Posicionamento Taxonômico e Efeito da Recombinação entre Isolados do Gênero Badnavirus

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE ALAGOAS
CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM
PROTEÇÃO DE PLANTAS

LUCAS JOBIM JORDÃO

POSICIONAMENTO TAXONÔMICO E EFEITO DA
RECOMBINAÇÃO ENTRE ISOLADOS DO GÊNERO
BADNAVIRUS

Rio Largo - AL
2015

LUCAS JOBIM JORDÃO

POSICIONAMENTO TAXONÔMICO E EFEITO DA
RECOMBINAÇÃO ENTRE ISOLADOS DO GÊNERO BADNAVIRUS

Dissertação de Mestrado apresentada ao
Programa de Pós-Graduação em Proteção de
Plantas do Centro de Ciências Agrárias da
Universidade Federal de Alagoas como
requisito parcial para obtenção do grau de
Mestre em Proteção de Plantas.
Orientador: Prof. Dr. Gaus S. A. Lima
Coorientador: Dr. Roberto Ramos Sobrinho

Rio Largo - AL
2015

LUCAS JOBIM JORDÃO

POSICIONAMENTO TAXONÔMICO E EFEITO DA
RECOMBINAÇÃO ENTRE ISOLADOS DO GÊNERO BADNAVIRUS
Dissertação apresentada ao Curso de Mestrado
em Proteção de Plantas, do Centro de Ciências
Agrárias da Universidade Federal de Alagoas.
Aprovada pela seguinte Banca Examinadora:

Prof. Dr. Gaus Silvestre de Andrade Lima

Banca Examinadora:

Prof. Dra. Iraildes Pereira Assunção – Universidade Federal de Alagoas (Examinador)

Prof. Dra. Sarah Jaqueline Cavalcanti da Silva – Universidade Federal de Alagoas
(Examinador)

Rio Largo - AL
2015

AGRADECIMENTOS

A Deus, acima de tudo, por sempre me guiar em todos os momentos da minha trajetória e
por dar-me coragem para enfrentar todos os desafios;
Aos meus queridos pais, Luiz Carlos Jordão e Simone Jobim, pelo amor, incentivo e apoio
em todas as horas;
A minhas irmãs Larissa, Lívia e Marina por sempre estarem ao meu lado;
A todos familiares e amigos que contribuíram para meu crescimento;
Aos professores Drs. Gaus Silvestre de Andrade e Iraildes Pereira Assunção pela
oportunidade, confiança, orientação, ensinamentos que foram fundamentais para minha
formação. Serei sempre grato;
Aos Drs. Roberto Ramos e Leonardo Barbosa pela amizade, pelos ensinamentos,
orientação e apoio durante minha trajetória no mestrado.
Aos meus amigos Mayra Machado, Aline Marques, Nayana Bruschi e Janaíne Rossane
pelo companheirismo no dia-a-dia, pelos momentos de alegria, aprendizado e por tornarem
tudo mais prazeroso;
A todos do Laboratório de Fitopatologia Molecular e Virologia Vegetal: Sarah, Jaqueline
Figueredo, Joseane, Antônio, Maria Jussara, Fred, Renato Nascimento, Ana, Tamires,
Laura, Jackeline Laurentino, Gilberlan, Jecylene Tomé, Daniel, pela amizade, ajuda mútua
e ensinamentos durante todo esse período;
A todos os professores do Programa de Pós-graduação em Proteção de Plantas CECAUFAL pelos conhecimentos passados, que contribuíram para a minha formação;
A todos os meus colegas do Programa de Pós-graduação em Proteção de Plantas do
CECA-UFAL;
A CAPES pela bolsa de mestrado concedida, o que me permitiu adquirir inúmeros
conhecimentos incluindo os fundamentais para a realização desse trabalho;
A todos aqueles que de alguma forma contribuíram para realização deste trabalho.

Obrigado!

RESUMO

Vírus pertencentes à família Caulimoviridae apresentam morfologia isométrica ou
baciliforme e são divididos em oito gêneros, com o gênero Badnavirus sendo o mais
importante devido ao grande número de espécies descritas infectando espécies cultivadas
em todo o mundo. O presente trabalho teve como objetivo determinar o efeito da mutação
e recombinação na evolução genômica de espécies de badnavírus. Inicialmente, um
conjunto de dados de sequências completas de isolados de badnavírus foi obtido a partir do
banco de dados não-redundantes GenBank. Alinhamentos múltiplos de sequências
nucleotídicas foram preparados para os conjuntos de dados genoma completo, RT/RNaseH
completa (1020pb), RT/RNaseH parcial (579pb), e ORFs I, II e III. Comparações pareadas,
e análises filogenéticas e de recombinação foram realizadas para todos os conjuntos de
dados individualmente. Um total de 71 isolados foi obtido, representando 32 espécies
distintas. Análise de comparações pareadas de nucleotídeos para os conjuntos de dados
RT/RNaseH e ORF III mostrou que alguns isolados considerados como espécies distintas
compartilharam até 82% de identidade nucleotídica, ultrapassando o limiar de ≥80% para
demarcação de espécies de badnavírus. Árvores filogenéticas Bayesianas mostraram a
formação de quatro grupos bem sustentados, com os Badnavirus Groups 1 e 3 formando
caldos irmãos contendo predominantemente isolados infectando cana-de-açúcar e banana.
Análise reticulada evidenciou um complexo padrão de recombinação, e pelo menos 13
eventos foram detectados com breakpoints de recombinação ocorrendo
predominantemente na ORF III e região intergênica. Estes resultados mostram que
mutação e recombinação são importante mecanismos evolutivos atuando na diversificação
de espécies de badnavírus, e que a região RT/RNaseH parcial é suficiente para determinar
o posicionamento taxonômico da maioria das espécies descritas dentro do gênero.

Palavras-chave: Caulimoviridae. mecanismos evolutivos. Filogenia. variabilidade
genética.

ABSTRACT

Viruses belonging to the family Caulimoviridae have isometric or bacilliform particles and
are divided into eight genera, with the genus Badnavirus being the most important due the
high number of species reported infecting cultivated plants worldwide. The present study
aimed to determine the effect of mutation and recombination in the genomic evolution of
badnavirus species. Firstly, a data set comprising badnavirus full-length genome sequences
was obtained from the non-redundant database GenBank. Multiple nucleotide sequence
alignments were prepared for the data sets complete genome, complete RT/RNaseH (1020
pb), partial RT/RNaseH (579 pb), and ORFs I, II and III. Pairwise comparisons, and
phylogenetic and recombination analyses were performed for all data sets individually. A
total of 71 isolates were obtained, representing 32 badnavirus species. Nucleotide pairwise
comparisons for the data sets RT/RNaseH and ORF III showed that some distinct
badnavirus species shared up to 82% of nucleotide identity, being higher than the ≥80%
threshold for badnavirus species demarcation. Bayesian phylogenetic trees showed four
well supported clusters, with the Badnavirus Groups 1 and 3 being sister clades comprising
predominantly isolates infecting sugarcane and banana. Network analysis evidenced a
complex pattern of recombination, and at least 13 events were detected with recombination
breakpoints occurring predominantly in the ORF III and Intergenic Region. These results
showed that mutation and recombination are important evolutionary mechanisms acting on
diversification of badnavirus species, and that the partial RT/RNaseH is sufficient to
determine the taxonomic placement of most viral species described into this genus.

Key words: Caulimoviridae. evolutionary mechanisms. Phylogeny. genetic variability.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 - Representação esquemática do genoma do Commelina yellow mottle virus
(CoYMV), espécie tipo do gênero Badnavirus ..................................................................................... 16
Figura 2 - Matriz bidimensional representando a porcentagem de identidade de
comparações pareadas de sequências nucleotídicas da região completa dos domínios
RT/RNaseH (579 pb) de isolados de Badnavirus disponíveis no GenBank.................................. 36
Figura 3 - Matriz bidimensional representando a porcentagem de identidade de
comparações pareadas de sequências nucleotídicas da região parcial dos domínios
RT/RNaseH (1020 pb) de isolados de Badnavirus disponíveis no GenBank ............................... 37
Figura 4 - Análise filogenética de inferência Bayesiana baseada no conjunto de dados da
região completa dos dominínios RT/RNaseH de isolados de Badnavirus disponíveis no
GenBank ........................................................................................................................................................... 38
Figura 5 - Análise filogenética de inferência Bayesiana baseada no conjunto de dados da
região parcial dos domínios de RT/RNaseH de isolados de Badnavirus disponíveis no
GenBank ........................................................................................................................................................... 39
Figura 6 - Análise filogenética de inferência Bayesiana baseada no conjunto de dados do
genoma completo de isolados de Badnavirus disponíveis no GenBank ........................................ 40
Figura 7 - Análise filogenética de inferência Bayesiana baseada no conjunto de dados da
ORF III de isolados de Badnavirus disponíveis no GenBank. .......................................................... 41
Figura 8 - Análise filogenética de inferência Bayesiana baseada no conjunto de dados da
ORF I de isolados de Badnavirus disponíveis no GenBank ............................................................. 42
Figura 9 - Análise filogenética de inferência Bayesiana baseada no conjunto de dados da
ORF II de isolados de Badnavirus disponíveis no GenBank ............................................................ 43
Figura 10 - Análise reticulada baseada no conjunto de dados do genoma completo dos
isolados de Badnavirus ................................................................................................................................ 44
Figura 11 - Análise reticulada baseada no conjunto de dados da ORF 3 dos isolados de
Badnavirus ........................................................................................................................................................ 45
Figura 12 - Análise reticulada baseada no conjunto de dados da ORF 1 dos isolados de
Badnavirus........................................................................................................................................................ 46
Figura 13 - Análise reticulada baseada no conjunto de dados da ORF 2 dos isolados de
Badnavirus ........................................................................................................................................................ 47

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Sequências de badnavirus obtidas a partir do banco de dados não-redundantes
GenBank. ........................................................................................................................................................... 33
Tabela 2 - Eventos de recombinação detectados entre membros do gênero Badnavirus. ......... 35

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ........................................................................................................................................ 11
2 REVISÃO DA LITERATURA .......................................................................................................... 13
2.1 Família Caulimoviridae ......................................................................................................................... 13
2.2 Gênero Badnavirus ................................................................................................................................ 14
2.3 Sequências endógenas.... ....................................................................................................................... 17
2.4 Culturas de grande importância econômica infectadas por Badnavirus.................................. 18
2.5 Variabilidade e estrutura genética de populações de Badnavirus ............................................. 20
2.5.1 Mutação. ................................................................................................................................................. 21
2.5.2 Recombinação. ...................................................................................................................................... 22
3 MATERIAL E MÉTODOS. ................................................................................................................. 23
3.1 Conjunto de dados. .................................................................................................................................. 23
3.2 Alinhamento e comparação de sequências....................................................................................... 23
3.3 Análises de recombinação ..................................................................................................................... 23
3.4 Análise filogenética. ............................................................................................................................... 24
4 RESULTADOS .......................................................................................................................................... 25
4.1 Conjunto de dados. .................................................................................................................................. 25
4.2 Demarcação de espécies. ....................................................................................................................... 25
4.3 Relacionamento Filogenético............................................................................................................... 26
4.4 Eventos de Recombinação .................................................................................................................... 27
5 DISCUSSÃO ............................................................................................................................................... 28
6 CONCLUSÕES ......................................................................................................................................... 32
7 REFERÊNCIAS ........................................................................................................................................ 48

1 INTRODUÇÃO

A família Caulimoviridae engloba vírus que apresentam morfologia isométrica ou
baciliforme, possuindo tamanho de aproximadamente 35-50nm de diâmetro e 900nm de
comprimento para os de formato baciliforme, e 45-50nm de diâmetro para os vírus com
formato isométrico (GEERING; HULL, 2012).

Vírus dentro dessa família são

caracterizados por possuírem genoma composto por DNA semicircular de fita dupla
medindo cerca de 7,2-9,2kb (FAUQUET et al., 2005; GEERING; HULL, 2012). A família
Caulimoviridae é dividida em oito gêneros (Badnavirus, Caulimovirus, Cavemovirus,
Petuvirus, Rosadnavirus, Solendovirus, Soymovirus e Tungrovirus) de acordo com gama
de hospedeiro, inseto vetor, filogenia e organização genômica (GEERING; HULL, 2012).
O gênero Badnavirus é considerado o segundo em importância dentro das famílias de
fitovírus com genoma de DNA, com diversas espécies sendo relatadas infectando culturas
de grande importância econômica, como: cana-de-açúcar (Saccharum spp.), banana (Musa
spp.), cacau (Theobroma cacao L.), pimenta (Capsicum spp.), inhame (Dioscorea spp.),
citros (citrus spp.) (SILVA et. al, 2015; JAMES et. al, 2011a; KOUAKOU et. al, 2012;
DEESHMA; BHAT, 2015; ENI et. al, 2008; JOHNSON et. al, 2012). Além dessa alta
diversidade de espécies, populações de badnavírus também apresentam altos índices de
variabilidade genética (MULLER et al. 2011; HARPER et al., 2005; GEERING et al.,
2000; JOHNSON et. al, 2012; GUIMARÃES et al., 2015; SILVA et al., 2015).
O genoma dos badnavírus é composto por uma única molécula de dsDNA de 7,27,6kb, a qual forma um semicírculo interrompido por descontinuidades sítio-específicas
que podem conter uma região intergênica poli A, e possuindo, em geral, três ORFs (Open
Reading Frames) conhecidas como ORFs I, II e III (BOUHIDA; LOCKHART;
OLSZEWSKI, 1993; HAGEN et al., 1993; HARPER; HULL, 1998). Até o presente
momento, nenhuma função foi atribuída às ORFs I e II, porém a ORF3 codifica para uma
poliproteína de 208 a 216 kDa que é proteoliticamente clivada, gerando as proteínas de
movimento, do capsídeo viral, a aspartato protease (AP) (responsável pela clivagem da
poliproteína), a transcriptase reversa (RT) e a ribonuclease H (domínios genômicos
envolvidos no processo de replicação viral) (HARPER; HULL, 1998; LACO; BEACHY,
1994; MEDBERRY; LOCKHART; OLSZEWSKI, 1990).
A identificação de espécies de badnavírus é realizada através da comparação de
sequências nucleotídicas dos domínios RT/RNaseH, com ≥80% de identidade sendo o

critério estabelecido para demarcação de espécies (GEERING; HULL, 2012). A
amplificação dessa região genômica viral é geralmente realizada por meio da técnica de
PCR (Polymerase Chain Reaction) utilizando-se oligonucleotídeos específicos (YANG et
al., 2003). Entretanto, esta técnica torna-se limitada durante processo diagnóstico, dado o
fato de não ser capaz de distinguir entre sequências de badnavírus integradas ao genoma da
planta hospedeira e cópias epissomais dos genomas virais (BOUSALEM; DOUZERY;
SEAL, 2009) e, também devido à grande diversidade e variabilidade genética entre
membro desse grupo de vírus (MULLER et al., 2011; NDOWORA et al., 1999). Na
tentativa de contornar tais dificuldades, métodos baseados na amplificação por círculo
rolante (RCA) têm sido utilizados, sendo considerado um método confiável por amplificar
apenas DNA circular e, portanto, evitando falso-positivos a partir de sequências virais
endógenas (JAMES et. al, 2011a, 2011b).
O presente trabalho teve como objetivo determinar os efeitos da mutação e
recombinação na evolução das espécies virais pertencentes ao gênero Badnavirus.

2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Família Caulimoviridae

A família Caulimoviridae engloba vírus encapsidados em partículas não
envelopadas, e podem ser de morfologia isométrica ou baciliforme. Possuem
aproximadamente 35-50 nm de diâmetro e 900nm de comprimento (formato baciliforme)
ou 45-50 nm de diâmetro e simetria icosaédrica (formato isométrico). O genoma dos
Caulimoviridae é constituído por uma molécula de DNA semicircular de fita dupla com
cerca de 7,2-9,2kb (FAUQUET et al., 2005; GEERING; HULL, 2012), uma região
intergênica poli (A) presente em alguns membros da família, e descontinuidades de fita
simples ou gaps em sítios específicos de ambas as fitas (HARPER et al., 2002).
Os hospedeiros naturais de espécies da família Caulimoviridae são angiospermas
das classes Dicotyledonae e Monocotyledonae. Dependendo do gênero, a transmissão
natural do vírus pode ocorrer via inseto vetor (insetos das famílias Aleyrodidae, Aphididae,
Cicadellidae e Pseudococcidae: ordem Hemiptera) ou por contato entre plantas
hospedeiras, bem como por sementes ou grão de pólen. A transmissão pode ser também
realizada via inoculação mecânica e enxertia (FAUQUET et al., 2005). Os sintomas
característicos na planta associados aos Caulimoviridae podem variar de acordo com o
hospedeiro, a espécie viral envolvida, e condições climáticas, sendo os mais comumente
observados: clareamento de nervuras, estrias, mosaico, manchas necróticas, linhas e
manchas cloróticas, nanismo, enrolamento e má formação foliar e enrolamento de folíolos
(GEERING; HULL, 2012).
Segundo o Comitê Internacional de Taxonomia de Vírus (ICTV), a família
Caulimoviridae é dividida em oito gêneros (Badnavirus, Caulimovirus, Cavemovirus,
Petuvirus, Rosadnavirus, Solendovirus, Soymovirus e Tungrovirus) de acordo com gama
de hospedeiro, inseto vetor, organização genômica e filogenia. O gênero Badnavirus é o
que possui o maior número de espécies reconhecidas (FAUQUET et al., 2005).
Recentemente, foi sugerido o reconhecimento de pelo menos mais duas novas espécies de
badnavírus infectando cacau: Cacao swollen shoot Togo A virus (AJ781003) e Cacao
swollen shoot Côte d’Ivore D virus (JN606110) (KOUAKOU et. al, 2012).
A replicação dos membros da família Caulimoviridae é similar a dos retrovírus,
com produção de um RNA intermediário de fita simples (ssRNA) através de transcrição
reversa, formado para gerar dsDNA (DNA fita dupla) no citoplasma. O tipo de replicação é

citoplasmática/nuclear, ou seja, o vírion chega à célula, sendo desencapsidado pela ação de
proteinases celulares e libera o dsDNA genômico que é transportado para o núcleo onde as
descontinuidades do DNA são reparadas e “mini-cromossomos” são formados. Tal DNA é
transcrito pela RNA polymerase II do hospedeiro (DE KOCHKO et al.,1998). O RNA
transcrito é traduzido, resultando nos produtos proteicos relacionados aos genes virais
existentes (FÜTTERER et al., 1997; POOGGIN et al., 1999). O RNA pré-genômico é
retrotranscrito pela transcriptase reversa no citoplasma produzindo novos dsDNA
genômicos (MEDBERRY et al., 1990). Os dsDNA genômicos são encapsidados,
produzindo assim novos vírions. O genoma desses vírus também contêm uma sequência
complementar ao tRNAMet da planta que corresponde ao sítio de iniciação da replicação
do DNA. Geralmente, este sítio está localizado dentro ou adjacente à região intergênica
(região não-codificante) e é designado como nucleotídeo um (DE KOCHKO et al.,1998).
Outra característica importante dos vírus da família Caulimoviridae é sua capacidade de
integração dentro do genoma do hospedeiro para replicação, apesar de não codificarem
para uma proteína integrase. Dado essas características, Temin (1985) sugeriu a
classificação dos membros desta família como "pararetrovírus", termo introduzido para
definir vírus de plantas que diferem dos retrovírus por possuírem genoma de DNA e
capacidade de integração ao genoma do hospedeiro.

2.2 Gênero Badnavirus

O gênero Badnavirus é o que apresenta maior diversidade de espécies dentro da
família Caulimoviridae, com 32 espécies oficialmente reconhecidas pelo ICTV, é o
segundo maior gênero de vírus de plantas com genoma de DNA (BOUHIDA et al., 1993;
HAGEN et al., 1993). Badnavírus apresentam formato baciliforme com 95-130 nm de
comprimento e 24-35 nm de largura (FAUQUET et al., 2005). O genoma dos badnavírus
contêm uma única molécula de dsDNA semicircular com cerca de 7,2-7,6 kb, apresentam
descontinuidades sítio-específicas e podem conter uma região intergênica poli A
(MEDBERRY et al., 1990).
O genoma da maioria dos badnavírus codifica para três ORFs (Figura 1A), porém
algumas espécies podem possuir maior número de ORFs, como: Taro baciliform virus
(TaBV) com quatro ORFs; Cacao swollen shoot virus (CSSV) com cinco; e Citrus yellow
mosaic virus (CYMV) com seis ORFs presentes no seu genoma (HAGEN, 1993; YANG,

2003). Contudo, todos os badnavírus contêm as três ORFs principais (ORFs I, II e III)
(BOUHIDA et al., 1993; HAGEN et al., 1993; HARPER; HULL, 1998).
As funções dos produtos das ORFs I e II permanecem desconhecidas. Entretanto, a
proteína P1 de 20,8 a 23kDa codificada pela ORF I em Comellina yellow motle virus
(CoYMV) foi descrita em associação com vírions imaturos, enquanto a proteína P2 de 14,5
a 15kDa codificada pela ORF II foi encontrada associada com ambos os vírions imaturos e
maduros (CHENG et al., 1996). A ORF III, codifica para uma poliproteína de 208 a
216kDa que é proteoliticamente clivada e gera, dentre outros produtos, as proteína de
movimento e do capsídeo viral, a aspartato protease (AP; responsável pela clivagem da
poliproteína), a transcriptase reversa (RT) e a ribonuclease H (conhecidos como domínios
genômicos envolvidos no processo de replicação viral) (Figura 1B) (MEDBERRY et al.,
1990; TZAFRIR et al., 1997; HARPER e HULL, 1998). Atualmente, a identificação de
espécies de badnavírus é baseada na gama de hospedeiros, tipo de inseto vetor, e
principalmente no critério de ≥80% de identidade de sequências nucleotídicas da região
RT/RNaseH (GEERING; HULL, 2012).

Figura 1. (A) Representação esquemática da organização genômica de Commelina yellow
mottle virus (CoYMV) espécie-tipo do gênero Badnavirus. O círculo completo representa
o genoma de DNA de fita dupla. As setas largas indicam a posição das ORFs I, II e III. (B)
Representação linear do mapa genômico de badnavírus mostrando a identificação dos
domínios: domínios de movimento (M), motivo de ligação ao RNA (BR), região
conservada de cisteína (CYS), aspartato protease (PR), transcriptase reversa (RT) e
ribonuclease H (RH) (BRIDDON et al., 1999).

A detecção de badnavírus tem sido realizada através de métodos como microscopia
eletrônica de transmissão e de imuno-adsorção, testes sorológicos, e testes baseados na
detecção de DNA (VEGA e SORDI, 1991; DELANOY et al., 2003; RIVAS et al., 2005;
2006; FIGUEIREDO et al., 2006; ANDRADE, 2007; VERZIGNASSI et al., 2009;
ALEXANDRE et al., 2010; BRIOSO et al., 2011; JAMES et al., 2011; PENG et al., 2012).
Testes sorológicos como ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) podem ser
vantajosos devido aos baixos custos, relativa eficiência e rapidez. Porém, apresentam
desvantagens na detecção de espécies apresentando alta variabilidade genética, sendo
comum obtenção de resultados falso-negativos (FIGUEIREDO; BRIOSO, 2007).
A técnica de PCR (Polymerase Chain Reaction) é também bastante utilizada na
detecção e identificação de espécies do gênero Badnavirus, possuindo também limitações
por não ser capaz de distinguir entre sequências virais integradas ao genoma do hospedeiro
e cópias epissomais dos vírus na planta (BOUSALEM et al., 2009). Dada a grande
diversidade e variabilidade genética dos badnavírus, testes de PCR são utilizados para

detecção de regiões genômicas conservadas presentes na ORF III (MEDBERRY;
LOCKHART; OLSZEWSKI, 1990), mais especificamente os domínios tRNAMet, e
RT/RNaseH (LOCKHART; OLSZEWSKI, 1993; GEERING et al., 2000). Na tentativa de
distinguir entre sequências virais endógenas e epissomais, foi desenvolvida técnica de
PCR-Imunocaptura, que inicialmente se utiliza um antissoro específico para depois obter a
amplificação da partícula viral via PCR. (Harper et al., 1999). Entretanto, foi observado
que, apesar da alta eficiência na detecção de diversas espécies, esta técnica não era capaz
de distinguir entre sequências integradas e epissomais de espécies de Banana streak viruses
(BSVs), dada a alta variabilidade genética presente neste complexo. (FIGUEIREDO et al.,
2006; GEERING et al., 2000, 2005b; HARPER et al., 2005; HARPER; HULL, 1998).
Um método amplamente utilizado, e que apresenta alta eficiência na distinção entre
sequências de badnavírus endógenas e epissomais, é a amplificação do genoma completo
por círculo rolante (RCA), evitando assim a detecção de vírus endógenos ou Endogenous
Pararetroviruses (EPRVs) integrados ao genoma do hospedeiro, mesmo para aquelas
espécies apresentando alta variabilidade genética como no caso de BSVs (JAMES et al.,
2011a, 2011b).

2.3 Sequências endógenas
Sequências genômicas de alguns pararetrovírus vegetais pertencentes ao gênero
Badnavirus como Banana streak OL virus (BSOLV), Banana streak GF virus (BSGFV),
Petunia vein clearing virus (PVCV), Tobacco vein clearing virus (TVCV), Pineapple
baciliform comosus virus (PBCV) e Dioscorea baciliform virus (DBV) têm sido
comumente observadas como sequências endógenas integradas ao genoma do hospedeiro
(NDOWORA et al., 1999; GAYRAL; ISKRA-CARUANA, 2009; STAGINNUS;
RICHERT-PÖGGELER, 2006; HERNANDEZ-RODRIGUEZ et al, 2013; SEAL, 2014).
Estas formas virais endógenas muitas vezes exercem papel epidemiológico importante, já
que podem dar origem a vírus epissomais e, consequentemente, iniciar processo de
infecção viral. Condições de estresse como culturas de tecidos podem favorecer a liberação
de sequências virais endógenas (DAHAL et al., 2000; DALLOT et al., 2001).
Dentre as principais culturas que apresentam alta frequência de integração de
sequências de badnavírus pode-se citar a cultura da banana (Musa spp.), onde são
comumente encontrado dois tipos de sequências integradas: formas virais incompletas,

onde não é observada infecção viral; e formas virais completas, onde, sob condições de
estresse, sequências virais endógenas são liberadas com consequente infecção do
hospedeiro (GAYRAL et al., 2008; JAMES et al., 2011). Recentemente, pelo menos três
sequências de badnavírus integradas ao genoma da banana foram caracterizadas
molecularmente: endogenous Banana streak OL virus (eBSOLV), endogenous Banana
streak GF virus (eBSGFV) e endogenous Banana streak IM virus (eBSIMV), confirmando
assim a alta diversidade destas sequências presentes no genoma do hospedeiro, o que
dificulta diagnóstico preciso para espécies de BSVs(CHABANNES, 2013). Além da
banana, culturas como abacaxi e inhame têm sido relatadas para conter sequências
endógenas de badnavírus (SEAL, 2014; GAMBLEY et al., 2008).

2.4 Culturas de importância econômica infectadas por badnavírus

Badnavírus têm sido descritos infectando culturas de grande importância econômica
em todo o mundo, como: inhame (Dioscorea spp.), abacaxi (Ananas comosus), cana-deaçúcar (Saccharum spp.), banana (Musa spp.), citros (citrus spp.), cacau (Theobroma
cacao L.) e pimenta (Capsicum spp.) (SILVA et. al, 2015; JAMES et. al, 2011a;
KOUAKOU et. al, 2012; DEESHMA; BHAT, 2015; ENI et. al, 2008; JOHNSON et. al,
2012). Em alguns casos, esta infecção pode interferir diretamente na produtividade da
cultura, causando perdas significativas em qualidade e rendimento. Estas perdas podem
variar em função da espécie botânica, cultivar/variedade, idade e época de infecção na
planta, percentual de plantas infectadas, virulência da estirpe/espécie viral, e da interação
com outros grupos de vírus em uma mesma planta (AHLAWAT et al., 1996; COMSTOCK
& LOCKHART, 1996; BHAT et al., 2003; GEIJSKES, 2003; BARANWAL et al., 2005;
GEERING, 2009; BESSE et al., 2010).
Em 1999, foi caracterizado o primeiro badnavírus (DBALV) infectando D. alata na
Nigéria (PHILLIPS, 1999). Em seguida, foi descoberto um novo badnavírus infectando D.
sansibarensis em ilhas do Sul do Pacífico, o Dioscorea bacilliform SN virus (DBSNV)
(GEERING; HULL, 2012). Entretanto, estudos recentes realizados na África e Sul do
Pacífico sugerem alta diversidade de espécies de badnavírus em inhame, com possível
presença de até doze espécies distintas (ENI et al. 2008). A cultura do inhame desempenha
grande importância na alimentação em regiões da África, onde são observados altos índices
de produtividade (MAFRA, 1996). No Brasil, a região Nordeste destaca-se como principal

produtora, onde serve como fonte de alimento e auxilia na geração de emprego e renda
(PEDRALLI, 2002). Dentre os vários problemas fitossanitários afetando esta cultura
destacam-se as fitoviroses causadas por espécies de badnavírus (SEAL; MULLER, 2007;
PHILLIPS et al., 1999). No Brasil, a espécie mais amplamente distribuída nos campos de
cultivo de inhame é o Dioscorea bacilliform AL virus (DBALV) (GUIMARÃES et al.,
2015). Este vírus pode induzir distorção foliar severa, sendo comumente encontrado em
infecções mistas com vírus do gênero Potyvirus (PIO-RIBEIRO et al., 2005; YANG et al.,
2003).
Pelo menos duas espécies de badnavírus são reconhecidas infectando a cultura do
abacaxi: Pineapple bacilliform CO virus (PBCoV) e Pineapple bacilliform ER virus
(PBErV). Ambos são transmitidos pela cochonilha Dysmicoccus brevipes e, no caso do
PBCoV, também pelas cochonilhas Planococcus citri e D. neobrevipes (GAMBLEY et al.,
2008b; SETHER et al., 2012). Entretanto, uma associação clara entre sintomas e infecção
por badnavírus em abacaxi ainda não foi demonstrada (GAMBLEY et al., 2008b).
Na cultura da cana-de-açúcar, são reconhecidas pelo ICTV duas espécies de
badnavirus: Sugarcane bacilliform IM virus (SCBIMV) e Sugarcane bacilliform MO virus
(SCBMOV), sendo comumente observados sintomas de manchas e estrias cloróticas e
nanismo (VISWANATHAN et al., 1996). Diversas espécies e híbridos comerciais de canade-açúcar (S. barberi, S.officinarum, S. robustum, S. spontaneum e S. sinense) já foram
relatados sendo infectados por diferentes espécies de badnavírus (VISWANATHAN et al.,
1996; SILVA et al., 2015). Trabalho realizado na Índia mostrou que pelo menos três novas
espécies de badnavírus estão associadas à cultura da cana-de-açúcar: Sugarcane
Bacilliform BB Virus (SCBBBV), Sugarcane Bacilliform BO Virus (SCBBOV) e
Sugarcane Bacilliform Black Reunion Virus (SCBBRV) (KARUPPAIAH et al., 2013).
Recentemente, foi demonstrada uma alta diversidade de espécies de badnavírus infectando
diferentes espécies/híbridos de cana-de-açúcar em um banco de germoplasma no Brasil,
com relato de uma possível espécie nova: Sugarcane bacilliform AL virus (SCBALV)
(SILVA et al., 2015).
Diversas espécies de badnavirus já foram relatadas na cultura da bananeira (Musa
spp.) causando uma doença conhecida como estria clorótica, as quais são consideradas um
complexo de espécies denominado BSVs (LHEUREUX et al., 2007; JAMES et al., 2011b).
As perdas causadas por este complexo de badnavírus podem variar de 6 a 90 % (DAHAL
et al., 2000; DANIELLS et al., 2001), levando a grandes prejuízos aos produtores, além do

uso indiscriminado de agrotóxicos que possuem elevados custos econômicos e ambientais.
Pelo menos dez diferentes badnavírus já foram relatadas compondo esse complexo de
espécies em banana em todo o mundo: Banana streak OL virus (BSOLV), Banana streak
GF virus (BSGFV), Banana streak MY virus (BSMyV), Banana streak VN virus
(BSVNV), Banana streak IM virus (BSIMV), Banana streak UA virus (BSUAV), Banana
streak UI virus (BSUIV), Banana streak UL virus (BSULV), Banana streak UM virus
(BSUMV) e Banana streak CA virus (BSCAV) (HARPER; HULL, 1998; LHEUREUX et
al., 2007; JAMES et al., 2011; GEERING; HULL, 2012).
Citrus yellow mosaic virus (CYMV) foi inicialmente relatado em laranja doce e,
posteriormente, em outras espécies cítricas (DAKSHINAMURTI; REDDY, 1975). Este
badnavírus emergiu no sul da Índia causando a doença do mosaico do citros, podendo ser
transmitida através de enxertia (AHLAWAT et al., 1996). Recentemente, CYMV foi
relatado em diferentes cultivares de citros: Sweet Orange, Pumello, Acid Lime, Sweet
Orange SOP, Sweet Orange Nagri, Acid Lime AP e Rangpur Lime, o qual se apresentou
filogeneticamente próximo do Cacao swollen shoot virus (CSSV) (JOHNSON et al.,
2012).
Espécies do gênero Badnavirus têm causado grandes prejuízos para a cultura do
cacau (Theobroma cacao) na África ocidental (KEBE et al., 2006; KOUAKOU et. al,
2012). No Brasil, é considerada praga quarentenária ausente. A doença é causada por pelo
menos três espécies distintas de badnavírus: Cacao swollen shoot virus (CSSV), Cacao
swollen shoot Togo virus (CSSToV) e Cacao swollen shoot Côte d’Ivore D virus
(CSSCIV), indicando a existência de uma alta variabilidade entre isolados de CSSV
ocorrendo nos principais países produtores de cacau (KEBE et al., 2006; KOUAKOU et.
al, 2012). Na Costa de Marfim, maior produtor de cacau do mundo, a sustentabilidade da
produção foi comprometida desde o aparecimento desta doença. Os sintomas da infecção
podem ser observados em diversos órgãos da árvore (folhas, galhos, brotos), podendo
afetar a produtividade e até mesmo causar morte da planta (CASTEL et al., 1980;
HOFFMANN et. al, 1997).

2.5 Variabilidade e estrutura genética de populações de fitovírus

A estrutura genética de populações de fitopatógenos refere-se à quantidade de
variabilidade genética existente e de sua distribuição dentro e entre populações

(MILGROOM, 1995). O estudo da dinâmica da variabilidade genética de populações de
fitopatógenos é necessário para conhecer como as populações evoluem (MCDONALD;
ZHAN; BURDON, 1999). Uma vez compreendidas as maneiras como populações de
fitopatógenos mantêm a variabilidade genética, é possível inferir sobre a taxa com a qual
estas populações evoluem (MCDONALD; LINDE, 2002a). Programas de melhoramento
visando resistência a patógenos podem ser orientados pelos conhecimentos da estrutura
genética de populações. McDonald e Linde (2002b) propuseram um modelo para auxiliar
na definição de estratégias de melhoramento visando aumentar a durabilidade da
resistência, que se baseia no potencial evolutivo de populações de fitopatógenos. Por sua
vez, o potencial evolutivo é determinado com base na estrutura genética das populações.
Em síntese, o modelo considera a quantidade e a distribuição da variabilidade genética na
população.
Em populações de fitovírus, o alto grau de diversidade e variabilidade genética é
gerado, principalmente, por erros durante o processo de replicação do genoma viral
(mutações), e rearranjos gênicos provocados por eventos de recombinação (GARCIAARENAL; FRAILE; MALPICA, 2003).

2.5.1 Mutação

A mutação é o processo pelo qual nucleotídeos que não estão presentes na fita
molde são incorporados na fita filha durante a replicação dos ácidos nucléicos, com a taxa
de mutação medindo o aparecimento de mutações espontâneas em função do tempo
(GARCIA-ARENAL; FRAILE; MALPICA, 2003). É conhecido que taxas de mutações
para vírus com genomas de RNA e DNA de fita simples (ssDNA) são extremamente
elevadas (DUFFY; SHACKELTON; HOLMES, 2008). As altas taxas de mutação
observadas para vírus de RNA (10-4 a 10-2 subs/sítio/ano) são explicadas pelo fato de esses
vírus serem replicados por polimerases de RNA dependentes de RNA que não possuem
capacidade de correção de erro (DRAKE; HOLLAND, 1999; JENKINS et al., 2002).
Entretanto, apesar de serem replicados por polimerases de DNA dependentes de DNA que
possuem capacidade de correção de erro, vírus de ssDNA evoluem tão rapidamente quanto
os vírus de RNA (SHACKELTON et al., 2006; DUFFY; SHACKELTON; HOLMES,
2008; DUFFY; HOLMES, 2009). Isso pode ser explicado por duas hipóteses principais:
primeiro, o tempo de duração do intermediário de fita dupla formado durante processo de

replicação de vírus de ssDNA não é suficientemente longo para que haja correção de erros;
e segundo, que mutações espontâneas poderiam ocorrer na fita de DNA durante a fase de
ssDNA viral (DUFFY; SHACKELTON; HOLMES, 2008; DUFFY; HOLMES, 2009).
Estudos com bactérias e sistemas animais indicaram que a taxa de mutação dos
vírus de dsDNA e ssDNA diferem significativamente, com vírus de ssDNA evoluindo
muito mais rapidamente (DUFFY; SHAKELTON; HOLMES, 2008). Infelizmente,
informações sobre taxas de mutação para vírus de dsDNA que infectam plantas são
escassas, sendo relatada apenas para o Cauliflower mosaic virus (CaMV), o qual
apresentou taxas em torno de 10-5 subs/sítio/ano (FROISSART et al., 2005). Segundo Firth
et al. (2010), os vírus dsDNA são frequentemente descritos evoluindo através de
associações com seus hospedeiros, onde se espera um padrão de baixas taxas de
substituição de nucleotídeos.

2.5.2 Recombinação

Recombinação é o processo pelo qual segmentos de uma fita de DNA ou RNA
tornam-se incorporados na fita de um indivíduo diferente durante o mecanismo de
replicação (PADIDAM; BEACHY; FAUQUET; 1999). Eventos de recombinação têm sido
demonstrados estar associados com vírus aumentando sua gama de hospedeiros (GIBBS;
WEILLER, 1999), virulência (PITA et al., 2001; ZHOU et al., 1997) e potencial evolutivo
e adaptação local (MONCI et al., 2002).
Recombinação é um evento bastante comum em fitovírus com genoma de ssDNA
como os geminivírus (LEFEUVRE et al., 2007; PADIDAM; BEACHY; FAUQUET,
1999), estando diretamente relacionada com os altos índices de variabilidade genética
observados em populações de begomovírus (LIMA et al., 2013; ROCHA et al., 2013;
RAMOS-SOBRINHO et al., 2014). A elevada frequência de recombinação nesse grupo de
vírus pode ser, em parte, explicada pela ocorrência frequente de infecções mistas
(DAVINO et al., 2009; GARCÍA-ANDRES et al., 2006; PITA et al., 2001; RIBEIRO et
al., 2003; SANZ et al., 2000; TORRES-PACHECO et al., 1996), com evidência de
infecção do mesmo núcleo da célula por mais de um begomovírus (MORILLA et al.,
2004). Outro mecanismo associados às altas taxas de recombinação é a replicação
dependente de recombinação (JESKE; LUTGEMEIER; PREISS, 2001).

Os vírus que pertencem à família Caulimoviridae (dsDNA) são considerados
objetos ideais para estudos de recombinação. Esta família de vírus de plantas tem recebido
atenção adicional desde a descoberta de que é capaz de se integrar no genoma da planta
hospedeira (SQUIRES et al., 2011). Eventos de recombinação homóloga foram relatados
para ativação dos genomas epissomais de BSV e TVCV integrados nos genomas de seus
hospedeiros (NDOWORA et al., 1999; STAGINNUS; RICHERT-PÖGGELER, 2006).
Estudos sugerem ainda que eventos de recombinação contribuem para a variação genética
observada entre membros dos gêneros Caulimovirus (FROISSART et al., 2005) e
Tungrovirus (ARBOLEDA; AZZAM, 2000).

3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Conjunto de dados

Sequência do genoma completo de espécies do gênero Badnavirus foram obtidas a
partir do banco de dados não-redundante GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank;
acessado em maio de 2015). A partir dos genomas completos, foram obtidos conjuntos de
dados das sequências nucleotídicas para as ORFs I, II, III, e domínios RT/RNaseH
completo (1020 pb) e parcial (579 pb). O conjunto de dados RT/RNaseH parcial refere-se à
região genômica amplificada pelos oligonucleotídeos mais amplamente utilizados para
detecção e identificação de espécies de badnavírus (YANG et al., 2003).

3.2 Alinhamento e comparação de sequências

Sequências completas de aminoácidos das ORFs I, II, e III foram individualmente
alinhadas utilizando o algoritmo MUSCLE (EDGAR, 2004), manualmente editadas no
pacote MEGA 6 (TAMURA et al., 2013), e convertidas em sequências nucleotídicas para
análises posteriores. Para estes três conjuntos de dados foram então utilizados para
obtenção de alinhamento dos genomas completos. A partir da sequência obtida da ORF3,
foram obtidos os conjunto de dados dos domínios RT/RNaseH (completo e parcial).
Para confirmar a taxonomia atribuída aos isolados de badnavírus obtidos a partir do
GenBank, os conjuntos de dados genoma completo, ORFs I, II, III e domínios RT/RNaseH
(completo e parcial) foram analisadas utilizando o programa Sequence Demarcation Tool
v. 1.2 (MUHIRE et al., 2013).

3.3 Análises de recombinação

Evidência de evolução em rede para os conjuntos de dados genoma completo e
ORFs I, II e III foi avaliada utilizando-se o método Neighbor-Net implementado no
programa SplitsTree v. 4.10 (HUSON; BRYANT, 2006). Possíveis parentais e locais
(breakpoints) de recombinação, para o conjunto de dados genoma completo, foram
determinados utilizando-se os métodos RDP, Geneconv, Boot-scan, Maximum Chi Square,
Chimaera, SisterScan e 3Seq implementados no pacote RDP v. 4.0 (MARTIN et al., 2015).
Os alinhamentos foram analisados com definições padrão para os diferentes métodos e a
significância estatística foi inferida por um P-valor menor que o Bonferroni corrigido de
0,05. Somente eventos de recombinação detectados no mínimo por quatro diferentes
métodos foram considerados confiáveis.

3.4 Análise filogenética

Inferência filogenética Bayesiana para os conjuntos de dados genoma completo,
ORFs I, II e III e domínios RT/RNaseH (completo e parcial) dos isolados de badnavírus foi
realizada no web portal CIPRES (MILLER et al., 2010) usando MrBayes v. 3.2.3
(RONQUIST et al., 2012). O melhor modelo de substituição de nucleotídeos foi
determinado para cada conjunto de dados usando MrModeltest 2.3 (POSADA;
BUCKLEY, 2004) de acordo com o Akaike Information Criterion (AIC). O modelo
evolutivo GTR+I+G foi utilizado para todos os conjuntos de dados. Análises foram
rodadas para cada conjunto de dados por 20 milhões de gerações usando quatro cadeias e
amostrando a cada 2.000 gerações, para um total de 10.000 árvores. As primeiras 2.500
árvores foram descartadas como uma fase de burn-in. Probabilidades posteriores
(RANNALA; YANG, 1996) foram determinadas a partir de uma árvore consenso
majority-rule gerada com as 7.500 árvores remanescentes. As árvores foram visualizadas e
editadas nos programas FigTree v. 1.4 (ztree.bio.ed.ac.uk/software/figtree) e Inkscape
(https://inkscape.org/pt/).

4 RESULTADOS
4.1 Conjunto de dados

Um total de 32 espécies distintas de badnavírus com sequências genômicas
completas foram obtidas a partir do GenBank (Tabela 1). Como algumas espécies foram
representadas por mais de um isolado/sequência, o conjunto de dados compreendeu 71
isolados, com Citrus yellow mottle virus (CYMV) tendo o maior número de representantes
(sete isolados), e 15 espécies sendo representadas por apenas um isolado/sequência (Tabela
1).

4.2 Demarcação de espécies

Na análise de comparações pareadas para o conjunto de dados RT/RNaseH parcial
(579pb), mais amplamente utilizado na identificação de espécies de badnavírus, foi
observado que as porcentagens de identidade de nucleotídeos entre as diferentes espécies
variou entre 57,0 a 82,2%, portanto, algumas comparações excederam o limiar de ≥80% de
identidade para demarcação de espécies dentro do gênero Badnavirus (GEERING; HULL,
2012). Isolados de SCBGAV compartilharam 80-82% e 81-82% de identidade de
nucleotídeos com isolados de BSOLV e BSCAV, respectivamente. Entretanto, isolado de
BSOLV e BSCAV exibiram porcentagens máximas de identidade nucleotídica de 76-77%.
O isolado de SCBBBV compartilhou 78-80% e 82% de identidade de nucleotídeos com
isolados de SCBIMV e SCBMOV, respectivamente. Já os isolados de SCBIMV e
SCBMOV exibiram porcentagens máximas de identidade nucleotídica de 79-80%. Para
todas as espécies representadas por mais de um isolado/sequência, porcentagens de
identidade foram superiores a 80% dentro de uma mesma espécie (Figura 2). Resultados
similares foram observados para o conjunto de dados RT/RNaseH completa (1020pb)
(Figura 3).
Quando analisado o conjunto de dados para ORF III (onde estão presentes os
domínios RT/RNaseH), pode-se observar as mesmas incongruências taxonômicas para os
isolados de SCBGAV, BSOLV e SCBGAV. Entretanto, isolados de SCBBBV, SCBIMV e
SCBMOV apresentaram porcentagens de identidade nucleotídicas abaixo de 80% (dados
não mostrados). Para o conjunto de dados de genomas completos, todas as comparações
entre espécies distintas de badnavírus foram abaixo de 80% de identidade de nucleotídeos,

com identidade máxima de 79,5% entre isolados de SCBGAV comparados com isolado de
BSOLV e BSCAV (dados não mostrados). Finalmente, para o conjunto de dados ORF I,
porcentagens de identidade ≥80% foram observadas entre isolados de SCBGAV, BSOLV e
SCBGAV e entre SCBIMV e SCBMOV (dados não mostrados). Entretanto, para a ORF II,
todas as comparações foram abaixo de 78% de identidade de nucleotídeos (dados não
mostrados).

4.3 Relacionamento filogenético

Como a região RT/RNaseH é amplamente utilizada para determinação da posição
taxonômica de membros do gênero Badnavirus (GEERING; HULL, 2012), árvores
filogenéticas de inferência Bayesiana foram obtidas para os conjuntos de dados genoma
completo, ORFs I, II e III, e domínios RT/RNaseH (parcial e completo), no intuito de
demonstrar se o relacionamento filogenético observado para os conjunto de dados
RT/RNaseH parcial (579pb) e completo (1020pb) refletem o agrupamento inferido para o
genoma completo dos isolados de badnavírus,
Para o conjunto de dados RT/RNaseH completo, foram observados os três
principais grupos de badnavírus (Badnavirus Groups 1, 2 e 3) descritos por Muller et al.
(2011). Adicionalmente, houve a formação de um grupo bem definido e relacionado com o
Badnavirus Group 3, aqui denominado Badnavirus Group 4 (Figura 4). Quando analisada
a árvore filogenética para RT/RNaseH parcial (como utilizado por MULLER et al., 2011),
os quatro principais grupos de badnavírus são ainda observados, com algumas
incongruências topológicas (Figura 5). Entretanto, a definição e valores de sustentação dos
ramos foram bem menores, indicando que o conjunto de dados RT/RNaseH parcial não
tem sinal filogenético suficiente para o correto agrupamento de todos os isolados de
badnavírus. Alguns isolados pertencentes ao Badnavirus Group 1, para a filogenia da
RT/RNaseH completa, foram posicionados fora deste grupo na filogenia para a
RT/RNaseH parcial (Figura 5).
Na árvore filogenética para o genoma completo, foi observada ainda a formação
dos quatro principais grupos presentes nas filogenias para RT/RNaseH (completa e
parcial), porém com algumas incongruências quanto ao relacionamento filogenético desses
grupos (Figura 6). Para o conjunto de dados genoma completo, o Badnavirus Group 3
formou um grupo irmão com o Badnavirus Group 1, sendo formados predominantemente

por badnavírus infectando cana-de-açúcar e banana (Figura 6). Resultados similares foram
observados para a filogenia da ORF III (Figura 7), a qual representa aproximadamente
80% do genoma completo dos badnavírus. Estes resultados reforçam a ideia de que
badnavírus infectando cana-de-açúcar e banana são proximamente relacionados, como
indicado pelas análises de comparação de sequências.
As filogenias para as ORFs I e II apresentaram topologia bastante distinta quando
comparadas com as árvores para os outros conjuntos de dados, além de baixos valores de
sustentação dos ramos formados (Figuras 8-9). Estes resultados sugerem que os conjuntos
de dados ORFs I e II possuem sinal filogenético insuficiente para inferir sobre o
relacionamento das diversas espécies de badnavírus analisadas aqui.

4.4 Eventos de recombinação

Análise reticulada para o genoma completo e ORFs I, II e III revelou forte
evidência de eventos de recombinação contribuindo para o processo evolutivo dos isolados
de badnavírus, sendo observados possíveis eventos de recombinação intra e interespecífico
(Figura 10-13). Estes eventos foram mais pronunciados entre os badnavírus infectando
cana-de-açúcar e banana em todos os conjuntos de dados analisados (Figura 10-13). As
redes formadas para os dados de genoma completo e ORF III foram similares (Figuras 1011), e bastante divergentes das redes para as ORFs I e II (Figuras 12-13), como observado
na análise filogenética. Além do efeito de recombinação, foi evidenciado o efeito de
mutação na diversificação dos membros do gênero Badnavirus, indicado pelos ramos
longos associados a diversos isolados (Figura 10-13).
Para adicionalmente investigar possíveis parentais e locais (breakpoints) de
recombinação, o conjunto de dados para o genoma completo foi analisado utilizando o
pacote RDP4. Como evidenciado pela análise reticulada, um complexo padrão de
recombinação foi observado (Tabela 2). Pelo menos 13 eventos independentes de
recombinação foram detectados entre os isolados de badnavírus, com sete desses eventos
ocorrendo em espécies infectando cana-de-açúcar e banana (Tabela 2). A maioria dos
breakpoints de recombinação foi localizada dentro da ORF III e Região Intergênica, com
apenas quatro eventos com breakpoints na ORF I (Tabela 2).

5 DISCUSSÃO

Os badnavírus vêm sendo relatados em culturas economicamente importantes em
todo o mundo (SILVA et. al, 2015; JAMES et. al, 2011a; KOUAKOU et. al, 2012;
DEESHMA; BHAT, 2015; ENI et. al, 2008; JOHNSON et. al, 2012), podendo induzir
grandes perdas na qualidade e produtividade destas culturas, como descrito em cacau na
Costa do Marfim (KOUAKOU et al., 2012) e banana em Uganda (DAHAL et al., 2000;
DANIELLS et al., 2001). Além disso, isolados de badnavírus apresentam alta diversidade e
variabilidade genética (MULLER et al., 2011; KARUPPAIAH et al., 2013; GUIMARÃES
et al., 2015; SILVA et al., 2015).
Sequências nucleotídicas da região parcial dos domínios RT/RNaseH (579pb),
presentes na ORF III, vem sendo amplamente utilizadas para identificação de espécies
pertencentes ao gênero Badnavirus (GUIMARÃES et al., 2015; SILVA et al., 2015;
MULLER et al., 2011). Oligonucleotídeos universais descritos por Yang et al. (2003) são
bastante eficientes na amplificação dessa região genômica nos badnavírus. Entretanto, tais
oligonucleotídeos são incapazes de distinguir entre sequências virais endógenas integradas
ao genoma do hospedeiro e sequências epissomais responsáveis pelo processo infecioso
(JAMES et al., 2011a). Além disso, a existência de diferentes espécies de badnavírus
proximamente relacionadas tem dificultado a classificação taxonômica dentro desse grupo
de vírus (FIGUEIREDO et al., 2006; GEERING et al., 2000, 2005b; HARPER et al., 2005;
HARPER; HULL, 1998; LHEREUX et al., 2007).
No presente trabalho, análise de comparações pareadas de sequências nucleotídicas
de amplo conjunto de dados de diferentes badnavírus mostrou que o limiar de ≥80% de
identidade para a região RT/RNaseH [parcial (579pb) ou completa (1020pb)] (GEERING;
HULL, 2012) permitiu o posicionamento taxonômico da maioria das espécies analisadas.
Entretanto, não foi possível distinguir entre algumas espécies de badnavírus infectando
banana e cana-de-açúcar, como observado em trabalhos publicados anteriormente
(LOCKHART; OLSZEWSKI, 1993; AUTREY, 1991; MULLER et al., 2011;
KARUPPAIAH et al., 2013; SILVA et al., 2015). Foi anteriormente observado que as
regiões intergênicas e RNaseH de isolados de Sugarcane bacilliform viruses (SCBV) e
Banana streak viruses (BSV) compartilham até 90% de identidade nucleotídica, reforçando
a hipótese de que esses isolados pertenceriam a uma única espécie de badnavírus
(LOCKHART; AUTREY, 1991; BRAITHWAITE et al., 1997), e explicaria a aparição

frequente de BSV em cana-de-açúcar. Interessantemente, mesmo analisando uma região
genômica mais ampla como a ORF III (representa cerca de 80% do genoma completo dos
badnavírus), foram obtidos resultados similares aos observados para a RT/RNaseH.
Na tentativa de solucionar tais problemas taxonômicos observados para alguns
badnavírus, principalmente infectando cana-de-açúcar e banana, são sugeridas algumas
alternativas. Primeiro, considerado o critério de ≥80% de identidade para a região
conservada RT/RNaseH na demarcação de espécies de badnavírus, isolados de BSV e
SCBV muito proximamente relacionados (identidade nucleotídica ≥80%) seriam
considerados como uma única espécie viral. Segundo, um novo limiar de identidade
nucleotídica para RT/RNaseH poderia ser estabelecido. Neste caso, foi observado que os
isolados analisados compartilharam máximo de identidade de 82%, portanto, critérios
acima desse valor poderiam ser adotados. Entretanto, seria interessante analisar um maior
número de sequências/isolados para a região RT/RNaseH antes da definição de um novo
critério. Terceiro, dada à ineficiência para diferenciação de algumas espécies de badnavírus
utilizando critério de identidade de sequências da RT/RNaseH, o posicionamento
taxonômico poderia ser realizado através de sequências do genoma completo, como
observado para outros grupos de fitovírus (BRWON et al., 2015).
Análise filogenética baseada na região RT/RNaseH parcial (529pb) mostrou que
não há uma separação clara entre isolados de SCBV e BSV em grupos distintos de
badnavírus (MULLER et al., 2011). A estreita relação entre isolados de SCBV e BSV, e a
estrutura polifilética de BSV (GAYRAL; ISKRA-CARUANA, 2009) são fortes
argumentos suportando a hipótese de que banana e cana-de-açúcar teriam um ancestral
comum, ou ainda que banana pode ter sido o hospedeiro original para SCBV, bem como
para outros badnavírus que agrupam com BSV (GAYRAL; ISKRA-CARUANA, 2009).
O relacionamento filogenético observado para todos os conjuntos de dados
analisados corroboram com as análises de comparações pareadas de sequências
nucleotídicas, onde se pode observar a não separação de isolados de SCBV e BSV em
filogrupos distintos. É importante notar que, apesar de algumas incongruências
topológicas, as filogenias para RT/RNaseH relembram o agrupamento inferido para o
genoma completo dos membros do gênero badnavírus. Além da formação bem definida
dos três grupos de badnavírus descritos por Muller et al. (2011), um quarto grupo
filogenético é proposto aqui, o Badnavirus Group 4, o qual representa um clado separado
dos outros badnavírus. Assim como observado por Muller et al. (2011), quando analisadas

apenas as filogenias para RT/RNaseH, os clados Badnavirus Group 1 e Badnavirus Group
3, compostos predominantemente por espécies que infectam cana-de-açúcar e banana, são
mais distantemente relacionados, com o Badnavirus Group 3 sendo mais próximo do
Badnavirus Group 4 na árvore filogenética para RT/RNaseH completa. Entretanto, quando
analisadas as filogenias para ORF III e genomas completos, fica evidente a proximidade
genética entre os Badnavirus Groups 1 e 3, onde formaram grupos irmãos. Estes resultados
reforçam a ideia de que os badnavírus infectando cana-de-açúcar e banana podem ter um
histórico evolutivo comum.
A alta variabilidade genética observada em badnavírus tem sido atribuída à
replicação inacurada por transcrição reversa presente em Caulimoviridae (BOUSALEM et
al., 2009). Transcriptases reversas são conhecidas por serem altamente tendenciosas a
produzirem erros em retrovírus e retroelementos para os quais a taxa de fidelidade foi
estimada (DRAKE et al., 1998; SVAROVSKAIA et al., 2003). Embora não seja conhecida
a medida precisa da fidelidade da transcriptase reversa (RT) codificada pelos vírus
pertencentes às famílias Caulimoviridae e Hepadnaviridae, acredita-se que as altas taxas
de mutação encontradas para esses vírus se deve à perda da atividade de correção de erros
de suas RTs (DRAKE et al., 1998; SVAROVSKAIA et al., 2003). Outro mecanismo
evolutivo que influencia a diversidade e variabilidade genética dos badnavírus é a
recombinação (GOVIND et al., 2014).
Análise de evolução em rede mostrou forte evidência de eventos de recombinação
contribuindo para o processo evolutivo de algumas espécies de badnavírus, principalmente
aqueles infectando cana-de-açúcar e banana. Estes resultados foram reforçados pela análise
de recombinação para o conjunto de dados de genomas completos, onde um complexo
padrão de eventos de recombinação foi detectado. Novamente, a maioria dos eventos
envolveu isolados de SCBV e BSV, com breakpoints de recombinação ocorrendo
predominantemente na ORF III e região intergênica.
Um das premissas básicas para que haja recombinação é a ocorrência de infecções
mistas, inclusive com presença dos vírus no núcleo de uma mesma célula vegetal (ZHOU
et al.,1997; FONDONG et al., 2000; GRAHAM et al., 2010). Infecção cruzada entre
badnavírus em cana-de-açúcar e banana são comumente relatadas, porém parece ser um
evento incomum para badnavírus infectando outros hospedeiros (KOUAKOU et al., 2012;
KARUPPAIAH et al., 2013; SILVA et al., 2015). Portanto, isto poderia explicar, em
partes, a origem recombinante comum entre isolados de SCBV e BSV, como evidenciado

pela análise reticulada. Adicionalmente, eventos frequentes de recombinação poderiam
explicar a alta diversidade de espécies de badnavírus comumente encontrada nesses
hospedeiros (SILVA et al., 2015; SMITH et al., 1996; BRAITHWAITE et al., 1997). Além
da recombinação contribuindo para diversificação dos badnavírus, mutação parece
realmente ser o mecanismo evolutivo mais importante atuando na evolução desse grupo de
vírus.

CONCLUSÕES



Mutação é o principal mecanismo evolutivo atuando na evolução dos membros do
gênero Badnavirus;



Isolados de SCBV e BSV possuem uma estreita relação filogenética;



A região RT/RNaseH parcial (579pb) é suficiente para demarcação da maioria das
espécies de badnavírus atualmente descritas, porém o limiar de ≥80% de identidade
nucleotídica sozinho é ineficiente para diferenciar todas as espécies de SCBV e
BSV.

Tabela 1. Sequências de badnavirus obtidas a partir do banco de dados não-redundantes
GenBank.

Espécie/Acrônimo

#acesso no GenBank

Banana streak VN virus/BSVNV

DQ092436

BSVNV

AY750155

BSVNV

KJ013510

Banana streak IM virus/BSIMV

HQ659760

BSIMV

KJ013508

BSIMV

HQ593112

Banana streak OL virus/BSOLV

DQ859899

BSOLV

KJ013506

BSOLV

DQ451009

BSOLV

JQ409539

BSOLV

JQ409540

Sugarcane baciliform GA virus/SCBGAV

FJ824813

SCBGAV

FJ824814

Banana streak CA virus/BSCAV

HQ593111

BSCAV

KJ013511

Banana streak UA virus/BSUAV

HQ593107

Kalanchoë top-spotting virus/KTSV

AY180137

Banana streak GF virus/BSGFV

AY493509

BSGFV

KJ013507

Banana streak mysore virus/BSMyV

KJ013509

BSMyV

KF724854

BSMyV

AY805074

BSMyV

KF724856

BSMyV

KF724855

Sugarcane Bacilliform GD virus/SCBGDV

FJ439817

Cycad leaf necrosis virus/CLNV

EU853709

Pineapple bacilliform comosus virus/PBCV

GQ398110

PBCV

GU121676

Cacao swollen shoot virus/CSSV

L14546

CSSV

AJ534983

CSSV

AJ609019

CSSV

AJ609020

Cacao swollen shoot Togo A virus/CSSTAV

AJ781003

Cacao swollen shoot Côte d’Ivore D virus/ CSSCIDV

JN606110

Hybiscus baciliform virus/HBV

KF875586

Citrus yellow mosaic virus/CYMV

JN006805

CYMV

AF347695

CYMV

EU708317

CYMV

JN006806

CYMV

EU489744

CYMV

EU489745

CYMV

EU708316

Dioscorea bacilliforma SN virus/DBSNV

DQ822073

Piper yellow mottle virus/PYMV

KC808712

PYMV

KJ873041

PYMV

KJ873042

PYMV

KJ873043

Banana streak UI virus/BSUIV

HQ593108

Banana streak UL virus/BSULV

HQ593109

Banana streak UM virus/BSUMV

HQ593110

Sugarcane bacilliform IM virus/SCBIMV

JN377533

SCBIMV

JN377536

SCBIMV

JN377537

SCBIMV

AJ277091

Sugarcane Bacilliform BB Virus/SCBBBV

JN377535

Sugarcane bacilliform MO virus/SCBMOV

JN377534

SCBMOV

M89923

Commelina yellow mottle virus/CoYMV

X52938

Dracaena mottle vírus/DMV

DQ473478

Pelargonium vein banding vírus/PVBV

GQ428155

Gooseberry vein banding associated virus/GVBV

JQ316114

GVBV

HQ852249

GVBV

HQ852250

GVBV

HQ852251

GVBV

HQ852248

Rubus yellow net virus/RYNV

KM078034

RYNV

KM078034

Grapevine vein clearing virus/GVCV

KJ725346

GVCV

JF301669

GVCV

JF301669

Yacon necrotic mottle virus/YNMV

KM229702

Tabela 2. Eventos de recombinação detectados entre isolados de badnavírus obtidos a partir
do Genbank.

Parentais
Minor
Major
AF347695_CYMV
JN006806_CYMV

Métodos†

P value‡

RGBMCS3

5.27E-97

377

AJ781003_CSSV

AJ609020_CSSV

RGBMCS

2.28E-26

5546

6674

Unknown

JN006806_CYMV

RMC3

2.82E-21

JN377533_SCBIMV

3148

3242

Unknown

JN377537_SCBIMV

RGBMC

6.02E-20

HQ593107_BSUAV

450

681

HQ593109_BSULV

KJ013511_BSCAV

RGBMCS

3.04E-18

KJ873043_PYMV

2111 (?)

3539

Unknown

KJ873042_PYMV

RGBMCS

3.34E-23

KJ873042_PYMV

5825

6499 (?)

KJ873043_PYMV

KC808712_PYMV

RGBMCS

4.96E-18

JN377534_SCBMOV

400

515

AJ277091_SCBIMV

M89923_SCBMOV

RGBMC

7.68E-12

AY493509_BSGFV
KJ013507_BSGFV

403

1868

KF724855_BSMyV

AY180137_KTSV

RBMCS

1.87E-09

HQ593110_BSUMV
HQ593108_BSUIV
HQ593109_BSULV

285

469

HQ593111_BSCAV

Unknown

RGBMCS

3.63E-08

JN377533_SCBIMV
JN377537_SCBIMV

6385

396 (?)

JN377534_SCBMOV

JN377535_SCBBBV

RBMS

5.41E-09

JQ409539_BSOLV
DQ859899_BSOLV
KJ013506_BSOLV
DQ451009_BSOLV
JQ409540_BSOLV

890

1731

Unknown

HQ593111_BSCAV

RBMCS

7.06E-05

AY180137_KTSV

1652

1891

Unknown

HQ593107_BSUAV

RBMCS

1.23E-03

Evento

Recombinante

Breakpoints*
Inicial
Final
1277
274

JN006805_CYMV

L14546_CSSV
AJ534983_CSSV

EU489744_CYMV
EU489745_CYMV

Figura 2. Matriz bidimensional representando a porcentagem de identidade de comparações
pareadas de sequências nucleotídicas da região completa dos domínios RT/RNaseH (579
pb) de isolados de Badnavirus disponíveis no GenBank.

Figura 3. Matriz bidimensional representando a porcentagem de identidade de comparações
pareadas de sequências nucleotídicas da região parcial dos domínios RT/RNaseH (1020
pb) de isolados de Badnavirus disponíveis no GenBank.

Figura 4. Análise filogenética de inferência Bayesiana baseada no conjunto de dados da
RT/RNAseH completa de espécies de badnavírus. Badnavirus Groups 1 (cinza), 2 (verde),
3 (azul) e 4 (laranja).

Figura 5. Análise filogenética de inferência Bayesiana baseada no conjunto de dados da
RT/RNAseH parcial de espécies de badnavírus. Badnavirus Groups 1 (cinza), 2 (verde), 3
(azul) e 4 (laranja).

Figura 6. Análise filogenética de inferência Bayesiana baseada no conjunto de dados do
genoma completo de espécies de badnavírus. Badnavirus Groups 1 (cinza), 2 (verde), 3
(azul) e 4 (laranja).

Figura 7. Análise filogenética de inferência Bayesiana baseada no conjunto de dados da
ORF III de espécies de badnavírus. Badnavirus Groups 1 (cinza), 2 (verde), 3 (azul) e 4
(laranja).

Figura 8. Análise filogenética de inferência Bayesiana baseada no conjunto de dados da
ORF I de espécies de badnavírus. Badnavirus Groups 1 (cinza), 2 (verde), 3 (azul) e 4
(laranja).

Figura 9. Análise filogenética de inferência Bayesiana baseada no conjunto de dados da
ORF II de espécies de badnavírus. Badnavirus Groups 1 (cinza), 2 (verde), 3 (azul) e 4
(laranja).

Figura 10. Análise reticulada baseada no genoma completo dos isolados de badnavírus.
Badnavirus Groups 1 (cinza), 2 (verde), 3 (azul) e 4 (laranja).

Figura 11. Análise reticulada baseada na ORF 1 dos isolados de badnavírus. Badnavirus
Groups 1 (cinza), 2 (verde), 3 (azul) e 4 (laranja).

Figura 12. Análise reticulada baseada na ORF 2 dos isolados de badnavírus. Badnavirus
Groups 1 (cinza), 2 (verde), 3 (azul) e 4 (laranja).

Figura 13. Análise reticulada baseada na ORF 3 dos isolados de badnavírus. Badnavirus
Groups 1 (cinza), 2 (verde), 3 (azul) e 4 (laranja).

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Proteção de Plantas

Campus de Engenharias e Ciências Agrárias

Universidade Federal de Alagoas