Variabilidade e Estrutura Genética de Populações do Begomovírus Cnidoscolus mosaic leaf deformation vírus (CnMLDV) Infectando Cnidoscolus urens (L.) Arthur (cansanção)
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE ALAGOAS
CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM
PROTEÇÃO DE PLANTAS
ADSO LEVI SOARES DE FIGUEIREDO MENDES
VARIABILIDADE E ESTRUTURA GENÉTICA DE POPULAÇÕES DO
BEGOMOVÍRUS Cnidoscolus mosaic leaf deformation virus
(CnMLDV) INFECTANDO Cnidoscolus urens (L.) Arthur (cansanção)
Rio Largo – AL
2017
ADSO LEVI SOARES DE FIGUEIREDO MENDES
VARIABILIDADE E ESTRUTURA GENÉTICA DE POPULAÇÕES
DO BEGOMOVÍRUS Cnidoscolus mosaic leaf deformation virus
(CnMLDV) INFECTANDO Cnidoscolus urens (L.) Arthur
(cansanção)
Dissertação de Mestrado apresentada ao
Programa de Pós-Graduação em Proteção de
Plantas do Centro de Ciências Agrárias da
Universidade Federal de Alagoas como
requisito parcial para obtenção do grau de
Mestre em Proteção de Plantas.
Orientadora: Prof.ª Dr.ª
Assunção
Iraildes
Pereira
Coorientador: Dr. Roberto Ramos Sobrinho
Rio Largo – AL
2017
Catalogação na fonte
Universidade Federal de Alagoas
Biblioteca Central
Bibliotecária Responsável: Helena Cristina Pimentel do Vale
M538v
Mendes, Adso Levi Soares de Figueiredo.
Variabilidade e estrutura genética de populações do begomovírus Cnidoscolus
mosaic leaf deformation vírus (CnMLDV) infectando Cnidosculus urens (L.) Arthur
(Cansanção) / Adso Levi Soares de Figueiredo Mendes. – 2017.
68 f. : il.
Orientadora: Iraildes Pereira Assunção.
Coorientador: Roberto Ramos Sobrinho.
Dissertação (Mestrado em Proteção de Plantas) - Universidade Federal de
Alagoas. Centro de Ciências Agrárias. Rio Largo, 2017.
Bibliografia: f. 53-68.
1. Proteção de plantas. 2. Infecção de plantas . 3. Begomovírus. 4. Plantas não
cultivadas. 5. Evolução molecular. I. Título.
CDU: 581.2
AGRADECIMENTOS
À minha família, em especial aos meus pais Maria de Fátima e Hermano, e à
minha irmã Camila pelo amor, incentivo e compreensão.
A Aryanna Regina, minha companheira, por todo o amor, pela compreensão
quando fui ausente, pelo constante apoio e por todos os momentos compartilhados.
Ao Centro de Ciências Agrárias e ao Programa de Pós-graduação em
Proteção de Plantas pela oportunidade de realização do curso de mestrado.
À professora Iraildes Pereira Assunção, minha orientadora, e ao professor
Gaus Silvestre de Andrade Lima pela orientação, pela confiança em mim
depositada, pelos conhecimentos compartilhados e pela dedicação em viabilizar este
trabalho em todas as suas etapas, incluindo a desenvolvida na Universidade Federal
de Viçosa.
Ao Dr. Roberto Ramos Sobrinho, meu coorientador, pelos ensinamentos, pelo
incentivo, por acreditar e confiar em mim, pela amizade dentro e fora do Laboratório
de Fitopatologia Molecular e Virologia Vegetal e por mediar a minha ida à
Universidade
Federal
de
Viçosa,
propiciando
uma
experiência
bastante
enriquecedora.
Ao professor Francisco Murilo Zerbini Júnior por me receber por um semestre
no Laboratório de Virologia Vegetal Molecular da Universidade Federal de Viçosa,
onde desenvolvi uma etapa essencial do trabalho, e conheci pessoas incríveis.
Aos colegas e amigos do Laboratório de Fitopatologia Molecular e Virologia
Vegetal (Mayra, Frederico, Nayana, Lucas Fonseca, Izabella, Lucas Jobim, Antonio,
Dr. Leonardo, Thiago, Tamires, Rafaela, Prof.ª Sarah, Caio, Janaíne, Mayara,
Lauristela, Jussara, Jackeline, Gilberlan, Daniel e Raphael) e do Laboratório de
Virologia Vegetal Molecular (Camila, Adriana, César, Rafaela, Murilo Alves, Diogo,
Larissa, Angélica, João Andrade, João Silva, Sarah, Hermano, Talita, Elton, Sílvia,
Osvaldo, Ana Caroline e Gabriela) pela ajuda que me deram, pelo aprendizado
propiciado ou pela agradável e divertida companhia que tornou mais leve e alegre a
rotina de laboratório. Destes, faço um agradecimento especial a Camila por me
acompanhar durante toda a minha passagem pela UFV, compartilhando comigo
conhecimentos inestimáveis e indispensáveis para a execução do trabalho, e pela
divertida companhia e amizade; a Mayra pela amizade e por me auxiliar desde o
começo do trabalho; a Nayana pelo constante incentivo e pela amizade; e a Fred e
Lucas Fonseca pela incomparável alegria que transmitiram diariamente.
A Michele por sempre ser solícita e por toda ajuda em questões
administrativas.
Aos grandes amigos do Centro de Ciências Agrárias Alison, Luan e Ariane
pela amizade e pelas conversas e reuniões produtivas ou apenas divertidas.
Aos amigos da vida Daniella, Eric, Jéssica e Victor por estarem comigo há
tantos anos, sempre presentes nos momentos de alegrias e adversidades.
Ao amigo Wagner José pela inspiração e pelo exemplo de dedicação.
Ao meu chefe, Alan Souza, pela amizade e compreensão.
A todos que contribuíram para a execução deste trabalho.
RESUMO
Vírus da família Geminiviridae possuem genoma de DNA circular de fita simples
encapsidado em partículas geminadas quasi-icosaédricas, sendo divididos em sete
gêneros (Becurtovirus, Begomovirus, Curtovirus, Eragrovirus, Mastrevirus,
Topocuvirus e Turncurtovirus) com base no tipo de inseto vetor, gama de
hospedeiros, organização genômica e relacionamento filogenético. Begomovirus são
transmitidos pelo complexo de espécies crípticas de mosca-branca Bemisia tabaci, e
causam grandes prejuízos em culturas de importância econômica em todo o mundo.
Além de plantas cultivadas, begomovírus infectam hospedeiras daninhas/silvestres
que podem servir como reservatório viral. Com o objetivo de avaliar a variabilidade e
estrutura genética de populações de begomovírus infectando a planta não-cultivada
Cnidoscolus urens (L.) Arthur (cansanção), amostras foliares apresentando sintomas
indicativos de infecção por begomovírus foram coletadas em diferentes localidades
do Estado de Alagoas em 2015 e 2016. O DNA total foi extraído a partir de cada
amostra e utilizado como molde para amplificação por círculo rolante (RCA), seguida
de clonagem e sequenciamento. Análise de comparações pareadas de sequências
nucleotídicas do DNA-A mostrou que todos os isolados pertencem a uma única
espécie: Cnidoscolus mosaic leaf deformation virus (CnMLDV). Análises filogenética
e de estruturação de populações mostraram a divisão dos isolados de CnMLDV em
duas subpopulações (Norte e Sul), as quais apresentam altos valores de
variabilidade nucleotídica. Análises de recombinação e de evolução em rede
mostraram fortes evidências de eventos de recombinação ocorrendo entre isolados
de CnMLDV. Finalmente, foi detectada forte pressão de seleção negativa atuando
sobre os genes CP e Rep de CnMLDV. Juntos, esses resultados mostram que a alta
variabilidade genética observada para os isolados CnMLDV está diretamente
relacionada a eventos frequentes de recombinação ocorrendo ao longo do genoma,
e que seleção purificadora atua de forma a manter a sequência de aminoácidos das
proteínas virais. Além disso, mutação foi determinada como um dos principais
fatores atuando na diverisificação dos isolados de CnMLDV.
Palavras-chave: Geminiviridae. Plantas não-cultivadas. Evolução molecular.
ABSTRACT
Viruses in the Family Geminiviridae have circular single-stranded DNA genome that
is encapsidated into twinned quasi-icosahedral particles and are divided into four
genera (Becurtovirus, Begomovirus, Curtovirus, Eragrovirus, Mastrevirus,
Topocuvirus e Turncurtovirus) based on the type of insect vector, genome
organization, host range and phylogenetic relationship. Begomovirus are transmitted
by whiteflies within the Bemisia tabaci cryptic species complex and cause great
losses in economically important crops worldwide. Besides being able to infect crop
plants begomoviruses also infect weed/wild plants which serve as viral reservoir.
Aiming to evaluate the genetic variability and population structure of begomoviruses
infecting the non-cultivated host Cnidoscolus urens (L.) Arthur, leaf samples showing
indicative symptoms of begomoviral infection were collected in different locations
within Alagoas State in the years 2015 and 2016. Total DNA was extracted from
each sample and used as template for rolling circle amplification (RCA) followed by
cloning and sequencing. Pairwise sequence comparisons analysis of DNA-A showed
that all isolates belong to a single species: Cnidoscolus mosaic leaf deformation virus
(CnMLDV). Phylogenetic and population structure analyses showed that CnMLDV
isolates are separated in two subpopulations (North and South) which have high
nucleotide variability values. Recombination and network evolution analyses showed
strong evidence of recombination events occurring between CnMLDV isolates.
Finally, strong negative selection pressure acting upon CP and Rep genes of
CnMLDV was detected. Taken together these results show that the high genetic
variability observed in CnMLDV isolates is directly related to frequent recombination
events occurring along the virus genome and that strong purifying selection acts in a
way to maintain the viral proteins amino acid sequences. Furthermore, mutation was
determined as one of the main factors acting in the diversification of CnMLDV
isolates.
Keywords: Geminiviridae. Non-cultivated plants. Molecular evolution.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Organização genômica dos begomovírus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
Figura 2 – Matriz de identidades de sequências do DNA-A de isolados de
CnMLDV . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34
Figura 3 – Árvores filogenéticas de inferência bayesiana construídas para
CnMLDV. A. DNA-A. B. Gene CP. C. Gene Rep. Isolados da
população sul estão marcados em azul, e os da população norte em
vermelho. O isolado recombinante BR-Mes5-16 está indicado em
preto . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36
Figura 4 – Gráfico de barras gerado pela análise de estruturação de subpopulações
no software STRUCTURE. As cores representam as subpopulações Sul
(azul) e Norte (vermelho). Cada barra vertical representa um isolado viral
cuja distribuição de cores é proporcional à estimativa de cada indivíduo
pertencer a cada subpopulação . . . . . .
37
Figura 5 – Análise reticulada baseada no DNA-A de CnMLDV. Isolados da
subpopulação Sul estão marcados em azul e da subpopulação Norte
em vermelho. O isolado recombinante BR-Mes5-16 está indicado em
preto . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41
Figura 6 – Análise reticulada baseada para CnMLDV. A. Gene CP. B. Gene Rep.
Isolados da subpopulação Sul estão marcados em azul e da
subpopulação Norte em vermelho. O isolado recombinante BR-Mes516 está indicado em preto . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
Figura 7 – Árvores filogenéticas de inferência bayesiana com remoção de blocos
recombinantes. A. Bloco da posição 330 a 888 deletado do
alinhamento. B. Bloco da posição 1332 a 2538 deletado do
alinhamento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Isolados de CnMLDV utilizados neste trabalho . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
Tabela 2 – Diversidade nucleotídica (π) de isolados de CnMLDV . . . . . . . . . . . . 38
Tabela 3 – Sítios selecionados positiva e negativamente nos genes CP e Rep de
CnMLDV . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
39
Tabela 4 –Teste de neutralidade D de Tajima para as ORFs CP e Rep das
subpopulações de CnMLDV . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .40
Tabela 5 – Eventos de recombinação detectados entre os isolados de CnMLDV. 43
Tabela 6 – Eventos de recombinação detectados entre isolados de CnMLDV e
begomovírus do Novo Mundo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44
SUMÁRIO
1
INTRODUÇÃO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .10
2
REVISÃO DE LITERATURA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .12
2.1
Cnidoscolus urens (L.) Arthur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
2.2
A família Geminiviridae . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
2.3
O gênero Begomovirus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .14
2.2.1 Organização genômica e funções das proteínas dos begomovírus . . . . . . . .16
2.2.2 Variabilidade e estrutura genética de populações de begomovírus . . . . . . . 20
2.2.3 Satélites . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
2.2.4 Begomovírus em plantas não cultivadas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
3
MATERIAL E MÉTODOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27
3.1
Coleta do material vegetal e extração de DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27
3.2
Clonagem e sequenciamento do genoma completo de begomovírus . . 27
3.3
Análise de sequências e demarcação de espécies . . . . . . . . . . . . . . . . 28
3.4
Alinhamento e análises filogenéticas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
3.5
Estrutura genética e índices de variabilidade . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
3.6
Análise de seleção . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
3.7
Análise de recombinação . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
4
RESULTADOS . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
4.1
Conjunto de dados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
4.2
Demarcação de espécies . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
4.3
Análise filogenética . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
4.4
Estrutura genética e índices de variabilidade . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
4.5
Análise de seleção . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38
4.6
Análise de recombinação . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40
5
DISCUSSÃO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48
6
CONCLUSÕES . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52
REFERÊNCIAS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53
10
1
INTRODUÇÃO
A família Geminiviridae é composta por vírus de genoma de DNA circular de
fita simples (~2,6-5,2 kb) encapsidados em partículas geminadas quasi-icosaédricas
(BROWN et al., 2015; GILBERTSON et al., 2015). A família é dividida em sete
gêneros
(Becurtovirus,
Begomovirus,
Curtovirus,
Eragrovirus,
Mastrevirus,
Topocuvirus and Turncurtovirus), classificados de acordo com o tipo de inseto vetor,
gama de hospedeiros, organização genômica e relacionamento filogenético
(VARSANI et al., 2017; ZERBINI et al., 2017). Nos últimos 20 anos, emergiram como
o grupo de vírus de plantas com maior número de espécies descritas, e causando
prejuízos em diversas culturas de importância econômica em todo o mundo
(GILBERTSON et al., 2015; INOUE-NAGATA; LIMA; GILBERTSON, 2016).
O gênero Begomovirus possui atualmente 322 espécies reconhecidas pelo
International Commitee on Taxonomy of Viruses – ICTV (http://www.ictvonline.org/
virusTaxonomy.asp), sendo o mais diverso de toda taxonomia viral (BROWN et al.,
2015). O genoma dos begomovírus pode ser composto por um (monopartidos) ou
dois (bipartidos) componentes genômicos conhecidos como DNA-A e DNA-B. No
caso dos begomovírus bipartidos, ambos os componentes genômicos são
necessários para que ocorra infecção sistêmica da planta hospedeira (BROWN et
al., 2012; 2015).
Os begomovírus são transmitidos pelo grupo de espécies crítpticas de moscabranca do complexo Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae) e infectam uma ampla
gama de hospedeiras dicotiledôneas, principalmente em regiões tropicais e
subtropicais (MORALES; ANDERSON, 2001; NAVAS-CASTILLO; FIALLO-OLIVÉ;
SÁNCHEZ-CAMPOS, 2011; BROWN et al., 2015). Além de espécies cultivadas, os
begomovírus infectam plantas silvestres/daninhas em diferentes famílias botânicas
(MORALES; ANDERSON, 2001). Essas plantas podem servir como hospedeiras
alternativas/reservatórios para vírus provenientes de hospedeiras cultivadas (ALABI
et al., 2008; BARBOSA et al., 2009; BARRETO et al., 2013; ROCHA et al., 2013),
evitando-se assim a extinção da população viral na ausência da espécie cultivada.
Além disso, alguns vírus detectados originalmente em plantas silvestres são
capazes de infectar plantas cultivadas (IDRIS et al., 1999; BARRETO et al., 2013;
LIMA et al., 2013; RAMOS-SOBRINHO et al., 2014). Infecções mistas são comuns
entre os begomovírus, o que possibilita a ocorrência de recombinação e
11
pseudorecombinação entre espécies e estirpes distintas, portanto contribuindo para
a evolução desses vírus (SEAL; VAN DEN BOSCH; JEGER, 2006; ALABI et al.,
2008; GARCÍA-ANDRÉS et al., 2006; MONDE et al., 2010; ROCHA et al., 2013;
STEWART et al., 2014; VAGHI MEDINA; MARTIN; LÓPEZ LAMBERTINI, 2015).
Diversas espécies de begomovírus têm sido relatadas infectando hospedeiras
não-cultivadas dentro da família botânica Euphorbiaceae: Euphorbia mosaic virus
(EuMV; HERNÁNDEZ-ZEPEDA et al., 2007), Croton yellow vein virus (CYVV;
HUSSAIN et al., 2011), Euphorbia yellow mosaic virus (EuYMV; FERNANDES et al.,
2011), Dalechampia chlorotic mosaic virus (DCMV; FIALLO-OLIVÉ et al., 2013),
Jatropha mosaic virus (JMV; SIMMONDS-GORDON et al., 2014), e Cnidoscolus
mosaic leaf deformation virus (CnMLDV; MELO et al., 2016). Apesar dessa
crescente diversidade de espécies, poucos estudos avaliando a variabilidade e
estrutura genética de populações desses begomovírus têm sido realizados (LEMOS,
2013; MELO, 2015; NASCIMENTO, 2015). É amplamente conhecido que a
diversidade genética de begomovírus infectando plantas cultivadas e/ou nãocultivadas no Brasil é alta (AMBROZEVICIUS et al., 2002; CALEGARIO et al., 2007;
CASTILLO-URQUIZA et al., 2008; LIMA et al., 2013; ROCHA et al., 2013; RAMOSSOBRINHO et al., 2014; FERRO, C. et al., 2017), e que populações desses vírus
apresentam estruturação biogeográfica (ROCHA et al., 2013; RAMOS-SOBRINHO
et al., 2014), com as subpopulações infectando predominantemente hospedeiros
silvestres exibindo maior variabilidade (SILVA et al., 2012; GONZÁLEZ-AGUILERA
et al., 2012; LIMA et al., 2013; ROCHA et al., 2013; RAMOS-SOBRINHO et al.,
2014; FERRO, M. et al., 2017).
Estudos sobre a diversidade e estrutura genética de populações de
begomovírus têm ajudado a entender as forças evolutivas atuando sobre esses
patógenos em condições de campo (PRASANNA et al., 2010; GONZÁLEZAGUILERA et al., 2012; SILVA et al., 2012; LIMA et al., 2013; ROCHA et al., 2013;
RAMOS-SOBRINHO et al., 2014; FERRO, M. et al., 2017), e tais informações
podem ser úteis para o desenvolvimento de estratégias de manejo voltadas para a
obtenção de plantas resistentes (GONZÁLEZ-AGUILERA et al., 2012). Nesse
contexto, o objetivo do presente trabalho foi avaliar a variabilidade e estrutura
genética de populações de CnMLDV infectando a euforbiácea Cnidoscolus urens
(L.) Arthur (cansanção) no estado de Alagoas, bem como estimar as forças
evolutivas que atuam sobre esse begomovírus.
12
2
REVISÃO DE LITERATURA
2.1
Cnidoscolus urens (L.) Arthur
O gênero Cnidoscolus Pohl (Euphorbiaceae) é constituído por cerca de 50
espécies, todas facilmente reconhecidas pelos seus tricomas urticantes (BURGER;
HUFT, 1995). São plantas endêmicas do Novo Mundo, encontradas principalmente
no México e região Nordeste do Brasil (WEBSTER, 1994; BURGER; HUFT, 1995;
MELO; SALES, 2008). No Brasil, ocorrem cerca de 18 espécies (aproximadamente
dez espécies já foram relatadas no Nordeste) (MELO; SALES, 2008). Entretanto,
apesar desta alta diversidade, o gênero é pouco estudado no país.
Cnidoscolus urens (cansanção, urtiga-cansanção) é a espécie dentro do
gênero mais amplamente distribuída, ocorrendo desde o Leste do México até a
Argentina (BURGER; HUFT, 1995; MELO; SALES, 2008). No Brasil, C. urens já foi
relatada nas regiões Nordeste (exceto nos Estados do Ceará e Maranhão), Sudeste
(exceto São Paulo), e no Distrito Federal (MELO; SALES, 2008). A planta de
cansanção possui tricomas urticantes por quase todas as suas partes vegetativas e
florais. Quando introduzidos no corpo humano, liberam uma substância que provoca
fortes dores, urticárias e até inchaços, palpitações e desmaio (LUTZ, 1914; MELO,
2008).
Plantas silvestres/não-cultivadas são amplamente conhecidas por serem
hospedeiras de fitovírus, incluindo os begomovírus (SILVA et al., 2012; LIMA et al.,
2013; ROCHA et al., 2013; RAMOS-SOBRINHO et al., 2014; FERRO, C. et al.,
2017). Infecção de C. urens por begomovírus foi relatada há mais de dez anos
(ASSUNÇÃO et al., 2006), porém só recentemente foi publicado o primeiro genoma
completo de um begomovírus ocorrendo naturalmente neste hospedeiro, o qual foi
identificado como Cnidoscolus mosaic leaf deformation virus (CnMLDV; MELO,
2016).
2.2
A família Geminiviridae
A família Geminiviridae é constituída por sete gêneros (Becurtovirus,
Begomovirus, Curtovirus, Eragrovirus, Mastrevirus, Topocuvirus e Turncurtovirus)
que se diferenciam pelo tipo de inseto vetor, gama de hospedeiros, organização
genômica e relacionamento filogenético (BROWN et al., 2012; VARSANI et al.,
13
2014). Os geminivírus possuem genoma de DNA circular de fita simples (ssDNA),
com tamanho variando entre 2,6 a 5,2 kb, e encapsidado em partículas geminadas
quasi-icosaédricas (junção de dois icosaedros incompletos, T = 1) (BROWN et al.,
2012; 2015). Com exceção do gênero Begomovirus, que pode ter integrantes mono
ou bipartidos, todos os demais representantes da família são monopartidos
(BROWN et al., 2012). Cada partícula geminada possui uma única molécula de
ssDNA, e no caso dos Begomovirus bipartidos, dois vírions contendo os diferentes
componentes genômicos (DNA-A e DNA-B) são necessários para o estabelecimento
da infecção sistêmica da planta hospedeira (BROWN et al., 2012; 2015).
Os geminivírus são geralmente transmitidos por insetos vetores, e emergiram
como o maior (em número de espécies) grupo de vírus de plantas nos últimos 20
anos, sendo capazes de infectar espécies cultivadas de grande importância
econômica em todo o mundo (INOUE-NAGATA; LIMA; GILBERTSON, 2016). Além
de
plantas
cultivadas,
os
geminivírus
infectam
plantas
ornamentais
e
daninhas/silvestres (HANLEY-BOWDOIN et al., 2013). Algumas doenças induzidas
por esses fitovírus causam grandes prejuízos na agricultura: os begomovírus Bean
golden mosaic virus (BGMV) e Bean golden yellow mosaic virus (BGYMV) infectando
feijões nas Américas; Beet curly top virus (BCTV; Curtovirus) infectando beterraba
açucareira na América do Norte e Oriente Médio; Tomato yellow leaf curl virus
(TYLCV; Begomovirus) infectando tomates em todo o mundo; African cassava
mosaic virus (ACMV; Begomovirus) infectando mandioca, Maize streak virus (MSV;
Mastrevirus) infectando milho na África; e Cotton leaf curl virus (CLCuV;
Begomovirus) infectando algodão na Ásia (HANLEY-BOWDOIN et al., 2013; INOUENAGATA; LIMA; GILBERTSON, 2016), com algumas espécies sendo capazes de
provocar perdas de até 100% (LEGG; FAUQUET, 2004; SHEPHERD et al., 2010;
SATTAR et al., 2013).
Alguns
vírus
com
características
de
geminivírus
foram
relatados
recentemente, porém são altamente divergentes dos gêneros até então descritos
para esta família: Citrus chlorotic dwarf-associated virus (CCDaV) na Turquia
(LOCONSOLE et al., 2012); Euphorbia caput-medusae latent virus (EcmLV) na
África do Sul (BERNARDO et al., 2013); French bean severe leaf curl virus
(FbSLCV) na Índia (não publicado); Grapevine red blotch associated virus (GRBaV)
nos Estados Unidos (AL RWAHNIH et al., 2013); Alfafa leaf curl virus (ALCV) na
França (ROUMANGNAC et al., 2015); Temperate fruit decay-associated virus
14
(TFDaV) no Brasil (BASSO et al., 2015); Apple geminivirus (AGV; LIANG et al.,
2015) e Mulberry mosaic dwarf-associated virus (MMDaV; MA et al., 2015) na China.
Para EcmLV, FbSLCV e ALCV, o gênero Capulavirus (Euphorbia caput-medusae
latente virus) foi proposto (BERNARDO et al., 2013; ROUMANGNAC et al., 2015).
Foi proposto ainda que algumas dessas espécies divergentes infectando videira
(KRENZ et al., 2012; AL RWAHNIH et al., 2013; POOJARI et al., 2013) sejam
classificadas como uma única espécie, Grapevine redleaf-associated virus (GRLaV),
dentro do possível novo gênero Graingemvirus (grapevine-infecting geminivirus)
(POOJARI et al., 2013). Com a era da metagenômica, e a crescente diversidade
viral, é provável que novas ordens, famílias e gêneros de vírus sejam criados num
futuro próximo (SIMMONDS et al., 2017).
2.3
O gênero Begomovirus
Apesar da diversidade geral que a família Geminiviridae apresenta, o gênero
Begomovirus é incomparavelmente o maior em número de espécies (NAVASCASTILLO; FIALLO-OLIVÉ; SÁNCHEZ-CAMPOS, 2011), com 322 atualmente
reconhecidas pelo International Comitee on Taxonomy of Viruses – ICTV
(http://www.ictvonline.org/virusTaxonomy.asp), sendo o gênero mais diverso de toda
taxonomia viral (BROWN et al., 2015).
Begomovírus são capazes de infectar uma ampla gama de plantas
dicotiledôneas e são transmitidos por insetos do grupo de espécies crípticas Bemisia
tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae) (BROWN et al., 2012; 2015), constituindo um grupo
de vírus de grande importância econômica em regiões tropicais e subtropicais
(MORALES; ANDERSON, 2001; NAVAS-CASTILLO; FIALLO-OLIVÉ; SÁNCHEZCAMPOS, 2011; BROWN et al., 2015). Nos últimos 20 anos, tem sido observada
uma rápida expansão/disseminação de begomovírus em todas as regiões do mundo,
provocada principalmente pelo inseto vetor B. tabaci Middle East-Asia Minor 1
(MEAM1; anteriormente conhecida como biótipo B) (NAVAS-CASTILLO; FIALLOOLIVÉ; SÁNCHEZ-CAMPOS, 2011; GILBERTSON et al., 2015). Esta recente
expansão na distribuição geográfica, incidência, diversidade de espécies, e
importância econômica de espécies ainda não relatadas (e também de espécies já
conhecidas), define os begomovírus como um grupo de fitovírus emergentes
(GILBERTSON et al., 2015).
15
As perdas econômicas ocasionadas por begomovírus são difíceis de avaliar.
Entretanto, é estimado que as perdas causadas por begomovírus associados ao
mosaico da mandioca (Cassava Mosaic Disease) chegam a US$ 2 bilhões por ano
na África (PATIL; FAUQUET, 2009). No Brasil, é estimado que as begomoviroses
causaram perdas de US$ 5 bilhões no período de 1995 a 2000 (JESKE, 2009). O
tomateiro e o feijoeiro são as principais culturas afetadas por begomovírus no Brasil,
com perdas que podem chegar a 100% (LIMA; HAJI, 1998; MORALES; ANDERSON
2001). Para os feijões (Phaseolus spp.), perdas médias anuais de 20% têm sido
estimadas (FARIA et al., 2014).
Diferentes sintomas como nanismo, deformação foliar, uma combinação de
mosaico/mosqueado de verde-claro a amerelo-dourado, amarelecimento venal ou
intervenal, e pontos amarelos nas folhas podem ser induzidos por begomovírus
(INOUE-NAGATA; LIMA; GILBERTSON, 2016). Diferentes isolados de uma mesma
espécie podem causar sintomas que variam significativamente, dependendo do
background genético do hospedeiro, das condições ambientais e do estágio de
crescimento e condições fisiológicas do hospedeiro no momento da infecção (PICÓ;
DÍEZ; NUEZ, 1996).
A correta identificação de espécies de begomovírus requer o uso de técnicas
moleculares como RCA (rolling circle amplification) e PCR (polymerase chain
reaction), seguidos de sequenciamento (INOUE-NAGATA; LIMA; GILBERTSON,
2016). A amplificação por círculo rolante utiliza a DNA Polimerase do bacteriófago
Φ29, e é capaz de amplificar DNA circular sem prévio conhecimento de sua
sequência com o uso de primers randômicos (INOUE-NAGATA et al., 2004). Esta
técnica simplificou e agilizou sobremaneira a amplificação e clonagem de genomas
completos de novos begomovírus e outros geminivírus (frequentemente muito
divergentes), possibilitando um aumento significativo no número de novas espécies
descritas em hospedeiros cultivados e não-cultivados (BROWN et al., 2015).
Recentemente, os critérios para demarcação de espécies dentro do gênero
Begomovirus foram revisados (BROWN et al., 2015), ficando estabelecido o limiar
(para identificação de espécies) de ≥91% de identidade para sequências
nucleotídicas do DNA-A em comparações pareadas utilizando-se o programa
Sequence Demarcation Tool (SDT; MUHIRE et al., 2014).
16
2.2.1 Organização genômica e funções das proteínas dos begomovírus
Os begomovírus podem ser mono (apenas um componente genômico) ou
bipartidos (dois componentes genômicos conhecidos como DNA-A e DNA-B). Os
componentes genômicos dos vírus bipartidos apresentam uma região conservada de
aproximadamente 200 nucleotídeos (região comum) que abriga a origem de
replicação (ori) numa estrutura em forma de grampo com o nonanucleotídeo
conservado 5’-TAATATTAC-3’ (JESKE, 2009; BROWN et al., 2012; BROWN et al.,
2015).
Geograficamente, os begomovírus são separados em dois grandes grupos
(provavelmente por consequência da deriva continental): Velho Mundo/Old World
(VM/OW), que compreende África, Europa, Ásia e Austrália; e Novo Mundo/New
World (NM/NW), compreendendo as Américas (GILBERTSON et al., 2015; INOUENAGATA; LIMA; GILBERTSON, 2016). Os begomovírus do VM são em sua maioria
monopartidos, com alguns representantes bipartidos, e frequentemente associados
a DNAs satélites; por sua vez, os begomovírus do NM são quase que
exclusivamente
bipartidos
(BROWN
et
al.,
2015;
INOUE-NAGATA;
LIMA;
GILBERTSON, 2016). Os poucos begomovírus monopartidos nativos do NM são:
Tomato leaf deformation virus (ToLDeV; SÁNCHEZ-CAMPOS et al., 2013;
MELGAREJO et al., 2013); Tomato mottle leaf curl virus (ToMoLCV); e Tomato
severe leaf curl virus (ToSLCV; GILBERTSON et al., 2015).
O genoma dos begomovírus possui ORFs (open reading frames) que
codificam proteínas multifuncionais. A multifuncionalidade de proteínas destaca a
plasticidade através da qual a evolução junta diferentes domínios, aparentemente
não relacionados, em uma única cadeia polipeptídica (WALSH; MOHR, 2006), o
que, no caso dos geminivírus, acaba sendo uma compensação ao pequeno tamanho
do genoma (FONDONG, 2013). É geralmente aceito que begomovírus possuem de
seis a oito ORFs (Fig. 1), considerando que quatro estão no sentido complementar
do DNA-A/genoma (bipartido/monopartido) [AC1/C1 (replication initiator protein ou
replication-associated protein – Rep), AC2/C2 (transcription activator protein – TrAP),
AC3/C3 (replication enhancer protein – REn) e AC4/C4] e uma no sentido viral [V1
(coat protein)] (LI et al., 2015). De fato, este é o número de ORFs que revisões
recentes abordam para begomovírus (FONDONG et al., 2013; HANLEY-BOWDOIN,
2013), porém, sequências codificantes da ORF AC5/C5 têm sido anotadas para
17
muitos begomovírus de maneira crescente (LI et al., 2015). O DNA genômico dos
begomovírus monopartidos do VM possuem uma ORF adicional no sentido viral (V2)
que codifica a PCP (precoat protein), a qual também está presente na maioria dos
begomovírus bipartidos do VM (MELGAREJO et al., 2013). Além das ORFs, os
begomovírus apresentam uma região intergênica (intergenic region – IR) onde estão
localizados a origem de replicação e os promotores da RNA polimerase II do
hospedeiro (um no sentido viral e outro no sentido complementar) (HANLEYBOWDOIN et al., 2000; JESKE, 2009).
Figura 1 – Organização genômica dos begomovírus.
Fonte: Elaborada pelo autor da pesquisa, 2017 – Adaptado de SATTAR et al., 2013.
No início da infecção, o ssDNA viral é liberado do vírion. Através de
mecanismos que dependem exclusivamente de proteínas do hospedeiro, primers de
RNA são sintetizados e se anelam à fita simples de DNA viral iniciando a síntese de
uma fita complementar pela DNA polimerase do hospedeiro (SAUNDERS; LUCY;
STANLEY, 1992; HANLEY-BOWDOIN et al., 2013; BRIDDON, 2015). A molécula de
dsDNA (dupla fita) resultante serve como molde para transcrição, permitindo a
síntese da Rep (HANLEY-BOWDOIN et al., 2013). Esta proteína, produto da ORF
AC1/C1, é a única proteína viral absolutamente necessária para a replicação e,
apesar de não ter atividade de polimerase, estimula células já diferenciadas a entrar
18
na fase S para facilitar a replicação do DNA viral (JESKE, 2009; BRIDDON, 2015). A
Rep se liga a sequências repetidas específicas da região intergênica chamadas de
iterons e cliva a fita de DNA no nonanucleotídeo, entre os últimos T e A (5’TAATATT//AC-3’), iniciando a replicação por círculo rolante (rolling circle replication
– RCR) (FONTES; LUCKOW; HANLEY-BOWDOIN, 1992). A fita de ssDNA circular
recém-sintetizada pode ser convertida em dsDNA para entrar num novo ciclo de
replicação ou encapsidada em vírions após a síntese da proteína capsidial
(HANLEY-BOWDOIN et al., 2013). A Rep ainda está ligada à regulação gênica, uma
vez que sua ligação à origem de replicação reprime a expressão de genes no
sentido complementar (incluindo sua própria expressão) (EAGLE et al., 1994), mas
aparentemente não reprime a expressão de genes no sentido viral (SHIVAPRASAD
et al., 2005). A TrAP, produto da ORF AC2/C2, por sua vez, atua como um fator de
transcrição necessário para a expressão dos genes no sentido viral CP (AV1/V1) e
NSP (nuclear shuttle protein; BV1) em begomovírus bipartidos (SUNTER; BISARO,
1992). Essa regulação de expressão mediada por Rep e TrAP sugere a existência
de um mecanismo de controle temporal que permite trocar de expressão gênica
inicial (sentido completar) para expressão gênica tardia (sentido viral), sintetizando
as proteínas necessárias no tempo apropriado durante a infecção (BRIDDON, 2015).
A TrAP ainda está envolvida na supressão de silenciamento gênico transcricional
(TGS) e pós-transcricional (PTGS) (VANITHARANI et al., 2004; WANG et al., 2005;
RAJA et al, 2008).
O produto da ORF AC3/C3 (Ren) é uma proteína que, apesar de não ser
essencial, está envolvida na replicação e interage com a Rep, aumentando a
replicação e o acúmulo de DNA viral (SUNG; COUTTS, 1995; SUNTER et al., 1990).
A AC4/C4 é uma ORF que está completamente contida na ORF Rep, porém numa
fase de leitura diferente, sendo também a menos conservada entre os begomovírus
(FONDONG,
2013).
Seu
produto
é
uma
proteína
supressora
de
PTGS
(VANITHARANI et al., 2004), mas que em begomovírus monopartidos atua no
movimento célula-à-célula em conjunto com outras proteínas como CP e V2 (ROJAS
et al., 1998; ROJAS et al., 2001). A ORF AC5/C5 codifica uma proteína que
aparentemente não tem papel essencial no ciclo da infecção viral para alguns
begomovírus ou isolados virais (KHEYR-POUR et al., 2000; FONTENELLE et al.,
2007; MELGAREJO et al., 2013), mas sua ausência em mutantes ocasionou
sintomas menos severos (MELGAREJO et al., 2013). Um estudo mais detalhado
19
com o Mungbean yellow mosaic India virus (MYMIV; LI et al., 2015) revelou o papel
multifuncional desta proteína, que pode atuar no desenvolvimento de sintomas, na
supressão do TGS e do PTGS, e na indução de uma resposta similar a de
hipersensibilidade (hipersensitive-like response – HLR).
No sentido viral, a ORF AV1/V1 codifica a proteína da capa proteica (CP), que
além de formar o capsídeo viral, media a transmissão pelo inseto vetor (BRIDDON et
al., 1990). A CP de begomovírus monopartidos também tem a função de transportar
o DNA viral do núcleo para o citoplasma e do citoplasma para o núcleo (LIU et al.,
1999), função exercida pela NSP de begomovírus bipartidos (NOUEIRY; LUCAS;
GILBERTSON, 1994), além de atuar no movimento célula-à-célula e na infecção
sistêmica do hospedeiro (BOULTON et al., 1989; LIU; BOULTON; DAVIES, 1997;
PITAKSUTHEEPONG, 1999 apud FONDONG et al., 2013). A CP dos begomovírus
se liga à proteína GroEL (sintetizada por endossimbiontes no intestino das moscasbrancas vetoras) e à proteína codificada pela própria mosca-branca HSP16 (heat
shock protein 16; OHNESORGE; BEJARANO, 2009; RANA et al., 2012). Estas
interações podem estabilizar o vírion durante a passagem pelo intestino e/ou facilitar
sua transferência através do epitélio do intestino para a hemolinfa (HANLEYBOWDOIN et al., 2013). As duas hipóteses são compatíveis com dados que
mostram
que
diferentes
isoformas
de
GroEL,
sintetizadas
por
diferentes
endossimbiontes, afetam a eficiência de transmissão (GOTLIEB et al., 2010;
HANLEY- BOWDOIN et al., 2013).
A outra proteína sintetizada no sentido viral é a AV2/V2, que em begomovírus
monopartidos do VM funciona como proteína do movimento (POORNIMAPRIYADARSHINI et al., 2011). Além da função de movimento, a AV2/V2 também
atua como proteína anti-defesa, inibindo o silenciamento gênico (CHOWDA-REDDY
et al., 2008; ZHANG et al., 2012).
O DNA-B possui duas ORFs que codificam proteínas envolvidas no
movimento do vírus. No sentido viral, a NSP é responsável pelo transporte do
ssDNA ou dsDNA viral do núcleo para o citoplasma (NOUEIRY; LUCAS;
GILBERTSON, 1994). A NSP se liga ao DNA viral formando o complexo NSPss/dsDNA, que é transportado para o citoplasma, onde interage com a MP, que
direciona o complexo para a periferia da célula vegetal para ser transportado à
célula adjacente (SANDERFOOT; LAZAROWITZ, 1995; 1996; SANDERFOOT;
INGHAM; LAZAROWITZ, 1996).
20
No sentido complementar o DNA-B codifica a MP que é envolvida no
transporte célula-à-célula através do mecanismo de aumento do limite de exclusão
dos plasmodesmas (NOUEIRY; LUCAS; GILBERTSON, 1994). A MP de Squash leaf
curl virus (SqLCV) interage com o retículo endoplasmático de células procambiais
(células vasculares imaturas) para formar túbulos que conectam uma célula a outra,
sugerindo que o complexo NSP-ssDNA viral pode ser transportado através de tais
estruturas (WARD et al., 1997).
2.2.2 Variabilidade e estrutura genética de populações de begomovírus
Vírus possuem um grande potencial para a geração de variação genética e
rápida evolução por apresentarem alta taxa de replicação, curto período de geração
e por constituírem grandes populações (DOMINGO; HOLLAND, 1997; ROOSSINCK,
1997; GARCÍA-ARENAL; FRAILE; MALPICA, 2001). Esta variação genética é
gerada por erros durante a replicação dos genomas virais (mutação), e amplificada
por recombinação, e no caso de vírus com mais de um componente genômico,
pseudorrecombinação (GARCÍA-ARENAL; FRAILE; MALPICA, 2001; SEAL; VAN
DEN BOSCH; JEGER, 2006).
Mutação é o processo pelo qual nucleotídeos que não estão presentes na fita
molde são incorporados na nova fita durante a replicação do genoma (GARCÍAARENAL; FRAILE; MALPICA, 2001). Begomovírus replicam o seu ssDNA utilizando
DNA polimerases do hospedeiro, que possuem mecanismos de correção de erro.
Entretanto, apresentam taxas de mutação semelhantes às de vírus de RNA, cujas
polimerases não possuem função de correção de erros (DUFFY; HOLMES, 2008;
2009). É sugerido que tais mecanismos de correção que atuam na replicação de
DNA em eucariotos talvez não sejam tão eficientes no processo de replicação por
círculo rolante e/ou na replicação de DNA de fita simples (VAN DER WALT et al.,
2008).
A dinâmica mutacional é o fator primário na diversificação de populações
virais (ROOSSINCK, 1997; GARCÍA-ARENAL et al., 2003), porém a recombinação
pode ter uma contribuição significativa (MARTIN et al., 2011; LIMA et al., 2013).
Recombinação é o processo pelo qual segmentos de informação genética de uma
fita de ácidos nucléicos são incorporados à fita de outro indivíduo durante a
replicação (GARCÍA-ARENAL; FRAILE; MALPICA, 2001; SEAL; VAN DEN BOSCH;
21
JEGER, 2006). Este processo facilita a transferência genética entre geminivírus, até
mesmo entre espécies distantemente relacionadas, de tal maneira que se acredita
que sua organização genômica evoluiu para maximizar seu valor adaptativo e
minimizar efeitos deletérios (MARTIN et al., 2011). A alta frequência de
recombinação que é observada em begomovírus pode ser parcialmente explicada
pelo mecanismo de replicação dependente de recombinação (recombinationdependent replication – RDR) que ocorre nos begomovírus e nos DNAs satélites
associados (JESKE; LUTGEMEIER; PREISS, 2001; ALBERTER et al., 2005). A
função primária da recombinação poderia ser a de reparar defeitos no ssDNA viral
gerados por mutações. Recombinantes que tivessem vantagem seletiva se
tornariam mais prevalentes no campo (SEAL; VAN DEN BOSCH; JEGER, 2006).
Pseudorrecombinação é a troca de componentes genômicos inteiros entre
vírus segmentados (GARCÍA-ARENAL; FRAILE; MALPICA, 2001). Em begomovírus,
esses rearranjos entre DNA-A e DNA-B já foram relatados para vírus do NM e VM
(GARRIDO-RAMIREZ et al., 2000; PITA et al., 2001; IDRIS et al., 2003; RAMOS et
al., 2003). Este fenômeno foi primeiramente observado experimentalmente
(STANLEY; TOWNSEND; CURSON, 1985), mas também ocorre naturalmente
(PAPLOMATAS et al., 1994). É mais comum que ocorra entre estirpes diferentes de
uma mesma espécie (FARIA et al., 1994; PITA et al., 2001), mas também ocorre
entre espécies distintas (GILBERTSON et al., 1993; ANDRADE et al., 2006).
Pseudorecombinantes infecciosos entre o DNA-A do Chino del tomate virus (CdTV)
e o DNA-B do BGYMV foram obtidos mesmo havendo uma baixa identidade de
sequência da região comum (68%), porém o pseudorecombinante recíproco (DNA-B
de CdTV e DNA-A de BGYMV) não foi infeccioso quando inoculado em feijoeiro
(GARRIDO-RAMIREZ et al., 2000). Essa assimetria entre a viabilidade de
pseudorrecombinantes recíprocos indica que este é um fenômeno complexo e que
envolve fatores dos vírus e também do hospedeiro (HILL et al., 1998).
A estrutura genética de populações de vírus de plantas é entendida como a
quantidade e a distribuição da variabilidade genética dentro e entre subpopulações.
A
distribuição
da
variação
gerada
por
mutação,
recombinação
e
pseudorrecombinação nas populações virais depende de dois principais processos
evolutivos: deriva genética e seleção (GARCÍA-ARENAL; FRAILE; MALPICA, 2001).
Os efeitos destes dois processos dependem de fatores ecológicos/ambientais como:
tamanho e fragmentação da população, taxa de transmissão, distribuição do vetor e
22
do hospedeiro (FONT et al; 2007). Deriva genética ocorre quando as populações
dos organismos não são grandes o suficiente para garantir que cada variante dentro
delas tenha representação na próxima geração, de maneira que efeitos estocásticos
ocorreriam durante a transmissão de características genéticas para as próximas
gerações. Por outro lado, seleção é um processo direcional pelo qual variantes com
maior adaptabilidade aumentam suas frequências na população (seleção positiva),
enquanto que variantes com menor adaptabilidade teriam suas frequências
diminuídas (seleção negativa ou purificadora) nas gerações seguintes (GARCÍAARENAL; FRAILE; MALPICA, 2001).
2.2.3 Satélites
Satélites são agentes subvirais que não possuem genes que codifiquem
funções necessárias para a sua replicação e dependem de um vírus auxiliar
coinfectando uma célula hospedeira para poderem se multiplicar. São divididos em
duas classes: 1) vírus satélites, que codificam uma proteína estrutural que encapsida
seu genoma; 2) ácidos nucleicos satélites (DNA ou RNA), que não codificam
nenhuma proteína ou apenas proteínas que não sejam estruturais (BRIDDON et al.,
2012; LOZANO et al., 2016). Begomovírus, principalmente os monopartidos do VM,
são frequentemente associados a DNAs satélites de duas classes: alfassatélites
(que são normalmente encontrados em associação com um complexo betassatélitebegomovírus) e betassatélites (BRIDDON et al., 2012; ZHOU et al., 2013; LOZANO
et al., 2016; ROSARIO et al., 2016).
Alfassatélites (anteriormente conhecidos como DNA-1) são moléculas com
tamanho aproximado de 1400 nucleotídeos (aproximadamente metade do
genoma/componente genômico de seu vírus auxiliar) que codificam uma proteína
(Replication-associated
protein,
Rep)
responsável
por
iniciar
a
replicação,
independentemente do vírus auxiliar. Sendo assim, tais moléculas não são
consideradas satélites num senso estrito, apesar de continuarem dependendo do
vírus auxiliar para encapsidação, movimento na planta e transmissão pelo inseto
vetor (BRIDDON; STANLEY, 2006; BRIDDON et al., 2012; ZHOU et al., 2013;
LOZANO et al., 2016; ROSARIO et al., 2016). Alfassatélites são semelhantes aos
componentes genômicos que codificam a Rep (DNA-R) dos nanovírus (Nanoviridae),
além de compartilharem o mesmo nonanucleotídeo 5’-TAGTATTAC-3’, sugerindo
23
que estas moléculas evoluíram a partir deste grupo de vírus (BRIDDON et al., 2004;
BRIDDON; STANLEY, 2006; BRIDDON et al., 2012; ZHOU et al., 2013). A
associação de alfassatélites com begomovírus (com ou sem betassatélites) não
apresenta uma relação direta com o desenvolvimento de sintomas na planta
hospedeira, porém, em alguns casos pode resultar na atenuação dos sintomas
(ZHOU et al., 2013).
Betassatélites (anteriormente conhecidos por DNA-β) possuem tamanho
aproximado de 1300-1350 nucleotídeos e apresentam uma ORF que codifica a
proteína βC1, de caráter multifuncional. Essa porteína atua na supressão de TGS e
PTGS e na repressão de outras respostas de defesa da planta, resultando
comumente em aumento da severidade dos sintomas da doença (em alguns casos
são até indispensáveis para o desenvolvimento dos sintomas virais típicos em
plantas hospedeiras, sendo consideradas fatores de patogenicidade) (ZHOU et al.,
2013; ROSARIO et al., 2016). Betassatélite não possuem similaridade de sequência
com o vírus auxiliar, exceto pelo nonanucleotídeo conservado 5’-TAATATTAC-3’,
nem com alfassatélites, exceto por uma região rica em adenina (HUANG et al.,
2013; LOZANO et al., 2016).
As primeiras associações begomovírus-satélite no Brasil foram relatadas em
2010 para Cleome leaf crumple virus (ClLCrV) e Euphorbia mosaic virus (EuMV)
(PAPROTKA; METZLER; JESKE, 2010). No mesmo ano, um satélite foi detectado
em associação com Melon chlorotic mosaic virus (MeCMV) na Venezuela (ROMAY
et al., 2010). Recentemente, alguns satélites foram detectados em mosca-branca
com a abordagem VEM (vector enabled metagenomics) na Guatemala e em Porto
Rico (ROSARIO et al., 2016). Todos estes relatos foram de associações entre
begomovírus e alfassatélites, e sugerem que a distribuição destas moléculas estão
bem difundidas pelo continente americano (ROSARIO et al., 2016). Até a presente
data, nenhum betassatélite foi detectado em associação com vírus nativos do NM,
apesar das tentativas de detecção direcionadas especificamente para estas
moléculas enquanto se investigava alfassatélites (ROMAY et al., 2010; ROSARIO et
al., 2016).
Uma nova classe de DNAs satélites foi identificada associada a begomovírus
infectando
malváceaes
em
Cuba
(FIALLO-OLIVÉ
et
al.,
2012).
Satélites
semelhantes haviam sido detectados usando a abordagem VEM em adultos de
moscas-brancas na Flórida (EUA) (NG et al., 2011), mas sua estrutura genômica
24
não foi descrita em detalhes (FIALLO-OLIVÉ et al., 2012). LOZANO e colaboradores
(2016) propõem o nome de deltassatélites para a classe e incluem nela, além dos
satélites cubanos (que juntamente com os satélites da Flórida são chamados de
deltassatélites do NM) (FIALLO-OLIVÉ et al., 2012), os DNAs satélites associados a
sweepovírus infectando Ipomoea spp. na Espanha (LOZANO et al., 2016) e demais
deltassatélites [ToLCV-Sat, primeiro DNA satélite associado ao begomovírus Tomato
leaf curl virus (DRY et al., 1997); o satélite associado a Sweet potato leaf curl virus
infectando Merremia dissecta (LOZANO et al., 2016)].
Rosario e colaboradores (2016) expandiram o conhecimento sobre essa nova
classe utilizando a abordagem VEM e detectaram satélites muito relacionados com
aqueles associados a begomovírus de Ipomoea spp. (LOZANO et al., 2016). Além
disso, os autores propuseram para essa mesma classe o nome de gammassatélites,
apesar de parecer que o termo deltassatélites tende a ser mais aceito, uma vez que
outras publicações já usaram tal termo (FIALLO-OLIVÉ; TOVAR; NAVÁSCASTILLO, 2016; HASSAN et al., 2016).
2.2.4 Begomovírus em plantas não cultivadas
Várias espécies de plantas não-cultivadas de diferentes famílias botânicas
têm sido relatadas como hospedeiras de begomovírus em todo o mundo
(AMBROZEVICIUS et al., 2002; IDRIS et al., 2003; JOVEL et al., 2004;
AMARAKOON et al., 2008; CASTILLO-URQUIZA et al., 2008; FIALLO-OLIVÉ et al.,
2012; SILVA et al., 2012; STEWART et al., 2014; KUMAR et al., 2016; ROMAY et
al., 2016), com algumas destas espécies virais sendo capazes de infectar plantas
cultivadas (IDRIS et al., 1999; FERNANDES et al., 2009; FERNANDES et al., 2011;
BARBOSA et al., 2012; BARRETO et al., 2013; LIMA et al., 2013; ROCHA et al.,
2013; FERNANDES et al., 2014; RAMOS-SOBRINHO et al., 2014). Além disso,
alguns begomovírus afetando culturas de importância econômica podem infectar
alternativamente hospedeiros silvestres, as quais servem como reservatórios virais,
prevenindo extinções locais desses vírus na ausência do hospedeiro cultivado
(BRACERO, 2003; ALABI et al., 2008; BARBOSA et al., 2009; ROCHA et al., 2013;
RAMOS-SOBRINHO et al., 2014).
Diante da grande diversidade de espécies de begomovírus que podem
infectar plantas não-cultivadas, é comum a ocorrência de infecções mistas (ALABI et
25
al., 2008; GARCÍA-ANDRÉS et al., 2006; MONDE et al., 2010; STEWART et al.,
2014), o que amplia as oportunidades de recombinação entre espécies próximas ou
mesmo distantemente relacionadas (GARCÍA-ANDRÉS et al., 2006; SEAL; VAN
DEN BOSCH; JEGER, 2006; LIMA et al.; 2013; RAMOS-SOBRINHO, et al. 2014;
STEWART et al., 2014.). A infecção por begomovírus recombinantes naturais tem
sido a causa de doenças de grande severidade e impacto econômico em mandioca
na África Oriental (ZHOU et al., 1997; PITA et al., 2001), em tomate na Espanha
(MONCI et al., 2002; GARCÍA-ANDRÉS et al., 2006; GARCÍA-ANDRÉS et al.,
2007a; GARCÍA-ANDRÉS et al., 2007b), e em algodão e quiabo no Paquistão
(ZHOU et al., 1998; IDRIS; BROWN, 2002; BRIDDON et al., 2014).
Plantas não-cultivadas da família Euphorbiaceae têm sido relatadas como
hospedeiras naturais de begomovírus há bastante tempo. Na década de 1930,
Jatropha gossypifolia L. foi descrita como hospedeira de begomovírus (COOK, 1931
apud SIMMONDS-GORDON, 2014). No Brasil, um begomovírus causando mosaico
em Euphorbia heterophylla L. (syn. Euphorbia prunifolia) foi relatado em 1950
(COSTA; BENNET, 1950), e provavelmente corresponde a Euphorbia yellow mosaic
virus
(EuYMV),
o
primeiro
begomovírus
de
euforbiáceas
completamente
caracterizado no país (FERNANDES et al., 2011). Com o passar dos anos, diversas
espécies têm sido descritas infectando principalmente J. gossypifolia (ROYES;
COLLINS; MAXWEL, 2006; SNEHI et al, 2011a; 2011b), Croton bonplandianus Baill
(AMIN et al., 2002; HUSSAIN et al., 2011) e Euphorbia spp. (MA et al., 2004;
HERNÁNDEZ-ZEPEDA et al., 2007; FERNANDES et al., 2011). Em 2016, uma nova
espécie foi descrita infectando Cnidoscolus urens (CnMLDV; MELO et al., 2016)
ampliando a gama de hospedeiras euforbiáceas para esse grupo de vírus.
No continente africano, a cultura de base alimentar mais importante é a
mandioca (Manihotis esculenta L.; Euphorbiaceae), e o principal fator limitante à sua
produção é um complexo de espécies de begomovírus (cassava mosaic
begomoviruses – CMBs) que causam epidemias em praticamente todos os países
africanos produtores (LEGG; FAUQUET, 2004; ALABI; KUMAR; NAIDU, 2011).
Acredita-se que estes vírus sejam nativos da África e que infectavam originalmente
plantas indígenas antes da introdução da mandioca no continente (PATIL;
FAUQUET, 2009; ALABI; KUMAR; NAIDU, 2011). Apesar de não haver provas
diretas confirmando que os CMBs sejam originados de plantas daninhas
(FAUQUET; FARGETTE, 1990; LEGG; FAUQUET, 2004), de fato, este salto de
26
hospedeiro de plantas nativas para plantas introduzidas/exóticas já foi relatado para
outras culturas na África (THRESH; FARGETTE, 2003).
27
3
MATERIAL E MÉTODOS
3.1
Coleta do material vegetal e extração de DNA
Amostras foliares de Cnidoscolus urens apresentando sintomas indicativos de
infecção
por
begomovírus
como
mosaico,
mosqueado,
amarelecimento
e
deformação foliar foram coletadas em diferentes localidades do Estado de Alagoas
(AL) em 2015 e 2016. O material vegetal foi armazenado na forma de exsicatas ou
congelado em ultrafreezer a -80 °C no Laboratório de Fitopatologia Molecular e
Virologia Vegetal (LFMVV) do Centro de Ciências Agrárias (CECA) da Universidade
Federal de Alagoas (UFAL). DNA total foi extraído a partir das amostras vegetais
ainda frescas, herborizadas ou congeladas segundo protocolo de Doyle & Doyle
(1987).
3.2
Clonagem e sequenciamento do genoma completo de begomovírus
As etapas de clonagem foram realizadas no Laboratório de Virologia Vegetal
Molecular (LVVM) da Universidade Federal de Viçosa (UVF), Estado de Minas
Gerais.
O DNA total obtido a partir de cada amostra vegetal foi utilizado como molde
para amplificação por círculo rolante (RCA) com o uso da enzima Φ29 DNA
Polimerase (INOUE-NAGATA et al., 2004). Alíquotas dos produtos de RCA foram
submetidas, individualmente, a digestão com endonucleases de restrição (ApaI,
KpnI, ou SacI) e posterior análise por eletroforese em gel de agarose a 0,8% corado
com brometo de etídeo (5 µg/mL) e visualizado sob luz ultravioleta. Produtos das
digestões que resultaram em fragmentos de ~2,6 kb (correspondentes a uma cópia
completa de cada componente genômico de begomovírus típicos do NM) foram
ligados ao vetor plasmidial pBluescript KS+ (Stratagene) previamente linearizado
com a mesma enzima, defosforilado e purificado com o kit illustra® GFX® PCR DNA
and Gel Band Purification (GE Healthcare). As ligações (vetor plasmidial + inserto
viral) foram utilizadas para transformação de células ultracompetentes de
Escherichia coli estirpe DH5α por eletroporação utilizando-se o equipamento Gene
Pulser Xcell® (BioRad). Após incubação em placas de Petri contendo meio LB (LuriaBertani), ampicilina e X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside)
por 16h a 37°C, colônias brancas, que possivelmente continham o plasmídeo
28
recombinante, foram selecionadas e repicadas para meio LB líquido com ampicilina
e incubadas por 16h a 37 °C sob agitação orbital a 200 rpm. Posteriormente, foi
realizada extração de DNA plasmidial das culturas com os kits illustra ® plasmidPrep
Mini Spin (GE Healthcare) ou Wizard® Plus SV Minipreps DNA Purification System
(Promega). A clonagem foi confirmada através do padrão eletroforético do DNA
plasmidial digerido com a enzima utilizada para clonagem. Alíquotas dos minipreps
dos clones confirmados foram submetidas a digestão com a enzima HaeIII para
seleção dos clones que foram enviados para sequenciamento por primer walking na
Macrogen, Inc. (Coréia do Sul).
3.3
Análise de sequências e demarcação de espécies
As sequências completas do DNA-A foram montadas utilizando o programa
CodonCode Aligner v.6.0.2 (www.codoncode.com) e organizadas para iniciar no
ponto de clivagem do nonanucleotídeo conservado (5’-TAATATT//AC-3’). Cada
sequência foi analisada no ORF Finder (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/) para
verificar as ORFs presentes neste componente genômico. As sequências obtidas
foram inicialmente analisadas com o algoritmo BLASTn (ALTSCHUL et al., 1990) e o
banco
de
dados
de
nucleotídeos
não-redundante
GenBank
(www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank) para determinar as espécies virais com as quais
elas compartilham maior identidade de sequência. Além das sequências geradas a
partir das amostras coletadas neste trabalho, foram utilizadas sequências de
CnMLDV obtidas por MELO (2015) e MELO et al. (2016). Comparações pareadas
foram realizadas para o conjunto de dados de DNA-A utilizando-se o programa
Sequence Demarcation Tool (SDT) v.1.2 (MUHIRE et al., 2014). Para correta
taxonomia dos novos isolados virais, foi utilizado o critério de identidade ≥91% para
sequências completas de DNA-A, estabelecido pelo Geminiviridae Study Group do
International Committe on Taxonomy of Viruses (ICTV) para demarcação de
espécies dentro do gênero Begomovirus (BROWN et al., 2015).
3.4
Alinhamento e análises filogenéticas
Alinhamentos múltiplos das sequências nucleotídicas foram preparados
através do algoritmo MUSCLE implementado no pacote MEGA6 (TAMURA et al.,
2013) e ajustados manualmente. Árvores filogenéticas para os conjuntos de dados
29
DNA-A, CP e Rep, além do DNA-A sem os blocos recombinantes detectados em CP
e Rep foram construídas utilizando-se o método de Inferência Bayesiana com a
software MrBayes (RONQUIST et al., 2012) v.3.2.6 disponibilizado no web-portal
CIPRES (MILLER et al., 2010). Os genes CP e Rep representam cerca de 70% do
DNA-A e são essenciais para transmissão pelo inseto vetor e replicação viral. Os
modelos de substituição de nucleotídeos e distribuição de heterogeneidade foram
escolhidos com o auxílio dos programas PAUP v.4.0b10 (SWOFFORD, 2003) e
MrModelTest2 v.2.3 (NYLANDER, 2004), sendo GTR+I+G o melhor modelo para
todos os conjuntos de dados. As análises foram rodadas por 10 milhões de gerações
com amostragem a cada 1000 passos, totalizando 10.000 árvores, com as 2.500
primeiras sendo descartadas como uma fase de burn-in. Probabilidades posteriores
(RANNALA; YANG, 1996) foram determinadas a partir de uma árvore consenso
majority-rule gerada com as 7.500 árvores remanescentes. As árvores foram
visualizadas
e
editadas
(ztree.bio.ed.ac.uk/software/figtree)
nos
programas
(RAMBAUT,
2014)
FigTree
e
v.1.4
Inkscape
(https://inkscape.org/pt/).
3.5
Estrutura genética e índices de variabilidade
A estrutura genética de populações para os isolados de CnMLDV foi
analisada utilizando o software STRUCTURE v.2.3.4 (PRITCHARD et al., 2000). O
modelo de ancestralidade escolhido foi o Admixture Model com frequências alélicas
independentes entre as populações. Foram determinadas 10.000 iterações de burnin e 1.000.000 de iterações após o burn-in. O número de populações (K) testadas
variou de um a dez, sendo dez corridas para cada K avaliado. O valor de ΔK
(EVANNO; REGNAUT; GOUDET, 2005) foi calculado no web-site/programa
Structure Harvester v.0.6.94 (EARL; VONHOLDT, 2012). Partindo dos resultados
obtidos com o STRUCTURE, a estrutura de subpopulações foi testada para DNA-A
e genes CP e Rep através do cálculo do índice de fixação F de Wright (FST;
WRIGHT, 1951) no programa DnaSP v.5.10 (ROZAS et al., 2003). O DnaSP foi
ainda utilizado para estimar a variabilidade genética de CnMLDV através da média
do número de diferenças de nucleotídeos por sítio (diversidade nucleotídica, π; NEI,
1987) para os conjuntos de dados DNA-A, CP e Rep da população total e das
subpopulações.
30
3.6
Análise de seleção
Para detectar evidências de seleção, os conjuntos de dados CP e Rep foram
analisados com o uso de dois diferentes métodos baseados em máxima
verossimilhança (ML) disponíveis no servidor DataMonkey (www.datamonkey.org):
Single-Likelihood
Ancestor
Counting
(SLAC),
Fixed-Effect
Likelihood
(FEL)
(KOSAKOVSKY-POND; FROST, 2005; SCHEFFLER et al., 2006). SLAC e FEL
indicam sítios (aminoácidos) sob pressão de seleção positiva ou negativa. Para
evitar erros na obtenção dos resultados, apenas grupos de
predominantemente
não-recombinantes
detectados
pelo
Genetic
sequências
Algorithm
Recombination Detection (GARD; KOSAKOVSKY-POND; FROST, 2005) foram
utilizados nas análises. O SLAC foi ainda utilizado para estimar a média da razão
entre as taxas de substituições não-sinônimas (por sítio não-sinônimo) e sinônimas
(por sítio-sinônimo), dN/dS, para CP e Rep com base nas árvores filogenéticas
inferidas pelo GARD. Adicionalmente, foi realizado o teste estatístico D de Tajima
(TAJIMA, 1989) no DnaSP. Este é um teste de neutralidade com o qual pode-se
inferir sobre evidências de seleção natural ou de eventos demográficos ocorrendo
nas subpopulações.
3.7
Análise de recombinação
A análise de recombinação foi realizada considerando dois conjuntos de
dados: sequências de CnMLDV; e sequências de CnMLDV + 122 sequências de
diferentes espécies de begomovírus do NM. Possíveis sequências parentais e
pontos (breakpoints) de recombinação foram determinados utilizando-se os métodos
RDP, Geneconv, Bootscan, Maximum Chi Square, Chimaera, SisterScan e 3Seq
implementados no pacote RDP4 (MARTIN et al., 2015). Os alinhamentos foram
analisados com configurações padrão para os diferentes métodos e a significância
estatística foi inferida por um valor P menor que o valor de corte de Bonferroni
corrigido de 0,05. Apenas eventos de recombinação detectados por pelo menos
quatro diferentes métodos foram considerados confiáveis. As evidências de
evolução em rede foram avaliadas com o método Neighbor-Net implementado no
programa SplitsTree v.4.10 (HUSON; BRYANT, 2006).
31
4
RESULTADOS
4.1
Conjunto de dados
Um total de 25 clones de DNA-A foram completamente sequenciados no
presente trabalho. Adicionalmente, foram utilizadas 18 sequências de DNA-A obtidas
por Melo (2015), totalizando 43 isolados. As sequências variaram entre 2641 a 2677
nt de comprimento, e a organização dos genes é típica de begomovírus do NM
(Tabela 1). Curiosamente, todos os isolados provenientes de amostras coletadas no
litoral Norte de AL apresentam uma ORF AC5 de 105 aa (aminoácidos), a qual não
foi encontrada nos isolados provenientes de outras reigões do Estado, aqui
denominadas como Sul de AL (Tabela 1).
4.2
Demarcação de espécies
Seguindo os critérios estabelecidos para demarcação de espécies dentro do
gênero Begomovirus (BROWN et al., 2015), a análise de comparações pareadas de
sequências nucleotídicas do DNA-A mostrou que todos os isolados pertencem a
uma única espécie: Cnidoscolus mosaic leaf deformation virus (CnMLDV).
Entretanto, foi observada a formação de dois grupos de sequências bastante
divergentes (Fig. 2). Desconsiderando o isolado recombinante BR-Mes5-16 (ver
análise de recombinação abaixo), pode-se observar que os isolados presentes no
litoral Norte (Municípios de Japaratinga, Paripueira e Porto de Pedras) são mais
proximamente relacionados entre si, apresentando identidades de sequências
variando entre 90.7-100%, enquanto os isolados provenientes de outras regiões do
Estado (Municípios de Branquinha, Maceió, Marechal Deodoro e Messias)
apresentaram identidades de sequências entre 89,5-99,9% entre si. Quando
comparados isolados presentes nesses dois grupos principais, foi observado que as
identidades de sequência variaram entre 87,2-91,5%.
Tabela 1 – Isolados de CnMLDV utilizados neste trabalho.
(continua)
Código da
Amostra
Local de Coleta
Data de coleta
Isolado*
Tamanho
do DNA-A
CP
Rep
TrAP
REn
AC4
AC5
182AL
186AL
195AL
4
5
7
C33
C01
C03
C04
1
3
C10
C11
C13
C14
C15
C16
C17
C19
C20
27C
27C
28C
C24
C25
C27
C29
C31
21C
Branquinha
Branquinha
Branquinha
Branquinha
Branquinha
Branquinha
Maceió
Messias
Messias
Messias
Messias
Messias
Marechal Deodoro
Marechal Deodoro
Marechal Deodoro
Marechal Deodoro
Marechal Deodoro
Marechal Deodoro
Marechal Deodoro
Marechal Deodoro
Marechal Deodoro
Japaratinga
Japaratinga
Japaratinga
Paripueira
Paripueira
Paripueira
Paripueira
Paripueira
Paripueira
Julho/2015
Julho/2015
Julho/2015
Abril/2016
Abril/2016
Abril/2016
Maio/2015
Maio/2015
Maio/2015
Maio/2015
Abril/2016
Abril/2016
Maio/2015
Maio/2015
Maio/2015
Maio/2015
Maio/2015
Maio/2015
Maio/2015
Maio/2015
Maio/2015
Novembro/2015
Novembro/2015
Novembro/2015
Maio/2015
Maio/2015
Maio/2015
Maio/2015
Maio/2015
Novembro/2015
BR-Bra1-15
BR-Bra2-15
BR-Bra3-15
BR-Bra4-16
BR-Bra5-16
BR-Bra6-16
BR-Mac2-15A
BR-Mes1-15A
BR-Mes2-15A
BR-Mes3-15A
BR-Mes4-16
BR-Mes5-16
BR-Md1-15A
BR-Md2-15A
BR-Md4-15A
BR-Md5-15A
BR-Md6-15A
BR-Md7-15A
BR-Md8-15A
BR-Md9-15A
BR-Md10-15A
BR-Jap1-15
BR-Jap2-15
BR-Jap3-15
BR-Par3-15A
BR-Par4-15A
BR-Par6-15A
BR-Par8-15A
BR-Par9-15A
BR-Par10-15
2642 nt
2641 nt
2642 nt
2641 nt
2641 nt
2662 nt
2676 nt
2642 nt
2653 nt
2641 nt
2663 nt
2643 nt
2677 nt
2676 nt
2663 nt
2652 nt
2652 nt
2652 nt
2651 nt
2675 nt
2676 nt
2659 nt
2659 nt
2663 nt
2663 nt
2662 nt
2661 nt
2661 nt
2663 nt
2663 nt
257 aa
257 aa
257 aa
257 aa
257 aa
257 aa
257 aa
257 aa
257 aa
257 aa
257 aa
257 aa
257 aa
257 aa
257 aa
265 aa
265 aa
265 aa
265 aa
257 aa
257 aa
257 aa
257 aa
257 aa
257 aa
257 aa
265 aa
257 aa
257 aa
257 aa
357 aa
357 aa
357 aa
357 aa
357 aa
357 aa
357 aa
357 aa
357 aa
357 aa
357 aa
357 aa
357 aa
357 aa
357 aa
357 aa
357 aa
357 aa
357 aa
357 aa
357 aa
382 aa
382 aa
382 aa
356 aa
357 aa
357 aa
357 aa
357 aa
357 aa
129 aa
129 aa
129 aa
129 aa
129 aa
129 aa
132 aa
132 aa
132 aa
132 aa
129 aa
129 aa
132 aa
132 aa
132 aa
132 aa
132 aa
132 aa
132 aa
132 aa
132 aa
172 aa
172 aa
129 aa
132 aa
132 aa
132 aa
132 aa
132 aa
129 aa
132 aa
132 aa
132 aa
132 aa
132 aa
132 aa
129 aa
129 aa
129 aa
129 aa
132 aa
132 aa
129 aa
129 aa
129 aa
129 aa
129 aa
129 aa
129 aa
129 aa
129 aa
132 aa
132 aa
132 aa
129 aa
129 aa
129 aa
129 aa
129 aa
132 aa
97 aa
97 aa
97 aa
97 aa
97 aa
97 aa
97 aa
97 aa
97 aa
97 aa
97 aa
97 aa
97 aa
97 aa
97 aa
97 aa
97 aa
97 aa
97 aa
97 aa
97 aa
97 aa
97 aa
97 aa
97 aa
97 aa
97 aa
97 aa
97 aa
97 aa
105 aa
105 aa
105 aa
105 aa
105 aa
105 aa
105 aa
105 aa
105 aa
32
Tabela 1 – Isolados de CnMLDV utilizados neste trabalho.
(conclusão)
Código da
Amostra
Local de Coleta
Data de coleta
Isolado*
Tamanho
do DNA-A
CP
Rep
TrAP
REn
AC4
AC5
22C
22C
23C
24C
24C
25C
25C
3C
4C
7C
13C
13C
14C
Paripueira
Paripueira
Paripueira
Paripueira
Paripueira
Paripueira
Paripueira
Porto de Pedras
Porto de Pedras
Porto de Pedras
Porto de Pedras
Porto de Pedras
Porto de Pedras
Novembro/2015
Novembro/2015
Novembro/2015
Novembro/2015
Novembro/2015
Novembro/2015
Novembro/2015
Novembro/2015
Novembro/2015
Novembro/2015
Novembro/2015
Novembro/2015
Novembro/2015
BR-Par11-15
BR-Par12-15
BR-Par13-15
BR-Par14-15
BR-Par15-15
BR-Par16-15
BR-Par17-15
BR-Pdp1-15
BR-Pdp2-15
BR-Pdp3-15
BR-Pdp4-15
BR-Pdp5-15
BR-Pdp6-15
2663 nt
2663 nt
2663 nt
2663 nt
2664 nt
2662 nt
2662 nt
2665 nt
2663 nt
2663 nt
2663 nt
2663 nt
2663 nt
257 aa
257 aa
257 aa
257 aa
257 aa
257 aa
257 aa
257 aa
257 aa
257 aa
257 aa
257 aa
257 aa
357 aa
357 aa
357 aa
357 aa
357 aa
357 aa
357 aa
357 aa
357 aa
357 aa
357 aa
357 aa
357 aa
129 aa
129 aa
129 aa
129 aa
129 aa
129 aa
129 aa
129 aa
129 aa
129 aa
129 aa
129 aa
129 aa
132 aa
132 aa
132 aa
132 aa
132 aa
132 aa
132 aa
132 aa
132 aa
132 aa
132 aa
132 aa
132 aa
97 aa
97 aa
97 aa
97 aa
97 aa
97 aa
97 aa
97 aa
97 aa
97 aa
97 aa
97 aa
97 aa
105 aa
105 aa
105 aa
105 aa
105 aa
105 aa
105 aa
105 aa
105 aa
105 aa
105 aa
105 aa
105 aa
*Os isolados obtidos neste trabalho estão marcados em negrito.
Fonte: Elaborada pelo autor da pesquisa, 2017.
33
Figura 2 – Matriz de identidades de sequências do DNA-A de isolados de CnMLDV.
Fonte: Elaborada pelo autor da pesquisa, 2017.
34
35
4.3
Análise filogenética
A árvore filogenética do DNA-A mostrou que os isolados de CnMLDV estão
distribuídos em dois grupos bem sustentados, com isolados localizados no litoral
Norte (Fig. 3A; em vermelho) se agrupando em um mesmo clado, e separados dos
demais isolados (Fig. 3A; em azul), sugerindo a existência de estruturação de
subpopulações. Concordando com os resultados obtidos na análise de comparações
pareadas, o isolado BR-Mes5-16 não seguiu o padrão de agrupamento segundo
local de coleta, sendo posicionado junto aos isolados do litoral Norte (Fig. 3A; em
preto). Nas filogenias baseadas nas sequências nucleotídicas dos genes CP e Rep
(Fig. 3B e 3C), pode-se observar algumas incongruências topológicas, sugerindo a
existência de recombinação entre alguns isolados de CnMLDV. A topologia da
árvore para a CP é similar à observada para o DNA-A. Entretanto, diferentemente
das filogenias para DNA-A e CP, o isolado BR-Mes5-16 se agrupou segundo origem
geográfica apenas na árvore da Rep. Evidências de recombinação podem ainda ser
observadas entre alguns isolados provenientes do município de Paripueira (litoral
Norte), os quais se agruparam com isolados de outras regiões na filogenia para o
gene Rep (Fig. 3C).
4.4
Estrutura genética e índices de variabilidade
De acordo com o método Evanno (EVANNO; REGNAUT; GOUDET, 2005), o
maior valor de ΔK calculado (229,96) foi para K=2, indicando a existência de duas
subpopulações geneticamente distintas para CnMLDV, consistente com o que foi
observado nas reconstruções filogenéticas e comparações pareadas. Além disso, a
análise no STRUCTURE sugere a existência de fluxo gênico entre as duas
subpopulações (Fig. 4). Adicionalmente, o teste de fixação de Wright (FST) indicou
um alto grau de diferenciação genética (FST/DNA-A = 0,43798) entre as duas
subpopulações. Resultados similares foram observados quando avaliados os
conjunto de dados CP (FST = 0,61685) e Rep (FST = 0,30866).
Figura 3 – Árvores filogenéticas de inferência bayesiana construídas para CnMLDV. A. DNA-A. B. Gene CP. C. Gene Rep. Isolados da
população Sul estão marcados em azul, e os da população Norte em vermelho. O isolado recombinante BR-Mes5-16 está indicado em preto
Fonte: Elaborada pelo autor da pesquisa, 2017.
36
Figura 4 – Gráfico de barras gerado pela análise de estruturação de subpopulações no software STRUCTURE. As cores representam as
subpopulações Sul (azul) e Norte (vermelho). Cada barra vertical representa um isolado viral cuja distribuição de cores é proporcional à
estimativa de cada indivíduo pertencer a cada subpopulação.
Fonte: Elaborada pelo autor da pesquisa, 2017.
37
38
Em geral, altos valores de diversidade nucleotídica (π) foram observados
para as subpopulações de CnMLDV (Tabela 2). A população total apresentou os
maiores índices de variabilidade genética, em todos os conjuntos de dados (DNA-A,
CP e Rep), quando comparada com as subpopulações locais estruturadas segundo
local de coleta. Entre as subpopulações, pode-se observar que o conjunto de dados
CP da subpopulação Sul é mais variável que o da subpopulação Norte (os outros
conjuntos de dados apresentaram índices de variabilidade semelhantes).
Tabela 2 – Diversidade nucleotídica (π) de isolados de CnMLDV.
DNA-A π*
CP π (SD)
(SD)†
CnMLDV
0,07670
0,10776
(Total)
(± 0,00270)
(± 0,00330)
CnMLDV (Sul)
21
0,05901
0,07293
(± 0,00565)
(± 0,00810)
CnMLDV
22
0,05542
0,05305
(Norte)
(± 0,00468)
(± 0,00558)
* Par-a-par, diversidade nucleotídica por sítio. / † Desvio padrão.
População
Número de
sequências
43
Rep π (SD)
0,05726
(± 0,00225)
0,04335
(± 0,00421)
0,04970
(± 0,00306)
Fonte: Elaborada pelo autor da pesquisa, 2017.
4.5
Análise de seleção
A análise de seleção utilizando os métodos SLAC e FEL indicou que grande
parte dos sítios presentes nos genes CP e Rep estão sob pressão de seleção
negativa, com alguns poucos sítios identificados sob seleção positiva (Tabela 3).
Adicionalmente, os valores de dN/dS (calculados utilizando SLAC) para CP
(0,06367) e Rep (0,17317), indicam uma forte pressão de seleção purificadora
atuando em ambos os genes.
O teste de neutralidade Tajima’s D retornou valores negativos para a
subpopulação Sul e positivos para a subpopulação Norte (Tabela 4), indicando que
eventos demográficos como expansão ou contração no tamanho populacional,
respectivamente, podem ter ocorrido recentemente nessas subpopulações. Como
estes valores foram estatisticamente não significativos, a hipótese de evolução
neutra (KIMURA, 1983) também deve ser considerada.
Tabela 3 – Sítios selecionados positiva e negativamente nos genes CP e Rep de CnMLDV.
Métodos
Conjunto
de dados
Número de
haplótipos
SLAC
FEL
Positiva
Negativa
Positiva
Negativa
CP
31
ND†
9,13,14,16,28,30,35,40,56,61,63,66,
70,74,75,77,78,81,84,85,86,87,90,93,
94,106,109,110,111,112,114,117,118,
120,121,124,125,126,127,132,134,
136,141,142,143,146,148,149,152,
153,157,158,160,161,162,164,165,
166,167,169,173,174,178,179,181,
183,186,187,188,191,194,195,199,
200,203,206,207,209,213,215,216,
230,244,245,255
17
6,9,10,13,14,15,16,23,24,27,28,30,31,34,
35,36,37,38,40,52,56,60,61,63,66,69,70,71,
72,74,75,76,77,78,79,80,81,84,85,86,87,90,
93,94,96,98,103,106,109,110,111,112,113,
114,115,117,118,119,120,121,124,125,126,
127,129,132,134,136,140,141,142,143,144,
146,148,149,150,152,153,156,157,158,160,
161,162,164,165,166,167,169,173,174,177,
178,179,181,183,186,187,188,190,191,193,
194,195,196,197,198,199,200,201,202,203,
206,207,209,210,211,213,215,216,229,230,
233,234,244,245,254,255
Rep
38
ND
3,13,17,18,25,27,33,34,40,45,47,49,
63,64,72,73,75,90,100,101,102,104,
120,161,163,164,165,168,172,173,
175,202,217,227,228,230,233,247,
251,253,257,259,267,284,294,299,
303,306, 310,317,328,329,332,348
105,145,224
3,8,9,10,13,16,17,18,20,22,25,27,28,33,34,
36,40,45,47,49,58,63,64,66,71,72,73,75,77,
79,83,84,90,96,100,101,102,104,106,120,
123,125,147,156,159,161,162,163,164,165,
166,168,169,171,172,173,175,185,189,198,
199,201,202,213,217,222,223,227,228,229,
230,233,234,239,240,242,243,247,251,253,
257,259,267,273,282,284,286,294,299,303,
306,310,312,317,328,329,332,333,348
* Sítios detectados por mais de um método estão em negrito. / † Não detectado.
Fonte: Elaborada pelo autor da pesquisa, 2017.
39
40
Tabela 4 – Teste de neutralidade D de Tajima para as ORFs CP e Rep das
subpopulações de CnMLDV.
População
CnMLDV (Sul)
CnMLDV (Norte)
*
ORF*
D de Tajima
CP
-0,43073 (ns†)
REP
-0,85380 (ns)
CP
0,45952 (ns)
REP
0,90973 (ns)
Rep, Replication-associated protein; CP, Coat protein. / †ns, valores não significativos a P > 0,10*
Fonte: Elaborada pelo autor da pesquisa, 2017.
4.6
Análise de recombinação
A análise reticulada mostrou evidências de eventos de recombinação
atuando na diversificação dos isolados de CnMLDV em todos os conjuntos de
dados avaliados (DNA-A, CP e Rep; Figs. 5 e 6). Na rede para o DNA-A, podem ser
observadas fortes evidências de que o isolado BR-Mes5-16 foi originado a partir de
possíveis eventos de recombinação ocorrendo entre isolados presentes nas duas
subpopulações (Fig. 5), como observado também para o conjunto de dados CP
(Fig. 6A). Adicionalmente, possíveis eventos de recombinação entre isolados nas
duas subpopulações foram evidenciado para o gene Rep (Fig. 6B).
A análise de recombinação no pacote RDP4 revelou pelo menos sete
eventos independentes de recombinação para o conjunto de dados formado
exclusivamente por isolados de CnMLDV (Tabela 5). O evento quatro identificou o
isolado BR-Mes5-16 como um recombinante, com possíveis breakpoints de
recombinação localizados no gene CP, como evidenciado nas análises filogenéticas
e de evolução em rede. Quando avaliado o conjunto de dados formado por
CnMLDV e outros begomovírus do NM, foram identificados 12 eventos
independentes, sendo os isolados de CnMLDV identificados como recombinantes
ou possíveis parentais (Tabela 6). Os eventos três e quatro mostram os isolados
BR-Md1-15A,
BR-Md2-15A,
BR-Md9-15A
e
BR-Md10-15A como
possíveis
recombinantes, com breakpoints de recombinação localizados na porção central do
gene Rep e no final da porção 3’ do gene CP (portanto, abrangendo a maior parte
do gene Rep, os genes REn e a TrAP e uma pequena parte do gene CP),
suportando as incongruências topológicas observadas nas filogenias para os genes
CP e Rep.
41
Figura 5 – Análise reticulada baseada no DNA-A de CnMLDV. Isolados da
subpopulação Sul estão marcados em azul e da subpopulação Norte em vermelho. O
isolado recombinante BR-Mes5-16 está indicado em preto.
Fonte: Elaborada pelo autor da pesquisa, 2017.
Figura 6 – Análise reticulada dos isolados de CnMLDV. A. Gene CP. B. Gene Rep. Isolados da subpopulação Sul estão marcados em
azul e da subpopulação Norte em vermelho. O isolado recombinante BR-Mes5-16 está indicado em preto.
Fonte: Elaborada pelo autor da pesquisa, 2017.
42
Tabela 5 – Eventos de recombinação detectados entre os isolados de CnMLDV.
Eventos
1
Pontos de recombinação
Início
Fim
2600
946
Recombinante
BR_Mac2_15A
BR_Mes2_15A
BR_Md5_15A
BR_Md6_15A
BR_Md7_15A
BR_Md8_15A
Sequências parentais
Secundária
Principal
BR_Md1_15A BR_Mes5_16
Métodosa
Valor P
RGBMCS3
4,38E-26
2
961 (?)
1784
BR_Md2_15A
BR_Md1_15A
Unknown
BR_Md5_15A
RGBMS3
1,30E-21
3
2235
2636
BR_Jap3_15
BR_Jap2_15
BR_Pdp1_15
RGBMCS3
1,79E-13
4
273
851 (?)
BR_Mes5_16
BR_Par8_15A
Unknown
RGBMCS3
7,27E-13
5
886
2300
BR_Par17_15
BR_Par3_15A
BR_Par4_15A
BR_Par6_15A
BR_Par8_15A
BR_Par9_15A
BR_Par10_15
BR_Par11_15
BR_Par12_15
BR_Par13_15
BR_Par14_15
BR_Par15_15
BR_Par16_15
BR_Jap1_15
BR_Jap2_15
BR_Mes3_15A BR_Pdp2_15
RGBMCS3
7,27E-15
6
2325
2604
BR_Md2_15A
BR_Pdp2_15
RGBMCS3
5,44E-08
7
2587
207
RMC3
3,99E-06
BR_Mes4_16
BR_Jap2_15
Unknown
BR_Par9_15A
BR_Jap1_15
a= R, RDP; G, GENECONV; B, Bootscan; M, Maxchi; C, Chimaera; S, SiScan; 3s, 3Seq.
Fonte: Elaborada pelo autor da pesquisa, 2017.
43
Tabela 6 – Eventos de recombinação detectados entre isolados de CnMLDV e begomovírus do Novo Mundo.
(continua)
Eventos
Pontos de recombinação
Início
Fim
1
96
2044
2
946
2600
Recombinante
Sequências parentais
Métodosa
Valor P
Secundária
Principal
SiYMV_NC_004639
SiMoV_NC_004637
BR_Par13_15
RGBMS3
1,85E-37
BR_Mac2_15A
BR_Mes5_16
BR_Md1_15A
RGBMCS3
3,59E-24
BR_Mes1_15A
BR_Md1_15A
RGMCS3
4,62E-19
Unknown
BR_Mes3_15A
RGBMCS3
1,20E-17
BR_Par13_15
BGMV_NC_004042
RGMCS3
1,86E-14
Unknown
BR_Par16_15
RGBMCS3
2,64E-13
BR_Mes2_15A
BR_Md5_15A
BR_Md6_15A
BR_Md7_15A
BR_Md8_15A
3
1038
2048
BR_Md10_15A
BR_Md9_15A
4
899
1784
BR_Md2_15A
BR_Md1_15A
5
1930
2414
ToCMoV_NC_003664
MaYNV_NC_017001
6
52
852
BR_Bra5_16
BR_Mes1_15A
BR_Mes2_15A
BR_Mes3_15A
BR_Mes4_16
BR_Mes5_16
BR_Bra4_16
BR_Bra6_16
44
Tabela 6 – Eventos de recombinação detectados entre isolados de CnMLDV e begomovírus do Novo Mundo.
(conclusão)
Eventos
6
Pontos de recombinação
Início
Fim
52
852
Recombinante
Sequências parentais
Secundária
BR_Bra1_15
Métodos
a
Valor P
Principal
Unknown
BR_Par16_15
RGBMCS3
2,64E-13
Unknown
BR_Par16_15
RGMCS3
5,02E-13
BR_Bra2_15
BR_Bra3_15
BR_Md4_15A
BR_Md5_15A
BR_Md6_15A
BR_Md7_15A
BR_Md8_15A
7
460
887 (?)
BR_Md2_15A
BR_Md1_15A
8
2233
2651
BR_Jap3_15
BR_Jap2_15
BR_Pdp1_15
RGBMCS3
7,98E-12
9
2042
2380
ToMoLCV_JF803246
BR_Par16_15
PhYSV_BR_Rla1_12A
RGMCS3
1,61E-11
10
435
886
BR_Mac2_15A
SimBV_FN436001
BR_Par6_15A
MCS3
5,21E-15
11
1289
2102
BR_Par6_15A
Unknown
BR_Par16_15
MCS3
1,08E-04
BR_Par16_15
PhYSV_BR_Rla1_12A
GMCS
6,90E-12
BR_Par3_15A
BR_Par4_15A
BR_Par8_15A
12
2040
2357
HyRMV1
a= R, RDP; G, GENECONV; B, Bootscan; M, Maxchi; C, Chimaera; S, SiScan; 3s, 3Seq.
Fonte: Elaborada pelo autor da pesquisa, 2017.
45
46
Para
adicionalmente
confirmar
a
ocorrência
desses
eventos
de
recombinação, árvores filogenéticas de inferência bayesiana foram inferidas para o
DNA-A, excluindo-se os blocos recombinantes identificados em CP e Rep pelo
RDP4. A árvore filogenética para o DNA-A sem o bloco recombinante envolvendo a
CP do isolado BR-Mes5-16 (evento 4; Tabela 5), mostra que esse isolado se
agrupa segundo região de origem geográfica (Fig. 7A), diferentemente do que foi
observado para os conjuntos de dados DNA-A e CP (incluindo blocos
recombinantes). Por sua vez, a topologia da árvore filogenética para o DNA-A sem
o bloco recombinante na Rep dos isolados BR-Md1-15A, BR-Md2-15A, BR-Md915A e BR-Md10-15A (eventos 3 e 4; Tabela 6) é bem semelhante às topologias das
árvores para o DNA-A e CP contendo os blocos recombinantes. Juntos, estes
resultados mostram que incongruências topológicas entre CP e Rep são resultantes
de eventos de recombinação ocorrendo nessas regiões genômicas.
Figura 7 – Árvores filogenéticas de inferência bayesiana com remoção de blocos recombinantes. A. Bloco da posição 330 a 888 (CP)
deletado do alinhamento. B. Bloco da posição 903 a 2052 (maior porção da Rep; TrAP e REn; pequena porção da CP) deletado do
alinhamento.
Fonte: Elaborada pelo autor da pesquisa, 2017.
47
48
5
DISCUSSÃO
Estudos sobre diversidade e distribuição da variabilidade genética em
populações de begomovírus têm auxiliando no entendimento dos mecanismos
evolutivos atuando sobre este importante grupo de fitovírus em condições naturais
(PRASANNA et al., 2010; GONZÁLEZ-AGUILERA et al., 2012; SILVA et al., 2012;
LIMA et al; 2013 ROCHA et al., 2013; RAMOS-SOBRINHO et al., 2014; FERRO, M.
et al., 2017). Trabalhos recentes têm demonstrado que populações de begomovírus
estão, geralmente, estruturadas biogeograficamente, com populações infectando
originalmente plantas não-cultivadas apresentando maiores índices de variabilidade
genética (SILVA et al., 2012; LIMA et al., 2013; ROCHA et al., 2013; RAMOSSOBRINHO et al., 2014). Entretando, também já foi demonstrado que alguns
begomovírus infectando hospedeiras cultivadas podem apresentar altos índices de
variabilidade
intra
e
interpopulacional
(RAMOS-SOBRINHO
et
al.,
2014;
VENKATARAVANAPPA et al., 2014; FERRO, M. et al., 2017). Similarmente, no
presente trabalho foi observado que isolados de CnMLDV, infectando a espécie
silvestre Cnidoscolus urens no Estado de AL, estão estruturados em pelo menos
duas subpopulações locais e apresentam altos índices de variabilidade genética.
Plantas cultivadas e não-cultivadas pertencentes à família Euphorbiaceae são
conhecidas por hospedarem uma alta diversidade de espécies de begomovírus
(MORALES; ANDERSON, 2001; HERNÁNDEZ-ZEPEDA et al., 2007; HUSSAIN et al.,
2011; FERNANDES et al., 2011; FIALLO-OLIVÉ et al., 2013; SIMMONDS-GORDON
et al., 2014; MELO et al., 2016). Em Alagoas, CnMLDV foi o único begomovírus encontrado
em plantas de C. urens coletadas nos anos de 2015 e 2016. As duas subpopulações de
CnMLDV apresentaram índices de variabilidade genética similares aos de populações
de diferentes begomovírus que infectam hospedeiros silvestres (LIMA et al; 2013
ROCHA et al., 2013; RAMOS-SOBRINHO et al., 2014; FERRO, M. et al., 2017).
Curiosamente, a CP foi a região genômica mais diversificada dentro do DNA-A de
CnMLDV, em contraste com outras populações brasileiras de begomovírus, onde é
observado que a Rep apresenta maiores índices de variabilidade (LIMA et al, 2013;
SILVA et al., 2012; ROCHA et al., 2013; RAMOS-SOBRINHO et al., 2014; FERRO M.
et al., 2017). Esta alta variação observada para CP em CnMLDV pode ser explicada,
em parte, pelos eventos frequentes de recombinação ocorrendo nessa região, como
49
já constatado para a Rep de begomovírus infectando hospedeiras leguminosas (LIMA
et al., 2013; RAMOS-SOBRINHO et al., 2014). Quando avaliada a população total, os
maiores valores de variabilidade são provavelmente devidos à estruturação
populacional dos isolados de CnMLDV, refletindo desta forma a variação existente
entre as subpopulações.
Estruturação
genética
de
populações
em
begomovírus
é
fortemente
influenciada por forças evolutivas como mutação e recombinação, e a interrelação
entre vírus/vetor/hospedeiro (NAVAS-CASTILLO et al., 2011; LIMA et al., 2013;
ROCHA et al., 2013; RAMOS-SOBRINHO et al., 2014). Assim como observado para
begomovírus infectando hospedeiras solanáceas e leguminosas (ROCHA et al., 2013;
RAMOS-SOBRINHO et al., 2014), os isolados de CnMLDV estão estruturados
biogeograficamente, apesar da pequena distância que separa as duas regiões de
amostragem [a menor distância entre os pontos de coleta foi de 31 km (entre os
municípios de Paripueira e Messias), e a maior foi de 82 km (entre os municípios de
Japaratinga e Branquinha)]. A existência de uma possível ORF AC5 de 105
aminoácidos encontrada apenas em isolados pertencentes à população do litoral
Norte é evidência adicional dessa estruturação populacional. Uma hipótese alternativa
para a estruturação biogeográfica observada no presente trabalho é a possível
existência de diferentes populações do hospedeiro C. urens. Em Pernambuco (PE),
foram observadas duas populações de C. urens segundo distribuição geográfica,
sendo o conjunto um encontrado da Zona da Mata ao Agreste, e o conjunto dois
restrito à região litorânea (MELO; SALES, 2008). Dada a proximidade entre os
Estados de AL e PE, é possível que os dois conjuntos de populações de C. urens
também ocorram em AL. Além disso, a presença da ORF AC5 nos isolados da
população Norte podem também suportar esta hipótese. Caso a ORF AC5 de
CnMLDV codifique uma proteína relacionada com TGS, PTGS e/ou resposta
semelhante à de hipersensibilidade (LI et al., 2015), seria uma evidência da estreita
relação entre esses isolados e seu hospedeiro. Como apenas amostras no Estado de
AL foram avaliadas, a obtenção de um número maior de isolados de CnMLDV
provenientes de diferentes localidades é necessária para uma conclusão definitiva
sobre a estruturação genética desse begomovírus.
Recombinação é um dos principais fatores atuando para a variabilidade
genética e evolução dos begomovírus (LEFEUVRE et al., 2007; 2009; PRASANNA;
RAI, 2007; MARTIN et al., 2011; SILVA et al., 2011; 2012; LIMA et al., 2013; ROCHA
50
et al., 2013; HOSSEINZADEH et al., 2014; RAMOS-SOBRINHO et al., 2014;
VENKATARAVANAPPA et al., 2014), sendo responsável pelo surgimento de novas
espécies e/ou isolados causando grandes prejuízos em culturas de importância
econômica em todo o mundo (ZHOU et al., 1997; MONCI et al., 2002; IDRIS;
BROWN, 2002; BRIDDON et al., 2014). Diversos trabalhos têm demonstrado que, em
begomovírus, a região do gene CP é um coldspot de recombinação, enquanto Rep e
a Região Intergênica (IR) são consideradas hotspots de recombinação (STANLEY,
1995; FAUQUET et al., 2005; GARCÍA-ANDRÉS et al., 2007b; LEFEUVRE et al.,
2007; SILVA et al., 2012; ROCHA et al., 2013; LIMA et al., 2013; RAMOS-SOBRINHO
et al., 2014). Curiosamente, diversos breakpoints de recombinação foram detectados
em CP (além da Rep e IR) para os isolados de CnMLDV, estando diretamente
relacionados com os altos índices de variabilidade observados para este gene. Pelo
menos sete eventos independentes de recombinação foram encontrados em
CnMLDV, mostrando que esse begomovírus é altamente recombinante. Além de
recombinação, evidências da influência de mutações atuando na diversificação dos
isolados de CnMLDV foi observada nas análises de evolução em rede (ramos longos
associados aos táxons).
Dada a natureza multifuncional de muitas proteínas virais, essas estão sujeitas
a diferentes pressões seletivas (GARCIA-ARENAL; FRAILE; MALPICA, 2003).
Seleção negativa ou purificadora tem sido detectada como uma das principais forças
seletivas atuando sobre populações de begomovírus (SILVA et al., 2012; LIMA et al.
2013; ROCHA et al., 2013; RAMOS-SOBRINHO et al., 2014), provavelmente porque
a maioria das mutações tendem a ser deletérias (GARCIA-ARENAL; FRAILE;
MALPICA, 2003; SEAL; VAN DEN BOSCH; JEGER, 2006). Apesar da alta
variabilidade nucleotídica observada entre isolados de CnMLDV, forte seleção
purificadora (dN/dS < 0,2) atua sobre os sítios codificados pelas ORFs CP e Rep. Isso
significa que grande parte das mutações ocorrendo em CnMLDV são sinônimas,
resultando em poucas alterações na sequência de aminoácidos, e consequentemente
na conservação da estrutura e função da proteína. A CP dos begomovírus está
diretamente envolvida na transmissão por mosca-branca, e interage com proteínas
dos endossimbiontes e do inseto vetor (BRIDDON et al., 1990; OHNESORGE;
BEJARANO, 2009; RANA et al., 2012). A Rep, por sua vez, contem múltiplos
domínios relacionados com o processo de replicação viral (ILYINA; KOONIN, 1992;
HEYRAUD-NITSCHKE et al., 1995; OROZCO et al., 1997; NASH et al., 2011).
51
Portanto, a conservação dessas proteínas é importante para a manutenção dos
principais processos biológicos dos begomovírus, incluindo CnMLDV.
52
6
CONCLUSÕES
•
Isolados do begomovírus CnMLDV apresentam alta variabilidade genética, e
estão estruturados biogeograficamente em pelo menos duas subpopulações locais no
Estado de Alagoas.
•
Mutação, recombinação e seleção negativa são os principais mecanismos
evolutivos atuando na evolução/diversificação de CnMLDV.
53
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