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                    UNIVERSIDADE FEDERAL DE ALAGOAS
CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PROTEÇÃO DE
PLANTAS

JANAÍNE ROSSANE ARAÚJO SILVA

CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR E MORFOCULTURAL DE
Colletotrichum spp. ASSOCIADAS À ANTRACNOSE EM Capsicum spp.
NO NORDESTE DO BRASIL

Rio Largo - AL
2015

JANAÍNE ROSSANE ARAÚJO SILVA

CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR E MORFOCULTURAL DE
Colletotrichum spp. ASSOCIADAS À ANTRACNOSE EM Capsicum spp.
NO NORDESTE DO BRASIL

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa
de Pós-Graduação em Proteção de Plantas do
Centro de Ciências Agrárias da Universidade
Federal de Alagoas como requisito parcial para
obtenção do grau de Mestre em Proteção de Plantas.
Orientadora: Prof. Dra. Iraildes Pereira Assunção
Coorientador: Dr. Leonardo da Fonseca Barbosa

Rio Largo - AL
2015

Catalogação na fonte
Universidade Federal de Alagoas
Biblioteca Central
S586c Silva, Janaíne Rossane Araújo.
Caracterização molecular e morfocultural de Colletotrichum spp. associados
à antracnose em Capsicum spp. no nordeste do Brasil./ Janaíne Rossane Araújo
Silva. – Maceió, 2015.
60f. : il. tabs., grafs.
Orientadora: Iraildes Pereira Assunção.
Dissertação (mestrado em Proteção de Plantas) – Universidade
Federal de Alagoas. Centro de Ciências Agrárias. Rio Largo, 2015.
Bibliografia: f.45-60.
1. Patogenicidade. 2. Antracnose. 3. Pimentão. 4. Pimenta. 5. Antracnose.
6. Multilocus. I. Título.
CDU: 632.4

JANAÍNE ROSSANE ARAÚJO SILVA

CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR E MORFOCULTURAL DE
Colletotrichum spp. ASSOCIADAS À ANTRACNOSE EM Capsicum spp.
NO NORDESTE DO BRASIL

Dissertação submetida ao corpo docente do
Programa de Pós-Graduação em Proteção de
Plantas, do Centro de Ciências Agrárias da
Universidade Federal de Alagoas e aprovada em
31 de Julho de 2015.

Rio Largo - AL
2015

AGRADECIMENTOS

A minha maior gratidão ao meu eterno Deus. Minha fortaleza e consolo nos momentos
de dificuldade.
Agradeço aos meus pais, Maria da Silva e José Araújo da Silva, pelo amor, apoio,
incentivo, investimento, dedicação e esforços despendidos a mim para realização deste sonho.
Aos meus irmãos Jamila Ranyelle Araújo Silva Frutuoso, Janiele Rayssa Araújo Silva Melo e
Jamis Henri Araújo Silva e a minha sobrinha Maria Luiza Araújo Frutuoso pela amizade,
cuidado e amor.
Ao meu namorado, Marlisson Araújo Cabral, pela companhia e apoio em todos os
momentos.
A Prof. Dra. Iraildes Pereira Assunção pela confiança e orientação. Ao Prof. Dr. Gaus
Silvestre de Andrade Lima pela confiança e apoio. Aos Profs. Dra. Fátima Muniz, Dr.
Gildemberg Leal e Dra Edna P. R. Amorim pelos valiosos ensinamentos e apoio para realização
deste trabalho.
Ao Dr. Leonardo da Fonseca Barbosa pela co-orientação e apoio. Ao Dr. Roberto
Ramos Sobrinho pelas sugestões e ensinamentos. E a Dra. Jaqueline Figueredo pela amizade e
apoio dado ao trabalho
À CAPES pela concessão da bolsa de estudo.
Ao corpo docente do Programa de Pós-graduação em Proteção de Plantas do Centro
de Ciências Agrárias pelos ensinamentos que contribuíram para minha formação.
Aos funcionários da Secretaria da pós-graduação, Geraldo de Lima, Marcos Antônio
Lopes e Michele Cristina Mela pela convivência;
Aos colegas do Laboratório de Fitopatologia Molecular que tive a oportunidade de
conhecer e conviver. Em especial a Tamires Paixão e Ana Raphaela Gomes da Silva pelo
constante apoio e grande contribuição nos trabalhos práticos. E a Lauraestela Hermogenes pela
amizade e incentivo.
Aos colegas e amigos da pós-graduação pela convivência durante a realização do
curso. Em especial Mayra Ferro, Aline Marques, Ronycleide da Silva Sousa, Lucas Jobim e
Maria Quitéria Cardoso.
E a todos que, direita ou indiretamente, contribuíram para a realização desse trabalho.

RESUMO
A antracnose é uma importante doença para hortaliças solanáceas, como pimentão e pimenta.
A doença é causada por fungos do gênero Colletotrichum que provocam grandes prejuízos na
produção mundial, tanto em campo como em pós-colheita, podendo levar a perdas de até 100%.
O objetivo do presente estudo foi a identificação das espécies do gênero Colletotrichum através
da caracterização molecular e morfocultual em Capsicum spp. Isolados foram obtidos de
pimentões e pimentas com sintomas de antracnose, coletados em municípios dos estados de
Alagoas, Sergipe e Pernambuco. Os trinta e oito isolados foram, inicialmente, analisados com
base nas sequências do gene gliceraldeído-3 fosfato desidrogenase (GAPDH), para conhecer a
diversidade de espécies presentes nestas culturas. As identificação dos isolados foi confirmada
com análise concatenada dos genes GAPDH, β-tubulina (TUB2) e da região ITS-rDNA. Para
caracterização cultural, das espécies identificadas, foi realizada a avaliação da taxa de
crescimento micelial dos isolados, e observada a coloração das colônias, cultivadas em BDA
sintético, após sete dias. Para caracterização morfológica, o comprimento e a largura de 50
conídios e apressórios foram mensurados. As espécies identificadas foram submetidas a teste
de patogenicidade cruzada em pimentão, pimenta, tomate e jiló, mantidos a 25ºC, no escuro.
Espécies em pelo menos quatro complexos distintos do gênero Colletotrichum estão associadas
à antracnose em frutos de Capsicum spp. no Nordeste do Brasil, sendo a espécie C. scovillei do
complexo C. acutatum, a mais frequentemente encontrada causando antracnose em Capsicum
spp. Pimenta, pimentão, tomate e jiló fazem parte da gama de hospedeiros das espécies C.
scovillei, C. tropicale, C. siamense e C. truncatum.

Palavras-chave: Pimentão. Pimenta. Antracnose. Multilocus. Patogenicidade.

ABSTRACT
Anthracnose is an important disease for solanaceous vegetables such as sweet peppers and chili
peppers. The disease is caused by fungi of Colletotrichum genus that cause great losses in world
production, both in the field and post-harvest, leading to losses of up to 100%. The aim of this
study was to identify the species of the genus Colletotrichum through molecular
characterization and morfocultual in Capsicum spp. Isolates were obtained from sweet peppers
and chili peppers with symptoms of anthracnose, collected in municipalities in the states of
Alagoas, Sergipe and Pernambuco. The thirty-eight isolates were initially analyzed based on
the sequences of glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase gene (GAPDH), to know the
diversity of species present in these cultures. The identification of the isolates was confirmed
with concatenated analysis of GAPDH genes, β-tubulin (TUB2) and ITS-rDNA region. For
cultural characterization of the identified species, it was carried out the assessment of mycelial
growth rate of isolated and observed the color of the colonies grown in synthetic BDA, after
seven days. For morphological characterization, the length and width of 50 conidia and
apressoria were measured. The identified species were subjected to cross-pathogenicity test in
chili pepper, sweet pepper, tomatoes and eggplant, kept at 25 ° C in the dark. Species in at least
four distinct genus Colletotrichum complexes are associated with anthracnose on fruits of
Capsicum spp. in northeastern Brazil, and the specie C. scovillei from complex C. acutatum
was most often found causing anthracnose in Capsicum spp. Chili pepper, sweet pepper,
tomatoes and eggplant are part of the host range of C. scovillei, C. tropicale, C. siamense and
C. truncatum.
Key words: Sweet pepper. Chili pepper. Anthracnose. Multilocus. Pathogenicity.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 – Teste de patogenicidade: pimentão inoculado com o isolado P1, sem ferimento (1)
e com ferimento (2) (A); e pimentas Dedo de moça, sem ferimento (1) e com
ferimento (2), inoculados com o isolado Pi18 (B)...................................................30
Figura 2 – Árvore filogenética de Inferência Bayseana com os isolados de Colletotrichum
pertencentes a quatro complexos, usando o gene GAPDH. ...................................31
Figura 3 – Porcentagem de ocorrência das espécies de Colletotrichum identificadas neste
trabalho...................................................................................................................32
Figura 4 – Árvore filogenética de Inferência Bayseana com um isolado de Colletotrichum do
complexo C. gloeosporioides, usando a sequência da combinação parcial de dados
dos genes GAPDH, TUB-2 e ITS. Colletotrichum boninense foi usado como
outgroup.................................................................................................................35
Figura 5 – Árvore filogenética de Inferência Bayseana com três isolados de Colletotrichum do
complexo C. acuntatum, usando a sequência da combinação parcial de dados dos
genes GAPDH, TUB-2 e ITS. Colletotrichum boninense foi usado como
outgroup.................................................................................................................36
Figura 6 – Aspecto dos cinco morfogrupos de isolados de Colletotrichum cultivados em meio
BDA sintético, observados ao 7° dia. C. scovillei: I (A) e (B). C. siamense: II (A) e
(B). C. truncatum: III (A) e (B). C. tropicale: IV (A) e (B). C. brevisporum: V (A)
e (B). Parte superior (A) e reverso (B) da placa de Petri..........................................37
Figura 7 – Características morfológicas da espécie C. scovillei: Conídios retos, cilíndricos com
extremidades arredondas ou com final mais ou menos agudos (A). Apressórios
castanho médio a escuro, subglobosos, ovoides a elipsoidais (B). As imagens (A) e
(B) foram obtidas a 40x. Escala de 20μm................................................................39
Figura 8 – Características morfológicas da espécie C. tropicale: Conídios curtos e largos com
extremidades arredondados, com uma leve contração perto do centro (A).
Apressórios subglobosos, ovoides e clavados (B). As imagens (A) e (B) foram
obtidas a 40x. Escala de 20μm................................................................................39
Figura 9 – Características morfológicas da espécie C. siamense: Conídios cilíndricos com
extremidades arredondados, com uma leve contração perto do centro (A).
Apressórios clavados, algumas vezes ovoides (B). As imagens (A) e (B) foram
obtidas a 40x. Escala de 20μm................................................................................40

Figura 10 – Características morfológicas da espécie C. truncatum: Conídios compridos com a
parte central ligeiramente curvada, afinando em direção ao ápice mais fortemente
curvos (A). Apressórios clavados, às vezes irregulares (B). As imagens (A) e (B)
foram obtidas a 40x. Escala de 20μm......................................................................40
Figura 11 – Características morfológicas da espécie C. brevisporum: Conídios cilíndricos, com
extremidades arredondadas (A). Apressórios irregulares e às vezes ovais (B). As
imagens (A) e (B) foram obtidas a 40x. Escala de 20μm.........................................41
Figura 12 – Patogenicidade de espécies de Colletotrichum associadas a antracnose no Nordeste
do Brasil em pimentão, tomate, pimenta e jiló........................................................42

LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Descrição dos isolados usados para identificação e caracterização de espécies de
Colletotrichum spp. associados à antracnose em Capsicum spp.............................22
Tabela 2 – Descrição dos primers usados para identificação de espécies pertencentes ao genêro
Colletotrichum.......................................................................................................24
Tabela 3 – Isolados incluídos nas análises de sequências multi-gene, com detalhes de espécies,
número de acesso das culturas e números de acessos do GenBank.................26 e 27
Tabela 4 – Modelo de substituição selecionado para os genes através do programa MrModeltest
2.3...........................................................................................................................34
Tabela 5 – Médias de comprimento e largura de conídios e apressórios, e taxa de crescimento
micelial de espécies de Colletotrichum...................................................................38

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO....................................................................................................................11
2 REVISÃO DE LITERATURA........................................................................................... 13
2.1 Gênero Capsicum................................................................................................................ 13
2.2 Importância Econômica do Gênero Capsicum................................................................... 14
2.3 Antracnose.......................................................................................................................... 15
2.4 Caracterização do Gênero Colletotrichum Corda (1831)................................................... 17
3 MATERIAL E MÉTODOS................................................................................................ 21
3.1 Obtenção dos Isolados........................................................................................................ 21
3.2 Cultura Monospórica..........................................................................................................21
3.3 Preservação dos Isolados.................................................................................................... 23
3.4 Teste de Patogenicidade...................................................................................................... 23
3.5 Caracterização Molecular................................................................................................... 23
3.5.1 Extração de DNA............................................................................................................. 23
3.5.2 Amplificação e sequenciamento do DNA....................................................................... 24
3.5.3 Análises filogenéticas...................................................................................................... 25
3.6 Estudos Morfológicos das Espécies de Colletotrichum...................................................... 28
3.7 Virulência de Espécies de Colletotrichum em Diferentes Hospedeiros............................. 29
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO.........................................................................................30
4.1 Teste de Patogenicidade...................................................................................................... 30
4.2 Caracterização Molecular...................................................................................................31
4.3 Estudos Morfológicos das Espécies de Colletotrichum......................................................36
4.4 Patogenicidade de Espécies de Colletotrichum em Diferentes Hospedeiros...................... 41
5 CONCLUSÃO...................................................................................................................... 44
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.................................................................................. 45

11
1 INTRODUÇÃO

O gênero Capsicum spp. compreende as pimentas (Capsicum spp.) e pimentões
(Capsicum annuum L.). Estas hortaliças apresentam diversos tamanhos, cores, sabores e
picância, fazem parte da riqueza cultural do Brasil e são consideradas patrimônios valiosos da
nossa biodiversidade. O cultivo ocorre em quase todas as regiões do país devido ao consumo
in natura de pimentões e pimentas, assim como do processamento na forma de molhos,
condimentos, conservas e geleias (FILGUEIRA, 2003; AZEVEDO et al., 2006; COSTA et al.,
2007).
No Brasil, a área anual cultivada é de cerca de 18 mil ha e os principais estados
produtores são Minas Gerais, Goiás, São Paulo, Ceará, Rio Grande do Sul, Rio de Janeiro e
Bahia (MAROUELLI e SILVA, 2012; GENUNCIO; ZONTA; NASCIMENTO, 2015). A
crescente demanda do mercado, tem impulsionado o aumento da área cultivada e o
estabelecimento de agroindústrias, tornando o agronegócio de pimentas e pimentões um dos
mais importantes do país. Além do mercado interno, parte da produção brasileira de pimentas
é exportada em diferentes formas, como páprica, pasta, desidratada e conservas ornamentais
(COSTA et al., 2007). O estado de Alagoas, vem crescendo em importância, devido a produção
na área denominada de cinturão verde, na região do município de Arapiraca, e da produção em
pequenas propriedades espalhadas por todo o estado.
No entanto, problemas fitossanitários, tanto em cultivo protegido como em campo
aberto, comprometem o rendimento da produção (AZEVEDO et al., 2006). A antracnose é
considerada uma importante doença para estas culturas, pois resulta em significativas perdas
tanto em campo como em pós-colheita, principalmente em regiões tropicais e subtropicais
(TOZZE JÚNIOR; MELLO; MASSOLA JÚNIOR, 2006; REIS; BOITEUX; HENZ, 2009;
JUNQUEIRA; JUNQUEIRA, 2014). Em locais com alta concentração de inoculo e em épocas
chuvosas, a doença pode afetar 100% da produção (KURUZAWA; PAVAN, 2005;
COLATTO, 2010).
No gênero Colletotrichum estão compreendidos os patógenos que causam a
antracnose. Estes fitopatógenos apresentam ampla gama de hospedeiros de importância
econômica como cereais, gramíneas, hortaliças, legumes e frutas (IVEY; NAVA-DIAZ;
MILLER, 2004; ROBERTS; PERNEZNY; KUCHAREK, 2012). Muitos trabalhos têm sido
desenvolvidos para identificação de espécies deste gênero em diferentes culturas (ROCA et al.,
2004; LINS; ALVES; ABREU, 2007; SILVA et al., 2012; CARNEIRO et al., 2012; KUPPER;

12
GIMENES-FERNANDES; GOES, 2003; SOUZA; SOUZA; MENDES-COSTA, 2007; CIA,
2005; COSTA et al., 2010; VIDA et al., 2006; BONETT et al., 2010). Estes estudos contribuem
para: a identificação de espécies, correlação de espécies hospedeiras e no desenvolvimento de
estratégias de manejo mais eficientes (GUIMARÃES, 2011).
A diversidade de espécies e a falta de informações sobre as relações com determinados
hospedeiros tornam sua taxonomia e nomenclatura bastante confusa (GUIMARÃES, 2011;
GUERBER et al, 2003), uma vez que, a antiga forma de classificação dos fungos era baseada
apenas nos caracteres morfológicos e fisiológicos (COLATTO, 2010), causando discordância
entre pesquisadores, dificultando assim sua identificação (CAI et al., 2009; ANDRADE et al.,
2007).
Para reduzir estas discordâncias, nos estudos de identificação e taxonomia do gênero
Colletotrichum, além das características morfológicas, culturais e fisiológicas, tem sido levado
em consideração características moleculares (SCHENA et al., 2014; DAMM et al., 2013; LIMA
et al., 2013; WEIR; JOHNSTON; DAMM, 2012; BONETT et al. 2010; TOZZE JÚNIOR;
MELLO; MASSOLA JÚNIOR, 2006; ANDRADE et al., 2007). Vários marcadores
filogenéticos são utilizados na identificação e solução de divergências de espécies do gênero
Colletotrichum. Os genes mais utilizados são actina (ACT), quitina sintetase (CHS-1), βtubulina (TUB2), calmodulina (CAL), gliceraldeido-3-fosfato desidrogenase (GAPDH),
histona (HIS3), glutamina sintetase (GS) e a região Internal transcribed spacer (ITS)
(CANNON et al., 2012; WEIR, JOHNSTON, DAMM, 2012; PENG et al., 2012; SHARMA et
al., 2013). A análise destes genes associados a caracterização morfológicas, culturais e
fisiológicas, tem permitido maior segurança na identificação de espécies de Colletotrichum.
O objetivo deste trabalho foi identificar espécies do gênero Colletotrichum associadas
à antracnose em Capsicum spp. coletados em três diferentes estados do nordeste do Brasil,
através da caracterização molecular e morfocultural.

13
2 REVISÃO DE LITERATURA

2.1 Gênero Capsicum

A família Solanaceae está presente em quase todos os lugares do mundo e inclui cerca
de 150 gêneros e 3000 espécies que se concentram na Região Neotropical. No Brasil está
representada por 30 gêneros e cerca de 450 espécies (SOUZA; LORENZI, 2012).
Diversas plantas cultivadas, ricas em vitaminas e sais minerais, utilizadas na
alimentação humana, pertencem à família Solanaceae. Dentre estas plantas, podemos citar o
tomate (Solanum lycopersicum L.), a batata (S. tuberosum L.), as pimentas e o pimentão, a
berinjela (S. melongena L.) e o Jiló (S. gilo Raddi) (SOUZA; LORENZI, 2012; FILGUEIRA,
2008).
O gênero Capsicum é originário da América Central e América do Sul. Segundo sua
classificação taxonômica, pertence ao reino Plantae, divisão Magnoliophyta, Classe
Magnoliopsida, ordem Solanes e família Solanaceae (KRISHMA DE, 2003).
Embora, ainda exista uma controvérsia de quantas espécies estão incluídas dentro do
gênero, de modo geral, acredita-se que 20 espécies e mais de 100 variedades estão distribuídas
em todo mundo, sendo esta diversidade justificada pela facilidade de ocorrer polinização
cruzada entre as espécies. Com o cultivo dos tipos selvagens, surgiram cinco espécies
domesticadas consideradas as mais importantes espécies dentro do gênero, são elas: Capsicum
annuum, C. baccatum, C. chinense, C. frutescens e C. pubescens. A maioria das variedades
comerciais pertencem às espécies C. annuum e C. frutescens (KRISHMA DE, 2003; DEWITT;
BOSLAND, 1996).
A espécie C. annuum inclui a maioria das variedades mais comuns, tais como,
jalapeño, pimentão, mulata, pimenta-de-mesa e piquin (ZANCANARO, 2008; KRISHMA DE,
2003; DEWITT; BOSLAND, 1996). E na espécie C. frutescens inclui as variedades malagueta,
pimenta-de-passarinho, tabasco, malaguetinha e malaguetão (ZANCANARO, 2008; COSTA
et al., 2007).
A espécie C. baccatum é representada pelas variedades cambuci, cumari verdadeira,
dedo-de-moça, peito-de-moça, pimenta fina, pitanga, cifre-de-veado, e sertãozinho
(ZANCANARO, 2008; COSTA et al., 2007). C. chinense compreende as variedades cabacinha,
chora-menino, cumari-do-Pará, murupi, pimenta-de-bode, pimenta-de-cheiro, pimenta-debiquinho e pimenta-de-cheiro-do-Norte (ZANCANARO, 2008; COSTA et al., 2007). Das

14
espécies domesticadas, apenas C. pubescens não é produzida no Brasil, sendo provavelmente a
menos conhecida (COSTA et al., 2007).
O centro de diversidade da espécie C. annuum var. annuum é o México e a América
Central; o de C. frutescens, inclui as terras baixas do sudeste brasileiro até a América Central e
as Antilhas, no Caribe; C. baccatum var. pendulum, tem como centro de diversidade a Bolívia
e o sudeste brasileiro e C. chinense, a mais brasileira das espécies domesticadas, a Bacia
Amazônia (COSTA et al., 2007).
As plantas de Capsicum são arbustivas e apresentam diferentes tamanhos e formas de
crescimento de acordo com a espécie e as condições de cultivo. O caule é resistente e o sistema
radicular pivotante, com amplas ramificações laterais. As folhas apresentam tamanho,
coloração, formato e pilosidade variáveis. As flores típicas são hermafroditas e bastante
utilizadas na taxonomia das espécies. O fruto define-se como uma baga, de estrutura oca e
forma lembrando uma cápsula, apresentando variadas formas, tamanhos, colorações e
pungências. Este ardido é característica comum das pimentas, com algumas exceções, devido a
presença do alcaloide capsicina na placenta do fruto. (FILGUEIRA, 2008; COSTA et al., 2007).

2.2 Importância Econômica do Gênero Capsicum

A partir do descobrimento das américas, as espécies de Capsicum se disseminaram
pelo mundo, e atualmente são cultivadas tanto em países de clima tropical como temperado
(COSTA et al., 2007). O cultivo comercial de pimentões e pimentas vem acendendo em
importância econômica, no Brasil e em outros países, devido ao aumento do consumo in natura
do pimentão e do processamento de molhos, temperos e conservas de pimentas. (AZEVEDO
et al., 2006).
Segundo dados da FAO, a produção de pimentas e pimentões no mundo, atingiu o total
de 31.131. 225, 56 toneladas em 2013. No ano de 2012, a Índia liderou o ranking dos países
produtores de pimentas e pimentões secos no mundo, com um total arrecadado de U$1.423.990
e uma produção de 1.299.940 MT, seguido pela China com um rendimento de U$317.674, Peru
com U$191.699 e Bangladesh com U$188.413 (FAO, 2015).
A produção de pimentas no Brasil está em torno de 22 mil toneladas por ano, variando
em produtividade de 10 a 45 t/ha, em função da espécie plantada. A estimativa para a área
cultivada é de 5 mil a 6 mil e 500 hectares, sendo os principais estados produtores Minas Gerais,
Goiás, São Paulo, Ceará e Rio Grande do Sul (GENUNCIO; ZONTA; NASCIMENTO, 2015).

15
A produção brasileira de pimentão, produz cerca de 290 mil toneladas de frutos em
uma área em torno de 13 mil hectares, sendo São Paulo, Minas Gerais, Bahia e Rio de Janeiro
os principais estados produtores (MAROUELLI e SILVA, 2012).
A utilização das pimentas tem sido devido sua versatilidade culinária, industrial,
ornamental e também por suas propriedades medicinais (RIBEIRO et al., 2008), sendo
indicadas no tratamento de doenças endócrinas, nutricionais e metabólicas, doenças infecciosas
e parasitárias, doenças da pele, do sistema osteomuscular e do sistema respiratório, entre outros
(GIRALD; HANAZAKI, 2010; ROMAN et al., 2011). A riqueza nutricional destas plantas,
como também a variedade de sabores e ardume, garantem sua aceitação na dieta humana, sendo
utilizada na culinária no preparo de molhos, conservas, saladas, cozidos, ensopados, diversas
carnes, entre outros (ZANCANARO, 2008). O valor nutricional dos frutos de Capsicum é
garantindo pela presença de metabolitos secundários como capsaicinoides, carotenoides,
flavonoides, vitaminas, antocianinas e atividade antioxidante que são componentes
fundamentais para uma boa saúde (CARVALHO et al., 2015; WAHYUNI, 2013).
Ainda podemos citar, o efeito de extratos de C. annuum (pimentão) na inibição do
crescimento de Salmonella typhimurium e Pseudomonas aeruginosa, nas concentrações 1,5
ml/100 g de carne e 0.3 ml/100 g de carne, respectivamente. E o efeito bactericida sobre P.
aeruginosa na concentração de 3 ml/100 g e sobre S. typhimurium de 1.5 ml/100 g (CAREAGA
et al. (2003). Extratos de C. annuum, também apresentaram efeito na inibição do crescimento
de diferentes espécies de bactérias, onde as espécies com maiores teores dos ácidos cinâmico e
m-cumárico demostraram maior capacidade inibitória (DORANTES et al., 2000).

2.3 Antracnose
A antracnose é conhecida há mais de 2000 anos, sendo considerada a doença mais
antiga na fitopatologia, com registro nos achados dos povos gregos e latinos (Enciclopédia
Agrícola Brasileira, 1995). Definida como:
Doença causada por fungos, principalmente por diferentes espécies do gênero
Colletotrichum [...]. Os sintomas são caracterizados por lesões circulares ou
alongadas, de coloração pardo-escura, deprimidas na região central,
geralmente apresentando massas rosadas que correspondem a estruturas do
tipo conídios produzidos em acérvulos. [...] (Enciclopédia Agrícola Brasileira,
1995, p.209).

É considerada uma importante doença para diversas plantas cultivadas, sendo de
ocorrência comum em solanáceas, como pimentão e pimenta (TOZZE JÚNIOR; MELLO;
MASSOLA JÚNIOR, 2006), podendo resultar em grandes prejuízos econômicos,

16
especialmente em regiões tropicais e subtropicais (REIS; BOITEUX; HENZ, 2009). Sob
condições climáticas favoráveis, períodos de chuva associados a incidência de clima quente e
úmido, os prejuízos podem levar a perdas de até 100% na produção de frutos (AZEVEDO et
al., 2006). Associado ao fator ambiental, o grau de suscetibilidade da planta intensifica a
severidade da doença (ROBERTS; PERNEZNY; KUCHAREK, 2012; COLATTO, 2010).
Os sintomas da doença em solanáceas podem ocorrer nas folhas e ramos, onde
aparecem com menos frequência e em forma de pequenas lesões necróticas circulares, e nos
frutos (REIS; BOITEUX; HENZ, 2009; AZEVEDO et al., 2006). São as lesões que ocorrem
nos frutos que caracterizam a doença e provocam maiores prejuízos para a produção, tanto em
campo como em pós-colheita (ROBERTS; PERNEZNY; KUCHAREK, 2012; AZEVEDO et
al., 2006), aumentando os custos de produção com a necessidade de controle no campo e na
pós-colheita (COLATTO, 2010).
A antracnose pode ocorrer tanto em frutos imaturos como maduros (ROBERTS;
PERNEZNY; KUCHAREK, 2012), mas manifesta-se, frequentemente, no estágio de
maturação avançada dos frutos e como métodos de controle torna-se necessário a aplicação de
fungicidas antes dessa fase e o cuidado na hora da colheita e manuseio para evitar ferimentos
(GALLI et al., 1980; TAVARES; SOUZA, 2005). Pois, conforme Cia (2005, p.16):
Durante o desenvolvimento dos frutos e após sua colheita, a resistência natural
a doenças geralmente declina resultando nos inevitáveis processos de infecção
e doença. Em frutos, as doenças pós-colheitas causadas por fungos usualmente
são provenientes de infecções quiescentes, estabelecidas no campo, ou de
infecções por ferimentos, originados durante subsequente colheita e
manuseio. O declínio da resistência natural pode ativar infecções quiescentes
e o aumento da incidência e/ou severidade da doença.

Dessa forma, se torna necessário desenvolver novas estratégias de controle para esta
doença que causa grandes perdas na produção de hortaliças, tanto em campo com em póscolheita.
A disseminação da doença ocorre por meio de irrigação e respingos de água, vento,
animais, ferramentas e utensílios agrícolas que carregam os esporos que podem estar presentes
no solo, em restos de cultura, em ramos secos, em plantas não cultivadas, em pecíolos e folhas
velhas até o hospedeiro (ROBERTS; PERNEZNY; KUCHAREK, 2012; AZEVEDO et al.,
2006; TAVARES; SOUZA, 2005; PUTZKE, J.; PUTZKE, M, 2002). As mudas, também,
podem atuar como inoculo primário contribuindo para a introdução da doença em novas áreas,
visto que é difícil a identificação de sintomas nesta fase (KOSOSKI et al., 2001). E ainda,
sementes contaminadas podem igualmente transmitir a doença (ROBERTS; PERNEZNY;
KUCHAREK, 2012).

17
2.4 Caracterização do Gênero Colletotrichum Corda (1831)

As várias espécies de fungo responsáveis por causar a doença antracnose pertencem
ao gênero Colletotrichum (IVEY; NAVA-DIAZ; MILLER, 2004; ROBERTS; PERNEZNY;
KUCHAREK, 2012) que possuem como teleomorfos as espécies de Glomerella (SUTTON,
1992), isso ocorre porque a maioria dos fungos apresentam duas formas de frutificação, como
consequência um mesmo fungo pode apresentar dois nomes científicos.
Segundo a classificação do Dictionary of the fungi (2008), o gênero Colletotrichum
pertence ao grupo dos fungos Anamórficos, classe Sordariomycetes, ordem Incertae sedis e
família Glomerellaceae. O gênero Colletotrichum possui micélio septado, conídios hialinos e
unicelulares, reprodução assexuada por meio dos conídios que são produzidos apicalmente em
conidióforos do tipo acérvulos (PUTZKE, J.; PUTZKE, M., 2002) e apressórios que são
estruturas de infecção que possibilitam a penetração do fungo no hospedeiro (MENEZES,
2006).
Os conídios são disseminadas por diversos agentes, e em presença de água forma os
apressórios que dão início ao processo de infecção, penetrando no tecido do hospedeiro
(TAVARES; SOUZA, 2005). Nesse processo, através de uma mucilagem hemicelulósica, o
apressório adere à superfície do hospedeiro (MENEZES, 2006) e após a penetração ocorre a
colonização, onde o fungo se distribui pelas células e os tecidos, retirando os nutrientes para
sua alimentação (AMORIM. REZENDE; BERGAMIN FILHO, 2011).
A colonização ocorre por meio de enzimas e toxinas excretadas pelo micélio que
degradam os componentes da parede celular, causando decomposição e promovendo o
desenvolvimento de sintomas e das estruturas de reprodução do patógeno (AMORIM.
REZENDE; BERGAMIN FILHO, 2011). As espécies de Colletotrichum produzem
[...] enzimas pectolíticas e toxinas que promovem a desorganização a nível
celular correspondente às lesões de aspecto encharcado que se desenvolvem
com rapidez e, além de deprimidas apresentam massa cotonosa constituída de
hifas e estruturas de frutificação (BEDENDO, 1995 apud ROZWALKA,
2003, p.12).

Conforme suas estratégias de nutrição, são classificados como patógenos
hemibiotróficos, que iniciam a colonização como biotróficos, se alimentando das células vivas
do hospedeiro, e depois de estabelecida as relações parasitarias estáveis passam para fase
necrotrófica, obtendo os nutrientes de células mortas do hospedeiro (AMORIM. REZENDE;
BERGAMIN FILHO, 2011).

18
O gênero Colletotrichum é apontado como um dos principais patógenos causadores de
doenças em plantas e ataca uma vasta gama de hospedeiros de importância econômica como
cereais, gramíneas, hortaliças, legumes e frutas (IVEY; NAVA-DIAZ; MILLER, 2004;
ROBERTS; PERNEZNY; KUCHAREK, 2012). Dentre as culturas de interesse econômico,
podemos citar: algodão (Gossypium hirsutum L.) (ROCA et al., 2004), café (Coffea arabica L.)
(LINS; ALVES; ABREU, 2007; SILVA et al., 2012), cártamo (Carthamus tinctorius L.)
(CARNEIRO et al., 2012), cítricos (Citrus spp. L.) (KUPPER; GIMENES-FERNANDES;
GOES, 2003), feijão (Phaseolus vulgaris L.) (SOUZA; SOUZA; MENDES-COSTA, 2007),
mamão (Carica papaya L.) (CIA, 2005), milho (Zea mays L.) (COSTA et al., 2010), pupunheira
(Bactris speciosa (Mart.) H. Karst.) (VIDA et al., 2006), jiló, pimentão e pimenta (Capsicum
frutensens L.) (BONETT et al., 2010), sendo possível observar que um hospedeiro pode ser
infectado por diferentes espécies e que uma mesma espécie pode infectar vários hospedeiros.
A espécie C. gloeosporioides tem se destacado, pois é muito conhecida e amplamente
distribuída na natureza, possuindo mais de 600 sinonímias e sendo indicada como anamorfo de
Glomerella cingulata (MENEZES, 2006). Segundo Phoulivong et al. (2010) a C.
gloeosporioides tem infectado pelo menos 1000 espécies de planta.
Em Capsicum spp., a espécie C. gloeosporioides tem sido relatada em vários países
como agente causal da doença antracnose (RAMDIAL; RAMPERSAD, 2015; THAN et al.,
2008; TOZZE JÚNIOR; MELLO; MASSOLA JÚNIOR, 2006; OH et al., 1998; McGOVERN;
POLSTON, 1995; HADDEN; BLACK, 1989; JOHNSTON; JONES, 1997). Mas, outras
espécies também tem sido descritas em diferentes regiões do mundo, como: Glomerella
cingulata, C. capsici, no Reino Unido (ADIKARAM; BROWN; SWINBURNE, 1983); C.
coccodes, C. musae, C. orbiculare, G. miyabeana e C acutatum em Nova Zelândia
(JOHNSTON; JONES, 1997); C. truncatum, em Trinidade (RAMDIAL; RAMPERSAD,
2015); C. acutatum, C. capsici na Tailândia (THAN et al., 2008); C. acutatum, C. coccodes e
C. capsici nos Estados Unidos (IVEY; NAVA-DIAZ; MILLER, 2004, HADDEN; BLACK,
1989; McGOVERN, 1995; ROY; KILLEBREW; RATNAYAKE, 1997). No Brasil, foram
identificadas as espécies C. acutatum, C. coccodes, C. capsici e C. boninense (TOZZE
JÚNIOR; MELLO; MASSOLA JÚNIOR, 2006; TOZZE JÚNIOR et al., 2007; TOZZE
JÚNIOR et al., 2009). Mais recentemente a espécie C. scovillei foi relatada no Brasil, Japão e
na Tailândia (CAIRES et al., 2014 KANTOS et al., 2014; DAMM et al., 2012).
Para a identificação e taxonomia do gênero Colletotrichum têm sido consideradas as
características moleculares em conjunto com as características morfológicas, culturais e
fisiológicas (SCHENA et al., 2014; DAMM et al., 2013; LIMA et al., 2013; WEIR;

19
JOHNSTON; DAMM, 2012; BONETT et al. 2010; TOZZE JÚNIOR; MELLO; MASSOLA
JÚNIOR, 2006; ANDRADE et al., 2007). A região ITS do 5.8S rDNA tem sido amplamente
sequenciada em estudos de identificação molecular das espécies do gênero Colletotrichum
(MILLS et al., 1992). A epitipificação para C. gloeosporiodes com base nas sequências de ITS,
por exemplo, possibilitou um grande avanço no entendimento deste gênero (CANNON;
BUDDIE; BRIDGE, 2008). No entanto, já são conhecidas as limitações da região ITS para
identificação de algumas espécies, e o desenvolvimento de genes mais informativos tornou-se
cada vez mais necessário (SHARMA; PINNAKA; SHENOY, 2013; WEIR; JOHNSTON;
DAMM, 2012; SILVA et al., 2011).
Os genes GAPDH, CAL, ACT, CHS (sintetase de quitina), EF1α (fator de alongação
1α) e a região ITS foram sequenciados de isolados de C. gloeosporioides sensu lato e avaliados
quanto a capacidade em separar os grupos. Os genes GAPDH, CAL e ACT foram indicados
como bons candidatos para barcode nesta espécie (CAI et al., 2009).
O gene GAPDH tem sido utilizado em muitos trabalhos como medida inicial de
diversidade de espécie do gênero Colletotrichum (LIMA et al., 2013; COSTA, 2014) e tem sido
indicado como barcode secundário na identificação de espécies, visto que sua combinação com
outros genes pode ser utilizado para distinguir de forma confiável a maioria dos táxons (WEIR;
JOHNSTON; DAMM, 2012).
Através da análise multilocus (CHS-1, ACT, TUB2 e ITS) as espécies deste gênero
foram separadas em nove principais complexos: C. gloeosporioides, C. boninense, C. acutatum,
C. graminicola, C. spaethianum, C. destructivum, C. dematium, C. truncatum, C. orbiculare
(CANNON et al., 2012) e posteriormente, o complexo C. brevisporum foi adicionado
(NOIREUNG et al., 2012). Estes complexos são estabelecidos com base na análise filogenética,
onde clados distintos são formados com espécies geneticamente próximas entre si, ou seja, cada
clado corresponde a um complexo.
A partir do conceito de complexos dentro do gênero Colletotrichum vários trabalhos
foram desenvolvidos, como as revisões dos complexos C. gloeosporiodes, C. boninense, C.
acutatum, C. destructivum, com base em análise multilocus utilizando os genes GAPDH, ACT,
CHS-1, TUB2, CAL, HIS3, GS, superóxido-dismutase de manganês (SOD) e a região ITS
(WEIR; JOHNSTON; DAMM, 2012; DAMM et al.; 2012a; DAMM et al. 2012b; DAMM et
al., 2014; CANNON et al., 2012). As ferramentas moleculares em conjunto com os métodos
clássicos de taxonomia, tem possibilitado a identificação de novas espécies. As espécies C.
tropicale e C fructicola foram relatadas recentemente na cultura da manga (Mangifera indica

20
L.), e também uma nova espécie, C. dianesii, foi identificada no nordeste do Brasil (LIMA et
al., 2013).
Estudos de identificação de espécies de Colletotrichum são importantes para o
desenvolvimentos de melhores estratégias de controle, pois diferentes espécies podem infectar
um mesmo hospedeiro (FREEMAN; KATAN; SHABI, 1998; CANNON et al., 2012;
PHOULIVONG; MCKENZIE; HYDE, 2012) e apresentarem diferentes níveis de sensibilidade
a fungicidas (LIMA et al., 2013; COSTA, 2014).

21
3 MATERIAL E MÉTODOS

O trabalho foi realizado de maio de 2014 a julho de 2015 no Laboratório de
Fitopatologia Molecular e Virologia Vegetal do Centro de Ciências Agrárias (CECA) da
Universidade Federal de Alagoas (UFAL) localizado no km 85 da BR 104 Norte (9º27’54.71”S
– 35º49’39.27”O), no Município de Rio Largo-Al.

3.1 Obtenção dos Isolados

Foram coletadas pimentas e pimentões apresentando sintomas de antracnose de
plantios comerciais, em municípios dos estados de Alagoas, Sergipe e Pernambuco (Tabela 1).
Após a coleta, os frutos foram levados ao laboratório, lavados, secos com papel toalha e
identificados. Quatro fragmentos, de cada fruto, foram retiradas da região de transição entre o
tecido doente e sadio. Em seguida, procedeu-se a desinfecção superficial em cabine de fluxo
laminar, na seguinte sequência: álcool a 70% (30 segundos), hipoclorito de sódio a 1% (1
minuto). Posteriormente, os fragmentos foram lavados duas vezes em água destilada
esterilizada (ADE). Utilizou-se papel de filtro esterilizado para retirar a umidade e, então, os
mesmos foram transferidos para placas de Petri contendo meio de cultura Batata-Dextrose-Ágar
(BDA) solidificado. As placas contendo os tecidos foram mantidas na temperatura ambiente,
em torno de 25ºC, durante três dias. Observado o crescimento do patógeno, foram retirados
discos (5 mm) das bordas das colônias e posteriormente, estes foram transferidos para novas
placas de Petri contendo meio de cultura BDA. As culturas dos isolados foram mantidas na
temperatura ambiente por aproximadamente sete dias, ou até o surgimento das estruturas de
reprodução do patógeno.

3.2 Cultura Monospórica

Observada a presença de esporos nos isolados realizou-se a metodologia para obtenção
de cultura monospórica, garantindo a pureza genética necessária à realização dos estudos de
caracterização cultural, morfológica e molecular. Inicialmente, preparou-se uma suspensão de
esporos com 1mL de água destilada esterilizada (ADE). A suspenção de esporos foi obtida
através de uma raspagem superficial sobre a colônia com o auxílio de uma alça de alumínio
previamente esterilizada na chama e resfriada. Em seguida, com auxílio de uma pipeta contendo
200 µL de ADE, foi realizada uma diluição seriada em 10-6. Então, 200 µL desta suspenção

22
foram colocados em uma placa de Petri contendo BDA e espalhada uniformemente com auxílio
de uma alça de Drigalski, previamente esterilizada na chama e resfriada, com duas repetições
por isolado. As placas de Petri contendo os esporos foram mantidas à temperatura de 25ºC.
Decorridos dois dias, discos de BDA (5mm) contendo um único esporo germinado foram
transferidos para placas de Petri com meio BDA.
Tabela 1 – Descrição dos isolados usados para identificação e caracterização de espécies de
Colletotrichum spp. associados à antracnose em Capsicum spp.
Código do
Ano da
Hospedeiro
Local de Coleta
Isolado
Coleta
Pimentão
P1
Maceió (AL)
2014
Pimentão
P5
Arapiraca (AL)
2014
Pimenta
Pi5
Coruripe (AL)
2014
Pimenta
Pi6
Coruripe (AL)
2014
Pimenta
Pi8
Coruripe (AL)
2014
Pimenta
Pi9
Coruripe (AL)
2014
Pimenta
Pi10
Coruripe (AL)
2014
Pimenta
Pi11
Coruripe (AL)
2014
Pimenta
Pi12
Coruripe (AL)
2014
Pimenta
Pi13
Coruripe (AL)
2014
Pimenta
Pi14b
Coruripe (AL)
2014
Pimenta
Pi15a
Coruripe (AL)
2014
Pimenta
Pi16
Coruripe (AL)
2014
Pimenta
Pi17
Coruripe (AL)
2014
Pimenta
Pi18
Coruripe (AL)
2014
Pimenta
Pi19
Coruripe (AL)
2014
Pimenta
Pi20
Coruripe (AL)
2014
Pimenta
Pi21
Coruripe (AL)
2014
Pimenta
Pi22
São Sebastião (AL)
2015
Pimenta
Pi23
São Sebastião (AL)
2015
Pimenta
Pi24
São Sebastião (AL)
2015
Pimenta
Pi25
São Sebastião(AL)
2015
Pimenta
Pi26
São Sebastião (AL)
2015
Pimenta
Pi27
São Sebastião(AL)
2015
Pimenta
Pi28
São Sebastião(AL)
2015
Pimenta
Pi30
São Sebastião(AL)
2015
Pimentão
P2
Cannindé do São Francisco (SE)
2015
Pimentão
P3.1
Cannindé do São Francisco (SE)
2015
Pimentão
P3.2
Cannindé do São Francisco (SE)
2015
Pimentão
P4.1
Cannindé do São Francisco (SE)
2015
Pimentão
P4.2
Cannindé do São Francisco (SE)
2015
Pimenta
Pi1
Coruripe (AL)
2014
Pimenta
Pi31
Cannindé do São Francisco (SE)
2015
Pimentão
P6
Camucin de São Felix (PE)
2014
Pimenta
Pi32
Arapiraca (AL)
2014
Pimenta
Pi33
Arapiraca (AL)
2014
Pimenta
Pi2
Coruripe (AL)
2014
Pimenta
Pi4
Coruripe (AL)
2014

23
3.3 Preservação dos Isolados

Para preservação dos isolados provenientes da cultura monospórica foram utilizados
três métodos. Os isolados foram preservados em água, através do método de Castellani (1967);
em tubos de ensaio contendo meio BDA, onde o disco de micélio foi depositado sobre a
superfície do meio de cultura e mantidos em temperatura ambiente (28ºC), e em tubos
eppendorf (2,0 mL). Após sete dias de crescimento da colônia, discos de micélio foram
transferidos para os tubos e mantidos a 4ºC.

3.4 Teste de Patogenicidade

Pimentas e pimentões sadios foram desinfestados com solução de hipoclorito a 1% por
dois minutos, lavados em água destilada (AD) e secos com papel toalha. O inóculo constituiuse de uma gota de 10µL de suspensão de esporos com concentração de 105 conídios/mL,
depositadas equidistantes uma das outras sobre a superfície dos frutos sadios, com duas
repetições para cada tratamento (com ferimento/sem ferimento). Os ferimentos foram feitos
com o auxílio de uma agulha previamente esterilizada na chama. A testemunha, com e sem
ferimento, foi composta apenas por ADE. Os frutos foram colocados, separadamente, em um
saco de polietileno contendo um algodão embebido em ADE ou em caixas gerbox com uma
folha de papel filtro esterilizada umedecida com ADE para não permitir a desidratação do fruto
e favorecer a germinação das estruturas de reprodução do patógeno. Para evitar o contato direto
com a superfície úmida foram utilizados tampas e fundos de placas de Petri esterilizadas. Os
experimentos foram mantidos em estufa incubadora BOD a 25°C ± 1°C e foto-período de 12
horas por sete dias.

3.5 Caracterização Molecular

3.5.1 Extração de DNA

Para obtenção da massa micelial dos isolados de Colletotrichum usados na extração
de DNA, três discos de BDA (5mm) contendo o patógeno foram cultivados em frascos de
Erlenmeyer (50mL) contendo 30 mL do meio Sacarose-Extrato de levedura-Asparagina
(sacarose 10 g, L-asparagina 2 g, extrato de levedura 2 g, KH2PO4 1 g, MgSO4.7H2O 0,1 g,

24
ZnSO4.7H2O 0,44 mg, FeCl3.6H2O 0,48 mg, e MnCl2.H2O 0,36 mg) (ZAUZA et al., 2007),
incubadas por 7 dias, sob temperatura de 25±1°C, sem agitação, e fotoperíodo de 12 horas.
Para a extração de DNA foi utilizado o protocolo de Doyle; Doyle (1987), onde os
micélios dos isolados foram macerados com nitrogênio líquido em almofariz de porcelana com
auxílio de um pistilo.
Após maceração, o micélio foi transferido para tubos de micro centrífuga com
capacidade de 1,5 mL. Em seguida, adicionou-se 1 mL de tampão de extração
hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB) 4% (CTAB 4%, NaCl 1,4M, EDTA 20 mM,
Tris-HCl 100 mM, PVP 1%), 4 µL de β-mercaptoetanol (0,1% v/v), e depois, os tubos foram
mantidos em banho-maria a 65°C por 30 minutos. Posteriormente, as amostras foram
centrifugadas a 12.000rpm por 15 minutos. O sobrenadante foi transferido para um novo tubo
onde foi adicionado 600µL de CIA (clorofórmio: álcool isoamílico 24:1) e 40 µL de CTAB
10% aquecido a 65°C. Após centrifugação, a fase aquosa foi transferida para um novo tubo e
foi acrescentando 400µL de etanol absoluto.
O DNA precipitado foi lavado com etanol 70% e seco em temperatura ambiente e, em
seguida, ressuspendido com 40 µL de TE (Tris-EDTA; Tris-HCl 10 mM, EDTA 1mM) +
RNAse (10µg/mL). A qualidade do DNA foi estimada visualmente em gel de agarose 0,8%,
corado com brometo de etídio a 5% e observado sob luz UV. O material foi armazenado sob
temperatura de -20°C.

3.5.2 Amplificação e sequenciamento do DNA

Os isolados obtidos foram amplificados com o gene que codifica para a proteína
gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH), para uma identificação prévia das espécies de
Colletotrichum. Posteriormente, as espécies encontradas foram amplificadas com o gene βtubulina (TUB2) e a região ITS-rDNA para confirmação das espécies identificadas (Tabela 2).
Tabela 2 – Descrição dos primers usados para identificação de espécies pertencentes ao
gênero Colletotrichum.
Gene
GAPDH
TUB2
ITS

Primer
GDR
GDF
T1
Bt2b
ITS1
ITS4

Sequencia (5’- 3’)
GCCGTCAACGACCCCTTCATTGA
GGGTGGAGTCGTACTTGAGCATGT
AACATGCGTGAGATTGTAAGT
ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC
TCCGTAGGTGAACCTGCGG
TCCTCCGCTTATTGATATGC

Referências
Guerber et al., 2003
O’ Donnel; Cigelnik, 1997
Glass; Donaldson, 1995
White et al., 1990

25
As reações de PCR foram realizadas com tampão 10X, MgCl2 50 mM, DNTP’s 10
mM, 10 μM de cada oligonucleotídeo, 1U de Taq DNA Polimerase e 1μL de DNA diluído
(1:20). O volume final das reações foi ajustado para 30μL com água Milli-Q autoclavada. As
reações de PCR foram realizadas em termociclador Applied Biosystems (2720 Thermal Cycler)
nas seguintes condições: um ciclo a 94°C por 4 min (desnaturação inicial); 35 ciclos a 94°C por
45s (desnaturação), 60°C por 45s (anelamento), e 72°C por 1 min (extensão); e um ciclo final
à 72°C por 7 min, para o gene GAPDH. Para o gene TUB2, a desnaturação inicial consistiu em
de 95°C por 4 min e 35 ciclos de 95°C por 30 s, 55°C por 30 s, 72°C por 45 s e um ciclo final
de 7 min por 72°C. E para a região ITS, a desnaturação inicial foi de 95°C por 2 min e 38 ciclos
de 95°C por 1 min, 55°C por 30 s, 72°C por 45 s e um ciclo final de 10 min por 72°C. Em
seguida, o produto de PCR foi enviado para purificação e sequenciamento com os mesmos
primers utilizados na amplificação.

3.5.3 Análises filogenéticas

As sequências de nucleotídeos foram montadas com o software Codon Code Aligner v.
4.1.1 (www.codoncode.com) (Codon Code Corporation, Dedham, Massachusetts, USA), e
analisadas visualmente. O arranjo dos nucleotídeos em posições ambíguas foram corrigidos por
comparação das sequências senso e anti-senso. Sequências parciais obtidas para o gene GAPDH
foram inicialmente analisadas com o algoritmo BLASTn (ALTSCHUL et al., 1990) e o banco
de dados de nucleotídeos não-redundante GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank), e
também comparadas com sequências no banco de dados Q-Bank Fungi para determinar as
espécies fúngicas com as quais elas compartilharam maior identidade de sequência.
Para identificação preliminar dos isolados, foi construída uma árvore filogenética
bayesiana com as sequências parciais do gene GAPDH. Para posicionamento taxonômico
definitivo, um subgrupo de isolados foi escolhido para obtenção de sequências adicionais com
os genes TUB2 e ITS. Foram então obtidas filogenias para os dados concatenados das
sequências parciais dos genes GAPDH, TUB2 e ITS do subgrupo dos isolados obtidos neste
trabalho e sequências disponíveis no GenBank (Tabela 3).

26
Tabela 3 - Isolados incluídos nas análises de sequências multi-gene, com detalhes de espécies,
número de acesso das culturas e números de acessos do GenBank.
Espécies

Nº de acesso do GenBank

Nº acesso da cultura
ITS

GAPDH

TUB2

C. aenigma

C1256

JX010243

JX009913

JX010390

C. aeschynomenes*

3-1-3

JX010176

JX009930

JX010392

C1275

JX010190

JX009990

JX010383

C1276

JX010191

JX010011

JX010449

C824

JX010251

JX010028

JX010411

C1189

JX010217

JX010018

JX010385

C1315

JX010406

JX010053

JX010406

C1187
CBS 123755

JX010192
JQ005153

JX009915
JQ005240

JX010384
JQ005588

C. chrysanthemi
C. chrysanthemi
C. dianesei*

CBS 126518

-

AFO60561

AFO61882

CBS 126519

-

AFO60562

AFO61883

CMM4083

KC329779

KC517194

KC517254

C. endophytica
C. grevilleae

DNCL075
CBS 132879

KF242123
KC 297078

KF242181
KC297102

KF254857
KC297010

C. gossypii

CML 2379

JX844082

JX847010

JX844108

C. gossypii
C. guajavae
C. hymenocallidis

CML 2374

JX844077

JX8470091

JX844104

IMI 350839

-

AFO60560

AFO61881

CSSN 3

GQ485601

GQ856759

GQ849439

C. indonesiense

CBS 127551

NR 111744

JQ948618

JQ949939

CLTA-01

HM131515

HM131501

HM153772

LLTA-01

HM131511

HM131497

HM153768

C1266

JX010231

JX010012

JX010444

C1275

JX010238

JX010042

JX010432

CBS 112989

NR111745

JQ948619

JQ949940

CBS129827

JQ948290

JQ948620

JQ949941

GZAAS5.09506

JQ247632

JQ247609

JQ247644

GZAAS5.09538

JQ247633

JQ247608

JQ247645

CBS116870

JX010146

JX010050

HQ596280

C1266.11

JX010142

JX010015

JX010395

C1275.24

JX010187

JX009972

JX010398

C1275.25

JX010189

JX009936

JX010397

C. alatae*
C. alienum*
C. asianum*
C. boninense*

C. jasmini-sambac
C. kahawae*
C. laticiphilum
C. murrayae*
C. musae*
C. nupharicola*
C. paxtonii
C. proteae*
C. queenslandicum*
C. salsolae*
C. scovillei

IMI 165753

NR111742

JQ948615

JQ949936

CBS 132882

KC297079

KC297009

KC297101

CBS 134301

KC842385

KC842379

KC842387

ICMP 1778

JX010276

JX009934

JX010414

C956

JX010185

JX010036

JX010412

C1314

JX010242

JX009916

JX010403

CBS 126529

-

AFO60559

AFO61880

CBS 120708

-

AFO60557

AFO61878

C. sloanei

IMI364297

NR111743

JQ948617

JQ949938

C. simmondsii

CBS 122122

NR111741

JQ948606

JQ949927

C. simmondsii

CBS 29467

FJ972610

FJ972581

FJ907444

27
Tabela 3 - Isolados incluídos nas análises de sequências multi-gene, com detalhes de
espécies, número de acesso das culturas e números de acessos do GenBank (Conclusão).
C. siamense*

C1315

JX010171

JX009924

JX010404

Tabela 3 - Isolados incluídosC1316
nas análises deJX010294
sequências multi-gene,
de
JX010006 com detalhes
JX010447
espécies,
número de acesso das
culturas e números
de acessos do
GenBank (Conclusão).
C. theobromicola*
C1275
JX010286
JX010024
JX010373
C. tropicale*
C. viniferum*
C. walleni

C1270

JX010289

JX009962

JX010380

C5101

JX010264

JX010007

JX010407

C1272

JX010275

JX010020

JX010396

YG4

JN412804

JN412798

JN412813

GG4

JN412802

JN412800

JN412811

CBS 125472

-

AFO60565

AFO61886

* Espécie tipo. TUB-2: ß-tubulin; GAPDH: glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase; ITS: partial rDNA-ITS region.

Alinhamentos múltiplos de sequências nucleotídicas foram preparados para os
* Espécie tipo. TUB-2: ß-tubulin; GAPDH: glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase; ITS: partial rDNA-ITS region.

conjuntos de dados GAPDH e dados concatenados (GAPDH, TUB2 e ITS) utilizando-se o
algoritmo MUSCLE (EDGAR, 2004) e ajustados manualmente no pacote MEGA6 (Molecular
Evolutionary Genetics Analysis) (TAMURA et al., 2013). A análise de Inferência Bayesiana
(BI) para os conjuntos de dados GAPDH e dados concatenados dos complexos C. acutatum e
C. gloeosporioides foi realizada, separadamente, empregando o método da cadeia de Markov
Monte Carlo (MCMC), no web portal CIPRES (MILLER et al., 2010) usando MrBayes v. 3.2.3
(RONQUIST et al., 2012).
O melhor modelo de substituição de nucleotídeos foi determinado para os dados de
cada região genômica usando MrModeltest 2.3 (POSADA; BUCKLEY, 2004) de acordo com
o Akaike Information Criterion (AIC). As quatro cadeias MCMC foram conduzidas
simultaneamente, iniciando as árvores aleatoriamente até 10.000.000 de gerações, para cada
conjunto de dados. As árvores foram amostradas a cada 1.000 gerações, resultando em 10.000
árvores. As primeiras 2.500 árvores foram descartadas da análise, como uma fase de burn-in.
Os valores de probabilidade posterior (RANNALA, YANG, 1996) foram determinados a partir
de uma árvore consenso majority-rule gerada com as 7.500 árvores remanescentes. A
convergência dos logs de verossimilhança foi analisada com o software TRACER v. 1.4.1
(beast.bio.ed.ac.uk/Tracer). As árvores foram visualizadas e editadas nos programas FigTree v.
1.4 (ztree.bio.ed.ac.uk/software/figtree) e Inkscape (https://inkscape.org/pt/).

28
3.6 Estudos Morfológicos das Espécies de Colletotrichum

Baseados nas espécies fúngicas identificadas nas análises filogenéticas, isolados foram
selecionados e utilizados para caracterização das colônias e morfologia dos conídios.
Para caracterização cultural, discos de BDA (5mm) contendo o micélio de cada isolado
foram retirados da borda da colônia cultivada por sete dias. Estes foram transferidos,
individualmente, para o centro de placas de Petri contendo 20 mL de meio BDA sintético. Os
tratamentos foram mantidos em incubadora BOD a 25°C ± 1°C e fotoperíodo de 12 horas,
dispostas em delineamento inteiramente casualizado, com cinco repetições, sendo a repetição
constituída por uma placa de Petri. Foram realizadas avaliações diárias do crescimento micelial
das colônias (cm) em duas direções diametricamente opostas no fundo externo das placas, com
auxílio de uma régua milimétrica, durante sete dias. Também foram observadas a coloração das
colônias e o aspecto do micélio aéreo.
A caracterização morfológica baseou-se no tamanho e forma de 50 conídios e
apressórios de cada espécie, escolhidos aleatoriamente, provenientes das estruturas do patógeno
crescidos em meio BDA por sete a 14 dias. Para mensuração dos esporos, foram preparadas
lâminas, onde foi depositada uma gota (40 μL) do corante azul de metileno juntamente com os
conídios e observadas em microscópico óptico.
A formação de apressórios foi realizada utilizando duas metodologias. Na primeira,
foi utilizada uma gota de suspensão de esporos depositada sobre uma lâmina de vidro estéril
acondicionada em placa de Petri forrada com papel filtro estéril umedecido com ADE, para
manter o ambiente úmido e permitir a germinação dos conídios. E na segunda, foi realizada a
microcultura. Após 48 horas, as imagens dos apressórios foram capturados. Para a mensuração
de comprimento e largura, considerou-se como comprimento, a distância entre o septo existente
entre o apressório e o tubo germinativo e a extremidade mais distante do mesmo. A largura foi
mensurada em sentido perpendicular ao considerado para o comprimento (SUSSEL, 2005).
As medidas de comprimento e largura dos conídios e apressórios foram obtidos através
de imagens capturadas por câmera digital (Olympus IX2-SLP) acoplada ao microscópio óptico
com aumento de 400x, projetada em monitor de computador, através do software Cellsenses
Standard (SAMSUNG SDC-415®). Foram calculados as médias dos conídios e apressórios.
Análises de variância (ANOVA) foram conduzidas para determinar as diferenças de
significância nas dimensões dos conídios, apressórios e taxas de crescimento com espécies de
Colletotrichum, e as médias foram comparadas pelo Teste de Tukey em nível de 5% de

29
probabilidade, utilizando o utilizando o programa ASSISTAT 7.6 beta desenvolvido por Santos
e Silva (2013).

3.7 Patogenicidade de Espécies de Colletotrichum em Diferentes Hospedeiros

A patogenicidade de quatro espécies de Colletotrichum, isoladas de pimentas e
pimentões, com sintomas de antracnose, foi avaliada em diferentes hospedeiros, constituída por
frutos comerciais de pimenta Dedo-de-moça, pimentão verde, tomate e jiló. Os frutos foram
lavados com detergente em água corrente, desinfestados superficialmente em solução de
hipoclorito de sódio (NaOCl) a 1% por 3 minutos e lavados com ADE. Após a secagem, a
epiderme de cada fruta foi perfurada em um ponto na região mediana, à profundidade de 3 mm,
com auxílio de agulha esterilizada. O inóculo constituiu-se de uma gota de 10µL de suspensão
de esporos com concentração de 105 conídios/mL, depositadas sobre o ferimento na superfície
de cada fruto. A testemunha foi composta apenas por ADE.
Os frutos foram colocados em gerbox forrados com papéis filtro esterilizados
umedecidos com ADE e cobertos com saco plástico, para manter a umidade relativa do ar
elevada. Os gerbox foram incubados a 25ºC, no escuro. Após 48h, foi retirada a câmara úmida,
e os frutos foram mantidos na mesma temperatura. O fungo foi inoculado nos hospedeiros
separadamente e para cada hospedeiro o delineamento experimental foi inteiramente
casualizado, com cinco repetições por espécie e um fruto por repetição. A patogenicidade foi
avaliada aos sete dias após a inoculação pela medição do diâmetro da lesão (cm) em duas
direções perpendiculares e calculado a média do diâmetro da lesão. Os dados obtidos foram
submetidos à análise de variância (ANOVA) e as médias comparadas pelo teste de Tukey em
nível de 5% de probabilidade, utilizando o programa ASSISTAT 7.6 beta desenvolvido por
Santos e Silva (2013).

30
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1 Teste de Patogenicidade

Foram obtidos 38 isolados pertencentes ao gênero Colletotrichum de pimentões e
pimentas coletados nos estados de Alagoas, Pernambuco e Sergipe. Todos os isolados
apresentaram patogenicidade quando inoculados em frutos sadios de pimentas e/ou pimentões
com ferimento (Figura 1). Entretanto, quando inoculados em frutos sem ferimento, estes
isolados não foram patogênicos. Os frutos com ferimento apresentaram sintomas típicos de
antracnose.
As diferenças observadas em frutos com e sem ferimentos estão relacionadas à
vulnerabilidade causada pelos ferimentos que facilitam a ação de fungos (KANTO et al., 2014),
sendo importante no processo de penetração e infecção de algumas espécies de Colletotrichum
(BAILEY et al., 1992). Além disso, diferentes estágios de maturação dos frutos influenciam na
suscetibilidade a patógenos, pois no processo de maturação e após a colheita, a resistência
natural dos frutos declina (CIA, 2005). Neste caso, os estágio de maturação em que se
encontravam os frutos não influenciou na infecção do patógeno, pois este não foi capaz de
iniciar o processo de infecção nos frutos sem ferimento, provavelmente, esta resistência dos
frutos sem ferimento pode ter ocorrido devido os resíduos de agrotóxicos utilizados para
controlar a ação de patógenos na pós-colheita.
Figura 1 – Teste de patogenicidade: pimentão inoculado com o isolado P1, sem ferimento (1)
e com ferimento (2) (A); e pimentas Dedo de moça, sem ferimento (1) e com ferimento (2),
inoculados com o isolado Pi18 (B).

1
1 o isolado P1, sem ferimento (1)
Figura 1 – Teste de patogenicidade: pimentão inoculado com
e com ferimento (2) (A); e pimentas Dedo de moça, sem ferimento (1) e com ferimento (2),
inoculados2com
1 o isolado Pi18 (B).
2
2 1

2
A

B

Fonte: SILVA, J. R. A.; PAIXÃO, T.; SILVA, A. R. G. da, 2015.

2
2

A

2
2

Fonte: SILVA, J. R. A.; PAIXÃO, T.; SILVA, A. R. G. da, 2015.

B

31
4.2 Caracterização Molecular

A análise molecular do gene GAPDH dos 38 isolados, permitiu a identificação de
cinco espécies de Colletotrichum pertencentes a quatro complexos: C. gloeosporioides, C.
acutatum, C. truncatum e C. brevisporum (Figura 2).
Figura 2 – Árvore filogenética de Inferência Bayesiana com os isolados de Colletotrichum
pertencentes a quatro complexos, usando o gene GAPDH.

C. gloeosporioides

C. acutatum

C. brevisporum
C. truncatum
Fonte: SILVA, J. R. A., 2015.

Os espécies identificadas foram: C. scovillei (26/38) Damm, C. tropicale (1/38) E.I.
Rojas, S.A. Rehner & Samuels, C. siamense (6/38) Prihastuti, L. Cai & K.D. Hyde, C.
truncatum (3/38) (Schw.) Andrus & Moore e C. brevisporum (2/38) S. Phoulivong, P.

32
Noireung, L. Cai & K.D. Hyde. As espécies apresentaram diferentes porcentagens de
ocorrência (Figura 3).
Figura 3 - Porcentagem de ocorrência das espécies de Colletotrichum identificadas neste
trabalho.
Figura 3 - Porcentagem de ocorrência das espécies de Colletotrichum identificadas neste
trabalho.
5%3%
8%
16%
68%

C. scovillei
C. brevisporum

C. siamense
C. tropicale

C. truncatum

Fonte: SILVA, J. R. A., 2015.

A espécie C. scovillei foi obtido a partir do isolamento em pimentas, coletadas em
áreas de plantio dos municípios de Coruripe-AL e São Sebastião-AL e de pimentões das áreas
de plantio dos
Fonte:
municípios
SILVA, J. R.
deA.,
Arapiraca-AL
2015.
e Maceió-AL. Estes isolados representam o maior
clado da árvore filogenética, representado por 68% de ocorrência, sendo a espécie
predominante no estado de Alagoas, nestas culturas.
Essa espécie foi relatada pela primeira vez no Brasil, em 2014, associada a frutos de
C. annum coletados no estado de Minas Gerais (CAIRES et al., 2014) e no mundo, foi
identificada na Tailândia e no Japão (DAMM et al., 2012b; KANTO et al., 2014). Existem
trabalhos que apontaram que espécies do complexo C. acutatum, isolados de pimentas e
pimentões, identificadas como C. acutatum, foram recentemente reclassificados como C.
scovillei (DAMM et al, 2012b). No Brasil, este foi o primeiro relato de C. scovillei associado
ao cultivo de pimenta (C. frutescens L.).
Do complexo C. gloeosporioides, duas espécies, C. siamense e C. tropicale, foram
identificadas. A primeira foi oriunda do plantio de Cannindé do São Francisco-SE, com 16%
de ocorrência, e a segunda, C. tropicale, de Coruripe –AL, com 3% de ocorrência.
Deste complexo, C. siamense já foi relatada associada a pimenta na Índia, Laos e
Tailândia (SHARMA; SHENOY, 2014; PHOULIVONG; MCKENZIE; HYDE, 2012). Além
de outros hospedeiros, como: Pitaia (Hylocereus undatus (Haw.) Britton & Rose) na Tailândia;
cebola (Allium cepa L.) no sudoeste da Índia; jaca (Artocarpus heterophyllus Lam), nêspera

33
(Eriobotrya japônica (Thunb.) Lindl), figueira (Ficus carica L.), hortelã (Mentha sp. L.),
pimenta-preta (Piper nigrum L.), alecrim (Rosmarinus officinalis L.) e cacau (Theobroma
cacao L.) na Austrália; café, na Tailândia e pêssego (Prunus persica (L.) Batsch), em Carolina
do Sul (MEETUM; LEKSOMBOON; KANJANAMANEESATHIAN, 2014; CHOWDAPPA;
CHETHANA; PAVANI, 2015; JAMES et al., 2014; PRIHASTUTI et al., 2009; HU;
GRABKE; SCHNABEL, 2015). No Brasil, é descrita em goiaba (Psidium guajava L.), manga,
abacate (Persia americana Mill), pêssego, maça (Malus domestica (Borkh.) Borkh), caju
(Anacardium occidentale L.) (BRAGANÇA, 2013), pinha (Annona squamosa L.) e graviola
(Annona muricata L.) (COSTA, 2014).
A outra espécie do complexo C. gloeosporioides, C. tropicale, já foi associada a
manga, pinha e graviola, no Brasil (LIMA et al., 2013; COSTA, 2014); cacau e graviola, no
Panamá (ROJAS et al., 2010; WEIR; JOHNSTON; DAMM, 2012); lichia (Litchi chinensis
Sonn), no Japão (WEIR; JOHNSTON; DAMM, 2012) e gramínea (Terpsichore taxifolia L.),
em Porto Rico (DOYLE et al., 2013).
Estas duas espécies tem sido associadas a cultura do pimentão em estudos de infecção
cruzada, com isolados obtidos de orquídeas (C. siamense) na China (YANG et al., 2011) e de
manga (C. tropicale) no Brasil (LIMA et al., 2013).
Do complexo C. truncatum, foram identificados três isolados como pertencentes a
espécie C. truncatum, representando 8% de ocorrência, sendo um isolado de pimentão, coletado
no estado de Pernambuco, e dois isolados de pimenta, coletados do estado de Alagoas. Essa
espécie foi descrita em Capsicum spp., na Tailândia (RAMDIAL; RAMPERSAD, 2015), na
Austrália (RANATHUNGE, et al 2012) e em Trinidade (MAHARAJ; RAMPERSAD, 2011).
No Brasil, sua ocorrência tem sido registrada em soja (Glycine max (L.) Merr.), sendo
considerada o agente causal da antracnose nessa cultura (ROGERIO, 2015) e feijão-fava
(Phaseolus lunatus L.) (CAVALCANTE et al., 2012). Também tem ocorrido em outros
hospedeiros como lentilha (Lens culinaris Medik.) no Canadá (FORD et al., 2004), pega-pega
(Desmodium tortuosum (Sw.) DC) nos EUA (CARDINA; LITTRELL; HANLIN,1988) e
espécies da família Amaryllidaceae (YANG et al., 2009).
Além disso, a espécie C. capsici, sinonímia da C. truncatum (DAMM et al., 2009) foi
relatada no Reino Unido (ADIKARAM; BRON; SWINBURNE, 1983), EUA (HADDEN;
BLACK, 1989; ROY; KILLEBREW; RATNAYAKE, 1997) e Tailândia (THAN et al., 2008)
em Capsicum spp.
Do complexo C. brevisporum foram identificados dois isolados provenientes de
Coruripe-AL, com 5% de ocorrência. Essa espécie foi recentemente descrita por Noireung et

34
al. (2012) na Tailândia, sendo considerada uma nova espécie dentro do gênero Colletotrichum,
estando no clado próximo a C. cliviae Yan L. Yang, Zuo Y. Liu, K.D. Hyde & L. Cai, C.
dracaenophilum D.F. Farr & M.E. Palm e C. yunnanense Xiao Ying Liu & W.P. Wu, dando
origem a um novo complexo. A ocorrência desta espécie tem sido relatada na Índia (SHARMA;
PINNAKA; SHENOY, 2013), na Coréia, em vinha matrimônio (Lycium chinense Mill) (PAUL
et al., 2014) e no Brasil, em mamoeiro (VIEIRA; NASCIMENTO; MICHEREFF, 2013). Esta
foi a primeira vez que C. brevisporum foi relatada em C. frutescens.
A concatenação dos genes GAPDH, TUB2, e região ITS dos isolados representantes
dos complexos C. gloeosporioides (Figura 4) e C. acutatum (Figura 5), confirmaram a análise
preliminar (com o gene GAHPD), ou seja, que os isolados identificados nestes complexos são
C. tropicale e C. scovillei, respectivamente.
O alinhamento concatenado, com os genes GAPDH, TUB2 e região ITS, para o
complexo C. acutatum apresentou 1315 caracteres, nos quais 62 são sítios informativos
parcimônia e 1062 sítios conservados. Os limites do locus nos alinhamentos foram: TUB2: 1506, GAPDH: 507-771 e ITS: 772-1315. Para o complexo C. gloeosporioides, o alinhamento
obteve 1390 caracteres, nos quais 363 são sítios informativos parcimônia e 859 sítios
conservados. Os limites do locus nos alinhamentos foram: GAPDH: 705-1008, ITS: 1009-1390,
TUB2: 1-704. O modelo de substituição selecionado para os genes baseado no Akaike
Information Criterion (AIC) está descrito na tabela 4.

Tabela 4 - Modelo de substituição selecionado para os genes através do programa MrModeltest
2.3.
Gene

Complexo C. gloeosporioides

Complexo C. acutatum

GAPDH

HKY+G

HKY

ITS

SYM+I

K80+I

TUB2

GTR+G

GTR+G

HKY- Hasegawa, Kishino e yano; SYM - Symonetrical Model; GTR - General time reversible; K80 - Kimura 2parâmetros; G - Distribuição gama; I - Proporção de sítios invariáveis.

35
Figura 4 – Árvore filogenética de Inferência Bayesiana com um isolado de Colletotrichum
do complexo C. gloeosporioides, usando a sequência da combinação parcial de dados dos
genes GAPDH, TUB-2 e ITS. Colletotrichum boninense foi usado como outgroup.

Fonte: SILVA, J. R. A., 2015.

36
Figura 5 – Árvore filogenética de Inferência Bayesiana com três isolados de Colletotrichum
do complexo C. acutatum, usando a sequência da combinação parcial de dados dos genes
GAPDH, TUB-2 e ITS. Colletotrichum boninense foi usado como outgroup.

Fonte: SILVA, J. R. A., 2015.

4.3 Estudos Morfológicos
Fonte: SILVA, J. R. A., 2015.

Com base na coloração das colônias, os isolados das espécies de Colletotrichum
agruparam-se em cinco morfogrupos distintos (Figura 6). O morfogrupo I, foi composto por
colônias cinza escuro com bordas brancas e reverso verde musgo com bordas brancas, com um
isolado apresentando massa alaranjada no centro, correspondendo a espécie C. scovillei.
Colônias brancas acinzentas com presença de massa de conídios no centro e reverso variando
de bege alaranjado a bege esverdeado estão inseridas no morfogrupo II, e agrupou os isolados
identificados como C. siamense. Isolados da espécie C. truncatum apresentaram colônias
salmão claro e centro esverdeado, reverso salmão claro com halo esverdeado no centro
formando o morfogrupo III. Um isolado com colônia branca e centro cinza e reverso branco
com halo verde oliva circundando o centro branco, com massa de conídios na parte superior e

37
no reverso da placa, formou o morfogrupo IV, correspondendo a espécie C. tropicale. A
coloração rósea com centro esverdeado na parte superior e no reverso da placa correspondeu
ao morfogrupo V agrupou a espécie C. brevisporum.
Figura 6 - Aspecto dos cinco morfogrupos de isolados de Colletotrichum cultivados em meio
BDA sintético, observados ao 7° dia. C. scovillei: I (A) e (B). C. siamense: II (A) e (B). C.
truncatum: III (A) e (B). C. tropicale: IV (A) e (B). C. brevisporum: V (A) e (B). Parte superior
(A) e reverso (B) da placa de Petri.
I (A)

II (A)

III (A)

IV (A)

V (A)

I (B)

II (B)

III (B)

VI (B)

V (B)

Fonte: SILVA, J. R. A.; PAIXÃO, T.; SILVA, A. R. G. da, 2015.

Os isolados das espécies de Colletotrichum provenientes de pimenta e pimentão do
Nordeste do Brasil apresentaram coloração das colônias bastante variáveis, conforme já
observado
paraJ. estas
mesmas espécies
em2015.
outras regiões do mundo. As espécies de
Fonte: SILVA,
R. A.; PAIXÃO,
T.; SILVA,isoladas
A. R. G. da,
Colletotrichum apresentaram as seguintes variações de cor: micélio branco acinzentado a cinza
escuro, branco-gelo, com reverso branco ao verde musgo, salmão claro e centro esverdeado,
cinza e micélio aéreo branco, róseo com centro esverdeado, reverso bege alaranjado a bege
esverdeado e incolor a laranja com manchas escuras e conídios em massa alaranjada (DAMM
et al., 2012b; SUTTON, 1980; SUTTON, 1992; WEIR; JOHNSTON; DAMM, 2012; BONETT
et al., 2010). Estas características culturais podem variar dentro de uma mesma espécie, pois
estão sujeitas a mudanças de acordo com as condições de cultivo. Temperatura, luminosidade
e meio de cultura, interferem na estabilidade e aspecto das colônias (COUTO; MENEZES,
2004; MENEZES, 2002).
Em relação ao crescimento micelial das diferentes espécies de Colletotrichum,
observamos que houve variação estatística entre as espécies do complexo C. gloeosporioides
que apresentaram maior taxa de crescimento micelial (TCM), quando comparada com as
espécies dos demais complexos. A espécie C. brevisporum apresentou menor taxa de
crescimento micelial, diferindo estatisticamente de todas as outras espécies (Tabela 5).

38
Os dados culturais são importantes na caracterização das espécies como informações
complementares que contribuem na sua identificação, apesar de não serem características que
devam ser levadas em consideração isoladamente. Neste trabalho, os dados de TCM,
corroboraram com o que é descrito na literatura, por exemplo, a espécie C. siamense apresentou
TCM de 0,95cm, semelhante a isolados desta mesma espécie, na China e na Tailândia que
apresentaram TCM variando entre 1,05-1,24 (YANG et al., 2009).
Os conídios apresentaram-se hialinos e unicelulares, com formato, comprimento e
largura variáveis. Houve diferença estatística entre C. truncatum (maior comprimento) e C.
brevisporum que diferiu de C. siamense que também diferiu de C. scovillei e C. tropicale que
apresentaram diferença estatística em relação aos demais espécies (Tabela 5).
Tabela 5 - Médias de comprimento e largura de conídios e apressórios, e taxa de crescimento
micelial de isolados de Colletotrichum.
TCM
Espécies
Conídios
Apressórios
cm/dia
Comprimento
Comprimento
Largura
Colletotrichum
Largura (µm)
(µm)
(µm)
(µm)
C. tropicale
14,73d
5,46a
9,67c
7,26b
1,10a
(12,84-16,65)
(4,44-6,36)
(6.79-9.68)
(6.0-9.67)
C. scovillei
14,97d
4,20c
10,81b
7,74ab
0,71b
(13,24-17,08)
(3,58-4,59)
(7,25-14,73)
(5,22-2,53)
C. siamense
16,20c
4,86b
11,86a
8,24a
0,95a
(13-18,39)
(3,44-6,1)
(9,12-16,49)
(5,80-9,85)
C.truncatum
27,45a
3,66d
5,03d
3,26c
0,67b
(23,34-31,25)
(3,14-4,29)
(3,84-7,66)
(2,40-5,32)
C. brevisporum
17,17b
5,54a
0,28c
(13,63-23,72)
(4,47-7,02)
Médias seguidas das mesmas letras não diferem estatisticamente pelo teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade.
TCM= Taxa de crescimento micelial em cm.

A espécie C. scovillei produziu conídios hialinos, asseptados, lisos, retos, cilíndricos
com extremidades arredondas ou com final mais ou menos agudos, com valores médios de
comprimento e largura X= 14,97 x 4,20 μm. Formato e valores semelhantes foram relatados
para esta espécie, variando entre 12,5-19,5 μm para o comprimento e 3,5-4,5 μm para a largura
(DAMM et al., 2012b; CAIRES et al., 2014; KANTO et al., 2014). Os apressórios tiveram
coloração castanho médio a escuro, de parede lisa, subglobosos e ovoides a elipsoidais, em todo
o contorno, às vezes ondular, com X= 10,81 x 7,74 μm. As medidas de apressórios encontrados
neste trabalho foram maiores do que as relatados por Damm et al. (2012b) e Kanto et al. (2014)
que variam entre 6,3 × 5,6 μm (Figura 7-A e B). Um dos fatores relacionados a estas diferenças

39
é o tipo de meio de cultura utilizado no trabalho, pois Kanto et al. (2014) e Damm et al. (2012b)
utilizaram meio de cultura SNA (Synthetic Nutrient Agar), além disso outras características do
ambiente e do isolado podem ter influenciado no tamanho de apressórios.
Figura 7 - Características morfológicas da espécie C. scovillei crescida em meio BDA: Conídios
retos, cilíndricos com extremidades arredondas ou com final mais ou menos agudos (A).
Apressórios castanho médio a escuro, subglobosos, ovoides a elipsoidais (B). As imagens (A)
e (B) foram obtidas a 40x. Escala de 20μm.

B

A

Fonte: SILVA, J. R. A.; PAIXÃO, T.; SILVA, A. R. G. da, 2015.

Colletotrichum tropicale apresentou conídios cilíndricos curtos e largos com
extremidades arredondados, com uma leve contração perto do centro, variando em tamanho
entre 12,84-16,65 x 4,44-6,36 µm, X= 14,73 x 5,46 µm. Os apressórios se apresentaram
Fonte: SILVA, J. R. A.; PAIXÃO, T.; SILVA, A. R. G. da, 2015.

subglobosos, ovoides e clavados, com comprimento variando entre 6,79-9,68 µm e largura 6,09,67 µm (Figura 8-A e B). Corroboram com este resultado o trabalho de Lima et al. (2013) que
descreveu conídios cilíndricos com média= 14,12x4,82 μm e Rojas et al. (2010), que descreveu
conídios variando entre 12,5–16,5 x 4,8–5,5 µm e apressórios 7,0–11,0 x 5,2–7,2 µm.
Figura 8 - Características morfológicas da espécie C. tropicale: Conídios curtos e largos com
extremidades arredondados, com uma leve contração perto do centro (A). Apressórios
subglobosos, ovoides e clavados (B). As imagens (A) e (B) foram obtidas a 40x. Escala de
20μm.

A

B

Fonte: SILVA, J. R. A.; PAIXÃO, T.; SILVA, A. R. G. da, 2015.

A

B

Conídios unicelulares, de parede lisa, hialinos, fusiforme com ápices obtusos
ligeiramente arredondados, por vezes, oblongo, são descrito para a espécie C. siamense,
características estas observadas neste trabalho (Figura 9-A e B). Além disso, as médias de
Fonte: SILVA, J. R. A.; PAIXÃO, T.; SILVA, A. R. G. da, 2015.

40
comprimento e largura dos conídios, bem como formato de apressórios foram semelhantes as
descritas para esta espécie (PRIHASTUTI et al., 2009; COSTA, 2014).
As espécies C. tropicale e C. siamense são consideradas próximas geneticamente e
compartilham algumas características morfológicas: conídios curtos e largos, com
extremidades arredondadas e muitas vezes suavemente apertados perto do centro (WEIR;
JOHNSTON; DAMM, 2012).
Figura 9 - Características morfológicas da espécie C. siamense: Conídios cilíndricos com
extremidades arredondados, com uma leve contração perto do centro (A). Apressórios
clavados, algumas vezes ovoides (B). As imagens (A) e (B) foram obtidas a 40x. Escala de
20μm.

A

B

Fonte: SILVA, J. R. A.; PAIXÃO, T.; SILVA, A. R. G. da, 2015.

Colletotrichum truncatum apresentou conídios compridos, hialinos, de parede lisa,
com a parte central ligeiramente curvada, afinando em direção ao ápice mais fortemente curvo.
Os valores médios para comprimento e largura dos conídios foram de 27,45 x 3,66 µm. Os
Fonte: SILVA, J. R. A.; PAIXÃO, T.; SILVA, A. R. G. da, 2015.

apressórios desta espécie mostraram-se clavados, ocasionalmente irregulares, semelhantes aos
encontrados por Ford et al. (2004). As dimensões de apressórios foram X= 5,03 x 3,26 μm.
(Figura 10-A e B). Os valores de comprimento e largura dos conídios para esta espécie na
literatura variam de 20–24,5 x 2,8–4 μm (DAMM et al., 2009; ROGERIO, 2015) e 16,1–20,7
μm × 3,3–4,9 μm (FORD et al., 2004). E as dimensões de apressórios variam 6,9 – 18,47 x 4,13
– 10,03 μm (DAMM et al., 2009; ROGERIO, 2015).
Figura 10 - Características morfológicas da espécie C. truncatum: Conídios compridos com
a parte central ligeiramente curvada, afinando em direção ao ápice mais fortemente curvos
(A). Apressórios clavados, às vezes irregulares (B). As imagens (A) e (B) foram obtidas a
40x. Escala de 20μm.
Figura 10 - Características morfológicas da espécie C. truncatum: Conídios compridos com
a parte central ligeiramente curvada, afinando em direção ao ápice mais fortemente curvos
(A). Apressórios clavados, às vezes irregulares (B). As imagens (A) e (B) foram obtidas a
40x. Escala de 20μm.

A

B

Fonte: SILVA, J. R. A.; PAIXÃO, T.; SILVA, A. R. G. da, 2015.

41
A espécie C. brevisporum apresentou conídios cilíndricos, hialinos, com extremidades
arredondadas e paredes lisas, e apressórios com formato irregular e às vezes oval, conforme já
descrito por Paul et al. (2014) (Figura 11-A e B). No entanto, diferente do que é descrito por
Noireung et al. (2012) e Vieira, Nascimento, Michereff (2013) os conídios não foram gutulados.
As médias de comprimento e largura dos conídios foi 17,17 x 5,54 μm. Estas dimensões de
conídios também corresponderam ao descrito na literatura X= 10,5-24 × 3,8-6 μm
(NOIREUNG et al., 2012; VIEIRA; NASCIMENTO; MICHEREFF, 2013, 2013; PAUL et al.,
2014). Para apressórios, as medidas de comprimento e largura variaram de 10-16,8 × 5-11μm
(PAUL et al., 2014; NOIREUNG et al., 2012). Não foi possível obter as médias de apressórios
para esta espécie, pois os isolados não produziram esta estrutura em quantidade suficiente.
Figura 11 – Características morfológicas da espécie C. brevisporum: Conídios cilíndricos, com
extremidades arredondadas (A). Apressórios irregulares e às vezes ovais (B). As imagens (A) e
(B) foram obtidas a 40x. Escala de 20μm.

A

B

Fonte: SILVA, J. R. A.; PAIXÃO, T.; SILVA, A. R. G. da, 2015.

4.4 Patogenicidade de Espécies de Colletotrichum em Diferentes Hospedeiros
SILVA, J. R.
PAIXÃO, T.; SILVA,
A. R. G. da, 2015.
Todos Fonte:
as espécies
deA.;Colletotrichum
apresentaram
patogenicidade aos quatro

hospedeiros (Figura 12).
Analisando a infecção das espécies de Colletotrichum spp. no mesmo hospedeiro é
possível inferir que: C. scovillei apresentou maiores lesões em pimentão do que as espécies C.
tropicale, C. siamense e C. truncatum. Em tomate e pimenta não houve diferença estatística
entre as espécies. No hospedeiro jiló, as espécies C. siamense e C. truncatum diferiram
estatisticamente entre si, sendo que C. siamense apresentou as maiores lesões (0,69 cm) e C.
truncatum as menores (0,08 cm).
Comparando a patogenicidade da mesma espécie em relação aos hospedeiros,
observamos que: o pimentão se mostrou mais suscetível a espécie C. scovillei, diferindo
significativamente dos demais hospedeiros. A espécie C. truncatum também causou maiores

42
lesões em pimentão, quando comparada com os demais hospedeiros, mas com lesões menores
que C. scovillei. As espécies C. siamense e C. tropicale não diferiram entre os hospedeiros.

Diâmetro da lesão (cm)

Figura 12 – Patogenicidade de espécies de Colletotrichum associadas a antracnose no
Nordeste do Brasil em pimentão, tomate, pimenta e jiló.
2
1,8
1,6
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0

aA

bA

aB

bA

bA

aA aBaAB

Pimentão

Tomate

C. tropicale

C.scovillei

aA

aA

aA

aA
aB

Pimenta

C.truncatum

abA
abBbB
Jiló

C.siamense

Médias seguidas pelas letras minúsculas iguais entre mesmo tipo de frutos e inoculadas
por espécie de Colletotrichum diferente não diferem entre si, e letras maiúsculas iguais
entre frutos diferentes inoculada pela mesma espécie de Colletotrichum não diferem entre
si pelo teste Tukey ao nível de 5% de probabilidade.

Estes
resultados
demostram
que umaiguais
mesma
dedeColletotrichum
é capaz de
Médias
seguidas pelas
letras minúsculas
entre espécie
mesmo tipo
frutos e inoculadas
por espécie
de Colletotrichum
diferente não
diferem
entre si, e letras
infectar diferentes
hospedeiros,
evidenciando
sua
inespecificidade
e maiúsculas
ocorrênciaiguais
generalizada
entre frutos diferentes inoculada pela mesma espécie de Colletotrichum não diferem entre

em vários hospedeiros
(FREEMAN;
SHABI, 1998; CANNON et al., 2012; LIMA et
si pelo teste Tukey
ao nível de KATAN;
5% de probabilidade.
al., 2013). Diversos trabalhos demostram a capacidade patogênica de diferentes espécies de
Colletotrichum sobre uma gama de hospedeiros. Por exemplo, a espécie C. gloeosporioides
demostrou ser patogênica às frutas de durian (Durio zibethinus L.), abacate, manga, rambutão
(Nephelium lappaceum L.), mangostão (Garcinia mangostana L.) e pini jambu (Syzygium
jambos L.) (ALAHAKOON; BROWN; SREENIVASAPRASAD, 1994). A mesma espécie,
isolada de abacate e manga, foi patogênica a morango (Fragaria vesca L.), pimentão, goiaba e
mamão (SANDERS; KORSTEN, 2003). Estudos de infecção cruzada com as espécies C.
asianum, C. cordylinicola, C. fructicola, C. siamense e C. simmondsii também foram avaliados
em pimenta, mamão, tangerina (Citrus reticulata Blanco), rose apple (Eugenia javanica Lam.),
manga e goiaba, e os autores demostraram que espécies oriundas de um determinado hospedeiro
tem preferência por seu hospedeiro original (PHOULIVONG; MCKENZIE; HYDE, 2012).
Neste trabalho, observou-se que C. scovillei, proveniente de Capsicum spp., apresentou lesões
maiores, com média de 1,8 cm, em pimentão, evidenciando a possibilidade deste ser seu
hospedeiro de origem.

43
A diferença no tamanho das lesões entre os hospedeiros pode estar associado com
interações específicas de patógeno/hospedeiro, particularidades do isolado e/ou características
próprias dos frutos inoculados (LIMA et al, 2013), como por exemplo níveis de suscetibilidade
do hospedeiro,

e

também

SREENIVASAPRASAD, 1994).

a densidade

do inoculo

(ALAHAKOON;

BROWN;

44
5 CONCLUSÃO

Espécies em pelo menos quatro complexos distintos do gênero Colletotrichum estão
associadas à antracnose em frutos de Capsicum spp. no Nordeste do Brasil;
A espécie C. scovillei (Complexo: C. acutatum) é a mais frequentemente encontrada
causando antracnose em Capsicum spp.;
Pimenta, pimentão, tomate e jiló fazem parte da gama de hospedeiros das espécies C.
scovillei, C. tropicale, C. siamense e C. truncatum.

45
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