator importante é a conservação da sequência de
aminoácidos da proteína Rep, especialmente os três aminoácidos do IRD que estariam
envolvidos diretamente na ligação aos iterons (ARGUELLO-ASTORGA; RUIZ-MEDRANO,
2001; RUIZ-MEDRANO; XOCONOSTRE-CAZARES; LUCAS, 2001).
2.5 Diversidade de Begomovirus infectando plantas cultivadas e plantas não-cultivadas
no Brasil
Desde os anos 80, begomovírus têm emergido como um dos principais patógenos de
plantas, particularmente nas regiões tropicais e subtropicais no mundo, causando severas
perdas econômicas (MORALES, 2006). No Brasil, as culturas mais severamente afetadas são
o feijoeiro e tomateiro (FARIA; MAXWELL, 1999; ZERBINI et al., 2005). Embora existam
relatos de infecção por begomovírus em outras culturas importantes como a soja (Glycine
max) (MELLO; ALMEIDA; ZERBENI, 2000; MELLO et al., 2002) e o pimentão (Capsicum
annum) (NOZAKI et al., 2005), esses ocorrem esporadicamente nas áreas de cultivo, não
sendo considerados fatores limitantes à produção.
Begomovírus que infectam feijoeiro (Phaseolus spp.) são distribuídos através das
Américas, constituindo um fator limitante para a produtividade dessa cultura. A diversidade
genética de begomovírus que infectam feijoeiro é baixa, com apenas quatro espécies descritas:
Bean calico mosaic virus (BcaMV), Bean dwarf mosaic virus (BDMV), Bean golden mosaic
virus (BGMV), Bean golden yellow mosaic virus (BGYMV) e Macroptilium yellow spot virus
(MaYSV) (FAUQUET et al., 2008; RAMOS-SOBRINHO et al., 2014).
De acordo com Faria e Maxuell (1999), a espécie BGMV apresentam um baixo grau
de variabilidade genética, o que não é comum para begomovírus. Um estudo recente sobre a
estrutura genética de BGMV, indicaram que a variabilidade é maior nas P. lunatus do que P.
vulgaris, e que as populações desse vírus estão estruturadas de acordo com a região
geográfica e hospedeira (RAMOS-SOBRINHO et al., 2014).
Contrastando com as frequentes ocorrências de BGMV em feijoeiro, as infecções de
begomovírus em soja são esporádicas principalmente na região Centro-Oeste do país, portanto
23
BGMV não tem importância econômica para esta espécie (MELLO et al., 2002;
FERNANDES et al., 2009 );
Uma situação oposta é observada para begomovírus que infectam solanáceas, a
exemplo do tomateiro e do pimentão, onde um grande número de espécies tem sido descritas,
e a variabilidade genética entre os isolados de uma determinada espécie é normalmente muito
alta (RIBEIRO et al., 2003; CASTILLO-URQUIZA et al., 2008; FERNANDES et al., 2008).
O primeiro relato de begomovírus em tomateiro no Brasil foi feito na década de 1970
(COSTA, 1975). O vírus foi caracterizado e denominado TGMV. Além do TGMV, cinco
outros vírus transmitidos por mosca-branca foram identificados, porém sem causar danos de
importância econômica (MATYIS et al., 1975). Isso provavelmente ocorria porque o biótipo
A de B. tabaci, o único presente no país naquela época, coloniza o tomateiro com baixa
eficiência (BEDFORD et al., 1994). No entanto, no início da década de 1990 um complexo de
begomovírus surgiu em tomateiro no Brasil, coincidindo com a introdução e disseminação do
biótipo B de B. tabaci (AMBROZEVICIUS et al., 2002; RIBEIRO et al., 2003). Desde então,
cinco espécies de begomovírus já foram descritas: ToCMoV, ToYSV, ToYVSV, Tomato
rugose mosaic virus (ToRMV) e Tomato severe rugose virus (ToSRV) (FARIA;
MAXWELL, 1999; FERNANDES et al., 2006; CALEGARIO et al., 2007; RIBEIRO et al.,
2007). Além dessas, três novas espécies tentativas (Tomato commom mosaic virus,
ToCmMV; Tomato leaf distortion virus, ToLDV; Tomato mild mosaic virus, ToMlMV)
foram identificadas com base na sequência do genoma completo (CASTILLO-URQUIZA et
al., 2008), e seis outras foram descritas a partir de sequências parciais (RIBEIRO et al., 2003;
FERNANDES et al., 2008). Algumas dessas espécies encontram-se amplamente distribuídas
pelo país, enquanto outras estão restritas a certas regiões. Por exemplo, o ToSRV já foi
relatado nos estados de Goiás, Minas Gerais, Pernambuco, Rio de Janeiro, Santa Catarina e
São Paulo (REZENDE et al., 1997; LIMA et al., 2006; CASTILLO-URQUIZA et al., 2007;
COTRIM et al., 2007; FERNANDES et al., 2008). Por outro lado, o ToYSV foi relatado
apenas em Minas Gerais (CALEGARIO et al., 2007).
Levantamentos realizados para acessar a diversidade de begomovírus em tomateiro
indicam que determinadas espécies tornaram-se prevalentes em diferentes regiões do país
(CASTILLO-URQUIZA et al., 2007; COTRIM et al., 2007; CASTILLO-URQUIZA, 2008;
FERNANDES et al., 2008). O sequenciamento direto de fragmentos de PCR de amostras de
tomateiro coletadas na região central do estado de São Paulo nos anos de 2003 e 2004 revelou
como espécie predominante o ToRSV, presente em 50% das amostras analisadas. O ToYVSV
e o SiMoV também estavam presentes (COTRIM et al., 2007). A mesma estratégia foi
24
utilizada para identificar begomovírus em amostras de tomateiro coletadas entre 2002 e 2004
no Distrito Federal e nos estados da Bahia, Goiás, Minas Gerais, Pernambuco e São Paulo.
Verificou-se a presença do ToSRV em 61% das amostras, além do ToYVSV, Tomato mottle
leaf curl virus (ToMoLCV) e duas possíveis novas espécies (FERNANDES et al., 2008).
Nos anos de 2005 e 2007 foi realizado um estudo sobre a diversidade de begomovírus
em duas importantes regiões produtoras de tomate no Sudeste do Brasil, Paty do Alferes (RJ)
e Coimbra (MG). A análise de sequências do genoma completo do DNA-A revelou que em
Paty do Alferes o ToYVSV era o vírus predominante, encontrado em 56,4% das amostras
analisadas, seguido pelo ToCmMV. Já em Coimbra o ToCmMV foi o único vírus encontrado
infectando tomateiro (CASTILLO-URQUIZA, 2008).
Acredita-se que a emergência dos begomovírus que infectam tomateiro no Brasil seja
resultado da transferência horizontal de vírus nativos que infectam plantas silvestres ou
invasoras pelo biótipo B da mosca-branca. Uma vez presentes no novo hospedeiro, esses vírus
evoluiram rapidamente via recombinação e pseudo-recombinação, dando origem às espécies
atualmente detectadas no campo. A predominância de algumas espécies poderia ser devido a
diferenças na adaptação ao tomateiro ou diferenças na eficiência de transmissão pelo vetor
(CASTILLO-URQUIZA et al., 2008).
Três observações corroboram essa hipótese. Em primeiro lugar, todas as espécies de
begomovírus detectadas até o presente em tomateiro no Brasil são de ocorrência restrita ao
país. Em segundo lugar, a caracterização biológica de algumas espécies (ToRMV, ToCMoV e
ToYSV) confirmou que plantas daninhas como Nicandra physaloides, Solanum nigrum e
Datura stramonium são hospedeiras (FERNANDES et al., 2006; CALEGARIO et al., 2007;
RIBEIRO et al., 2007). Por fim, begomovírus originalmente encontrados em plantas
silvestres/daninhas, como o SiMoV e o SimMV, já foram encontrados infectando
naturalmente o tomateiro (CASTILLO-URQUIZA et al., 2007; COTRIM et al., 2007).
A presença de diversas espécies no campo, todas transmitidas pelo mesmo inseto
vetor, torna comum a ocorrência de infecções mistas, com dois ou mais vírus presentes
simultaneamente na mesma planta, aumentando a probabilidade da ocorrência de eventos de
recombinação e pseudo-recombinação, o que pode levar ao surgimento de espécies melhor
adaptadas ao hospedeiro (PITA et al., 2001; MONCI et al., 2002; ANDRADE et al., 2006a;
INOUE-NAGATA et al., 2006; RIBEIRO et al., 2007). Evidências de recombinação e
pseudo-recombinação já foram encontradas em associação ao complexo de begomovírus
infectando o tomateiro no Brasil. Galvão et al. (2003) e Ribeiro et al. (2007) sugeriram que os
isolados MG-Bt1 e BA-Se1 do ToCMoV possuem origem recombinante. A formação de
25
pseudo-recombinantes viáveis entre clones infecciosos do TGMV (DNA-A) e ToYSV (DNAB), e entre o ToYSV (DNA-A) e o Tomato crinkle leaf yellow virus (ToCrLYV), já foi
demonstrada (ANDRADE et al., 2006a). Além disso, foi sugerida a presença de um pseudorecombinante ocorrendo naturalmente entre o ToRMV e um novo vírus (FERNANDES et al.,
2006).
PAPROTKA et al. (2010a) estudaram a diversidade genética de begomovírus
presentes em acessos de batata-doce naturalmente infectados no Banco de Germoplasma
brasileiro. Nesse estudo foram identificadas duas novas espécies, Sweet potato golden veinassociated virus (SPGVaV) e Sweet potato mosaic-associated virus (SPMaV), além de três
novos isolados e vários variantes do Sweet potato leaf curl virus (SPLCV). A comparação de
sequências dos begomovírus encontrados nesses acessos revelou a presença de “footprints” de
recombinação em seus genomas, ressaltando o risco do surgimento de novos begomovírus no
material propagado vegetativamente no Banco de Germoplasma.
Além das plantas cultivadas, muitas espécies silvestres e/ou invasoras têm sido
relatadas como hospedeiras de begomovírus em vários países, incluindo o Brasil (IDRIS et
al., 2003; JOVEL et al., 2004; VARSANI et al., 2009; FIALLO-OLIVE et al., 2010; MUBIN
et al., 2010). As espécies comumente relatadas como hospedeiras pertencem às famílias
Malvaceae, Euphorbiaceae e Fabaceae (MORALES; ANDERSON, 2001). Alguns estudos
demonstraram que begomovírus provenientes de plantas invasoras podem ser transmitidos
para espécies cultivadas pelo inseto vetor ou mediante inoculação via extrato vegetal
tamponado (FRISCHMUTH et al., 1997; FARIA et al., 2000; MORALES; ANDERSON,
2001; CASTILLO-URQUIZA et al., 2007; COTRIM et al., 2007).
No Brasil, já se realizaram estudos com o objetivo de caracterizar molecularmente
isoalados de begomovírus que infectam plantas silvestres e daninhas, sobretudo em
associação às culturas do feijoeiro e do tomateiro (RIBEIRO et al., 1998; FARIA;
MAXWELL, 1999; CASTILLO-URQUIZA et al., 2008). Os resultados desses estudos
revelaram que, a exemplo do que ocorre com plantas cultivadas, a diversidade genética é alta
entre os isolados de begomovírus que infectam plantas invasoras (AMBROZEVICIUS et al.,
2002; CALEGARIO, 2004; CASTILLO-URQUIZA, 2008).
Costa e Bennett (1950) descreveram um vírus induzindo sintomas de mosaico em
plantas de Euphorbia prunifolia (Euphorbiaceae) no Brasil, o qual era transmitido por moscabranca (Bemisia tabaci), contudo a identificação foi feita apenas a partir dos sintomas, dadas
as condições tecnológicas disponíveis na época. O agente etiológico descrito por Costa e
Bennet em 1950 foi caracterizado alguns anos depois como pertencendo ao grupo dos
26
geminivírus (JARAMILLO; LASTRA, 1986) e identificado como Euphorbia mosaic virus
(EuMV).
Em 2011, foi realizada caracterização molecular de um begomovírus infectando
Euphorbia heterophylla, o qual apresentou porcentagem de identidade de 87% com o DNA-A
da espécie Euphorbia mosaic Peru virus (EuMPV), e 56,2% de identidade com a espécie do
EuMV isolado no México, sendo portanto considerado como uma espécie nova: Euphorbia
yellow mosaic virus (EuYMV); (FERNANDES et al., 2011). A maioria dos isolados de
EuYMV descritos até o momento indicam que esta é a única espécie de begomovírus da
família Euphorbiacea no Brasil que teve seu genoma completamente determinado. Essa
espécie já foi relatada infectando naturalmente Macroptilium artropurpureus, Sida
santaremensis, Crotalaria juncea e Solanum lycopersicus no Brasil (BARRETO et al, 2013;
TAVARES et al, 2012; SILVA et al, 2011). Apesar desse vírus não ter sido descrito causando
problemas econômicos em plantas cultivadas, essa ampla gama de hospedeiros (incluíndo o
tomateiro, uma espécie plantada em todo Brasil) indica que EuYMV pode vir a se tornar um
problema fitossanítario no país.
Outro representante de planta daninha da família Euphorbiaceae que foi detectado
begomovírus é Cnidoscolus urens, conhecida popularmente como cansanção. É uma planta
herbácea que tem como importante característica a presença de tricomas urticantes em quase
todas as suas partes vegetativas e florais, os quais, quando tocados, provocam fortes dores
localizadas, urticárias e até, em raros casos, desmaios (MUENSCHER, 1958; MELO,
SALES, 2008).
Estudos realizados em plantas daninhas de Cnidoscolus urens (Euphorbiaceae),
Cleome affinis (Capparaceae), Desmodium sp., Macroptilium lathyroides (Fabaceae),
Herissantia crispa, Sidastrum micranthum, S. rhombifolia, Sida spinosa (Malvaceae),
Triumfetta semitriloba e Waltheria indica (Sterculiaceae), apresentando sintomas de mosaico
amarelo, deformação do limbo foliar e redução do crescimento (ASSUNÇÃO et al., 2006)
confirmaram a presença de infecção por begomovírus, utilizando-se a técnica de
Amplificação em Cadéia da Polimerase (PCR). Padrões distintos de clivagem obtidos em
análise de PCR-RFLP sugeriram a existência de um alto grau de variabilidade genética
(ASSUNÇÃO et al., 2006). Entretanto, as espécies de begomovírus infectando estas plantas
não foram identificadas.
Castillo-Urquiza et al. (2008) analisaram a presença de begomovírus em tomateiro e
plantas invasoras associadas à cultura. Foram encontradas seis novas espécies, três
provenientes do tomateiro e três provenientes das invasoras Blainvillea rhomboidea
27
(Blainvillea yellow spot virus, BlYSV), Sida rhombifolia (Sida yellow mosaic virus, SiYMV)
e Sida micrantha (Sida common mosaic virus, SiCmMV).
Um novo begomovírus, Abutilon mosaic Brazil virus (AbMBV), foi identificado
infectando Abutilon sp. no estado da Bahia. Análises filogenéticas demonstraram que ambos
os componentes genômicos são distintos da espécie clássica, Abutilon mosaic virus (ABMV)
originária do oeste da Índia. (PAPROTKA, METZLER, JESKE, 2010).
A partir de material foliar de plantas sintomáticas pertencentes às famílias Malvaceae,
Euphorbiaceae e Capparaceae, coletadas no município de Miranda (Mato Grosso do Sul)
foram identificadas duas novas espécies de begomovírus, Cleome leaf crumple virus
(ClLCrV), obtido de Cleome affinis, e Sida mosaic Brazil virus (SiMBV). Além disso, foram
encontrados dois alfassatélites associados ao Euphorbia mosaic virus (Euphorbia mosaic virus
Mato Grosso do Sul-associated DNA1) e ao ClLCrV (Cleome leaf crumple virus-associated
DNA1). Este foi o primeiro relato de alfassatélites ocorrendo naturalmente no Novo Mundo
(PAPROTKA; METZLER; JESKE, 2010).
A caracterização molecular de begomovírus associados a Sida spp. revelou a presença
de quatro novas espécies infectando essa hopedeira: Sida yellow blotch virus (SiYBV), Sida
yellow net virus (SiYNV), Sida mottle Alagoas virus (SiMoAV) e Sida yellow mosaic
Alagoas virus (SiYMAV). Esses resultados, reforçam a hipótese que a diversidade de espécies
de Sida é bastante elevada (TAVARES et al., 2012)
Estudos sobre a diversidade de espécies e variabilidade genética de populações de
leguminosas invasoras no Nordeste do Brasil, evidenciou a presença de quatro novas espécies:
Centrosema yellow spot virus (CenYSV), Macroptilium yellow vein virus (MaYVV),
Macroptilium yellow net virus (MaYNV) e Macroptilium yellow spot virus (MaYSV). A
espécie MaYSV, apresenta uma alta variabilidade genética, sendo capaz de infectar diversas
hospedeiras daninhas (Macroptilium lathyroides, Calopogonium mucunoides, Canavalia sp.)
e cultivadas como feijoeiro (P. vulgaris) e fava (P. lunatus). MaYSV está amplamente
disseminado na região Nordeste do país e é capaz de infectar eficientemente o feijoeiro e fava,
substituindo as populações nativas de BGMV, sendo a espécie predominantemente encontrada
nessa cultura em Alagoas (RAMOS-SOBRINHO et al., 2014). MaYSV constitui uma ameça
para produção de feijoeiro no Brasil, pelo potencial de quebrar de resistência de uma cultivar
geneticamente modificada via RNA interfence que é resitente a doença mosaico dourado do
feijoeiro causado pelo BGMV. Portanto esforços estão sendo realizados para impedir sua
disseminação para outras regiões do país.
28
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Coleta do material vegetal
Amostras foliares de cansanção (Cnidoscolus urens) apresentando sintomas
indicativos de infecção por begomovírus (amarelecimento, mosaico, deformação foliar e
nanismo) foram coletadas no estado da Alagoas (AL) em maio de 2015. O material vegetal foi
armazenado em ultra-freezer (-80ºC) no Laboratório de Fitopatologia Molecular e Virologia
Vegetal do Centro de Ciências Agrárias da Universidade Federal de Alagoas.
3.2 Clonagem e sequenciamento do genoma completo de begomovírus
DNA total foi extraído a partir de cada amostra vegetal segundo protocolo de Doyle &
Doyle (1987) e utilizado como molde para reações de amplificação do genomas virais
completos via círculo rolante na presença da enzima DNA polimerase do bacteriófago phi29,
de acordo com método descrito por Inoue-Nagata et al. (2004). Alíquotas das reações de
amplificação foram submetidas, individualmente, a clivagens com enzimas de restrição (ApaI,
BamHI, HindIII, SacI e KpnI) para linearizar o genoma. Os produtos das reações de clivagem
enzimática foram analisados em gel de agarose a 0,8%, corados com brometo de etídio (5
µg/mL) e visualizados sob luz UV. Alíquotas das reações de clivagem contendo fragmentos
de aproximadamente 2600 nucleotídeos (nt), correspondente a uma cópia de cada componente
genômico, foram utilizadas para ligação no vetor pBluescript KS+ (Stratagene) previamente
linearizado com a mesma enzima e defosforilado. O produto da reação de ligação foi utilizado
para transformação de células ultracompetentes de Escherichia coli estirpe DH5α pelo
método de choque térmico (SAMBROOK, et al., 2001). Colônias contendo os possíveis
plasmídeos recombinantes foram repicadas para meio LB líquido contendo ampicilina
(Ampicilin, sodium salt USB©) e incubadas a 37oC sob agitação orbital de 180 rpm durante
12h. Após incubação, as culturas foram submetidas à extração de DNA plasmidial com KIT
illustraTM plasmidPrep Mini Spin (GE Healthcare). O DNA plasmidial foi então digerido com
a enzima utilizada para clonagem e o padão de bandas em gel de agarose 0,8% foi utilizado
para confirmação do processo de clonagem. Clones foram digeridos com a enzima HaeIII
para seleção de isolados a serem completamente sequenciados comercialmente por primer
walking.
29
3.3 Análise de sequências e demarcação de espécies
Sequências nucleotídicas correspondentes aos componentes genômicos virais (DNA-A
e DNA-B) completos foram montadas utilizando-se o programa CodonCode Aligner v. 4.1.1
(www.codoncode.com). As sequências obtidas foram inicialmente analisadas com o algoritmo
BLASTn (ALTSCHUL et al., 1990) e o banco de dados de nucleotídeos não-redundante
GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank) para determinar as espécies virais com as quais
elas compartilham maior identidade de sequência. As sequências similares obtidas a partir do
GenBank (Tabela 2) foram utilizadas para demarcação de espécie dos novos isolados de
begomovírus utilizando-se o programa Sequence Demarcation Tool v. 1.2 (MUHIRE et al.,
2013).
3.4 Análise filogenética
Alinhamentos múltiplos de sequências nucleotídicas dos begomovírus provenientes de
C. urens (Tabela 1) e outros isolados disponíveis no GenBank (Tabela 2) foram preparados
para o conjunto de dados DNA-A, genes Rep e CP utilizando-se o algoritmo MUSCLE
(EDGAR, 2004), e ajustadas manualmente no pacote MEGA6 (TAMURA et al 2013).
Inferência Bayesiana para o DNA-A, CP e Rep foi realizada no web portal CIPRES
(MILLER et al., 2010) usando MrBayes v. 3.2.3 (RONQUIST et al., 2012). O melhor modelo
de substituição de nucleotídeos foi determinado para cada conjunto de dados usando
MrModeltest 2.3 (POSADA; BUCKLEY, 2004) de acordo com o Akaike Information
Criterion (AIC). Os modelos evolutivos GTR+I, GTR+I, HKY+I, GTR+I, SYM+G e GTR+I
foram utilizados para os conjuntos de dados DNA-A, CP e Rep, respectivamente. Análises
foram rodadas para cada conjunto de dados por 10 milhões de gerações usando quatro cadeias
e amostrando a cada 1.000 gerações, para um total de 10.000 árvores. As primeiras 2.500
árvores foram descartadas como uma fase de burn-in. Probabilidades posteriores
(RANNALA; YANG, 1996) foram determinadas a partir de uma árvore consenso majorityrule gerada com as 7.500 árvores remanescentes. As árvores foram visualizadas e editadas nos
programas
FigTree
(https://inkscape.org/pt/).
v.
1.4
(ztree.bio.ed.ac.uk/software/figtree)
e
Inkscape
30
3.5 Estrutura genética e índices de variabilidade
Inferência sobre a estrutura genética da população de isolados de begomovírus obtidos
de C. urens foi baseada no índice de fixação F de Wright (Fst) (WRIGHT, 1949), calculado
usando o programa DnaSP v. 5.10 (ROZAS et al., 2003). A estrutura da população foi testada
de acordo com a localização geográfica dos isolados virais. A média das diferenças de
nucleotídeos por sítio (π) foi estimada para os conjuntos de dados DNA-A, Rep e CP em cada
população utilizando-se DnaSP v. 5.10.
3.6 Análises de recombinação
Os conjuntos de dados de DNA-A e genes CP e Rep obtidos de isolados de C. urens e
outros begomovírus disponíveis no GenBank, foram submetidos à análise de detecção de
evolução em rede, utilizando o método Neighbor-Net implementado no programa SplitsTree
v. 4.10 (HUSON; BRYANT, 2006).
A determinação dos locais (breakpoints) de recombinação e identificação de prováveis
sequências parentais foram realizadas utilizando os métodos RDP, Geneconv, Boot-scan,
Maximum Chi Square, Chimaera, SisterScan e 3Seq implementados no pacote RDP v. 4.0
(MARTIN et al., 2015). Nesta análise, o alinhamento do conjunto de dados DNA-A foi
analisado com definições padrão para os diferentes métodos e a significância estatística foi
inferida por um P-valor menor que o Bonferroni corrigido de 0,05. Somente eventos de
recombinação detectados no mínimo por quatro diferentes métodos foram considerados
confiáveis.
3.7 Análise de seleção
Para detectar evidência de pressão de seleção positiva ou negativa, os conjuntos de
dados de sequências nucleotídicas dos genes CP e Rep de foram submetidos aos testes de
neutralidade Tajima D, Fu & Li D*, Fu & Li F* e estimação da taxa média de substituições
não-sinônimas por substituições sinônimas (dN/dS) pelo modelo Pamilo-Bianchi-Li (PBL),
todos disponíveis no programa DnaSP v 5.10 (ROZAS et al., 2003).
31
4 RESULTADOS
4.1 Análises de sequências e demarcação de espécie
Um total de 21 clones dos componentes genômicos virais completos (19 DNA-A e 2
DNA-B) foram obtidos a partir das amostras de C. urens coletadas no estado de Alagoas. As
análises BLASTn e de comparações pareadas utilizando SDT demonstraram a presença de
duas novas espécies, as quais foram identificados de acordo com o critério de ≥91% de
identidade para sequências completas de DNA-A, estabelecido pelo Geminiviridae Study
Group do International Committe on Taxonomy of Viruses (ICTV) para espécies do gênero
Begomovirus (BROWN et al., 2015). Uma primeira nova espécie, nomeada Cnidoscolus
mosaic leaf deformation virus (CnMLDV), foi representada por 18 clones (Figuras 3), sendo
mais proximamente relacionada com o Passionfruit severe leaf distortion virus (PSLDV;
número de acesso FJ972767) com entre 84-87,6% de identidade de sequências nucleotídicas.
Uma segunda nova espécie, nomeada Cnidoscolus severe rugose virus (CnSRV), a qual
também foi mais estreitamente relacionada com PSLDV (84% de identidade), foi
representado pelo clone BR:Par2:15A. As duas novas espécies compartilharam < 87% de
identidade de sequências nucleotídicas do DNA-A (Figura 3).
O sintoma apresentado em plantas de C. urens infectadas pela primeira nova espécie
de begomovírus (CnMLDV) foi de mosaico e deformação foliar. Já o sintoma apresentado em
plantas de C. urens infectadas pela segunda nova espécie de begomovírus (CnSRV) foi de
bolhosidade severa (Figura 4).
Os genomas das duas novas espécies possui organização típica dos begomovírus
bissegmentados do ”Novo Mundo”, com quatro ou cinco ORFs no DNA-A (CP, Rep, TrAP,
REn, AC4 e AC5) e duas ORFs no DNA-B (MP e NSP) (Tabela 1). Na região comum dos
isolados virais de CnMLDV e CnSRV foram detectados o nonanucleotídeo conservado (5’
TAATATT/AC 3’), o qual faz parte do stem-loop que contém a origem de replicação viral; e
iterons de sequência (GGGG), sítio de ligação de Rep essencial para o início da replicação
viral. Adicionalmente, as sequências da região comum dos componentes DNA-A e DNA-B
dos isolados BR:Mes3:15A e BR:Mes3:15B compartilharam acima de 97% de identidade
nucleotídica, confirmando que ambos pertencem a espécie CnSRV.
32
Figura 3. Matriz bidimensional representando porcentagem de identidade de comparações pareadas de
sequências nucleotídicas do DNA-A coletadas nos estados de AL com amostras de begomovírus disponíveis no
GenBank.
33
Figura 4. Sintomas em Cnidoscolus urens infectadas por dois novos begomovírus. A. Sintomas de mosaico e
deformação nas folhas da planta da qual o Cnidoscolus mosaic leaf deformation virus (CnMLDV) foi obtido. B.
Sintoma de bolhosidade severa nas folhas da planta da qual o Cnidosculos sever rugose virus (CnSRV) foi
obtido.
34
Tabela 1. Open reading frames (ORFs), com seus respectivos números de aminoácidos (aa), encontrados no DNA-A e DNA-B das espécies de begomovírus descritas neste
trabalho.
Isolado
Genoma completo
CP
Rep
REn
TrAP
AC4
AC5
NSP
MP
BR:Mes1:15A
BR:Mes2:15A
DNA-A
2642 nt
2653 nt
DNA-B
-
257 aa
257 aa
357 aa
357 aa
132 aa
132 aa
129 aa
129 aa
97 aa
97 aa
-
-
-
BR:Mes3:15A
BR:Mes3:15B
BR:MD1:15A
2641 nt
2677 nt
2613 nt
-
257 aa
257 aa
357 aa
357 aa
132 aa
132 aa
129 aa
129 aa
97 aa
97 aa
-
256 aa
-
293 aa
-
BR:MD2:15A
BR:MD4:15A
BR:MD5:15A
BR:MD6:15A
2676 nt
2663 nt
2652 nt
2652 nt
-
257 aa
257 aa
265 aa
265 aa
357 aa
357 aa
357 aa
357 aa
132 aa
132 aa
132 aa
132 aa
129 aa
129 aa
129 aa
129 aa
97 aa
97 aa
97 aa
97 aa
-
-
-
BR:MD7:15A
BR:MD8:15A
BR:MD9:15A
2652 nt
2651 nt
2675 nt
-
265 aa
265 aa
257 aa
357 aa
357 aa
357 aa
132 aa
132 aa
132 aa
129 aa
129 aa
129 aa
97 aa
97 aa
97 aa
-
-
-
BR:MD10:15A
BR:Par1:15B
BR:Par2:15A
2676 nt
2660 nt
2620 nt
-
257 aa
257 aa
357 aa
356 aa
132 aa
132 aa
129 aa
129 aa
97 aa
87 aa
105 aa
258 aa
-
293 aa
-
BR:Par3:15A
BR:Par4:15A
BR:Par6:15A
BR:Par8:15A
2663 nt
2662 nt
2661 nt
2661 nt
-
257 aa
257 aa
265 aa
257 aa
356 aa
357 aa
357 aa
357 aa
132 aa
132 aa
132 aa
132 aa
129 aa
129 aa
129 aa
129 aa
97 aa
97 aa
97 aa
97 aa
105 aa
105 aa
105 aa
105 aa
-
-
BR:Par9:15A
BR:Mac2:15A
2663 nt
2676 nt
-
257 aa
257 aa
357 aa
357 aa
132 aa
132 aa
129 aa
129 aa
97 aa
97 aa
105 aa
-
-
-
35
4.2 Análises Filogenéticas
Análise filogenética baseada na sequência de nucleotídeos dos conjuntos de dados
DNA-A, CP e Rep dos isolados de CnMLDV e CnSRV incluiu isolados obtidos aqui e outros
disponíveis no GenBank (Tabelas 2 e 3). A filogenias bayesiana inferida para o conjunto de
dados DNA-A revelou que todos os isolados da espécie CnMLDV formaram dois grupos
principais: o Grupo 1, abrangendo isolados provenientes do município de Paripueira, e o
Grupo 2, que inclui os isolados provenientes dos municípios de Maceió, Marechal Deodoro e
Messias. A espécie CnSRV (BR:Par2:15A) formou um ramo irmão isolado dos demais clones
(Figura 5).
Na filogenia inferida para o gene CP também foi observada a formação dos Grupos 1
e 2 para isolados de CnMLDV, porém com algumas incongruências topológicas (Figura 6).
Por exemplo, o isolado BR:Mes3:15A pertencente ao Grupo 2 para filogenia do DNA-A,
ocupou um ramo independente a todos os outros isolados. Além disso, a espécie CnSRV
(BR:Par2:15A) agrupou com os outros isolados provenientes de Paripueira pertencentes ao
Grupo 1.
No caso do gene Rep, ainda é possível observar a formação de dois grupos principais,
porém também com incongruência topológica (Figura 7), pois a espécie CnSRV
(BR:Par2:15A) formou um terceiro grupo, juntamente com o Tomato chlorotic mottle virus
(TCMoV, NC003664).
Estas incongruências observadas para filogenia dos genes Rep e CP, sugerem
possíveis eventos de recombinação entre os isolados das espécies de CnMLDV e CnSRV. A
formação de dois grupos principais nas filogenias inferidas para o DNA-A, genes CP e Rep
sugere também estruturação populacional para os isolados CnMLDV.
36
Tabela 2. Amostras de begomovírus provenientes do estado da Alagoas obtidas neste trabalho.
Código
Hospedeiro
Local
Data
Isolado
Atribuição de espécies
C01H2
Cnidoscolus urens
Messias – AL
Maio, 2015
DNA-A
BR:Mes1:15A
DNA-B
C03A2
Cnidoscolus urens
Messias – AL
Maio, 2015
BR:Mes2:15A
C04A2
Cnidoscolus urens
Messias – AL
Maio, 2015
BR:Mes3:15A
C10H3
Cnidoscolus urens
Marechal Deodoro – AL
Maio, 2015
BR:MD1:15A
CnMLDV
C11H3
Cnidoscolus urens
Marechal Deodoro – AL
Maio, 2015
BR:MD2:15A
CnMLDV
C13H1
Cnidoscolus urens
Marechal Deodoro – AL
Maio, 2015
BR:MD4:15A
CnMLDV
C14H1
Cnidoscolus urens
Marechal Deodoro – AL
Maio, 2015
BR:MD5:15A
CnMLDV
C15H1
Cnidoscolus urens
Marechal Deodoro – AL
Maio, 2015
BR:MD6:15A
CnMLDV
C16H2
Cnidoscolus urens
Marechal Deodoro – AL
Maio, 2015
BR:MD7:15A
CnMLDV
C17H2
Cnidoscolus urens
Marechal Deodoro – AL
Maio, 2015
BR:MD8:15A
CnMLDV
C19H2
Cnidoscolus urens
Marechal Deodoro – AL
Maio, 2015
BR:MD9:15A
CnMLDV
C20H2
Cnidoscolus urens
Marechal Deodoro – AL
Maio, 2015
BR:MD10:15A
CnMLDV
C22A3
Cnidoscolus urens
Paripueira – AL
Maio, 2015
C23K2
Cnidoscolus urens
Paripueira – AL
Maio, 2015
BR:Par2:15A
CnSRV (nova)
C24A1
Cnidoscolus urens
Paripueira – AL
Maio, 2015
BR:Par3:15A
CnMLDV
C25S2
Cnidoscolus urens
Paripueira – AL
Maio, 2015
BR:Par4:15A
CnMLDV
C27A1
Cnidoscolus urens
Paripueira – AL
Maio, 2015
BR:Par6:15A
CnMLDV
C29A2
Cnidoscolus urens
Paripueira – AL
Maio, 2015
BR:Par8:15A
CnMLDV
C31A1
Cnidoscolus urens
Paripueira – AL
Maio, 2015
BR:Par9:15A
CnMLDV
C33A1
Cnidoscolus urens
Maceió – AL
Maio, 2015
BR:Mac2:15A
CnMLDV
CnMLDV (nova)
CnMLDV
BR:Mes3:15B
BR:Par1:15B
CnMLDV
CnMLDV
37
Tabela 3. Sequências de begomovírus obtidas a partir do banco de dados não-redundante Genbank.
Espécie (Acrônino)
Nº de acesso no Genbank
Hospedeiro
Local
Data
Passionfruit severe leaf distortion virus (PSLDV)
NC012786
Passiflora edulis f. flavicarpa
Bahia
2010
Passionfruit severe leaf distortion virus (PSLDV)
FJ972767
Passiflora edulis f. flavicarpa
Bahia
2010
Tomato mottle leaf curl virus (ToMoLCV)
JF803251
Solanum lycopersicum
Pernambuco
2012
Tomato mottle leaf curl virus (ToMoLCV)
JF803248
Solanum lycopersicum
Goiás
2012
Macroptilium yellow spot virus (MaYSV)
KJ939872
Phaseolus lunatus
Brasil
2015
Macroptilium yellow spot virus (MaYSV)
NC016999
Phaseolus lunatus
Brasil
2015
Sida yellow blotch virus (SiYBV)
NC020254
Sida urens
Alagoas
2013
Sida yellow blotch virus (SiYBV)
JX871380
Sida urens
Alagoas
2013
Tomato chlorotic mottle virus (ToCMoV)
KC706560
Solanum lycopersicum
Minas Gerais
2013
Tomato chlorotic mottle virus (ToCMoV)
NC003664
Solanum lycopersicum
Brasil
2008
Tomato interveinal chlorosis virus (ToICV)
JF803253
Solanum lycopersicum
Pernambuco
2012
Tomato interveinal chlorosis virus (ToICV)
JF803252
Solanum lycopersicum
Pernambuco
2012
Macroptilium yellow net virus (MaYNV)
JN418998
Macroptilium lathyroides
Alagoas
2012
Macroptilium yellow net virus (MaYNV)
NC017001
Macroptilium lathyroides
Alagoas
2012
Euphorbia yellow mosaic virus (EuYMV)
JF756676
Euphorbia heterophylla
Goiás
2011
Euphorbia yellow mosaic virus (EuYMV)
NC012553
Euphorbia heterophylla
Goiás
2011
38
Figura 5. Análise filogenética de inferência Bayesiana baseada no DNA-A, mostrando a formação de dois
grupos principais. Grupo 1 = isolados provenientes apenas do município de Paripueira, e Grupo 2 = os isolados
provenientes dos municípios de Maceió, Marechal Deodoro.
39
Figura 6. Análise filogenética de inferência Bayesiana baseada na ORF CP, mostrando a formação de dois
grupos principais. Grupo 1 = isolados provenientes apenas do município de Paripueira, e Grupo 2 = os isolados
provenientes dos municípios de Maceió, Marechal Deodoro e Messias.
40
Figura 7. Análise filogenética de inferência Bayesiana baseada na ORF Rep, mostrando a formação de dois
grupos principais. Grupo 1 = isolados provenientes apenas do município de Paripueira, Grupo 2 = os isolados
provenientes dos municípios de Maceió, Marechal Deodoro e Messias, e Grupo 3 = CnSRV com um isolado
TCMoV.
41
4.3 Estrutura genética e índices de variabilidade
Um alto valor Fst foi observado quando os 18 isolados da espécie CnMLDV foram
submetidos ao testes de diferenciação Fst de acordo com a região geográfica (Fst geografia =
0,57). Esse resultado sugere que a população de CnMLDV se encontra estruturada com base
na região geográfica, contendo duas subpopulações. A Subpopulação 1, inclui os isolado
provenientes de Maceió, Marechal Deodoro e Messias. Enquanto a subpopulação 2, engloba
os isolados obtidos no município de Paripueira (Tabela 1).
O índice de diversidade nucleotídica (π) da população total de CnMLDV e
subpopulação 1 foram similares quando considerados todos os conjuntos de dados (DNA-A,
CP e REP). Os maiores valores de π foram encontrados para o gene CP, tanto na população
total quanto na subpopulação 1 (Litoral Sul), quando comparados com os índices para o
DNA-A (Tabela 4). Entretanto, valores de π semelhantes aqueles encontrados para CP,
também foram observados para o gene Rep da Subpopulação 1. Quando analisada a
variabilidade dentro da subpopulação 2 (Litoral Norte), foi observado que π apresentou
valores semelhantes para os conjuntos de dados DNA-A, CP e Rep, indicando que a
diversidade nucleotídica está uniformemente distribuída ao longo do genoma.
42
Tabela 4. Diversidade nucleotídica (π) em CnMLDV no DNA-A, e ORF’s CP e Rep.
População
Nº de sequências
DNA-A π* (SD)†
CP π (SD)
Rep π (SD)
CnMLDV (total)
18
0.0729 (0.0046)
0.1418 (0.0324)
0.0973 (0.0367)
CnMLDV (Subpopulação 1 - Litoral Sul)
13
0.0601 (0.0066)
0.1217 (0.0463)
0.1062 (0.0491)
CnMLDV (Subpopulação 2 - Litoral Norte)
5
0.0211 (0,0000)
0,0157 (0.0030)
0.0276 (0.0097)
* Par-a-par, diversidade nucleotídica por sítio.
† Desvio padrão.
43
4.4 Análise de Recombinação
A análise reticulada revelou forte evidência de eventos de recombinação contribuindo
para o processo evolutivo de isolados de CnMLDV e CnSRV (Figuras 8, 9 e 10), como
sugerido pelas incongruências encontradas nas árvores filogenéticas.
Foram detectados fortes sinais de recombinação intraespecíficas entre os 18 isolados
de CnMLDV para os conjuntos de dados DNA-A, CP e Rep. Por exemplo, a recombinação
intraespecífica pode ser claramente observada entre os diferentes isolados provenientes do
município de Paripueira (Grupo 2) para DNA-A e CP (Figuras 8 e 9). Vários eventos de
recombinação intraespecífica também foram evidenciados entre os isolados provenientes dos
municípios de Maceió, Marechal Deodoro e Messias (Grupo 1).
Evidências de recombinação interespecíficas foram observadas entre os isolados de
CnMLDV e CnSRV quando utilizada apenas sequência do gene CP (Figura 9), como
sugerido pela análise filogenética para esta mesma região. Adicionalmente, também foi
sugerido um possível evento de recombinação interespecífica entre a espécie CnSRV e o
PSLDV, quando utilizado o grupo de dados DNA-A (Figura 8). Este evento corrobora com as
análises filogenéticas, onde o PSLDV surge como possível ancestral para as espécies
CnMLDV e CnSRV.
Investigação de adicionais eventos de recombinação, determinação dos breakpoints
de recombinação e identificação das possíveis espécies parentais foi realizada para o conjunto
de dados do DNA-A utilizando o pacote RDP4. Como evidenciado pela análise reticulada,
eventos de recombinação intra e interespecíficos ocorrendo em isolados das espécies
CnMLDV e CnSRV foram detectados (Tabela 5). Sete eventos independentes de
recombinação foram detectados, com pontos (breakpoints) de recombinação ocorrendo na
Região Comum (CR), genes CP, Rep e REn. A maioria dos eventos de recombinação
envolvendo os isolados de CnMLDV preditos pela análise reticulada foram confirmados.
Juntos, estes resultados reforçam a importância da recombinação no processo evolutivo de
espécies pertencentes ao gênero Begomovirus.
44
Figura 8 – Análise reticulada baseada no DNA-A dos isolados de CnMLDV e CnSRV obtidos neste trabalho, junto com isolados depositados no GenBank.
45
Figura 9 – Análise reticulada baseada na ORF CP dos isolados de CnMLDV e CnSRV obtidos neste trabalho, junto com isolados depositados no GenBank.
46
Figura 10 – Análise reticulada baseada na ORF Rep dos isolados de CnMLDV e CnSRV obtidos neste trabalho, junto com isolados depositados no GenBank.
47
Tabela 5. Eventos de recombinação detectados entre os isolados de CnMLDV e CnSRV obtidos neste trabalho e os begomovírus mais proximamente relacionados acessados
do Genbank.
Breakpoints
Eventos
Começo
Fim
1
948
1880
Recombinantes
BR_MD1_15A
Parentais
Programasa
P-Value
Menor
Maior
Desconhecido
BR_Mac2_15A
RGBMCS3
4.46E-24
BR_MD2_15A
2
452
923
BR_Mes2_15A
BR_MD1_15A
BR_Mes_15A
RGBMCS3
9.42E-06
3
1424
2258
BR_Par3_15A
Desconhecido
BR_Par9_15A
RGBMCS3
8,69E-05
BR_MD10_15A
Desconhecido
RGBMCS3
1,88E-09
PSLDV
BR_M10_15A
RGBMCS3
9,43E-12
BR_Par4_15A
BR_Par6_15A
BR_Par8_15A
4
2289
192
BR_Par3_15A
BR_Par4_15A
BR_Par6_15A
BR_Par8_15A
BR_Par9_15A
5
345
874
BR_Par2_15A
BR_Par3_15A
48
BR_Par4_15A
BR_Par6_15A
BR_Par8_15A
BR_Par9_15A
BR_Mac2_15A
6
72
553
BR_Mac2_15A
BR_MD1_15A
BR_MD7_15A
RGBMCS3
3,11E-11
7
1148
2006
BR_Par2_15A
PSLDV
Desconhecido
RGBMCS3
3,18E-82
(a)= R, RDP; G, GENECONV; B, Bootscan; M, Maxchi; C, Chimaera; S, SiSscan; 3s, 3Seq.
49
4.5 Análise de seleção
Testes de neutralidade foram usados para acessar os tipo de seleção ou forças
demográficas atuando nas sequências codificadoras para os genes CP e Rep das populações de
CnMLDV. A maioria dos valores obtidos para os testes Tajima D, Fu & Li D* e Fu & Li F*
para as ORFs CP e Rep das populações de CnMLDV, foram negativos e estatisticamente não
suportados (Tabela 6). No entanto, valores negativos estatisticamente significativos foram
detectados para os testes Fu & Li D* e Fu & Li F* na população total e subpopulação 1 para a
ORF Rep. Também foram encontrados valores positivos não significativos estatisticamente
para os três testes de neutralidade para ORF CP da Subpopulação 2. Esses resultados sugerem
a ocorrência de seleção negativa (purificadora) ou uma recente expansão da população.
Os valores de dN/dS < 1 foram encontrados para as ORFs CP e Rep da população total
e subpopulações 1 e 2 de CnMLDV, confirmando que seleção purificadora pode de fato estar
atuando sob as mesmas.
50
Tabela 6. Sítios selecionados positiva e negativamente nas ORFs CP e Rep da população de CnMLDV.
População
CnMLDV (Total)
CnMLDV (Subpopulação 1)
CnMLDV (Subpopulação 2)
*
ORF*
Tajima’s D
Fu and Li’s D
Fu and Li’s F
dN/dS
CP
-1,0562 (ns) †
-1,6031 (ns)
-1,6764 (ns)
0.8237
REP
-1,7670 (ns)
-2,6750 (s) ‡
-7,9900 (s)
0,7786
CP
-1.5357 (ns)
-1.8557 (ns)
-2.0273 (ns)
0.8061
REP
-1.7788 (ns)
-2.2779 (s)
-2.4556 (s)
0.7579
CP
0.1245 (ns)
0.1240 (ns)
0.1333 (ns)
0.6869
REP
-0.8737 (ns)
-0.8508 (ns)
-0.9284 (ns)
0.8545
Rep, Replication-associated protein; CP, Coat protein.
ns, valores não significativos a P > 0,10
‡
s, valores significativos a P < 0.05
†
51
5. DISCUSSÃO
A diversidade de espécies de begomovírus tem sido amplamente investigada
(CASTILLO-URQUIZA et al., 2008, SILVA et al., 2011 e 2012, TAVARES et al., 2012,
FERNANDES et al., 2008). Entretanto, apenas poucos estudos sobre a estrutura genética de
populações de begomovírus de hospedeiras não-cultivadas estão disponíveis (SILVA et al.,
2011 e 2012, LIMA et al., 2013, ROCHA et al., 2013, RAMOS-SOBRINHO et al., 2014),
principalmente aqueles que incluem os vírus que infectam hospedeiras da família
Euphobiaceae.
O complexo de espécies ACMV, EACMV e South African cassava mosaic virus
(SACMV) responsável por causar o mosaico da mandioca (“cassava mosaic disease”) no
continente Africano, são os begomovírus mais economicamente importantes que infectam
euforbiáceas, representando a principal ameaça para segurança alimentar nesse continente
(RYBICKI et al., 2015). No entanto, até o presente momento nenhuma dessas espécies foi
descrita no “Novo Mundo”. EuYMV, obtido de Euphorbia heterophylla, é a espécie
predominante de begomovírus que infectam membros de Euphorbiaceae no Brasil
(FERNANDES et al., 2011, ROCHA et al., 2013). Neste estudo foram investigadas a
diversidade e variabilidade genética de begomovírus que infectam cansanção (C. urens,
família Euphorbiaceae) no estado de Alagoas.
Duas novas espécies de begomovírus foram obtidas a partir de 19 sequências
completas do DNA-A. Esses resultados sugerem que a diversidade de espécies de
begomovírus que infectam C. urens é maior que a encontrada para EuYMV, o qual constituía
até recentemente, no único representante desse gênero ocorrendo no país.
Análises filogenéticas baseadas nas sequências completas do DNA-A demonstraram
que as duas novas espécies (CnMLDV e CnSRV) formam dois grupos distintos na árvore,
porém compartilham como ancestral comum o PSLDV, obtida de maracujazeiro, no estado da
Bahia (Figura 5).
As filogenias para os conjuntos de dados DNA-A e genes CP e Rep revelaram que os
isolados da espécie CnMLDV formaram dois grupos principais com base na região geográfica
(Figuras 5, 6 e 7). Resultados semelhantes foram descritos para diferentes begomovírus de
plantas não cultivadas e tomateiro (ROCHA et al., 2013; NASCIMENTO, 2015). Contudo,
foi observado que populações de BGMV podem estar estruturadas tanto pela localização
geográfica quanto pelo hospedeiro (RAMOS-SOBRINHO et al, 2014). A formação de grupos
de isolados de acordo com a região geográfia sugere estruturação populacional da CnMLDV.
52
A hipótese de estruturação genética evidenciada pela filogenia, foi confirmada com
base no alto valor Fst (Fst geografia = 0,57) baseado nas sequências completas do DNA-A.
A população de CnMLDV foi subdividada nas subpopulações Litorais Norte e Sul (Figura 5),
apesar da grande proximidade das áreas de coleta (60 Km). Entretanto, o pequeno número de
isolados provenientes da subpopulação do Litoral Norte pode estar interferindo nesse
resultado. Desta forma, torna-se necessária a obtenção de mais isolados dessas regiôes para
confirmação antes de uma conclusão definitiva.
Mutação e Recombinação são os principais mecanismos evolutivos que agem na
distribuição da variabilidade genética em populações virais (GARCIA-ARENAL; FRAILE;
MALPICA, 2003). As ocorrências frequentes de eventos de recombinação, em algumas
populações de begomovírus, estão diretamente relacionadas aos altos índices de variabilidade
genética (LIMA et al., 2013; ROCHA et al., 2013; RAMOS-SOBRINHO et al., 2014). No
presente estudo, altos índices de variabilidade foram encontrados. Vários estudos demonstram
que a variabilidade de populações de begomovírus em hospedeiras não-cultivadas é mais alta
que em begomovírus de plantas cultivadas (FIALLO-OLIVÉ et al., 2010; SILVA et al., 2011,
2012; WYANT et al., 2011).
Os maiores índices de variabilidade da população de CnMLDV foram encontrados
principalmente para os genes Rep e CP da população total e subpopulação Litoral Norte, com
índices de diversidade nucleotídica variando entre π = 0,09 e π = 1,41 (Tabela 4). Altos valores
de π também foram encontrados para DNA-A da população total (πtotal = 0.0729) (Tabela 4).
Esses valores são ligeiramente superiores que aqueles já determinados para outros
begomovírus de plantas não cultivadas como MaYSV e SiMoALV, os quais apresentam
índices de diversidade nucleotídica em torno de πtotal = 0.06 (LIMA et al., 2013; FERRO,
2015). A variabilidade genética de πtotal = 0.06 foi encontrada para os isolados que compõe a
subpopulação Litoral Norte. Mesmo sendo a variabilidade mais baixa encontrada no trabalho,
ainda supera aquelas encontradas para EuYMV (ROCHA et al., 2013; NASCIMENTO,
2015). Contudo, o baixo número de isolados desta população pode estar interferindo nos
valores reais de sua variabilidade.
Recombinação constitui um importante mecanismo evolutivo que comumente atua nas
populações de begomovírus brasileiros contribuindo para o aumento de diversidade e
variabilidade genética desses vírus (SILVA et al., 2012; LIMA et al., 2013; ROCHA et al.,
2013; RAMOS-SOBRINHO et al., 2014). Análises de evolução reticulada e RDP revelaram
um complexo padrão de recombinação para CnMLDV, os quais ocorreram com maior
frequência no gene Rep e CP. Esses resultados corroboram com o fato que eventos de
53
recombinação detectados em populações de begomovírus brasileiros ocorrem de forma
regular em regiões não-randômicas do genoma (LIMA et al., 2013). Os resultados ainda
sugerem que a recombinação pode explicar, em parte, a alta variabilidade genética encontrada
para as populações de CnMLDV. Não foi possível fornecer evidência definitiva que as
sequências parentais aqui identificadas são verdadeiros pais. No entanto, fortes evidências
indicam que os isolados de CnMLDV das subpopulações Litorais Norte e Sul evoluíram por
meio de eventos de recombinação intraespecífica, envolvendo como parentais isolados de
CnMLDV de origens geográficas iguais ou distintas e em alguns casos com o PSLDV. A
espécie CnMLDV parece ter evoluído a partir de eventos de recombinação interespecíficos
envolvendo isolados de CnMLDV e PSLDV. Portanto, pode ser observado no presente
trabalho que a recombinação constitui um dos principais mecanismo atuando na evolução dos
isolados de CnMLDV.
É também evidente a atuação de eventos de mutação atuando sobre os isolados de
CnMLDV e CnSRV após os possíveis eventos de recombinação, indicando que estes eventos
podem não ser recentes (Figuras 8, 9 e 10). Estudos da estrutura genética de EuYMV e Bean
golden mosaic virus (BGMV) infectando diversas hospedeiras leguminosas revelaram que a
recombinação parece não contribuir grandemente na variabilidade genética de suas
populações (RAMOS-SOBRINHO et al., 2014; NASCIMENTO et al., 2015).
Mudanças na sequência nucleotídica dos genes como as causadas por mutações
aleatórias podem provocar alterações na conformação da proteína de modo a alterar também
sua função (BURNS, BOTTINO, 1991; SUZUKI et al, 1991; NUSSBAUM et al, 2002). A
seleção negativa ou purificadora têm sido descrita como a principal força seletiva atuando
sobre populações de begomovírus que infectam espécies cultivadas e não-cultivadas (SILVA
et al., 2011; LIMA et al. 2013; ROCHA et al., 2013; RAMOS-SOBRINHO et al., 2014).
Similarmente, seleção purificadora foi a principal força seletiva atuando sobre os genes CP e
Rep da população de CnMLDV. Vários estudos identificam que as sequências codificadoras
para os genes Rep e CP são hotspots de recombinação (LEFREUVE et al, 2007; LIMA et al
2013; ROCHA et al., 2013; RAMOS-SOBRINHO et al., 2014; FERRO, 2015). Apesar da
maioria dos eventos de recombinação desse trabalho terem ocorrido em CP e Rep,
contribuindo possivelmente para o alto grau de variabilidade para CnMLDV, a seleção
purificadora parece atuar nessas regiões preservando as sequências de aminoácidos
codificadas por esses genes. O motivo pelo qual a seleção purificadora atua nos genes de CP e
Rep é para manter as funções biológicas de seus produtos protéicos, os quais estão
relacionados a sobrevivência dos begomovírus. Por exemplo, o gene Rep em geminivírus
54
inclui regiões ou motivos conservados de grande importância para o processo de replicação
viral (ILYINA, KOONIN, 1992). Já o gene CP inclui regiões ou motivos conservados
envolvidos na formação do capsídeo, transmissão do vírus pelo vetor, e em alguns casos no
movimento viral (BROWN et al., 2012). Portanto, manutenção da integridade dessas regiões é
crucial para o sucesso da replicação, e consequentemente, infecção viral.
55
6 CONCLUSÃO
CnMLDV foi a espécie predominante em C. urens em Alagoas.
Apesar da grande proximidade entre as áreas de coleta, a população de CnMLDV
demonstrou estruturação genética com base na região geográfica.
A detecção de duas novas espécies (CnMLDV e CnSRV) em C. urens, demonstra que
esta hospedeira atua como importante reservatório de begomovírus.
Mutação, recombinação e seleção negativa ou purificadora são os principais
mecanismos evolutivos atuando sobre a população de CnMLDV.
56
REFERÊNCIAS
ALTSCHUL S.F., et al. Basic local alignment search tool. Journal of Molecular Biology, v.
215, 403-410, 1990.
AMBROZEVICIUS, L.P. et al. Genetic diversity of begomovirus infecting tomato and
associated weeds in Southeastern Brazil. Fitopatologia Brasileira, Brasília, v. 27, p. 372 377,
2002.
ANDRADE, E.C. et al. Tomato yellow spot virus, a tomato-infecting begomovirus from
Brazil with a closer relationship to viruses from Sida sp., forms pseudorecombinants with
begomoviruses from tomato but not from Sida. Journal of General Virology, v. 87, p. 3687
3696, 2006.
ARGUELLO-ASTORGA, G. et al. High-frequency reversion of geminivirus replication
protein mutants during infection. Journal of Virology, v. 81, p. 11005-11015, 2007.
ARGUELLO-ASTORGA, G.R.; RUIZ-MEDRANO, R. An iteron-related domain is
associated to Motif 1 in the replication proteins of geminiviruses: identification of potential
interacting amino acid-base pairs by a comparative approach. Archives of Virology, New
York, v. 146, p. 1465-1485, 2001.
ASSUNÇÃO, I.P. et al. Diversidade genética de begomovírus que infectam plantas invasoras
na Região Nordeste. Planta Daninha, Rio de Janeiro, v. 24, p. 239-244, 2006.
BARRETO, S.S. et al. A Study of Weeds as Potential Inoculum Sources for a Tomato
Infecting Begomovirus in Central Brazil. Phytopathology, v. 103, n º 5, 2013.
BEDFORD, I.D. et al. Geminivirus transmission and biological characterization of Bemisia
tabaci (Gennadius) biotypes from different geographical regions. Annals of Applied Biology,
v. 125, p. 311-325, 1994.
BRIDDON R. W. Cotton leaf curl disease, a multicomponent begomovirus complex
Molecular Plant Pathology, v. 4, p. 427–434, 2003.
BRIDDON, R. W. et al. Geminivirus coat protein gene replacement alters insect specificity.
Virology, v. 177, p. 85-94, 1990.
BRIDDON, R.W.; STANLEY, J. Subviral agents associated with plant single-stranded DNA
viruses. Virology, v. 344, p. 198-210, 2006.
BROWN J.K. New species and revised taxonomy proposal for the genus Begomovirus
(Geminiviridae): phylogenetic and pairwise distance analysis using the same approach as
implemented for the genera Mastrevirus and Curtovirus in the same family, 2013. Disponível
em: <http://talk.ictvonline.org/files/ictv_official_taxonomy_updates_since_the_8th_report/m/
plant-official/4838.aspx>. Acesso em Julho de 2015.
BROWN J.K., et al. Family Geminiviridae. In: King A.M.Q, Adams M.J., Carstens E.B.,
Lefkowitz E.J. (eds) Virus Taxonomy 9th Report of the International Committee on
Taxonomy of Viruses. Elsevier Academic Press, p. 351-373, 2012.
57
BROWN, J.K. The biology and molecular epidemiology of the Geminiviridae subgroup III.
Plant Microbe Interactions, v. 2, p. 125-195, 1997.
BULL, S.E.; BRIDDON, R.W.; SSERUBOMBWE, W.S.; NGUGI, K.; MARKHAM, P.G.;
STANLEY, J. Infectivity, pseudorecombination and mutagenesis of Kenyan cassava mosaic
begomoviruses. Journal of General Virology, v. 88, p. 1624-1633, 2007.
BURNS GW, BOTTINO P.J. Genética. 6ª edição, Editora Guanabara Koogan S.A. 1991
CALEGARIO, R.F. Caracterização do isolado de begomovírus MG-Bi2, um possível
membro da espécie Sida micrantha mosaic virus (SimMV). Tese M.S. Departamento de
Fitopatologia, Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, MG. 48 p., 2004.
CALEGARIO, R.F. et al. Characterization of Tomato yellow spot virus, (ToYSV), a novel
tomato-infecting begomovirus from Brazil. Pesquisa Agropecuária Brasileira, Rio de
Janeiro, v. 42, p. 1335-1343, 2007.
CASTILLO-URQUIZA, G.P. et al. Genetic diversity of begomoviruses infecting tomato in
Paty do Alferes, Rio de Janeiro state, Brazil. Virus Reviews and Research, v. 12, p. 233,
2007.
CASTILLO-URQUIZA, G.P. et al. Six novel begomoviruses infecting tomato and associated
weeds in Southeastern Brazil. Archives of Virology, v. 153, p. 1985-1989. 2008.
CHATTERJI, A.; PADIDAM, M.; BEACHY, R.N.; FAUQUET, C.M. Identification of
replication specificity determinants in two strains of tomato leaf curl virus from New Delhi.
Journal of Virology, Washington, v. 73, p. 5481-5489, 1999.
COSTA, A.S. Increase in the populational density of Bemisia tabaci, a threat of widespread
virus infection of legumes crops in Brazil. In Bird J.; Maramorosch K. (eds) Tropical
diseases of legumes. Academic Press, p. 27-49, 1975.
COSTA, A.S.; BENNETT, C.W. Whitefly transmitted mosaic of Euphorbia prunifolia.
Phytopathology, v. 40, p. 266-283, 1950.
COTRIM, M.A. et al. Diversidade genética de begomovírus em cultivos de tomateiro no
Centro-Oeste Paulista. Summa Phytopathologica, v. 33, p. 300-303, 2007.
CRAMERI, R., et al. DNA Shuffling of a Family of Genes from Diverse Species Accelerates
Directed Evolution. Nature, v. 391, p. 288-291. 1998.
CROMIE, G.A, et al. Recombination at double-strand breaks and DNA ends: conserved
mechanisms from phage to humans. Molecular Cell, 8(6):1163-74. 2001.
CUI, X.F. et al. A begomovirus DNA beta-encoded protein binds DNA, functions as a
suppressor of RNA silencing, and targets the cell nucleus. Journal of Virology, v. 79, p.
10764-10775, 2005.
CUI, X.F.; TAO, X.R.; XIE, Y.; FAUQUET, C.M.; ZHOU, X.P. A DNA beta associated with
Tomato Yellow Leaf Curl China Virus is required for symptom induction. Journal of
Virology, Washington, v. 78, p. 13966-13974, 2004.
58
DOYLE J.J.; DOYLE J.L. A rapid DNA isolation procedure for small amounts of fresh leaf
tissue. Phytochemical Bulletin, v. 19, p. 11-15, 1987.
DUFFY, S.; HOLMES, E.C. Validation of high rates of nucleotide substitution in
geminiviruses: Phylogenetic evidence from East African cassava mosaic viruses. Journal of
General Virology, v. 90, p. 1539-1547, 2009.
EAGLE, P.A.; OROZCO, B.M.; HANLEY-BOWDOIN. A DNA sequence required for
geminivirus replication also mediates transcriptional regulation. Plant Cell, Rockville, v. 6, p.
1157-1170, 1994.
EDGAR, R. C. MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high
throughput. Nucleic Acids Research, v. 32, p. 1792-1797, 2004.
ELMER, J. S. et al. Genetic analysis of the tomato golden mosaic virus. II. The product of the
AL1 coding sequence is required for replication. Nucleic Acids Research, v. 16, p. 7043-60,
1988.
ETESSAMI, P. et al. Mutational analysis of complementary-sense genes of African cassava
mosaic virus DNA A. Journal General Virology, v. 72, p. 1005-12, 1991.
FARIA, J. C. E ZERBINI, F. M. Familia Geminiviridae: Taxonomia, replicação e
movimento. In: (Luz, W. C; Fernandes, J. M; Prestes, A. M; e Picinini, E. C.) Revisão Anual
de Patologia de Plantas, v. 8, p. 27-57, 2000.
FARIA, J.C. et al. Bean golden mosaic geminivirus type II isolates from the Dominican
Republic and Guatemala: Nucleotide sequences, infectious pseudorecombinants, and
phylogenetic relationships. Phytopathology, v. 84, p. 321-329, 1994.
FARIA, J.C. et al. Situação atual das geminiviroses no Brasil. Fitopatologia Brasileira,
Brasília, v. 25, p. 125-137, 2000.
FARIA, J.C.; MAXWELL, D.P. Variability in geminivirus isolates associated with Phaseolus
spp. in Brazil. Phytopathology, v. 89, p. 262-268, 1999.
FAUQUET C.M.; STANLEY T.J. Revising the way we conceive and name viruses below the
species level: a review of geminivirus taxonomy calls for new standardize d isolate
descriptors. Archives of Virology, v. 150, p. 2151-2179, 2005.
FAUQUET, C.M. et al. Geminivirus strain demarcation and nomenclature. Archives of
Virology, New York, v. 153, p. 783-821, 2008.
FAUQUET, C.M. et al. Sequence analysis and classification of apparent recombinant
begomoviruses infecting tomato in the nile and Mediterranean basins. Phytopathology, v. 5,
p. 549-555, 2005.
FERNANDES, A.V.; GALVÃO, R.M.; MACHADO, J.J.; ZERBINI, F.M.; FONTES, E.P.B.
Cloning and molecular characterization of A components of two new Sida rhombifoliainfecting geminiviruses. Virus Reviews and Research, Belo Horizonte, v. 4, p. 148, 1999.
59
FERNANDES, F. et al. Molecular and biological characterization of a new Brazilian
begomovirus, euphorbia yellow mosaic virus (EuYMV), infecting Euphorbia heterophylla
plants. Archives of Virology, 156(11), 2063-2069. 2011.
FERNANDES, F. R., et al. Three distinct begomoviruses associated with soybean in central
Brazil. Archives of Virology, 154, 1567-570. 2009.
FERNANDES, F.R, et al. Diversity and prevalence of Brazilian bipartite begomovirus species
associated to tomatoes. Virus Genes, v. 36, p. 251-258, 2008.
FERNANDES, J.J. et al. Biological and molecular properties of Tomato rugose mosaic virus
(ToRMV), a new tomato-infecting begomovirus from Brazil. Plant Pathology, v. 55, p. 513
522, 2006.
FERRO, M. M. M. Estrutura genética de populações dos begomovírus Tomato mottle leaf
curl virus E Sida mottle Alagoas virus infectando tomate (Solanum lycopersicum) e
espécies de Sida no Brasil. Dissertação (Mestrado em Proteção Vegetal) - Programa de PósGraduação em Proteção de Plantas - PPGPP, Universidade Federal de Alagoas. 2015.
FIALLO-OLIVÉ, E. et al. Complete nucleotide sequence of Sida golden mosaic Florida virus
and phylogenetic relationships with other begomoviruses infecting malvaceous weeds in the
Caribbean. Archives of Virology, v. 155, p. 1535-1537, 2010.
FONT, M.I.; RUBIO, L.; MARTINEZ-CULEBRAS, P.V.; JORDA, C. Genetic structure and
evolution of natural populations of viruses causing the tomato yellow leaf curl disease in
Spain. Virus Research, Amsterdam, v. 128, p. 43-51, 2007.
FONTES, E.P.B. et al. Interaction between a geminivirus replication protein and origin DNA
is essential for viral replication. Journal of Biological Chemistry, v. 269, p. 8459-8465,
1994a.
FONTES, E.P.B.; LUCKOW, V.A.; HANLEY-BOWDOIN, L. A geminivirus replication
protein is a sequence-specific DNA binding protein. Plant Cell, v. 4, p. 597-608, 1992.
FRISCHMUTH, T. et al. Nucleotide sequence evidence for the occurrence of three distinct
whitefly-transmitted, Sida-infecting bipartite geminiviruses in Central America. Journal of
General Virology, London, v. 78, p. 2675-2682, 1997.
GALVÃO, R. M., MARIANO, A. C., LUZ, D. F., ALFENAS, P. F., ANDRADE, E. C.,
ZERBINI, F. M., ALMEIDA, M. R., FONTES, E. P. B. A naturally occurring recombinant
DNA-A of a typical bipartite begomovirus does not require the cognate DNA-B to infect
Nicotiana benthamiana systemically. Journal of General Virology 84, 715-726. 2003.
GARCIA-ANDRES, S. et al. Frequent occurrence of recombinants in mixed infections of
tomato yellow leaf curl disease-associated begomoviruses. Virology, v. 365, p. 210-219,
2007.
GARCIA-ARENAL, F.; FRAILE, A.; MALPICA, J.M. Variability and genetic structure of
plant virus populations. Annual Review of Phytopathology, v. 39, p. 157-186, 2001.
60
GARCIA-ARENAL, F.; FRAILE, A.; MALPICA, J.M. Variation and evolution of plant virus
populations. International Microbiology, v. 6, p. 225-232, 2003.
GARRIDO-RAMIREZ, E.R.; SUDARSHANA, M.; GILBERTSON, R.L. Bean golden
yellow mosaic virusfrom Chiapas, Mexico: Characterization, pseudorecombination with other
bean-infecting geminiviruses and germ plasm screening. Phytopathology, v. 90, p. 1224
1232. 2000.
GE, L.M.; ZHANG, J.T.; ZHOU, X.P.; LI, H.Y. Genetic structure and population variability
of tomato yellow leaf curl China virus. Journal of Virology 81, 5902-7. 2007.
GILBERTSON, R.L. et al. Genetic diversity in geminiviruses causing bean golden mosaic
disease: the nucleotide sequence of the infectious cloned DNA components of a Brazilian
isolate of bean golden mosaic geminivirus. Phytopathology, v. 83, p. 709-715, 1993a.
GUTIERREZ, C. et al. Geminivirus DNA replication and cell cycle interactions. Veterinary
Microbiology, v. 98, p. 111-119, 2004.
GUTIERREZ, C. Geminivirus DNA replication. Cellular and Molecular Life Sciences, v.
56, p. 313-329, 1999.
HANLEY-BOWDOIN, L. et al. Geminiviruses: Models for plant DNA replication,
transcription, and cell cycle regulation. Critical Reviews in Plant Sciences, v. 18, p. 71-106,
1999.
HARKINS, G.W. et al. Experimental evidence indicating that mastreviruses probably did not
co-diverge with their hosts. Virology Journal, v. 6, p.1-14, 2009.
HARRISON, B.D.; ROBINSON, D.J. Natural genomic and antigenic variation in white-fly
transmitted geminiviruses (begomoviruses). Annual Review of Phytopathology, v. 39, p.
369-398, 1999.
HEYRAUD-NITSCHKE, F.et al. Determination of the origin cleavage and joining domain of
geminivirus Rep proteins. Nucleic Acids Research, v. 23, p. 910– 916, 1995.
HÖFER, P. et al. Coat protein gene replacement results in whitefly transmission of an insect
non transmissible geminivirus isolate. Virology, v. 236, p. 288-295, 1997a.
HÖFER, P. et al. Coat protein gene replacement results in whitefly transmission of an insect
non transmissible geminivirus isolate. Virology, v. 236, p. 288-295, 1997a.
HUSON, D. H.; BRYANT, D. Application of Phylogenetic Networks in Evolutionary
Studies. Molecular Biology and Evolution, 23(2):254-267, 2006.
IDRIS A.M., et al. Two newly described begomoviruses of Macroptilium lathyroidesand
common bean. Phytopathology 93:774-783. 2003.
IDRIS, A.M.; BROWN, J.K. Molecular analysis of Cotton leaf curl virus-Sudan reveals an
evolutionary history of recombination. Virus Genes, v. 24, p. 249-256, 2002.
61
ILYINA, T.V.; KOONIN, E.V. Conserved sequence motifs in the initiator proteins for rolling
circle DNA replication encoded by diverse replicons from eubacteria, eucaryotes and
archaebacteria. Nucleic Acids Research, Oxford, v. 20, p. 3279-3285, 1992.
INOUE-NAGATA et al. New species emergence via recombination among isolates of the
Brazilian tomato infecting Begomovirus complex. Pesquisa agropecuária brasileira, v.41,
n.8, p.1329-1332, 2006.
ISNARD, M. et al. Quasi species nature of three maize streak virus isolates obtained through
different modes of selection from a population used to assess response to infection of maize
cultivars. Journal of General Virology, v. 79, p. 3091-3099, 1998.
JARAMILLO, S.; LASTRA, R. Purification and properties of the geminivirus Euphorbia
mosaic virus. Journal of Phytopathology, v. 115, p. 193-203, 1986.
JOVEL J. et al. Sida micrantha mosaic is associated with a complex infection of
begomoviruses different from Abutilon mosaic virus. Archives of Virology, v.149, p. 829
841, 2004.
JUPIN, I., HEROCOURT, F., BENZ, B., GRONENBORN, B. DNA replication specificity of
TYLCV geminivirus is mediated by the amino-terminal 116 amino acids of the Rep protein.
FEBS Letters, Amsterdam, v. 262, p. 116-120, 1995.
KEIGHTLEY, P., OTTO, S. P. Interference among deleterious mutations favours sex and
recombination in finite populations. Nature 443: 89–92. 2006.
LAUFS, J. et al. In vitro cleavage and joining at the viral origin of replication by the
replication initiator protein of tomato yellow leaf curl virus. Proceedings of the National
Academy of Sciences of the United States of America, v. 92, p. 3879– 3883, 1995.
LAZAROWITZ, S.G. et al. Sequence-specific interation with the vial AL1 protein identifies a
geminivirus DNA replication origin. Plant Cell, v. 4, p. 799-809, 1992.
LAZAROWITZ, S.G. Geminiviruses: genome structure and gene function. Critical Reviews
in Plant Sciences, v. 11, p. 327-349, 1992.
LEFEUVRE P, MARTIN DP, HOAREAU M, et al. Begomovirus 'melting pot' in the South
west Indian Ocean islands: Molecular diversity and evolution through recombination.
Journal of General Virology v. 88, p. 3458-68. 2007.
LIMA, A.T.M. et al. Primeiro relato de infecção pelo geminivírus Tomato severe rugose virus
(ToSRV) em tomateiro no estado de Santa Catarina. Fitopatologia Brasileira, v.
31(Suplemento), p. 224, 2006.
LIMA, A.T.M. et al. Synonymous site variation due to recombination explains higher genetic
variability in begomovirus populations infecting non-cultivatedhosts. Journal of General
Virology, v. 94, p. 418-431, 2013.
MARTIN D. P. et al. RDP4: Detection and analysis of recombination patterns in virus
genomes. Virus Evolution, p. 1-5, 2015.
62
MARTIN, D. P. et al. Recombination in Eukaryotic Single Stranded DNA Viruses. Viruses,
v. 3, p. 1699-1738, 2011.
MATYIS, J.C.; et al. Purificação e morfologia do vírus do mosaico dourado do tomateiro.
Summa Phytopathologica, v. 1, p. 267-275, 1975.
MELGAREJO, T. A. et al. Characterization of a New World Monopartite Begomovirus
Causing Leaf Curl Disease of Tomato in Ecuador and Peru Reveals a New Direction in
Geminivirus Evolution. Journal of Virology, American Society for Microbiology, v. 87, p.
5397-5413, 2013.
MELLO, R.N.; ALMEIDA, A.M.R.; ZERBINI, F.M. Detection and identification of
geminiviruses infecting soybean and associated weeds in Brazil. Fitopatologia Brasileira,
Brasília, v. 25, p. 444, 2000.
MELLO, R.N.; COTRIM, M.A.A.; LOPES, E.F.; MOREIRA, A.G.; CONTIN, F.S.;
FONTES, E.P.B.; ALMEIDA, A.M.R.; ZERBINI, F.M. Survey of begomoviruses associated
with soybean and identification of Sida mottle virus (SiMoV) infecting this crop in Brazil.
Virus Reviews and Research, Belo Horizonte, v. 7(Supplement), p. 157, 2002.
MELO, A.L., SALES, M. F. O gênero Cnidoscolus Pohl (Crotonoideae-Euphorbiaceae) no
Estado de Pernambuco, Brasil. Acta Botanica Brasilica, v. 22(3), p. 806-827, 2008.
MONCI, F. et al. A natural recombinant between the geminiviruses Tomato yellow leaf curl
Sardinia virus and Tomato yellow leaf curl virus exhibits a novel pathogenic phenotype and is
becoming prevalent in Spanish populations. Virology, v. 303, p. 317-326, 2002.
MORALES, F.J. History and current distribution of begomoviruses in Latin America.
Advances in Virus Research, v. 67, p. 127-162, 2006.
MORALES, F.J.; ANDERSON, P.K. The emergence and dissemination of whitefly
transmitted geminiviruses in Latin America. Archives of Virology, New York, v. 146, n. 3, p.
415-441, 2001.
MORENO, I.M.; MALPICA, J.M.; DIAZ-PENDON, J.A.; MORIONES, E.; FRAILE, A.;
GARCIA-ARENAL, F. Variability and genetic structure of the population of watermelon
mosaic virus infecting melon in Spain. Virology, New York, v. 318, p. 451-460, 2004.
MUBIN, M. et al. Characterization of begomovirus components from a weed suggests that
begomoviruses may associate with multiple distinct DNA satellites. Virus Genes, v. 40, p.
452-457, 2010.
MUENSCHER, W.C. Euphorbiaceae. In: MUENSCHER, W.C. (Ed.) Poisonous plants of
the United States. New York: The Macmillan Company. p. 142-152, 1958.
MUHIRE B., et al. A genome-wide pairwise-identity-based proposal for the classification of
viruses in the genus Mastrevirus (family Geminiviridae). Archives of Virology, v. 158, p.
1411–1424, 2013.
NASCIMENTO, N. N. Variabilidade e estrutura genética do begomovírus Euphorbia
63
yellow mosaic virus infectando hospedeiros não-cultivados no Brasil. Dissertação
(Mestrado em Proteção Vegetal) - Programa de Pós-Graduação em Proteção de Plantas PPGPP, Universidade Federal de Alagoas. 2015.
NAVAS-CASTILLO, J.; FIALLO-OLIVÉ, E.; SÁNCHEZ-CAMPOS, S. Emerging virus
diseases transmitted by whiteflies. Annual Review of Phytopathology, v. 49, p. 219-248,
2011.
NOZAKI, D.N.; KRAUSE-SAKATE, R.; HASEGAWA, J.M.; CESAR, M.A.; DZIUBA,
P.H.; PAVAN, M.A. Ocorrência de Tomato severe rugose virus em pimentão (Capsicum
annuum L.) no estado de São Paulo. Fitopatologia Brasileira, Brasília, v. 30 (Suplemento),
p. S189, 2005.
NUSSBAUM R.L.; McINNES R.R.; WILLARD H.F. Thompson & Thompson: Genética
Médica. 6 ed.. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan SA, 1635p. 2002.
OROZCO, B.M.; HANLEY-BOWDOIN, L. A. DNA structure is required for geminivirus
replication origin function. Virology Journal, London, v. 70, p. 148-158, 1996.
OROZCO, B.M.; HANLEY-BOWDOIN, L. Conserved sequence and structural motifs
contribute to the DNA binding and cleavage activities of a geminivirus replication protein.
Journal of Biological Chemistry, Bethesda, v. 273, p. 24448-24456, 1998.
PADIDAM, M.; BEACHY, R.N.; FAUQUET, C.M. A phage single-stranded DNA (ssDNA)
binding protein complements ssDNA accumulation of a geminivirus and interferes with viral
movement. Journal of Virology, Washington, v. 73, p. 1609-1616, 1999.
PADIDAM, M.; BEACHY, R.N.; FAUQUET, C.M. Classification and identification of
geminiviruses using sequence comparisons. Journal of General Virology, London, v. 76, p.
249-263, 1995.
PALMER, K.E.; RYBICKI, E.P.The molecular biology of mastreviruses. Advances In: Virus
Research, San Diego, v. 50, p. 183-234, 1998.
PAPROTKA, T.; METZLER, V.; JESKE, H. The first DNA 1-like alpha satellites in
association with New World begomoviruses in natural infections. Virology, New York, v.
404, p. 148-157, 2010.
PEDERSEN, T.J.; HANLEY-BOWDOIN. Molecular characterization of the AL3 protein
encoded by a bipartite geminivirus. Virology, New York, v. 202, p. 1070-1075, 1994.
PICÓ, B.; DIAZ, M.J.; NUEZ, F. Viral disease causing the greatest economic losses to the
tomato crop. II. The Tomato yellow leaf curl virus – a review. In: Scientia Horticulturae,
v.67, p. 151-196, 1996.
PINEL, A.; ABUBAKAR, Z.; TRAORE, O.; KONATE, G.; FARGETTE, D. Molecular
epidemiology of the RNA satellite of Rice yellow mottle virus in Africa. Archives of
Virology, New York, v. 148, p. 1721-1733, 2003.
64
PITA, J.S. et al. Recombination, pseudorecombination and synergism of geminiviruses are
determinant keys to the epidemic of severe cassava mosaic disease in Uganda. Journal of
General Virology, London, v. 82, p. 655-665, 2001.
POSADA, D.; BUCKLEY, T. Model Selection and Model Averaging in Phylogenetics:
Advantages of Akaike Information Criterion and Bayesian Approaches Over Likelihood Ratio
Tests. Systematic Biology, v. 53, p. 793–808, 2004.
RANNALA, B.; YANG, Z. Probability distribution of molecular evolutionary trees: a new
method of phylogenetic inference. Journal of Molecular Evolution, v. 43, p. 304-311, 1996.
RAMOS, P. L. et al. Tomato mottle Taino virus pseudorecombines with PYMV but not with
ToMoV: Implications for the delimitation of cis- and trans- acting replication specificity
determinants. Archives of Virology, New York, v. 148, p. 1697-1712, 2003.
RAMOS-SOBRINHO, R., et al. Contrasting genetic structure between two begomoviruses
infecting the same leguminous Hosts. Journal of General Virology, v. 95, p. 2540–2552,
2014.
RAMOS-SOBRINHO, R., et al. Contrasting genetic structure between two begomoviruses
infecting the same leguminous Hosts. Journal of General Virology, 95,2540–2552. 2014.
REZENDE, W.L. et al. Infecção mista em plantas de tomate infectadas por geminivírus,
detectada por meio de LIS-SSCP-PCR. Fitopatologia Brasileira, Brasília, v. 22, p. 338,
1997.
RIBEIRO, S.G. et al. Distribution and genetic diversity of tomato-infecting begomoviruses in
Brazil. Archives of Virology, New York, v. 148, p. 281-295, 2003.
RIBEIRO, S.G. et al. Molecular and biological characterization of Tomato chlorotic mottle
virus suggests that recombination underlies the evolution and diversity of Brazilian tomato
begomoviruses. Phytopathology, Saint Paul , v. 97, p. 702-711, 2007.
RIBEIRO, S.G. et al. Widespread occurrence of tomato geminiviruses in Brazil, associated
with the new biotype of the whitefly vector. Plant Disease, Saint Paul , v. 82, p. 830, 1998.
RIBEIRO, S.G.; AMBROZEVICIUS, L.P.; ÁVILA, A.C.; BEZERRA, I.C.; CALEGARIO,
R.F.; FERNANDES, J.J.; LIMA, M.F.; MELLO, R.N.; ROCHA, H.; ZERBINI, F.M.
Distribution and genetic diversity of tomato-infecting begomoviruses in Brazil. Archives of
Virology, New York, v. 148, p. 281-295, 2003.
ROCHA, C. S. et al. Brazilian begomovirus populations are highly recombinant, rapidly
evolving, and segregated based on geographical location. Journal of Virology, v. 87, p.
5784–5799, 2013.
ROJAS, M.R. et al. Exploiting chinks in the plant’s armor: evolution and emergence of
geminiviruses. Annual Review of Phytopathology, Palo Alto, v. 43, p. 361–394, 2005.
ROMAY, G. et al. Association of an atypical alphasatellite with a bipartite New World
begomovirus. Archives of Virology, New York, v. 155, p. 1843-1847, 2010.
65
RONQUIST, F. et al. MrBayes 3.2: Efficient Bayesian Phylogenetic Inference and Model
Choice across a Large Model Space. Systematic Biology Advance Access, v. 61, p. 539-42,
2012.
ROOSSINCK, M. J. Mechanisms of plant virus evolution. Annual Revew of
Phytopathology, v. 35, p. 191–209, 1997.
ROUMAGNAC, P.; GRANIERL, M.; BERNARDOL, P.; DESHOUX, M. FERDINAND, R.;
GALZI, S.; FERNANDEZ, E. ; ABT, C. J. I. ; FILLOUXL, D. ; MESLÉARD, F ;
VARSANI, A.; BLANC, S. ; MARTIN, D. P. ; PETERSCHMITT, M. Alfalfa leaf curl virus:
An aphid-transmitted geminivirus. JVI Accepted Manuscript. Journal of Virology. 2015.
ROZAS, J. et al. DnaSP, DNA polymorphism analyses by the coalescent and other methods.
Bioinformatics, v. 19, p. 2496–2497, 2003.
RUIZ-MEDRANO, R.; XOCONOSTLE-CAZARES, B.; LUCAS, W.J. The phloem as a
conduit for inter-organ communication. Current Opinion in Plant Biology, Cambridge, v. 4,
p. 202-209., 2001.
RYBICKI, E.P. A Top Ten list for economically important plant viroses. Archives of
Virology, v. 160. P. 17-20. 2015.
SAMBROOK J.; RUSSEL D. Molecular Cloning -A Laboratory Manual (3ª ed.). Cold
Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001.
SÁNCHEZ-CAMPOS S. et al. Fulfilling Koch’s postulates confirms the monopartite
nature of tomato leaf deformation virus: A begomovirus native to the New World.
Virus Research, v.173, p. 286-293. 2013.
SANDERFOOT, A.A.; LAZAROWITZ, S.G. Cooperation in viral movement: The
geminivirus BL1 movement protein interacts with BR1 and redirects it from the nucleus to the
cell periphery. Plant Cell, Rockville, v. 7, p. 1185-1194, 1995.
SAUNDERS, K.; BEDFORD, I.D.; BRIDDON, R.W.; MARKHAM, P.G.; WONG, S.M.;
STANLEY, J. A unique virus complex causes Ageratum yellow vein disease. Proceedings of
the National Academy of Sciences of the United States of America, Washington, v. 97, p.
6890-6895, 2000.
SAUNDERS, K.; BEDFORD, I.D.; STANLEY, J. Adaptation from whitefly to leafhopper
transmission of an autonomously replicating nanovirus-like DNA component associated with
ageratum yellow vein disease. Journal of General Virology, London, v. 83, p. 907-913,
2002.
SAUNDERS, K.; STANLEY, J. A nanovirus-like DNA component associated with yellow
vein disease of Ageratum conyzoides: Evidence for interfamilial recombination between plant
DNA viruses. Virology, New York, v. 264, p. 142-152, 1999.
SEAL, S. E., VAN DEN BOSCH, F. & JEGER, M. J. Factors influencing begomovirus
evolution and their increasing global significance: Implications for sustainable control.
Critical Reviews in Plant Sciences, v. 25, p. 23-46. 2006.
66
SILVA, S.J.C. et al. High genetic variability and recombination in a begomovirus population
infecting the ubiquitous weed Cleome affinis in northeastern Brazil. Archives of Virology,
New York, v. 156, p. 2205–2213, 2011.
SILVA, S.J.C. et al. Species diversity, phylogeny and genetic variability of begomovirus
populations infecting leguminous weeds in northeastern Brazil. Plant Pathology, v. 61, p.
457–467, 2012.
STAMATAKIS, A. RAxML-VI-HPC: maximum likelihood-based phylogenetic analyses
with thousands of taxa and mixed models. Bioinformatics 22, 2688–2690. 2006.
STANLEY, J. Analysis of African cassava mosaic virus recombinants suggest strand nicking
occurs within the conserved nonanucleotide motif during the initiation of rolling circle DNA
replication. Virology, v. 206, p. 707-712, 1995.
STANLEY, J. et al. Family Geminiviridae. In Virus Taxonomy: Eighth Report of the
International Committee on Taxonomy of Viruses. Elsevier, London, p. 301–326, 2005.
STENGER, D.C. et al. Replicational release of geminivirus genomes from tandemly repeated
copies: Evidence for rolling-circle replication of a plant viral DNA. Proceedings of the
National Academy of Sciences of the United States of America, Washington, v. 88, p.
8029-8033, 1991.
SUNG, Y.K.; COUTTS, R.H. Pseudorecombination and complementation between potato
yellow mosaic geminivirus and tomato golden mosaic geminivirus. Journal of General
Virology, London, v. 76, p. 2809-2815, 1995.
SUNTER, G. et al. Plants expressing tomato golden mosaic virus AL2 or beet curly top virus
L2 transgenes show enhanced susceptibility to infection by DNA and RNA viruses. Virology,
v. 285, n. 1, p. 59-70, 2001.
SUNTER, G.; BISARO, D.M. Transactivation of geminivirus AR1 and BR2 gene expression
by the viral AL2 gene product occurs at the level of transcription. Plant Cell, v. 4, p. 1321
1331, 1992.
SUZUKI. D.T., et al. Introdução à Genética. 4 ed.. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan S.A.
764p. 1991.
TAVARES, S.S. et al. Further molecular characterization of weed-associated begomoviruses
in Brazil with an emphasis on Sida spp. Planta Daninha, Rio de Janeiro, v. 30, n. 2, p. 305
315, 2012.
TIMMERMANS, M.C.P.; DAS, O.P.; MESSING, J. Geminiviruses and their uses as
extrachromossomal replicons. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular
Biology. v. 45, p. 79-112, 1994.
UMAHARAN, P.; PADIDAM, M.; PHELPS, R.H.; BEACHY, R.N.; FAUQUET, C.M.
Distribution and diversity of geminiviruses in Trinidad and Tobago. Phytopathology, v. 88,
p. 1262-1268. 1998.
67
UNSELD, S. et al. Virus-specific adaptations for the production of a pseudorecombinant virus
formed by two distinct bipartite geminiviruses from Central America. Virology, New York, v.
274, p. 179-188, 2000.
VANITHARANI, R.; CHELLAPPAN, P.; PITA, J.S.;FAUQUET, C.M. Differential roles of
AC2 and AC4 of cassava geminiviruses in mediating synergism and suppression of
posttranscriptional gene silencing. Journal of Virology, Washington, v. 78, p. 9487-9498,
2004.
VARSANI, A. et al. A highly divergent South African geminivirus species illuminates the
ancient evolutionary history of this family. Virology Journal, v. 6, p. 36, 2009.
VARSANI, A. et al. Establishment of three new genera in the family Geminiviridae:
Becurtovirus, Eragrovirus and Turncurtovirus. Archives of Virology, Springer Vienna, v.
159, p. 2193-2203, 2014.
VON ARNIM, A.; STANLEY, J. Inhibition of African cassava mosaic virus systemic
infection by a movement protein from the related geminivirus Tomato golden mosaic virus.
Virology, New York, v. 187, p. 555-564, 1992.
WRIGHT, S. The genetical structure of populations. Annals of Eugenics, v. 15, p. 323–354,
1949.
WYANT, K. A. et al., The genomes of four novel begomovirus species and a new Sida
micrantha mosaic virus strain from Bolivian weeds. Arch. Virol, v. 156, p. 347–352. 2011.
ZERBINI, F.M. et al. Traditional and novel strategies for geminivirus management in Brazil.
Australasian Parglant Pathology, Perth, v. 34, p. 475-480, 2005.
ZERBINI, F.M.; CARVALHO, M.G.; MACIEL-ZAMBOLIM, E. Introdução à Virologia
Vegetal. Viçosa: Ed. UFV, 2002. 145p. 2000.
ZHOU, X.; et al. Evidence that DNA-A of a geminivirus associated with severe cassava
mosaic disease in Uganda has arisen by interspecific recombination. Journal of General.
Virology, v. 78, p. 2101-2111, 1997.
