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                    UNIVERSIDADE FEDERAL DE ALAGOAS
CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM
PROTEÇÃO DE PLANTAS

RENATO NUNES DO NASCIMENTO

VARIABILIDADE E ESTRUTURA GENÉTICA DO
BEGOMOVÍRUS Euphorbia yellow mosaic virus INFECTANDO
HOSPEDEIROS NÃO-CULTIVADOS NO BRASIL

Rio Largo - AL
2015

N244v

Nascimento, Renato Nunes do.
Variabilidade e estrutura genética do Begomovírus Euphorbia yellow
mosaic vírus infectando hospedeiros não-cultivados no Brasil / Renato Nunes
do Nascimento. – 2015.
64 f. : il.
Orientadora: Iraildes Pereira Assunção.
Coorientador: Roberto Ramos Sobrinho.
Dissertação (Mestrado em Proteção de Plantas) – Universidade Federal de
Alagoas. Centro de Ciências Agrárias. Rio Largo, 2015.
Bibliografia: f. 53-64.
1. Geminivírus. 2. Plantas daninhas. 3. Variabilidade genética.
4. Estruturação de população. I. Título.

CDU: 632.38

RENATO NUNES DO NASCIMENTO

VARIABILIDADE E ESTRUTURA GENÉTICA DO
BEGOMOVÍRUS Euphorbia yellow mosaic virus INFECTANDO
HOSPEDEIROS NÃO-CULTIVADOS NO BRASIL

Dissertação de Mestrado apresentada ao
Programa de Pós Graduação em Proteção de
Plantas do Centro de Ciências Agrárias da
Universidade Federal de Alagoas como
requisito parcial para obtenção do grau de
Mestre em Proteção de Plantas.
Orientadora: Prof.ª Dr.ª Iraildes Pereira
Assunção

Rio Largo - AL
2015

RENATO NUNES DO NASCIMENTO

VARIABILIDADE E ESTRUTURA GENÉTICA DO
BEGOMOVÍRUS Euphorbia yellow mosaic virus INFECTANDO
HOSPEDEIROS NÃO-CULTIVADOS NO BRASIL
Dissertação

apresentada

ao

Curso

de

Mestrado em Proteção de Plantas, do
Centro

de

Ciências

Agrárias

Universidade

Federal

de

Alagoas.

seguinte

Banca

Aprovada

pela

da

Examinadora:

Prof.ª Dr.ª. Iraildes Pereira Assunção - Universidade Federal de Alagoas (Orientadora)

Banca Examinadora:

Prof. Dr. Gaus Silvestre de Andrade Lima – Universidade Federal de Alagoas
(Examinador)

Dr. Roberto Ramos Sobrinho – Bolsista PRODOC/CAPES/UFAL (Examinador)

Rio Largo - AL
2015

Dedico esse trabalho à minha esposa Suênia
e à minha filha Clarissa, razões para esse
esforço.

AGRADECIMENTOS

Ao Programa de Pós-graduação em Proteção de Plantas do CECA - UFAL, à
todos os mestres da casa pelos ensinamentos, ao Prof. Gaus Andrade de Lima, ao Prof.
Marcio Aurélio Lins e Prof. Eliane Aparecida Holanda Cavalcanti, ambos do Campus
Arapiraca pelo apoio para a realização desse curso.
À minha família pelo apoio incondicional, aos meus colegas de laboratório:
Aline, Lucas, Jane Cléa, Fred, Jaqueline, Lourdes Regina, Laura, Jecy, Leonardo e em
especial à Mayra Ferro pelas valiosas contribuições, Jean Phellipe pelo constante apoio e
ao Prof. Jorge Portella pelas boas conversas, sempre proveitosas.
Aos meus amigos-irmãos em Alagoas, Anderson Sabino e Jefferson Leal.
Aos meus orientadores desde o início dos trabalhos de pesquisa: Dr.ª Márcia
Carine, Dr. Roberto Ramos Sobrinho e Prof.ª Dr.ª Iraildes Pereira Assunção.

RESUMO
Os begomovírus estão entre os grupos de fitopatógenos de maior importância
econômica em todo o mundo, afetando diversas espécies cultivadas, principalmente em
regiões tropicais e subtropicais. No Brasil, além de plantas cultivadas como as
pertencentes ao gênero Phaseolus (feijoeiros) e tomateiro (Solanum lycopersicum), os
begomovírus infectam plantas não-cultivadas pertencentes à diversas famílias botânicas
como Malvaceae, Euphorbiaceae, Fabaceae e Asteraceae. Esses vírus podem ser
transmitidos entre os diferentes hospedeiros cultivados e não-cultivados, com plantas
silvestres atuando como possíveis fontes de inóculo e como hospedeiros alternativos,
apresentando importância epidemiológica durante o ciclo da doença. O objetivo deste
trabalho foi quantificar os diferentes mecanismos evolutivos atuando sobre a
variabilidade e estrutura genética de populações de begomovírus infectando hospedeiros
não-cultivados no Brasil. Amostras de plantas da família Euphorbiaceae apresentando
sintomas de infecção por begomovírus foram coletadas no estado da Paraíba, o DNA
total foi extraído e os componentes genômicos virais foram amplificados por RCA,
clivados com enzimas de restrição, clonados e sequenciados. As sequências obtidas
foram comparadas com sequências a partir do banco de dados de nucleotídeos não
redundantes Genbank, usando o critério de ≥91% para demarcação de espécie. Foram
realizadas análises filogenéticas, de diversidade, recombinação e seleção. A análise de
comparações pareadas mostrou que os 49 isolados utilizados neste trabalho pertenceram
a uma única espécie viral: Euphorbia yellow mosaic virus (EuYMV).
Filogeneticamente, as populações agruparam em árvores bastante similares, porém com
algumas incongruências topológicas para as diferentes regiões genômicas. Foi
observada a formação de dois grupos principais correlacionados com a origem
geográfica. A diversidade nucleotídica da população total apresentou-se maior quando
comparada com as subpopulações do Nordeste e Centro-Oeste, sendo essa diversidade
semelhante para os conjuntos de dados DNA-A, CP e Rep. Análise reticulada do
conjunto de dados DNA-A, CP e Rep mostrou evidências de recombinação atuando na
evolução de alguns isolados do Nordeste e Centro-Oeste, sendo detectado apenas um
isolado possivelmente recombinante, com pontos de recombinação na Região Comum e
interface dos genes Trap e Ren. Análise de seleção mostrou que a pressão de seleção
negativa ou purificadora é a principal força seletiva atuando sobre os genes CP e Rep
das subpopulações do EuYMV.
Palavras-chave: Geminivírus, Plantas daninhas, Variabilidade genética, Estruturação
de população.

ABSTRACT
The begomoviruses are among the most economic important pathogens worldwide,
affecting different crops, mainly in tropical and subtropical regions. In Brazil, besides
cultivated plants belonging to the genus Phaseolus (beans) and tomato (Solanum
lycopersicum), begomoviruses infect non-cultivated hosts in different botanical
families: Malvaceae, Euphorbiaceae, Fabaceae and Asteraceae. These viruses can be
transmitted between different cultivated and non-cultivated hosts, with wild plants
acting as putative source of inoculum and as alternate hosts, displaying epidemiological
importance in the disease cycle. The aim of this study was to quantify the different
evolutionary mechanisms acting on the variability and genetic structure of begomovirus
populations infecting non-cultivated hosts in Brazil. Plants from the family
Euphorbiaceae showing symptoms of begomovirus infection were collected in the
Paraíba State, total DNA was extracted and viral genomic components were amplified
by RCA, cleaved with restriction enzymes, cloned and sequenced. The sequences from
this study were compared to sequences from the Genbank non-redundant nucleotide
database, taking account the criterion of ≥91% for species demarcation. Phylogenetic,
diversity, recombination and selection analyses were performed. The pairwise
comparison showed that all 49 isolates used in this study belonged to one only viral
species: Euphorbia yellow mosaic virus (EuYMV). Phylogenetically, the population
grouped in very similar trees, but with some topological inconsistencies for the different
genomic regions. Formation of two main groups correlated with geographic origin was
observed. Nucleotide diversity of the total population was higher than Northeastern and
Midwestern subpopulations, being similar in the DNA-A, CP and Rep datasets.
Network analysis of the DNA-A, CP and Rep datasets showed evidence of
recombination affecting the evolution of isolated from Northeastern and Midwestern,
being detected only one isolate as putative recombinant, with recombination breakpoints
in the Common Region and interface of the Trap and Ren genes. Selection analysis
showed that negative selection pressure or purifying selection is the main selection force
acting on CP and Rep of the EuYMV subpopulations.
Key words: Geminivirus, Weeds, Genetic variability, Population structure.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1 - Representação esquemática do genoma do Bean golden yellow mosaic virus
(BGYMV), espécie-tipo do gênero Begomovirus. ................................................................... 16
Figura 2 - Matriz bidimensional representando a porcentagem de identidade de
comparações pareadas de sequências nucleotídicas do DNA-A dos isolados da Paraíba e
Goiás com isolados de begomovírus disponíveis no GenBank ................................................ 46
Figura 3 - Análise filogenética de máxima verossimilhança baseada no DNA-A,
mostrando a formação de dois grupos distintos de acordo com a origem geográfica.
Grupo 1 = isolados obtidos no Centro-Oeste, grupo 2 = isolados obtidos no Nordeste. ......... 47
Figura 4 - Análise filogenética de máxima verossimilhança baseada na ORF CP,
mostrando a formação de dois grupos distintos de acordo com a origem geográfica.
Grupo 1 = isolados obtidos no Centro-Oeste, grupo 2 = isolados obtidos no Nordeste. ......... 48
Figura 5 - Análise filogenética de máxima verossimilhança baseada na ORF Rep,
mostrando a formação de dois grupos distintos de acordo com a origem geográfica.
Grupo 1 = isolados obtidos no Centro-Oeste, grupo 2 = isolados obtidos no Nordeste. ......... 49
Figura 6 - Análise reticulada baseada no DNA-A. Isolados obidos no estado da Paraíba
(linha vermelha). ....................................................................................................................... 50
Figura 7 - Análise reticulada baseada na ORF CP. Isolados obidos no estado da Paraíba
(linha vermelha). ....................................................................................................................... 51
Figura 8 - Análise reticulada baseada na ORF Rep. Isolados obidos no estado da Paraíba
(linha vermelha) ........................................................................................................................ 52

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Isolados de begomovírus obtidos a partir de amostras coletadas no estado da
Paraíba ...................................................................................................................................... 39
Tabela 2 - Isolados de begomovírus provenientes do estado de Goiás. ................................... 40
Tabela 3 - Sequências de begomovírus obtidas a partir do banco de dados nãoredundante de nucleotídeos Genbank. ...................................................................................... 41
Tabela 4 - Diversidade genética em populações do Euphorbia yellow mosaic virus
infectando hospedeiras não-cultivadas no Brasil ..................................................................... 43
Tabla 5 - Eventos de recombinação detectados entre os isolados de Euphorbia yellow
mosaic virus .............................................................................................................................. 44
Tabela 6 - Sítios sob pressão de seleção positiva e negativa nas ORFs CP e Rep dos
isolados de Euphorbia yellow mosaic virus... .......................................................................... 45

SUMÁRIO
1

INTRODUÇÃO .................................................................................................................................. 11

2

REVISÃO DA LITERATURA .................................................................................................... 12

2.1

A família Geminiviridae...................................................................................................................... 12

2.2

Organização genômica e papel desempenhado pelas proteínas dos Begomovirus............ 14

2.3

Replicação viral. .................................................................................................................................... 17

2.4 Variabilidade e estrutura genética de populações de begomovírus. ...................................... 20
2.4.1 Mutação .................................................................................................................................................... 20
2.4.2 Recombinação. ....................................................................................................................................... 21
2.4.3 Pseudorecombinação. ........................................................................................................................... 23
2.5

Diversidade de begomovírus infectando plantas cultivadas e plantas daninhas no
Brasil. ....................................................................................................................................................... 25

3

MATERIAL E MÉTODOS. ........................................................................................................... 30

3.1

Coleta do material vegetal. ................................................................................................................. 30

3.2 Extração de DNA, amplificação e clonagem dos genomas virais. ......................................... 30
3.3 Análise de sequências e demarcação de espécies. ....................................................................... 31
3.4

Análise filogenética. ............................................................................................................................. 31

3.5

Estrutura genética e índices de variabilidade................................................................................ 31

3.6

Análises de recombinação. ................................................................................................................. 32

3.7 Análise de seleção. ................................................................................................................................ 32
4

RESULTADOS .................................................................................................................................... 33

4.1

Demarcação da espécie. ...................................................................................................................... 33

4.2

Filogenia. ................................................................................................................................................. 33

4.3

Diversidade genética. ........................................................................................................................... 33

4.4

Recombinação. ....................................................................................................................................... 34

4.5

Análise de seleção. ................................................................................................................................ 34

5

DISCUSSÃO ......................................................................................................................................... 35

6

CONCLUSÕES.................................................................................................................................... 38
REFERÊNCIAS .................................................................................................................................. 53

11

1 INTRODUÇÃO

Os begomovírus são fitovírus de DNA de fita simples (ssDNA) circular
compostos por um ou dois componentes genômicos (DNA-A e DNA-B) encapsidados
numa estrutura geminada icosaédrica, sendo transmitidos naturalmente pela “moscabranca” Bemisia tabaci (BROWN et al., 2012). Begomovírus constituem um grupo
importante de fitopatógenos pertencente à família Geminiviridae, afetando diversas
culturas de importância econômica em todo o mundo. No Brasil, as culturas mais
prejudicadas por begomovírus são os feijoeiros (Phaseolus spp.) e tomateiro (Solanum
lycopersicum). Em feijões, as perdas podem chegar a 100%, e em tomate, redução de
60% na produtividade já foi observada (QUINTELA et al., 2008; MORALES, 2001;
GIORDANO et al., 2005)
Além de plantas cultivadas, os begomovírus podem infectar plantas silvestres de
diversas famílias botânicas, podendo servir como fonte de inóculo e como hospedeiros
alternativos na ausência da espécie cultivada. A diversidade genética dos begomovírus
que

infectam

plantas

cultivadas

e/ou

não-cultivadas

no

Brasil

é

alta

(AMBROZEVICIUS et al., 2002; CALEGARIO, 2004; CASTILLO-URQUIZA, 2008;
LIMA et al., 2013; ROCHA et al., 2013; RAMOS-SOBRINHO et al., 2014), e podem
ser fruto de frequentes eventos de recombinação e pseudorecombinação entre os
begomovírus durante infecções mistas (AMBROZEVICIUS, et al, 2002, ZHOU et
al.,1997; FONDONG et al., 2000).
Mutação, recombinação e pseudorecombinação são os principais motores
responsáveis pela variabilidade genética nas populações de begomovírus, variabilidade
que fornece oportunidades de adaptação às diversas condições ambientais encontradas
nos campos de cultivo. Conhecer a estrutura e a diversidade genética das populações de
begomovírus

é

crucial

para

a

compreensão

das

interações

vírus/insetos

vetores/hospedeiros (GARCIA-ARENAL; FRAILE; MALPICA, 2003; ROOSSINCK,
1997; LIMA et al., 2013; ROCHA et al., 2013; RAMOS-SOBRINHO et al., 2014).
O objetivo do presente trabalho foi quantificar os diferentes mecanismos
evolutivos atuando sobre a variabilidade e estrutura genética de populações do
Euphorbia yellow mosaic virus (EuYMV), um begomovírus que infecta diversos
hospedeiros não-cultivados associados à culturas de importância econômica no Brasil.

12

2 REVISÃO DE LITERATURA

2.1

A família Geminiviridae

A família Geminiviridae é considerada uma das mais numerosas dentre os vírus
de planta, contando com 325 espécies distribuídas em sete gêneros: Becurtovirus,
Begomovirus, Curtovirus, Eragrovirus, Mastrevirus, Topocuvirus e Turncurtovirus,
sendo que os três últimos gêneros foram incluídos recentemente à família (VARSANI et
al., 2014). Essa divisão é baseada em características como gama de hospedeiros, tipo de
inseto vetor, organização genômica e relacionamento filogenético (VARSANI et al,
2014). Os membros dessa família são caracterizados por apresentarem DNA de fita
simples circular encapsidados em partículas geminadas de morfologia icosaédrica
(BROWN et al., 2012). Dentre os geminivírus, o gênero Begomovirus (espécie tipo
Bean golden yellow mosaic virus - BGYMV) é aquele que conta com o maior número
de espécies (VARSANI et al., 2014). Este gênero inclui os mais importantes vírus nas
regiões tropicais e subtropicais, como o Bean golden mosaic virus (BGMV), o African
cassava mosaic vírus (ACMV) e o Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV). Os
begomovírus apresentam um ou dois componentes genômicos designados DNA-A e
DNA-B, são transmitidos pela mosca-branca Bemisia tabaci (Homoptera: Aleyrodidae)
e infectam plantas dicotiledôneas (STANLEY et al., 2005; FARIA et al., 2000).
Os begomovírus são encontrados basicamente no floema das plantas infectadas,
entretanto, algumas espécies são capazes de infectar tecidos mais externos como as
células do mesófilo (Revisado por NELSON e VAN BEL, 1997). Esta capacidade de
colonizar o tecido epidérmico pode ser derivada de características genéticas adquiridas
por algumas espécies, como por exemplo, o Tomato golden mosaic virus (TGMV), que
é capaz de infectar células do mesófilo e de liberar o Bean golden mosaic virus (BGMV,
um vírus comumente restrito ao floema) a partir dos tecidos vasculares. Essa capacidade
de infectar células do mesófilo parece estar associada menos com a proteína codificada
pela ORF CP e mais com uma interação complexa entre a região não codificadora, a
Trap, Ren além das proteínas de movimento. (MORRA; PETTY, 2000). O Tomato
yellow spot virus (ToYSV) também invade células do mesófilo e em infecções mistas
com o Tomato rugose mosaic virus (ToRMV), o ToYSV libera para o mesófilo o
ToRMV que inicialmente é restrito ao floema (ALVES-JÚNIOR et al., 2009).

13

Baseado na organização genômica, diversidade genética e distribuição
geográfica, os begomovírus são divididos em dois grupos: begomovírus do “Velho
Mundo” (Europa, África, Ásia e Austrália) e do “Novo Mundo” (Américas). Os
begomovírus do "Velho Mundo" apresentam um ou dois componentes genômicos e
frequentemente estão associados a moléculas de ssDNA satélites denominados
alfassatélites (anteriormente DNA-1) e betassatélites (anteriormente DNA β)
(FAUQUET & STANLEY, 2005). SRIVASTAVA et al., (2015) amostraram uma nova
molécula de DNA satélite (RecSat) em associação com Tobacco leaf curl Yunnan virus
(TbLCYNV) infectando naturalmente plantas de tabaco. Análise de sequência
demonstrou que o satélite é uma quimera com elementos de alfassatélites e
betassatélites resultante de pelo menos três eventos de recombinação distintos,
demostrando assim a recombinação entre satélites distintos.
A maioria dos begomovírus encontrados no "Novo Mundo" apresenta dois
componentes genômicos denominados DNA-A e DNA-B, com relatos de ocorrência de
associação a alfassatélites (PAPROTKA; METZLER; JESKE, 2010b; ROMAY et al.,
2010). Recentemente, um begomovírus desprovido do componente genômico B foi
relatado causando Tomato leaf curl disease (ToLCD) no Peru e Equador. Esse vírus foi
denominado Tomato leaf deformation virus (ToLDV) e provavelmente é resultado de
eventos de recombinação e evolução convergente a partir do DNA-A do progenitor
bissegmentado (MELGAREJO et al., 2013; SÁNCHEZ-CAMPOS et al., 2013). Tratase, portanto, do primeiro relato de um begomovírus monopartido nativo do “Novo
Mundo”.
Alfassatélites foram identificados no Brasil e na Venezuela associados aos
begomovírus bissegmentados Cleome leaf crumple virus (ClLCrV), Euphorbia mosaic
virus (EuMV) e Melon chlorotic mosaic virus (MeCMV), sendo esses os primeiros
relatos de alfassatélites associados a begomovírus ocorrendo naturalmente no “Novo
Mundo” (PAPROTKA; METZLER; JESKE, 2010b; ROMAY et al., 2010). O primeiro
begomovírus relatado em associação com um betassatélites foi o Ageratum yellow vein
virus (AYVV). Desde então, vários outros begomovírus têm sido reportados e devido ao
número crescente de relatos de betassatélites, um sistema de classificação e
nomenclatura foi proposto para estes componentes, no qual já se observam listadas 51
espécies (BRIDDON et al., 2008).

14

Moléculas de DNA-satélite associadas a begomovírus monopartidos do “Velho
Mundo” foram relatadas interferindo na replicação do vírus auxiliar, na maioria das
vezes atenuando os sintomas, porém em alguns casos, induzindo o vírus auxiliar a
produzir novos sintomas não observados em infecções virais na ausência dos satélites
(ROOSSINCK, 1992). Complexos formados entre vírus e DNA Satélite quimérico pode
interferir no vírus auxiliar prejudicando seu acúmulo ou induzindo sintomas diferentes
daqueles produzidos unicamente pelo vírus, Srivastava et al., (2015). Briddon & Stanley
(2006) afirmam que as funções dos satélites ainda não são claras, pois variam
dependendo do vírus auxiliar. Entretanto parecem estar associados à virulência do
patógeno, exercendo função na supressão do silenciamento gênico da planta, com a
proteína βC1, codificada pelo betassatélite, sendo responsável por essa função (CUI et
al., 2005). Foi demonstrado ainda que begomovírus distintos quando interagem com um
mesmo DNA-satélite produzem os mesmos sintomas nas plantas infectadas
(MANSOOR et al., 2003), indicando que os satélites de DNA podem atuar como fatores
de patogenicidade. O método mais seguro para identificação de espécies de
begomovírus tem sido a determinação da sequência completa de nucleotídeos do DNAA. Devido à dificuldade inerente na identificação de espécies, o Grupo de Estudos de
Geminiviridae do Comitê Internacional de Taxonomia de Vírus (ICTV) propôs o limite
de ≥89% de identidade de nucleotídeos entre sequências completas do DNA-A para
espécies de Begomovirus (FAUQUET et al., 2008). Este limite foi redefinido para
≥91% de identidade (BROWN, et al., 2015). Em 2004, Inoue-Nagata e colaboradores
desenvolveram um método simples para clonagem de genomas completos de
begomovírus baseado na amplificação dos componentes genômicos por círculo rolante
(RCA – rolling-circle amplification) seguido por digestão com enzima de restrição e
ligação ao vetor. Este método tem facilitado os procedimentos de clonagem e rápida
realização de sequenciamento de um grande número de isolados. A utilização dessas
técnicas tem permitido a realização de estudos de variabilidade genética, epidemiologia
molecular, além de fornecer suporte a programas de melhoramento genético de espécies
cultivadas.

2.2 Organização genômica e papel desempenhado pelas proteínas dos Begomovirus
O genoma da maioria dos Begomovirus do “Novo Mundo” apresenta dois
componentes genômicos denominados DNA-A e DNA-B. Cada componente é

15

encapsidado separadamente em partículas geminadas sendo necessárias as duas
moléculas de DNA para que a infecção ocorra. Ambos apresentam um comprimento
semelhante de aproximadamente 2,6 Kb, não apresentando homologia de sequência,
exceto por uma região com cerca de 200 pb, a região comum (RC). A RC é altamente
conservada dentro de cada espécie viral, apresentando normalmente acima de 90% de
identidade. Na RC estão localizadas a origem de replicação e os promotores da síntese
dos mRNA’s virais (LAZAROWITZ, 1992; LAZAROWITZ et al., 1992; FONTES et
al., 1994b).
Dentro da RC localiza-se uma sequência de nove nucleotídeos (5’TAATATTAC-3’) conservada entre todos os geminivírus, onde se localiza o domínio
funcional da origem de replicação (OROZCO; HANLEY-BOWDOIN, 1996).
Entretanto, vale salientar que um nonanucleotídeo não usual (5’-TAGTATTAC-3’) foi
relatado no begomovírus Malvaviscus yellow mosaic virus (MYMV), obtido a partir de
hospedeiros ornamentais da família Malvaceae (LIMA et al., 2011). Este
nonanucleotídeo é clivado durante o início da replicação viral e se localiza num
contexto de 30 nucleotídeos capazes de formar uma estrutura em forma de grampo.
Embora a sequência de 30 nucleotídeos varie entre espécies de geminivírus, a estrutura
em forma de grampo está sempre presente, sendo considerado um elemento conservado
estruturalmente (FARIA & ZERBINI, 2000). A transcrição é bidirecional tanto no
componente A, que codifica genes envolvidos na replicação e encapsidação viral,
quanto no componente B, que codifica genes envolvidos na movimentação do vírus da
planta (Figura 1; TIMMERMANS; DAS; MESSING, 1994; BROWN, 1997; FARIA et
al., 2000).
No componente A, um gene é transcrito no sentido viral denominado CP que
codifica para a proteína da capa proteica (CP), e quatro, no sentido complementar Rep,
TrAP, Ren e C4, que codificam, respectivamente para a proteína associada à replicação
[Replication associated Protein (Rep)], a proteína da transcrição [Trans-Acting Protein
(TrAP)], uma proteína que aumenta a replicação do genoma viral [Replication Enhancer
(REn)] e uma proteína envolvida na supressão do silenciamento gênico. (C4), (FARIA
& ZERBINI, 2000).

16

Figura 1. Representação esquemática do genoma do Bean golden yellow mosaic virus (BGYMV),
espécie-tipo do gênero Begomovirus. Os círculos representam o genoma viral, com dois componentes
(DNA-A e DNA-B) de aproximadamente 2.600 nucleotídeos cada. Uma sequência de aproximadamente
200 nucleotídeos, denominada região comum (RC), contém a origem de replicação viral, com uma
estrutura em forma de grampo e uma sequência invariável de nove nucleotídeos (TAATATT↓AC),
conservada em todos os membros da família Geminiviridae. A seta (↓) indica o sítio de início da
replicação do DNA viral por círculo rolante. As setas coloridas indicam os genes virais e o sentido em
que ocorre a transcrição (viral – sentido horário e complementar – sentido anti-horário).

A função da capa proteica (CP) está relacionada com a proteção do genoma
contra degradação, aquisição do vírus e transmissão por insetos vetores, infectividade e
movimento sistêmico. A proteína CP é determinante da especificidade da transmissão
do vírus e na interação entre o vírus e a planta hospedeira, parece ainda estar associada
com o desenvolvimento de sintomas (GARDINER et al., 1998). Foi experimentalmente
demonstrado que a troca do gene CP do African cassava mosaic virus (ACMV), um
begomovírus transmitido por mosca-branca, pelo correspondente do Beet curly top virus
(BCTV), um curtovírus transmitido por cigarrinha, resultou na alteração da
especificidade do inseto vetor (BRIDDON et al., 1990).
O produto do gene Rep é uma enzima com propriedades de ligação a ácidos
nucléicos e de endonucleases. A função da proteína Rep é de se ligar ao sítio de
iniciação da replicação viral e cortar uma das fitas de DNA iniciando o processo
(FONTES;

LUCKOW;

HANLEY-BOWDOIN,

1992).

Rodríguez-Negrete

e

colaboradores (2013) sugerem que a Rep exibe atividade supressora dos mecanismos de
silenciamento gênico da planta reduzindo a expressão das metiltransferases
[metiltransferase 1 (MET1)], e junto com a proteína AC4 regula a crometilase (CMT3)
reduzindo a metilação do DNA viral em sítios GC.

17

A proteína TrAP, codificada pelo gene trap, é um fator de transcrição, que atua
nos promotores de genes de sentido viral (CP e NSP). Portanto os transcritos
correspondentes a estes genes só são observados na célula após a expressão de trap
(SUNTER & BISARO, 1992). Outra função da trap pode ser a de interagir com
proteínas do hospedeiro relacionadas com a defesa, como a adenosina kinase (ADK) e
SNF1 (SUNTER et al., 2001)
A proteína REn, codificada pelo gene REn, é um fator de amplificação da
replicação viral. Embora não seja essencial para que a replicação ocorra, o acúmulo de
DNA viral é muito maior quando esta proteína está presente (ZERBINI; CARVALHO;
MACIEL-ZAMBOLIM, 2002). Estudos envolvendo mutações nesta proteína têm
mostrado retardamento e atenuação de sintomas (ELMER et al., 1988; ETESSAMI et
al., 1991). Há a possibilidade de que a REn direcione a Rep para o domínio de ligação
Rep/DNA viral no local de clivagem no início da replicação (HANLEY-BOWDOIN et
al., 1999).
A C4 é responsável por contrariar a resposta do hospedeiro à ação da Rep
(Revisado por ROJAS et al, 2005; STANLEY et al, 2005), além disso é um importante
fator na determinação dos sintomas, estando comprometida no controle do ciclo celular,
podendo se envolver com outras proteínas virais e interagir com proteínas envolvidas
com o processo de ubiquinização pelo hospedeiro na tentativa de garantir o avanço da
infeção, (CASTILLO et al., 2004; EINI et al., 2009; LOZANO-DURAN e
BEJARANO, 2011; LOZANO-DURÁN, ROSAS-DÍAZ, GUSMAROLI, et al., 2011;
SÁNCHEZ-DURÁN et al., 2011; ZHANG et al., 2011)
No componente B, no sentido viral o gene NSP codifica uma proteína que realiza o
transporte do DNA através do envelope nuclear [Nuclear Shuttle Protein (NSP)], e no
sentido complementar o gene MP codifica a proteína de movimento [Moviment Protein
(MP)] com funções de movimento célula-a-célula (FARIA; ZERBINI, 2000; ZERBINI;
CARVALHO; MACIEL-ZAMBOLIN, 2002). Acredita-se que o transporte célula-acélula é realizado por um complexo: MP – DNA – NSP (HEHNLE et al., 2004).

2.3 Replicação viral

No processo de infecção dos geminivírus, o inseto vetor deposita as partículas
virais (ssDNA) nas células floemáticas do hospedeiro (LAZAROWITZ, 1992). O
genoma viral se dissocia da CP de forma espontânea e é transportado até o núcleo das

18

células hospedeiras com o auxílio da proteína de tráfego. Uma vez dentro do núcleo,
ocorre a replicação do genoma viral (LAZAROWITZ, 1992; STANLEY et al., 1995).
A replicação se inicia com a síntese de uma fita complementar de DNA gerando
um intermediário de fita dupla denominado “forma replicativa” (FR). A maneira como
esta conversão ocorre não é conhecida, no entanto evidências indiretas, como a
necessidade de desestabilização local do dsDNA para o iniciação da replicação por
círculo rolante em procariotos por “strand-nicking enzimes” indicam que é realizada por
fatores do hospedeiro (STENGER et al., 1991; STANLEY et al., 1995; ZERBINI;
CARVALHO; MACIEL-ZAMBOLIN, 2002). Essa forma replicativa acumula-se em
grandes concentrações na célula infectada e atua como molde para a síntese de novos
componentes genômicos e também para transcrição de genes virais (LAUFS et al.,
1995; HEYRAUD-NITSCHKE et al., 1995; STANLEY, 1995).
A FR serve como molde para síntese dos novos componentes genômicos que
ocorre por meio do mecanismo de “círculo rolante”, semelhante ao utilizado pelos
bacteriófagos φX174 e M13 (ZERBINI; CARVALHO; MACIEL-ZAMBOLIN, 2002).
A origem de replicação viral (ori) está localizada na região comum (RC), onde se
encontra a sequência conservada em forma de grampo (“structurally-conserved
element”, SCE) denominada nonanucleotídeo (5’-TAATATTAC-3’), no qual ocorre a
clivagem (TAATATTAC) realizada pela proteína Rep, que atua como uma
endonuclease, iniciando assim o processo de replicação por círculo rolante. A replicação
ocorre da mesma forma para o DNA-B (LAUFS et al., 1995; FARIA; ZERBINI, 2000;
STANLEY et al., 2005).
Na região comum encontram-se as sequências específicas para ligação da
proteína Rep (FONTES; LUCKOW; HANLEY-BOWDOIN, 1992; FONTES et al.,
1994a) e regiões promotoras da RNA polimerase tipo II de plantas, responsável pela
transcrição dos genes virais (HANLEY-BOWDOIN et al., 1999). Após a ligação da Rep
ao DNA viral e estabilização do complexo formado por Rep, Ren e fatores do
hospedeiro, a proteína Rep cliva o nonanucleotídeo localizado na SCE, dando início à
replicação por círculo rolante (GUTIERREZ, 1999). O reconhecimento pela proteína
Rep é considerado vírus-específico (HARRISON; ROBINSON, 1999; RAMOS et al.,
2003). Após o estágio inicial, os fatores necessários para completar a fase de círculo
rolante são de origem celular (GUTIERREZ et al., 2004). O último estágio é a produção
e a encapsidação do ssDNA genômico circular maduro em partículas virais
(GUTIERREZ, 1999).

19

Há outro mecanismo para a replicação dos geminivírus, conhecido como
Replicação Dependente de Recombinação (RDR), o qual foi proposto a partir da
identificação de intermediários de replicação viral do Abutilon mosaic virus (AbMV)
que não poderiam ser explicados pelo mecanismo de círculo rolante (JESKE et al.,
2001). Posteriormente, esses intermediários também foram observados nos geminivírus
African cassava mosaic virus (ACMV), Beet curly top virus (BCTV), Tomato golden
mosaic virus (TGMV) e Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) (PREISS e JESKE,
2003), indicando que a RDR é um mecanismo geral entre esses vírus. Além disso,
também já foram encontrados indícios que sugerem que DNA’s satélites associados ao
Tomato leaf curl virus (ToLCV), bem como a CLCuD (“cotton leaf curl disease”),
também replicam via RDR, concomitantemente à via de círculo rolante (ALBERTER et
al., 2005).
O início da RDR se dá quando uma molécula incompleta de ssDNA interage
com um DNA circular covalentemente fechado (“covalentely closed circular”
cccDNA), em um sítio de recombinação homólogo. O ssDNA é então alongado tendo
como molde o cccDNA, sintetizando-se assim um ssDNA completo, que então será
molde para a síntese da fita complementar. Ainda não está bem esclarecido se o
mecanismo é direcionado pelas proteínas do hospedeiro, ou se depende das proteínas
virais. Contudo, há indícios de que TrAP e REn não são essenciais (JESKE et al., 2001).
O modelo RDR explica diversos fenômenos biológicos relacionados aos geminivírus,
como a rápida e frequente recombinação. Além disso, a RDR poderia fornecer
vantagens adaptativas. Se a replicação viral normal for obstruída pela falta de
nucleotídeos, digestão do DNA viral pelas enzimas do hospedeiro ou conflitos entre
replicação e transcrição, as moléculas de DNA incompletas podem ser recuperadas pela
recombinação homóloga e serem convertidas em genomas virais completos (JESKE et
al., 2001).
Normalmente, os vírus infectam células vegetais já diferenciadas, ou seja, que
não estão em processo de síntese de DNA, sendo assim capazes de ativar a transcrição
dos genes da hospedeira que estão envolvidos na síntese das proteínas que necessitam.
Esse processo resulta em sintomas severos causados por esses vírus. Outro fator
relacionado à expressão de sintomas é a movimentação célula-a-célula do vírus, que
leva a um desarranjo do transporte intercelular, levando ao surgimento de sintomas da
infecção (FARIA; ZERBINI, 2000).

20

2.4 Variabilidade e estrutura genética de populações de begomovírus

A análise da diversidade e estrutura genética de populações é crucial para uma
melhor compreensão da evolução e interação do vírus com as plantas hospedeiras. As
principais fontes que determinam a variação e modificam a estrutura genética das
populações dos vírus em plantas são: mutação, recombinação e pseudorecombinação
(GARCIA-ARENAL; FRAILE; MALPICA, 2003). A estrutura genética de populações
de vírus de plantas refere-se à quantidade e à distribuição da variabilidade genética
dentro e entre subpopulações (GARCÍA-ARENAL et al., 2001).
A geração de diversidade genética entre vírus de plantas fornecem novas
oportunidades para adaptação a novos hospedeiros e a mudanças nas condições
ambientais (ROOSSINCK, 1997). A ocorrência de eventos de recombinação e
pseudorecombinação entre begomovírus bissegmentados e a alta taxa de mutação
contribuem para o elevado grau de diversidade observado neste grupo de vírus
(PADIDAM; SAWYER; FAUQUET, 1999; ANDRADE et al., 2006; DUFFY;
HOLMES, 2009). A ocorrência de infecção mista facilita a ocorrência de recombinação,
bem como de pseudorecombinação, contribuindo para a emergência de novas espécies
de begomovírus (ZHOU et al.,1997; FONDONG et al., 2000).

2.4.1 Mutação

Assim como para todos os vírus, a evolução dos geminivírus depende
primariamente de mutações. Há evidências de que a rápida evolução dos geminivírus é,
ao menos em parte, dirigida por processos mutacionais que agem especificamente sobre
ssDNA (HARKINS et al., 2009). O impacto das mutações pontuais tem sido estudado
nesse grupo de vírus sob diferentes condições de seleção, como presença de um efeito
gargalo (população inicial pequena do vírus, período curto de aquisição pelo vetor),
transferências sucessivas entre hospedeiros sem emprego do vetor, e inoculação de
plantas resistentes (ISNARD et al., 1998).
Duffy e Holmes (2009) realizaram análises estruturadas no tempo de isolados
de East African cassava mosaic virus (EACMV) para estimar a taxa de evolução dessa
espécie de begomovírus. As taxas foram estimadas em 1,6x10-3 e 1,33x10-4
subs/sítio/ano para o DNA-A e DNA-B, respectivamente. A região que codifica a
proteína CP apresentou 1,37x10-3 subs/sítio/ano e a região que codifica a proteína

21

associada à replicação mostrou 1,24x10-3 subs/sítio/ano. As regiões codificadoras
presentes no DNA-B, ORFs BV1 e BC1, apresentaram 2,77x10-4 e 3,45x10-4,
respectivamente (DUFFY; HOLMES, 2009). Os autores concluíram que as mutações
observadas refletem mais uma rápida dinâmica mutacional do que uma frequência de
evolução adaptativa. Contudo, validaram esses altos níveis de heterogeneidade apenas
para o DNA-A e a ORF AV1. Foi observado então que as taxas de evolução indicadas
para essas duas espécies de begomovírus, entre 10-3 e 10-5, corroboram em geral aquelas
determinadas experimentalmente para Mayze streak virus (MSV), (HARKINS et al.,
2009) e Tomato yellow leaf curl China virus (TYLCCNV); (GE et al., 2007). Os dados
obtidos por Rocha e colaboradores (2013), analisando begomovírus brasileiros
bipartidos, mostraram altas taxas de substituições de nucleotídeos por sitio por ano e
que as regiões do genoma que apresentam maiores taxas são da região intergênica e do
gene CP, corroborando os dados obtidos por Duffy e Holmes (2009).
Mutantes para a proteína Rep do Tomato golden mosaic virus (TGMV) e do
Cabbage leaf curl virus CaLCuV que não permitem a interação com a proteína pRB,
inoculados em protoplastos de fumo (Nicotiana tabacum) e em plantas N. benthamiana
apresentaram até 100% de frequência de reversão de mutações, evidenciando a
capacidade de populações de geminivírus de evoluir rapidamente para alterar mudanças
deletérias em seu genoma (ARGUELLO-ASTORGA et al., 2007).

2.4.2 Recombinação

A recombinação pode ocorrer em genomas de DNA e RNA e desempenham um
papel importante na evolução dos vírus de plantas (GARCIA-ARENAL et al., 2001).
Por recombinação, os vírus podem adquirir novas informações genéticas a partir de
outros vírus ou ainda a partir do hospedeiro (PADIDAM; BEACHY; FAUQUET,
1999). Os vírus, através da recombinação, conseguem ainda resgatar características
perdidas por mutações através de trocas genéticas com genomas do tipo selvagem
(MAKINO et al, 1986).
A recombinação é um evento bastante comum em geminivírus (PADIDAM;
BEACHY; FAUQUET, 1999) e parece contribuir grandemente para a diversificação
genética dos begomovírus aumentando seu potencial evolutivo e adaptação local
(MONCI et al., 2002). A recombinação tem sido destacada como um dos mais

22

importantes mecanismos evolutivos em begomovírus (LEFEUVRE et al., 2007, LIMA
et al., 2013; MARTIN et al., 2011) sendo responsável pela alta variabilidade genética
observada em populações de begomovirus que infectam plantas não-cultivadas (LIMA
et al., 2013; RAMOS-SOBRINHO et al., 2014).
Eventos de recombinação têm sido diretamente implicados na emergência de
novas doenças e epidemias em plantas cultivadas. Essas incluem a epidemia
devastadora do mosaico da mandioca (Manihot esculenta), causada pelo recombinante
EACMV na Uganda e países vizinhos (PITA et al., 2001); as epidemias do complexo
TYLCV na Bacia Ocidental do Mediterrâneo, com o surgimento dos recombinantes
Tomato yellow leaf curl Malaga virus (TYLCMalV) e Tomato yellow leaf curl
Axarquia virus (TYLCAxV) nos campos de tomate na Espanha; e as epidemias de
Cotton leaf curl virus (CLCuV) no Paquistão causadas por um complexo de espécies
incluindo diversos begomovírus recombinantes (IDRIS; BROWN, 2002; MONCI et al.,
2002).
Recentemente, Serfraz e colaboradores (2015) relataram no Paquistão um novo
begomovírus denominado Okra enation leaf curl virus (OELCuV). Esse begomovírus
aparece associado com Ageratum conizoides simthomless alphassatelite (AConSLA),
formando o complexo Okra enation leaf curl disease (OELCuD). Os autores sugerem
que o esse novo begomovírus é resultado de recombinação entre Bhendi yellow vein
mosaic virus (BYVMV) e Cotton leaf curl Multan virus (CLCuMV), mais precisamente
na região que codifica a proteína Rep.
A emergência frequente de novas espécies de geminivírus devido a eventos de
recombinação foi demonstrada por meio de análise de conversão gênica (PADIDAM;
BEACHY; FAUQUET, 1999). Embora na época o número de genomas completos
sequenciados fosse pequeno, os autores analisaram todas as combinações dois-a-dois
possíveis e identificaram 420 fragmentos recombinantes tanto entre espécies como entre
gêneros da família Geminiviridae.
Os mecanismos precisos que controlam a recombinação em begomovírus
permanecem desconhecidos (PADIDAM; BEACHY; FAUQUET, 1999). No entanto, é
conhecido que sítios recombinantes não são uniformemente distribuídos ao longo do
genoma com a existência de sítios frequentes (“hot spots”) e infrequentes (“cold spots”)
de recombinação (STANLEY, 1995; FAUQUET et al., 2005; GARCIA-ANDRES et
al., 2007; LEFEUVRE et al., 2007). Análises de bioinformática para detectar vírus
recombinantes ocorrendo naturalmente revelaram que a origem de replicação viral é um

23

sítio frequente de recombinação (HANLEY-BOWDOIN et al., 1999). A comparação de
sequência de begomovírus mono e bissegmentados depositadas no GenBank até maio
de 2006 (123 e 116 sequências, respectivamente) indicou que a região do gene Rep que
codifica a porção N-terminal da proteína Rep, assim como a região intergênica
adjacente (RC) são frequentemente intercambiadas durante a replicação. Também foram
identificados sítios frequentes de recombinação localizados na região intergênica entre
os genes CP e Ren (LEFEUVRE et al., 2007).
Diversos tipos de recombinantes podem surgir, o que reforça a importância da
recombinação como fonte de diversidade genética em begomovírus. O potencial
observado por esses vírus para gerar novos variantes genéticos através da recombinação
poderia explicar em parte a sua capacidade de adaptação e surgimento na natureza
(FARGETTE et al, 2006).

2.4.3 Pseudorecombinação

A existência de dois componentes genômicos na maioria dos begomovírus
promove um mecanismo alternativo, conhecido como pseudorecombinação, pelo qual a
troca de material genético pode ocorrer sem necessidade de recombinação
intermolecular, ocorrendo apenas a troca de componentes genômicos entre dois vírus
distintos (SUNG; COUTTS, 1995; ANDRADE et al., 2006).
Experimentos com pseudorecombinação são ferramentas úteis no estudo de
funções de genes e podem revelar relações filogenéticas, como é o caso da mistura de
componentes genômicos do BGYMV e do Bean golden mosaic virus (BGMV), que
possuem identidade inferior a 75% em suas sequências de nucleotídeos e não formam
pseudorecombinantes infecciosos (GILBERTSON et al., 1993a). Por outro lado,
pseudorecombinantes formados a partir da mistura de componentes genômicos de dois
isolados de BGYMV mostraram-se infecciosos. Quando inoculada, a mistura formada a
partir de DNA-A do isolado da Guatemala (BGYMV-GA) e DNA-B do isolado da
República Dominicana (BGYMV-DR) foi capaz de induzir os mesmos sintomas
apresentados pelos parentais, enquanto o pseudorecombinante recíproco induziu
sintomas atenuados e tardios. Esses resultados demonstram que geminivírus com
regiões comuns suficientemente similares podem formar pseudorecombinantes
infecciosos, mas ressaltam que frequentemente os pseudorecombinantes recíprocos
apresentam diferenças na eficiência de replicação e infecção sistêmica (FARIA et al.,

24

1994). Esse fato foi também observado para o African cassava mosaic virus (ACMV) e
TGMV (STANLEY et al., 2005; VON ARNIM; STANLEY, 1992).
Embora a pseudorecombinação seja comum entre estirpes de uma mesma
espécie de begomovírus, a formação de pseudorecombinantes viáveis entre espécies
distintas é mais difícil (HOFER, et al. 1997a; UNSELD, 2000; GARRIDO-RAMIREZ
et al, 2000).
Um pseudorecombinante produzido entre o DNA-A do Tomato mottle virus
(ToMoV) e o DNA-B do Bean dwarf mosaic virus (BDMV), embora infeccioso,
apresentou acúmulo reduzido do DNA-B e induziu sintomas atenuados em N.
benthamiana (GILBERTSON et al., 1993b; HOU e GILBERTSON, 1996). Entretanto,
após três passagens mecânicas sucessivas nesse hospedeiro, os sintomas tornaram-se
idênticos aos produzidos pelo ToMoV e o nível do DNA-B tornou-se igual ao do DNAA. A análise das regiões comuns dos DNA’s-A e -B do pseudorecombinante comprovou
a ocorrência de recombinação intermolecular na RC do BDMV, que foi substituída
quase que totalmente pela RC do DNA-A do ToMoV (HOU e GILBERTSON, 1996).
Assim, o DNA-B passou a ser reconhecido com cem por cento de eficiência pela
proteína

Rep

do

ToMoV.

Esse

resultado

evidencia

a

importância

da

pseudorecombinação e da recombinação na evolução de begomovírus e em sua
adaptação a novos hospedeiros.
Outro pseudorecombinante foi obtido entre o DNA-A do Abutilon mosaic virus
(AbMV) e o DNA-B do Sida golden mosaic Costa Rica virus (SiGMCRV), porém o
pseudorecombinante recíproco não foi infeccioso (HOFER et al., 1997b). Similarmente,
um pseudorecombinante viável foi formado pelo DNA-A de um isolado de Sida golden
mosaic virus (SiGMV) de Honduras [SiGMV-(Hoyv)] e o DNA-B do SiGMCRV.
Entretanto, dentre os pseudo-recombinantes recíprocos formados pelo DNA-A do
SiGMCRV combinado ao DNA-B de três isolados de SiGMV-[Hoyv] que possuíam
pequenas diferenças na composição de nucleotídeos, apenas um mostrou-se viável,
porém pouco eficiente, e não foi capaz de infectar a planta a partir da qual foi
originalmente isolado (UNSELD et al., 2000).
Pseudorecombinantes infecciosos foram formados entre o DNA-A do TGMV e
o DNA-B do ToYSV, que possuem iterons similares. A não formação do
pseudorecombinante recíproco sugere que a proteína Rep do TGMV tem maior
versatilidade em termos de reconhecimento de componentes de DNA heterólogos
comparada à do ToYSV (ANDRADE et al., 2006).

25

A viabilidade de pseudorecombinantes indica que fatores envolvidos na
replicação e movimento são intercambiáveis entre espécies altamente relacionadas ou
entre estirpes de uma mesma espécie. A assimetria entre pseudorecombinantes
recíprocos indica que a pseudorecombinação entre begomovírus é um fenômeno
complexo que envolve interações entre fatores do vírus e do hospedeiro (HILL et al.,
1998).

2.5 Diversidade de begomovírus infectando plantas cultivadas e plantas daninhas
no Brasil

As begomoviroses são doenças de grande importância econômica em diversas
espécies vegetais cultivadas em regiões tropicais e subtropicais, como feijão (Phaseolus
vulgaris), mandioca (Manihot esculenta), algodão (Gossypium sp.), tabaco (Nicotiana
tabacum) e tomate (Solanum lycopersicum), resultando em perdas significativas
(GRAHAM et al., 2010).
No Brasil, as culturas mais prejudicadas por begomovírus são feijoeiro e
tomateiro. Em feijão, os begomovírus provocam perdas econômicas que podem variar
de 30% a 100%, dependendo da cultivar, estádio de infecção da planta, população do
vetor, presença de hospedeiros alternativos e condições ambientais (QUINTELA et al.,
2008; MORALES, 2010). Em estudos da infecção de plantas de tomate por
begomovírus foi observada uma redução de aproximadamente 60% na produtividade,
sendo essa redução causada principalmente pela redução significativa do número médio
de frutos por planta (GIORDANO et al., 2005).
Begomovírus que infectam feijoeiro (Phaseolus spp.) são distribuídos através
das Américas, sendo sua incidência um fator limitante para a produtividade dessa
cultura. A diversidade genética de begomovírus que infectam feijoeiro é baixa, com
apenas quatro espécies descritas: Bean calico mosaic virus (BcaMV), Bean dwarf
mosaic virus (BDMV), Bean golden mosaic virus (BGMV), Bean golden yellow mosaic
virus (BGYMV) e Macroptilium yellow spot virus (MaYSV) (FAUQUET et al., 2008;
RAMOS-SOBRINHO et al., 2014). Estudos moleculares demonstraram que vírus
distintos causavam o mosaico dourado do feijoeiro no Brasil, na América Central e
Caribe (FARIA et al., 1994). A denominação atual para a espécie viral encontrada no
Brasil é o BGMV, enquanto a espécie encontrada na América Central e Caribe manteve
o BGYMV.

26

Ramos-Sobrinho e colaboradores (2014) analisando populações do BGMV e
MaYSV em hospedeiros cultivados (Phaseolus vulgaris e P. lunatus) e não-cultivado
(Macroptilium lathyroides), observaram que para cada espécie de begomovírus a
variação é similar nos hospedeiros cultivados e não-cultivado, o que parece indicar que
os hospedeiros não afetam a variabilidade genética desses vírus. Neste trabalho, os
autores também observaram um alto grau de variabilidade nas populações de MaYSV,
em comparação com as populações de BGMV, mas atribuem esse fato aos numerosos
eventos de recombinação em MaYSV. Foi sugerido ainda que a distribuição geográfica
dos hospedeiros influencia na estrutura genética de subpopulações do BGMV, mas não
de MaYSV.
O primeiro relato de geminivírus em tomateiro no Brasil ocorreu em 1975, no
qual o agente etiológico foi caracterizado como Tomato golden mosaic virus (TGMV),
como sendo transmitido pela “mosca-branca” (COSTA, 1975). Nos anos seguintes,
observou-se aumento na incidência e perdas de produção causadas por este grupo de
vírus em outras regiões produtoras. A presença de begomovírus foi posteriormente
observada infectando tomateiros nos Estados de Minas Gerais (ZERBINI et al., 1996),
São Paulo (FARIA et al., 1997) e em outros Estados produtores de tomate (BEZERRA
et al., 1996; RIBEIRO et al., 1996; FARIA et al., 2000). No Submédio do Vale São
Francisco, infecção por begomovírus em tomateiro causaram perdas estimadas em até
100% em algumas áreas (LIMA; HAJI, 1998).
A incidência da infecção por begomovírus em tomateiro tem aumentado
significativamente devido a introdução do Biótipo B da Bemisia tabaci no início da
década de 1990. Desde então, onze espécies definidas de begomovírus foram descritas:
Tomato golden mosaic virus (TGMV), Tomato rugose mosaic virus (ToRMV), Tomato
chlorotic mottle virus (ToCMoV), Tomato yellow spot virus (ToYSV), Tomato severe
rugose virus (ToSRV), Tomato mild mosaic virus (ToMlMV), Tomato yellow vein
streak virus (ToYVSV), Tomato mottle leaf curl virus (TMoLCV), Tomato common
mosaic virus (ToCmMV), Tomato interveinal chlorosis virus (ToICV) e Tomato golden
vein virus (TGVV) (FLORES et al., 1960; MATYIS et al., 1975; FERNANDES et al.,
2006; RIBEIRO et al., 2007; CALEGARIO et al., 2007; FERNANDES et al., 2008;
CASTILLO-URQUIZA et al., 2008; ALBUQUERQUE et al., 2012; RIBEIRO et al.,
2003; ).
Segundo Castillo-Urquiza et al. (2008) amostras de tomateiro e plantas daninhas
coletadas nos estados do Rio de Janeiro e Minas Gerais indicaram a prevalência do

27

ToYVSV e de uma nova espécie denominada Tomato common mosaic virus
(ToCmMV). Além disso, mais cinco novas espécies foram identificadas, duas
infectando tomateiro [Tomato mild mosaic vírus (ToMlMV) e Tomato leaf distortion
virus (ToLDV)] e três provenientes das invasoras Blainvillea rhomboidea [Blainvillea
yellow spot virus (BlYSV)], Sida rhombifolia [Sida yellow mosaic virus (SiYMV)] e
Sida micrantha [Sida common mosaic virus (SiCmMV)]. Rocha et al. (2013)
trabalhando com espécies de begomovírus infectando tomateiro, hospedeiros nãocultivados e espécies podendo infectar ambos os tipos de hospedeiros concluiu, com
base em evidências de recombinação, que as espécies identificadas no tomateiro tem
prováveis parentais nos hospedeiros não-cultivados e que as vírus deste tipo de
hospedeiro são geneticamente mais variáveis do que os predominantemente encontrados
em tomateiro.
Em pimentão, o primeiro relato de begomovírus no Brasil foi feito por Lima et
al. (2001), que verificaram um total de 43,8% de infecção nas amostras da cultivar S-59
e o híbrido Tango coletadas nos municípios de Curaçá (Bahia) e Petrolina
(Pernambuco) no Submédio do Vale São Francisco, causando, em média, 20% de perda
na produção.
Paprotka et al. (2010) estudaram a diversidade genética de begomovírus
presentes em acessos de batata-doce naturalmente infectados num Banco de
Germoplasma brasileiro. Duas novas espécies forma identificadas, Sweet potato golden
vein-associated virus (SPGVaV) e Sweet potato mosaic-associated virus (SPMaV),
além de três novos isolados e vários variantes do Sweet potato leaf curl virus (SPLCV).
A comparação de sequências dos begomovírus encontrados nesses acessos revelou a
presença de footprints, “pegadas” de recombinações anteriores em seus genomas,
ressaltando o risco do surgimento de novos begomovírus no material propagado
vegetativamente no Banco de Germoplasma.
Além de plantas cultivadas, muitas espécies de plantas invasoras têm sido
relatadas como hospedeiras de Begomovirus em vários países, inclusive no Brasil
(IDRIS et al., 2003; JOVEL et al., 2004; VARSANI et al., 2009; FIALLO-OLIVE et
al., 2010; MUBIN et al., 2010). As espécies relatadas geralmente pertencem a
Malvaceae, Euphorbiaceae e Fabaceae (MORALES & ANDERSON, 2001;
ASSUNÇÃO, 2006). Alguns estudos demonstraram casos em que Begomovirus
provenientes de plantas invasoras podem ser transmitidos para espécies cultivadas

28

através do inseto-vetor ou mediante inoculação via extrato vegetal tamponado
(FRISCHMUTH et al., 1997; MORALES; ANDERSON, 2001).
No Brasil, diversos trabalhos foram realizados com o objetivo de caracterizar
molecularmente isolados de begomovírus que infectam plantas silvestres e/ou daninhas,
sobretudo em associação às culturas do feijoeiro e do tomateiro (RIBEIRO et al., 1998;
FARIA; MAXWELL, 1999; CASTILLO-URQUIZA et al., 2008; LIMA et al., 2013;
ROCHA et al., 2013; RAMOS-SOBRINHO et al., 2014). Os resultados desses estudos
revelaram que, a exemplo do que ocorre com plantas cultivadas, a diversidade genética
é alta entre os isolados de begomovírus que infectam plantas invasoras
(AMBROZEVICIUS et al., 2002; CALEGARIO, 2004; CASTILLO-URQUIZA, 2008;
LIMA et al., 2013; ROCHA et al., 2013; RAMOS-SOBRINHO et al., 2014).
Ambrozevicius e colaboradores (2002) analisando a variabilidade genética de
begomovírus infectando tomateiros e algumas plantas daninhas associadas na região
Sudeste do Brasil, observaram que os isolados de begomovírus obtidos a partir de
plantas de tomate e espécies daninhas aproximavam-se filogeneticamente, sugerindo
que os hospedeiros naturais têm um importante papel como reservatório de espécies de
begomovírus, e que os vírus de tomate podem ter evoluído a partir de plantas daninhas,
devido principalmente a recombinações e pseudorecombinações. O Sida mottle virus
(SiMoV), obtido originalmente de plantas de Sida rhombifolia coletadas em Viçosa,
MG (FERNANDES et al., 1999), foi também encontrado em plantas de tomateiro na
Zona Metalúrgica no estado de Minas Gerais (CALEGARIO, 2004), dando suporte a
hipótese de que begomovírus de tomate podem ter evoluído a partir de begomovírus
infectando hospedeiros silvestres
A partir de material foliar de plantas sintomáticas pertencentes às famílias
Malvaceae, Euphorbiaceae e Capparaceae, coletadas no município de Miranda (Mato
Grosso do Sul), foram identificadas duas novas espécies de begomovírus, Cleome leaf
crumple virus (ClLCrV), obtido de Cleome affinis, e Sida mosaic Brazil virus (SiMBV).
Além disso, foram encontrados dois alfassatélites associados ao Euphorbia yellow
mosaic virus (Euphorbia mosaic virus Mato Grosso do Sul-associated DNA1) e ao
ClLCrV (Cleome leaf crumple virus-associated DNA1). Este foi o primeiro relato de
alfassatélites ocorrendo naturalmente no “Novo Mundo” (PAPROTKA; METZLER;
JESKE, 2010a).
Um novo begomovírus, Abutilon mosaic Brazil virus (AbMBV), foi identificado
infectando Abutilon sp. no estado da Bahia. Análises filogenéticas demonstraram que

29

ambos os componentes genômicos são distintos da espécie clássica, Abutilon mosaic
virus (AbMV) originária do oeste da Índia. Além disso, inoculação via biobalística
comprovou sua transmissão para Malva parviflora, a qual desenvolveu sintomas
característicos de clareamento de nervuras e mosaico (PAPROTKA; METZLER;
JESKE, 2010a).
Silva et al. (2011; 2012) observaram uma alta diversidade de espécies em
begomovírus infectando hospedeiras leguminosas silvestres tais como Macroptilium
spp, enquanto uma única espécies viral foi detectado na espécie não-cultivada Cleome
affinis.
Almeida (2012) identificou a presença de infecção por begomovirus bipartidos
em três espécies de Malváceas: Sidastrum micranthum, algodão (Gossypium hirsutum) e
Malvaviscus arboreus. Amostra de S. micranthum apresentando 69% de identidade de
nucleotídeos com Sida micrantha mosaic virus (SiMMV), sugerindo assim uma nova
espécie de begomovírus. Já amostras de algodão apresentaram 78% de identidade
(DNA-A) com Tomato mosaic comum virus (ToCMV) e 64% (DNA-B) com Cabbage
leaf curl virus (CabLCV) e Rhyncosia rugose golden mosaic virus (RhRGMV). Na
planta ornamental Malvaviscus arboreus, a sequência nucleotídica do DNA-A e do
DNA-B apresentaram porcentagem de identidade de 78% e 74% com Abutilon mosaic
Bolivia virus (AbMBoV), respectivamente. Estes resultado evidenciam que novas
espécies de begomovírus estão ocorrendo em plantas daninhas, cultivadas e ornamentais
pertencente à família Malvaceae no Brasil. O que pode ser corroborado pelo trabalho de
Tavares et al., (2012), os quais identificaram quatro novas espécies de begomovírus
infectando diferentes espécies de Sida, para as quais os seguintes nomes foram
propostos: Sida yellow net virus (SiYNV) obtido de Sida micrantha, Sida mottle
Alagoas virus (SiMoAV) obtido de S. urens e Sida sp., Sida yellow blotch virus (SiYBV)
e Sida yellow mosaic Alagoas virus (SiYMAV) obtidos de S. urens.

30

3 MATERIAL E MÉTODOS

3.1 Coleta do material vegetal

Amostras foliares

de Euphorbia heterophylla (família Euphorbiaceae)

apresentando sintomas típicos de infecção por begomovírus como mosaico,
amarelecimento, nanismo e deformação foliar foram coletadas no estado da Paraíba
(PB) em maio de 2014 (Tabela 1). Para cada amostra os seguintes dados foram obtidos:
espécie de planta, data da coleta, coordenadas de GPS do local de coleta e sintomas
(descrição e imagem digital da amostra no momento da coleta). As amostras foram
herborizadas e estocadas em temperatura ambiente. Dezenove sequências obtidas em
Santo Antônio de Goiás (GO) em 2012 foram gentilmente cedidas pelo Prof. Dr. Murilo
Zerbini e o Dr. Roberto Ramos (Tabela 2). Outras vinte sequências foram obtidas a
partir do banco de dados não-redundante de nucleotídeos Genbank (Tabela 3).

3.2 Extração de DNA, amplificação e clonagem dos genomas virais

O DNA total foi extraído a partir do material vegetal herborizado de acordo com
Doyle e Doyle (1987). Os componentes genômicos virais presentes nas amostras foram
amplificados utilizando-se a enzima DNA polimerase do bacteriófago phi29 de acordo
com o método descrito por Inoue-Nagata et al. (2004). Alíquotas das amplificações
foram submetidas, individualmente, a clivagens com a enzima de restrição HindIII. Os
produtos das reações de digestão foram então analisados em gel de agarose a 0,8%
corado com brometo de etídeo (5 µg/mL) e visualizados sob luz UV. Alíquotas das
reações de clivagem contendo fragmentos de ~2600 nucleotídeos, correspondentes a
uma cópia de cada componente genômico, foram utilizadas para ligação ao vetor
pBluescript KS+ (Stratagene) previamente linearizado com a mesma enzima e
defosforilado. Os produtos das reações de ligação foram utilizados para transformação
de células ultracompetentes de Escherichia coli estirpe DH5α pelo método de choque
térmico (SAMBROOK, et al., 2001). Colônias contendo os possíveis plasmídeos
recombinantes foram repicadas para meio LB líquido contendo ampicilina (Ampicilin,
sodium salt USB©) e incubadas a 37oC sob agitação orbital de 180 rpm durante 12h.
Após incubação, as culturas foram submetidas à extração de DNA plasmidial com KIT
illustraTM plasmidPrep Mini Spin (GE Healthcare), e o padrão eletroforético do DNA

31

plasmidial digerido com a enzima utilizada para clonagem foi utilizado para
confirmação da clonagem. Clones foram digeridos com a enzima HaeIII para seleção de
isolados a serem completamente sequenciados comercialmente por primer walking.

3.3 Análise de sequências e demarcação de espécies

Os genomas virais completos foram montados utilizando-se o programa
CodonCode Aligner v. 4.1.1 (www.codoncode.com). As sequências obtidas foram
inicialmente comparadas, através do algoritmo BLASTn (ALTSCHUL et al., 1990) e a
base de dados de nucleotídeos do GenBank, a fim de se determinar com quais espécies
virais elas compartilham maior identidade. As sequências similares do GenBank
(Tabela 3) foram utilizadas para classificação dos isolados obtidos nesse trabalho
utilizando-se o programa Sequence Demarcation Tool v. 1.0 (MUHIRE et al., 2013).

3.4 Análise filogenética

Alinhamentos múltiplos de sequências nucleotídicas foram preparados para o
DNA-A e para as sequências das regiões genômicas codificando as proteínas Rep e CP
utilizando-se o algoritmo MUSCLE (EDGAR, 2004) e ajustadas manualmente no
pacote MEGA6 (TAMURA et al 2013). Árvores filogenéticas de Máxima
Verossimilhança foram inferidas para os conjuntos de dados DNA-A, Rep e CP
utilizando-se o programa RAxML v. 7.0.3 (STAMATAKIS, 2006) assumindo General
Time Reversible (GTR) como modelo de substituição de nucleotídeos e modelo Gamma
(G) para distribuição da heterogeneidade. A robustez de cada ramo foi estimada a partir
de 1000 repetições e as árvores foram visualizadas e editadas nos programas FIGTREE
(ztree.bio.ed.ac.uk/software/figtree), Inkscape (https://inkscape.org/pt/) e CorelDraw
(CorelDRAW® Graphics Suite X7 Copyright © 1989-2014 Corel Corporation).

3.5 Estrutura genética e índices de variabilidade

Inferências sobre a estrutura genética das subpopulações foram baseadas no
índice de fixação F de Wright (WRIGTH, 1951), calculado usando o programa DnaSP
v. 5.10 (ROZAS et al., 2003). A estrutura das subpopulações foi testada de acordo com
a localização geográfica dos hospedeiros. A média das diferenças de nucleotídeos por

32

sitio (π) foi estimada para os conjuntos de dados DNA-A, Rep e CP em cada
população/subpopulação utilizando-se DnaSP v. 5.10.

3.6 Análises de recombinação

Possíveis locais (breakpoints) de recombinação no DNA-A foram determinados
utilizando-se os métodos RDP, Geneconv, Boot-scan, Maximum Chi Square, Chimaera,
SisterScan e 3Seq implementados no pacote RDP v. 3.44, (MARTIN et al., 2010). Os
alinhamentos foram analisados com definições padrão para os diferentes métodos e a
significância estatística foi inferida por um P-valor menor que o Bonferroni corrigido de
0,05. Somente eventos de recombinação detectados no mínimo por três diferentes
métodos foram considerados confiáveis. Evidência de evolução em rede foi avaliada
utilizando-se o método Neighbor-Net implementado no programa SplitsTree v. 4.10
(HUSON; BRYANT, 2006).

3.7 Análise de seleção

Para detectar sítios sob pressão de seleção positiva e negativa, os conjuntos de
dados para Rep e CP foram analisados utilizando-se o método baseado em ML
disponível no servidor DataMonkey (www.datamonkey.org): Single-Likelihood
Ancestor Counting (SLAC; SERGEI et al, 2005).

33

4 RESULTADOS

4.1 Demarcação de espécie
Usando análise de comparações pareadas e o critério de ≥91% de identidade para
sequências completas do componente genômico DNA-A (BROWN et al., 2013), os dez
isolados obtidos neste trabalho foram classificados em uma única espécie de
begomovírus: Euphorbia yellow mosaic virus (EuYMV; Figura 2). A porcentagem de
identidade de nucleotídeos variou entre 96,4-100% entre os isolados de EuYMV.

4.2 Filogenia

Análise filogenética mostrou que as árvores de ML para os conjuntos de dados
DNA-A, CP e Rep são bastante similares, porém com algumas incongruências
topológicas. Na filogenia para o DNA-A, pode-se observar a formação de dois grupos
principais (Grupos 1 e 2), correlacionados com a origem geográfica dos isolados [Grupo
1 com isolados a partir da região Centro-Oeste (CO), e Grupo 2 com isolados
predominantemente da região Nordeste (NE)] (Figura 3). Estruturação biogeográfica foi
então confirmada pelo alto valor observado de Fst (0,65). Entretanto, um isolado,
proveniente de Florestal estado de Minas Gerais (número de acesso KC706530)
agrupou com isolados do NE (Figura 3), o que pode estar relacionado com possíveis
eventos de migração atuando no processo evolutivo de subpopulações do EuYMV
nestas regiões. Quando analisadas as filogenias para os conjuntos de dados CP e Rep,
pode-se observar que o isolado de Florestal agrupa-se com isolados provenientes da
região CO para a região genômica CP (Figura 4), enquanto na filogenia para o gene
Rep, pode-se observar além do isolado de Florestal, pelo menos três outros isolados
provenientes do CO agrupando com isolados do NE (Figura 5). Esses resultados podem
indicar para possíveis eventos de recombinação entre os isolados de EuYMV, hipótese
que ganha maior força através da análise reticulada (ver abaixo).

4.3 Diversidade genética
Os índice de diversidade nucleotídica (π) para os isolados de EuYMV foi maior,
em todos os conjuntos de dados (DNA-A, CP e Rep), quando comparada a população

34

total com as subpopulações baseadas em localização geográfica, sendo a subpopulação
do CO ligeiramente mais diversa que a do NE (Tabela 4). Quando analisada a
variabilidade dentro das subpopulações, pode ser observado que π apresenta valores
semelhantes para os conjuntos de dados DNA-A, CP e Rep, indicando que a diversidade
nucleotídica está uniformemente distribuída ao longo do genoma.

4.4 Recombinação

Análise reticulada para os conjuntos de dados DNA-A, CP e Rep mostrou
evidência de eventos de recombinação influenciando a evolução de isolados de EuYMV
(Figuras 6, 7 e 8). A formação de rede é mais evidente entre alguns isolados compondo
a subpopulação do NE e isolados a partir do CO, como já evidenciado pela análise
filogenética. É também evidente a atuação de eventos de mutação sobre os isolados de
EuYMV após os possíveis eventos de recombinação, indicando que estes eventos
podem não ser recentes (Figuras 6, 7 e 8). Detecção de possíveis eventos de
recombinação no conjunto de dados de DNA-A mostrou um único evento, com pontos
de recombinação Região Comum (RC) e interface Trap e Ren do isolado FJ619507,
proveniente do estado de Goiás (Tabela 5), e para o qual análise reticulada evidenciou
uma possível origem recombinante (mais evidente no gene Rep; Figura 8).

4.5 Análise de seleção

A análise dos conjuntos de dados para as regiões genômicas codificando os
genes CP e Rep do EuYMV mostraram que a pressão de seleção negativa ou
purificadora é a principal força seletiva agindo sobre essas populações. Utilizando o
programa SLAC, nenhum sítio foi identificado sob pressão de seleção positiva para a
ORF CP, porém 13 sítios foram identificados sob pressão de seleção negativa. Para o
conjunto de dados Rep, um sítio foi identificado sob pressão de seleção positiva (sítio
39), e 16 sob seleção negativa (Tabela 6). A razão de taxa de substituições nãosinônimas sobre substituições sinônimas (dN/dS) foi de 0,12 para CP e 0,29 para Rep,
confirmando a seleção purificadora.

35

5 DISCUSSÃO

Costa e Bennett (1950) descreveram um vírus induzindo sintomas de mosaico
em plantas de Euphorbia prunifolia no Brasil, o qual era transmitido por mosca-branca
(Bemisia tabaci), contudo a identificação foi feita apenas a partir dos sintomas, dadas as
condições tecnológicas disponíveis na época. O agente etiológico descrito por Costa e
Bennet em 1950 foi caracterizado alguns anos depois como pertencendo ao grupo dos
geminivírus (JARAMILLO; LASTRA, 1986) e identificado como Euphorbia mosaic
virus (EuMV). Recentemente, foi realizada caracterização molecular de um
begomovírus infectando Euphorbia heterophylla no Brasil, o qual apresentou
porcentagem de identidade de 87% com o DNA-A da espécie Euphorbia mosaic Peru
virus (EuMPV), e 56,2% de identidade com um isolado de EuMV do México, sendo
portanto considerado como uma espécie nova: Euphorbia yellow mosaic virus
(EuYMV; FERNANDES et al., 2011). Desta forma, é provável que plantas da família
Euphorbiaceae venham sendo descritas no Brasil como hospedeiras de begomovírus
desde 1950. A partir desses resultados, pode-se afirmar que a espécie EuYMV
encontrada em E. heterophylla no Brasil é distinta dos begomovírus que infectam
hospedeiros da mesma família nas Américas Central e do Norte, e que essa espécie
provavelmente se originou dessa região, podendo ter descendido de isolados de EuMV.
A maioria dos isolados de EuYMV descritos até o momento foram obtidos a
partir de plantas do gênero Euphorbia. Entretanto, essa espécie já foi relatada infectando
naturalmente Macroptilium artropurpureus, Sida santaremensis, Crotalaria juncea e
Solanum lycopersicum no Brasil (BARRETO et al, 2013; TAVARES et al, 2012;
SILVA et al, 2011). Apesar desse begomovírus não ter sido descrito causando
problemas econômicos em plantas cultivadas, essa ampla gama de hospedeiros
(incluíndo o tomateiro, uma espécie plantada em todo Brasil) indica que EuYMV pode
vir a se tornar um problema fitossanítario no país.
Rocha et al, (2013) trabalhando com begomovírus que infectam tomateiros e
plantas daninhas observaram que populações eram estruturadas segundo localização
geográfica, e que tais populações apresentavam alta variabilidade genética. Estruturação
biogeográfica foi observada em populações do begomovírus Bean golden mosaic virus
(BGMV) infectando diferentes espécies de leguminosas (RAMOS-SOBRINHO et al.,
2014). Resultados semelhantes foram obtidos aqui, onde subpopulações do EuYMV
foram estruturadas segundo região geográfica de coleta. Esta estruturação pode estar

36

relacionada com a proximidade geográfica a partir de onde os isolados de EuYMV
foram obtidos, o que permitiria maiores taxas de fluxo gênico, mediado pelo inseto
vetor, em populações fisicamente mais próximas. Vale ressaltar que isolados no Grupo
1 são provenientes de diferentes espécies hospedeiras, indicando que essa estruturação
populacional deve ser realmente baseada em geografia e não em espécie de planta
hospedeira. Juntos, esses trabalhos corroboram as afirmações de Brown et al. (2012) de
que a estruturação de populações (e filogenia) dos begomovírus baseia-se
principalmente na localização geográfica, e não na espécie de hospedeiro.
Os principais mecanismos evolutivos determinando a distribuição da
variabilidade genética em populações virais são mutação e recombinação (GARCIAARENAL; FRAILE; MALPICA, 2003). Foi observado anteriormente que os altos
índices de variabilidade genética observados em algumas populações de begomovírus
estão diretamente relacionados à ocorrência de eventos frequentes de recombinação
(LIMA et al., 2013; ROCHA et al., 2013; RAMOS-SOBRINHO et al., 2014). No
presente trabalho, a maior variabilidade genética para a população total de EuYMV
pode estar relacionada com o fato de as subpopulações estarem estruturadas de acordo
com origem geográfica e, portanto, os valores observados referem-se à variabilidade
interpopulacional. Quando analisadas as subpopulações individuais, a do Centro-Oeste
apresenta índices ligeiramente maiores que a do Nordeste. Entretanto, vale salientar que
a subpopulação do Centro-Oeste é composta por um número três vezes maior de
isolados, e evidência de recombinação foi observada apenas em isolados representados
nesta subpopulação, o que poderia explicar a maior variabilidade genética. Em
comparação com outras espécies de begomovírus, as subpopulações de EuYMV
analisadas neste trabalho mostraram índices de diversidade genética similares a outras
populações onde evidência de recombinação não foi detectada (SILVA et al., 2011,
LIMA et al., 2012; ROCHA et al., 2013; RAMOS-SOBRINHO et al., 2014). Silva et
al., (2011) observaram o valor de 0,0572 no índice de diversidade nucleotídica para o
DNA-A de uma população do Macroptilium yellow spot virus (MaYSV), o que
representa um alto índice em relação aos valores observados para EuYMV relatado
aqui. Vale ressaltar que os altos índices de variabilidade genética presentes em MaYSV
são devido eventos frequentes de recombinação ocorrendo principalmente em Rep
(LIMA et al., 2012; RAMOS-SOBRINHO et al., 2014), o que não foi observado para as
populações de EuYMV.

37

Estudos têm demonstrado que sítios recombinantes não são aleatoriamente
distribuídos ao longo do genoma dos begomovírus, com breakpoints de recombinação
sendo mais frequentemente detectados no gene Rep e Região Comum (hotspots), e
menos frequentemente localizados nas demais regiões genômicas [CP, Trap e Ren
(coldspots)] (STANLEY, 1995; FAUQUET et al., 2005; GARCIA-ANDRES et al.,
2007; LEFEUVRE et al., 2007; SILVA et al., 2012; ROCHA et al., 2013; LIMA et al.,
2013; RAMOS-SOBRINHO et al., 2014). Para os isolados de EuYMV, recombinação
parece não influenciar grandemente na variabilidade genética observada. Resultados
semelhantes foram observados para populações do BGMV infectando diferentes
hospedeiras leguminosas no Brasil, enquanto que para populações do MaYSV,
recombinação parece ser o mecanismo evolutivo diretamente ligado com os altos
índices de diversidade genética observado nestes isolados (RAMOS-SOBRINHO et al.,
2014).
Mudanças na sequência nucleotídica dos genes como as causadas por mutações
aleatórias podem provocar alterações na conformação da proteína de modo que podem
também alterar sua função (BURNS & BOTTINO, 1991; SUZUKI et al., 1991;
NUSSBAUM et al., 2002). Hoëhnle et al. (2001) demostraram que a troca de apenas
três aminoácidos da sequência da proteína CP de Abutilon mosaic virus (AbMV) tornou
impossível a transmissão do isolado mutante pelo inseto vetor. Ramos-Sobrinho e
colaboradores (2014) trabalhando com BGMV e MaYSV demostraram ser a seleção
purificadora a principal pressão seletiva sobre as ORFs CP e Rep das populações desses
vírus, estando de acordo com muitos outros trabalhos em populações de begomovírus
(GARCÍA-ANDRES et al, 2007; LIMA et al, 2013; ROCHA et al, 2013; SANZ et al.,
1999; SILVA et al., 2012, 2011). Resultados semelhantes foram obtidos neste trabalho
que observou a seleção purificadora como principal força seletiva atuando sobre os
sítios nos genes Rep e CP de EuYMV.

38

6 CONCLUSÕES


O begomovírus Euphorbia yellow mosaic virus (EuYMV) apresenta ampla gama
de hospedeiros, porém é mais comumente encontrado associado à plantas de
Euphorbia heterophylla;



Subpopulações de EuYMV apresentam-se estruturadas de acordo com a origem
geográfica;



A variabilidade genética presente nas subpopulações de EuYMV deve ser
resultado principalmente de mutações;



A principal força seletiva atuando sobre as regiões genômicas CP e Rep de
EuYMV é a seleção negativa ou purificadora;

39
Tabela 1. Isolados de begomovírus obtidos a partir de amostras do estado da Paraíba coletadas para esse trabalho.

Código

Coordenadas Geográficas

Especie/Acrônino

Isolado

Hospedeiro

Local

Data

3PB-1H

-7º29’8’’ S

-36º9’45’’ W

Euphorbia Yellow Mosaic Virus /EuYMV

BR:Boq3:14

Euphorbia heterophylla

Boqueirão – PB

Maio, 2014

5PB-1H

-7º29’8’’ S

-36º9’45’’ W

Euphorbia Yellow Mosaic Virus /EuYMV

BR:Boq4:14

Euphorbia heterophylla

Boqueirão – PB

Maio, 2014

7PB-1H

-7º29’8’’ S

-36º9’45’’ W

Euphorbia Yellow Mosaic Virus /EuYMV

BR:Boq6:14

Euphorbia heterophylla

Boqueirão – PB

Maio, 2014

8PB-II

-7º29’8’’ S

-36º9’45’’ W

Euphorbia Yellow Mosaic Virus /EuYMV

BR:Boq7:14

Euphorbia heterophylla

Boqueirão – PB

Maio, 2014

9PB-1H

-7º29’8’’ S

-36º9’45’’ W

Euphorbia Yellow Mosaic Virus /EuYMV

BR:Boq8:14

Euphorbia heterophylla

Boqueirão – PB

Maio, 2014

10PB-1H

-7º29’8’’ S

-36º9’45’’ W

Euphorbia Yellow Mosaic Virus /EuYMV

BR:Boq9:14

Euphorbia heterophylla

Boqueirão – PB

Maio, 2014

14PB-1H

-7º29’8’’ S

-36º9’45’’ W

Euphorbia Yellow Mosaic Virus /EuYMV

BR:Boq12:14

Euphorbia heterophylla

Boqueirão – PB

Maio, 2014

18PB-II

-7º29’8’’ S

-36º9’45’’ W

Euphorbia Yellow Mosaic Virus /EuYMV

BR:Boq15:14

Euphorbia heterophylla

Boqueirão – PB

Maio, 2014

20PB-II

-7º29’8’’ S

-36º9’45’’ W

Euphorbia Yellow Mosaic Virus /EuYMV

BR:Boq16:14

Euphorbia heterophylla

Boqueirão – PB

Maio, 2014

23PB-1H

-7º29’8’’ S

-36º9’45’’ W

Euphorbia Yellow Mosaic Virus /EuYMV

BR:Boq18:14

Euphorbia heterophylla

Boqueirão – PB

Maio, 2014

Fonte: dados da pesquisa 2015

40
Tabela 2. Isolados de begomovírus provenientes do estado de Goiás.

Código

Coordenadas Geográficas

Especie/Acrônino

Isolado

Hospedeiro

Local

Data

GO-32

-16°30’22.5”S

-49°17’06.8”W

Euphorbia Yellow Mosaic Virus /EuYMV

BR:Sag7:12

Euphorbia heterophylla

Sto. Antônio de Goiás – GO

Dez, 2012

GO-33

-16°30’22.5”S

-49°17’06.8”W

Euphorbia Yellow Mosaic Virus /EuYMV

BR:Sag8:12

Euphorbia heterophylla

Sto. Antônio de Goiás – GO

Dez, 2012

GO-34

-16°30’22.5”S

-49°17’06.8”W

Euphorbia Yellow Mosaic Virus /EuYMV

BR:Sag9:12

Euphorbia heterophylla

Sto. Antônio de Goiás – GO

Dez, 2012

GO-35

-16°30’22.5”S

-49°17’06.8”W

Euphorbia Yellow Mosaic Virus /EuYMV

BR:Sag10:12

Euphorbia heterophylla

Sto. Antônio de Goiás – GO

Dez, 2012

GO-41

-16°30’22.5”S

-49°17’06.8”W

Euphorbia Yellow Mosaic Virus /EuYMV

BR:Sag11:12

Euphorbia heterophylla

Sto. Antônio de Goiás – GO

Dez, 2012

GO-42

-16°30’22.5”S

-49°17’06.8”W

Euphorbia Yellow Mosaic Virus /EuYMV

BR:Sag12:12

Euphorbia heterophylla

Sto. Antônio de Goiás – GO

Dez, 2012

GO-43

-16°30’22.5”S

-49°17’06.8”W

Euphorbia Yellow Mosaic Virus /EuYMV

BR:Sag13:12

Euphorbia heterophylla

Sto. Antônio de Goiás – GO

Dez, 2012

GO-44

-16°30’22.5”S

-49°17’06.8”W

Euphorbia Yellow Mosaic Virus /EuYMV

BR:Sag14:12

Euphorbia heterophylla

Sto. Antônio de Goiás – GO

Dez, 2012

GO-50

-16°30’22.5”S

-49°17’06.8”W

Euphorbia Yellow Mosaic Virus /EuYMV

BR:Sag15:12

Euphorbia heterophylla

Sto. Antônio de Goiás – GO

Dez, 2012

GO-51

-16°30’22.5”S

-49°17’06.8”W

Euphorbia Yellow Mosaic Virus /EuYMV

BR:Sag16:12

Euphorbia heterophylla

Sto. Antônio de Goiás – GO

Dez, 2012

GO-52

-16°30’22.5”S

-49°17’06.8”W

Euphorbia Yellow Mosaic Virus /EuYMV

BR:Sag17:12

Euphorbia heterophylla

Sto. Antônio de Goiás – GO

Dez, 2012

GO-53

-16°30’22.5”S

-49°17’06.8”W

Euphorbia Yellow Mosaic Virus /EuYMV

BR:Sag18:12

Euphorbia heterophylla

Sto. Antônio de Goiás – GO

Dez, 2012

GO-54

-16°30’22.5”S

-49°17’06.8”W

Euphorbia Yellow Mosaic Virus /EuYMV

BR:Sag19:12

Euphorbia heterophylla

Sto. Antônio de Goiás – GO

Dez, 2012

GO-56

-16°30’22.5”S

-49°17’06.8”W

Euphorbia Yellow Mosaic Virus /EuYMV

BR:Sag20:12

Euphorbia heterophylla

Sto. Antônio de Goiás – GO

Dez, 2012

GO-57

-16°30’22.5”S

-49°17’06.8”W

Euphorbia Yellow Mosaic Virus /EuYMV

BR:Sag21:12

Euphorbia heterophylla

Sto. Antônio de Goiás – GO

Dez, 2012

41

Tabela 2. Isolados de begomovírus provenientes do estado de Goiás. (conclusão)
Código

Coordenadas Geográficas

Especie/Acrônino

Isolado

Hospedeiro

Local

Data

GO-58

-16°30’22.5”S

-49°17’06.8”W

Euphorbia Yellow Mosaic Virus /EuYMV

BR:Sag22:12

Euphorbia heterophylla

Sto. Antônio de Goiás – GO

Dez, 2012

GO-59

-16°30’22.5”S

-49°17’06.8”W

Euphorbia Yellow Mosaic Virus /EuYMV

BR:Sag23:12

Euphorbia heterophylla

Sto. Antônio de Goiás – GO

Dez, 2012

GO-59

-16°30’22.5”S

-49°17’06.8”W

Euphorbia Yellow Mosaic Virus /EuYMV

BR:Sag23.1:12

Euphorbia heterophylla

Sto. Antônio de Goiás – GO

Dez, 2012

GO-61

-16°30’22.5”S

-49°17’06.8”W

Euphorbia Yellow Mosaic Virus /EuYMV

BR:Sag24:12

Euphorbia heterophylla

Sto. Antônio de Goiás – GO

Dez, 2012

Fonte: dados da pesquisa 2015

Tabela 3. Sequências de begomovírus obtidas a partir do banco de dados não-redundante de nucleotídeos Genbank.

Nº de acesso no
Genbank

Hospedeiro

Local

Data

Euphorbia yellow mosaic virus EuYMV / BR:GO:LEA:08

FJ619507

Euphorbia heterophylla

Santo Antônio de Goias – GO

2008

Euphorbia yellow mosaic virus EuYMV / Brazil:GO:Luziania 8675:2009

JF756676

Euphorbia heterophylla

Luziania – GO

2009

Euphorbia yellow mosaic virus EuYMV / Brazil:GO:São Miguel do Passa Quatro
AB404:2002

JF756675

Euphorbia heterophylla

São Miguel do Passa Quatro – GO

2002

Euphorbia yellow mosaic virus EuYMV / Brazil:GO:Morrinhos 9027:2009

JF756674

Euphorbia heterophylla

Morrinhos – GO

2009

Euphorbia yellow mosaic virus EuYMV / Brazil:DF:Taquara 8880:2009

JF756673

Euphorbia heterophylla

Taquara – DF

2009

Espécie/Acrônimo/Isolado

42

Tabela 3. - Sequências de begomovírus obtidas a partir do banco de dados não-redundante de nucleotídeos Genbank. (conclusão)
Nº de acesso no
Genbank

Hospedeiro

Local

Data

Euphorbia yellow mosaic virus EuYMV / Brazil:GO:Itaberai:5082A:2007

JF756671

Euphorbia heterophylla

Itaberai – GO

2007

Euphorbia yellow mosaic virus EuYMV / Brazil:DF:Taquara:ABA3:2002

JF756670

Euphorbia heterophylla

Taquara – DF

2002

Euphorbia yellow mosaic virus EuYMV / Brazil:DF:Planaltina:AB5818:2007

JF756669

Euphorbia heterophylla

Planaltina – DF

2007

Euphorbia yellow mosaic virus EuYMV / Brazil:Mato Grosso do sul:2:2007

FN435997

Euphorbia sp.

Mato Grosso do Sul

2007

Euphorbia yellow mosaic virus EuYMV / Brazil:Mato Grosso do sul:1:2007

FN435995

Euphorbia sp.

Mato Grosso do Sul

2007

Euphorbia yellow mosaic virus EuYMV / BR:3539AB1:09

JX415200

Euphorbia heterophylla

Acreuna – GO

2009

Euphorbia yellow mosaic virus EuYMV / BR:768Tom8a:08

JX415192

Solanum lycopersicum

Luziania – GO

2008

Euphorbia yellow mosaic virus EuYMV / BR:768Cro3b:08

JX415191

Crotalaria juncea

Luziania – GO

2008

Euphorbia yellow mosaic virus EuYMV / BR:GO:Luz768c:03

JX415186

Crotalaria sp.

Luziania – GO

2003

Euphorbia yellow mosaic virus EuYMV / BR:GO:Luz768b:03

JX415185

Crotalaria sp.

Luziania – GO

2003

Euphorbia yellow mosaic virus EuYMV / BR:GO:Luz768a:03

JX415184

Crotalaria sp.

Luziania – GO

2003

Euphorbia yellow mosaic virus EuYMV / BR:Flo166:08

KC706530

Euphorbia sp.

Florestal –MG

2008

Euphorbia yellow mosaic virus EuYMV / BR:Vic9:10

JX871379

Sida santaremensis

Viçosa – MG

2010

Euphorbia yellow mosaic virus EuYMV / BR:Car2:09

JN419000

Macroptilium
atropurpureum

Caruaru –PE

2009

Espécie/Acrônimo/Isolado

Fonte: dados da pesquisa 2015

43

Tabela 4. Diversidade genética em populações do Euphorbia yellow mosaic virus infectando hospedeiras não-cultivadas no Brasil.
Nº de sequências

DNA-A π

CP π

Rep π

EuYMV (Total)

49

0,0189 (± 0,0009)

0,0198 (± 0,0014)

0,0173 (± 0,0008)

EuYMV (Nordeste)

12

0,0059 (± 0,0024)

0,0074 (± 0,0023)

0,0045 (± 0,0021)

EuYMV(Centro-oeste)

36

0,0137 (± 0,0012)

0,0123 (± 0,0013)

0,0143 (± 0,0012)

População

Fonte: dados da pesquisa 2015

44

Tabela 5 – Eventos de recombinação detectados entre os isolados de Euphorbia yellow mosaic virus.

Breakpoint na
sequência
recombinante

Métodos de detecçãoa

Parentais

Número de eventos
de recombinação

Começo

Fim

Sequência
recombinante

Menor parental

1

2591

1241

EuYMV_FJ619507

EuYMV_JX415200

Maior
Parental

R

G

B

M

C

Desconhecido NS

NS

NS

3,95x1011

1,19x1012

NS = Não significante
(a) = R, RDP; G, GENECONV; B, Bootscan; M, Maxchi; C, Chimaera; S, SiSscan; P, PhylPro; L, LARD; 3s, 3Seq.
Fonte: dados da pesquisa 2015

S

P

L

3s

2,097x108 NS NS NS

45
Tabela 6 – Sítios sob pressão de seleção positiva e negativa nas ORF’s CP e Rep dos isolados de Euphorbia
yellow mosaic virus.

Conjunto de dados

Sítio sob seleção Positiva

EuYMV – CP

-

EuYMV – Rep

39

Fonte: dados da pesquisa 2015

Sítios sob seleção Negativa
12, 15, 66, 70, 81, 99, 126,
130, 159, 176, 194, 208, 223
4, 103, 119, 162, 173, 181,
216, 238, 248, 255, 256, 271,
297, 311, 319, 323

46

Figura 2. Matriz bidimensional representando a porcentagem de identidade de comparações pareadas de
sequências nucleotídicas do DNA-A dos isolados da Paraíba e Goiás com isolados de begomovírus
disponíveis no GenBank.

47

Figura 3. Análise filogenética de máxima verossimilhança baseada no DNA-A, mostrando a formação de
dois grupos distintos de acordo com a origem geográfica. Grupo 1 = isolados obtidos no Centro-Oeste, grupo
2 = isolados obtidos no Nordeste.

48

Figura 4. Análise filogenética de máxima verossimilhança baseada na ORF CP, mostrando a formação de
dois grupos distintos de acordo com a origem geográfica. Grupo 1 = isolados obtidos no Centro-Oeste, grupo
2 = isolados obtidos no Nordeste.

49

Figura 5. Análise filogenética de máxima verossimilhança baseada na ORF Rep, mostrando a formação de
dois grupos distintos de acordo com a origem geográfica. Grupo 1 = isolados obtidos no Centro-Oeste, grupo
2 = isolados obtidos no Nordeste.

50
Figura 6 – Análise reticulada baseada no DNA-A. Isolados obtidos no estado da Paraíba (linha vermelha).

51
Figura 7 – Análise reticulada baseada na ORF CP. Isolados obtidos no estado da Paraíba (linha vermelha).

52
Figura 8 – Análise reticulada baseada na ORF Rep. Isolados obtidos no estado da Paraíba (linha vermelha).

53

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