Determinação do potencial alelopático e composição química de extratos vegetais da espécie Croton heliotropiifolius kunth no controle de Bidens pilosa (L.) e Digitaria insularis (L.) Fedde.
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UNIVERSIDADEFEDERAL DE ALAGOAS
CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PROTEÇÃO DE PLANTAS
CHRYSLANE BARBOSA DA SILVA
DETERMINAÇÃO DO POTENCIAL ALELOPÁTICO E COMPOSIÇÃO
QUÍMICA DE EXTRATOS VEGETAIS DA ESPÉCIE Croton heliotropiifolius
kunth NO CONTROLE DE Bidens pilosa (L.) e Digitaria insularis (L.) Fedde
Rio Largo – AL,
2018
CHRYSLANE BARBOSA DA SILVA
DETERMINAÇÃO DO POTENCIAL ALELOPÁTICO E COMPOSIÇÃO
QUÍMICA DE EXTRATOS VEGETAIS DA ESPÉCIE Croton heliotropiifolius
kunth no controle de Bidens pilosa (L.) E Digitaria insularis (L.) Fedde
Dissertação apresentada ao Programa de PósGraduação em Proteção de Plantas, do Centro de
Ciências Agrárias da Universidade Federal de
Alagoas, como requisito para a obtenção do título
de Mestre em Proteção de Plantas.
Orientadora: Profa. Dra. Lígia Sampaio Reis
Co-Orientador: Prof. Dr. João Gomes da Costa
Rio Largo – AL,
2018
Catalogação na fonte
Universidade Federal de Alagoas
Biblioteca Setorial do Centro de Ciências Agrárias
Bibliotecário: Erisson Rodrigues de Santana
S586d Silva, Chryslane Barbosa da
Determonação do potencial alelopático e composição quimica
de extratos vegetais da espécie Croton heliotropiifolius kunth no
controle de Bidens pilosa (L.) e Digitaria insularis (L.) Fedde. Rio
Largo - AL – 2018.
92 f.; il; 33 cm
Dissertação (Mestrado em Proteção de Plantas) - Universidade
Federal de Alagoas, Centro de Ciências Agrárias. Rio Largo, 2018.
Orientador(a): Prfª. Drª. Ligia Sampaio Reis
Co-Orientador: Prof. Dr. João Gomes da Costa.
1. Plantas infestanters 2. Alelopatia 3. Metabolitos secundarios.
I. Título.
CDU: 632.5
A minha mãe Marinalva Sabino da Silva, meu pai José Barbosa da Silva, minha
avó Josefa e meus irmãos Kelly Barbosa da Silva, Alexandre Barbosa da Silva e
Acássio Barbosa da Silva.
Aos que acreditaram e incentivaram meus sonhos.
Dedico este Trabalho
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Deus pela coragem, determinação e sabedoria, sendo meu
porto seguro no decorrer da longa jornada cotidiana, guiando-me para continuar firme e
perseverante para alcançar minhas metas.
Agradeço a minha mãe Marinalva Sabino da Silva e ao meu pai José Barbosa da
Silva por me acompanharem nos momentos mais difíceis, sempre me incentivando até o
término.
A minha avó Josefa Isidoro Sabino da Silva e familiares pelo apoio e compreensão
na concretização da minha profissão. E aos meus irmãos Kelly Barbosa da Silva, Alexandre
Barbosa da Silva e Acássio Barbosa da Silva por constituírem meu porto seguro na
concretização dos meus sonhos e por sempre enxergarem o melhor de mim.
A Profa. Dra. Lígia Sampaio Reis, pela honra de poder ter tido o prazer de contar com
a sua preciosa orientação e companheirismo no decorrer da minha vida enquanto graduanda
pesquisadora. Ao meu estimado Co – Orientador Prof. Dr. João Gomes da Costa pelo seu
incentivo e pela realização das análises estatísticas.
Aos professores da Universidade Estadual de Alagoas e do Centro de Ciências
Agrárias, especialmente do Curso de Pós-Graduação em Proteção de Plantas que contribuíram
de maneira magistral para a minha formação acadêmica.
Ao Prof. Dr. Antônio Euzébio Goulart Santana da Universidade Federal de Alagoas
Coordenador do Laboratório de Pesquisa em Recursos Naturais - LRPQN da
UFAL/MACEIÓ, e ao Prof. Dr. Ticiano Gomes do Nascimento Coordenador do Curso de
Farmácia/ESENFAR por terem me dado à oportunidade de realizar os experimentos em seus
Laboratórios.
Aos amigos e demais funcionários do Laboratório de Pesquisa em Recursos Naturais LRPQN da UFAL/MACEIÓ, Aldy, Maurício, Maria Aparecida, Ana Paula, Gebson,
Arthur Ferreira, Jovem, Cicero, Regina, Henrique F.G., Dailson e demais colegas pela
amizade e ajuda na execução das análises nos laboratórios. E aos funcionários da Embrapa
Tabuleiros Costeiros, Rio Largo - AL, pela ajuda durante a coleta no material no campo.
A todos que contribuíram direto ou indiretamente para a concretização desse projeto,
os meus mais sinceros agradecimentos. OBRIGADA!
Chryslane Barbosa da Silva
RESUMO
A capacidade de expansão das plantas daninhas em diferentes áreas agrícolas tem
proporcionado interferência no desenvolvimento das cultivares, promovendo a diminuição da
produção e causando prejuízos econômicos. Uma das formas de manejo cultural dessas
espécies se dá através da alelopátia. Este manejo ocorre através do mecanismo no qual as
plantas em função de sua composição química exercem efeito positivo e/ou negativo sobre
outras plantas, desempenhando papel primordial na minimização de impactos na agricultura.
Diante disso, o trabalho teve por objetivo determinar o potencial alelopático e a composição
química de extratos vegetais da Croton heliotropiifolius Kunth no controle de Bidens pilosa
(L.) e Digitaria insularis (L.) Fedde. O material vegetal foi coletado, seco, triturado e
utilizado para o preparo dos extratos brutos por maceração etanólica e decocção. A
determinação dos compostos foi realizada de forma quali-quantitativa, respectivamente, pelo
teste de Folin Ciocalteau, teor de flavonoides em espectrofotômetro UV-Vis, prospecção
fitoquímica preliminar e por Cromatografia liquida de Alta Eficiência (HPLC). As soluções
dos extratos foram preparadas a 1mg/mL (100%), desta foi obtido soluções teste nas
concentrações de 0,1; 0,25; 0,5 e 1 mg/mL, tendo água destilada como controle. Após o
preparo das soluções aferiu-se o pH e avaliou-se o potencial osmótico em alíquotas de 10µL
destas soluções. De cada solução estoque foi aplicado 7 mL em quatro repetições e
distribuídas 25 sementes das plantas alvo, estas foram mantidas em câmara do tipo BOD com
fotoperíodo de alternância (12L:12E), durante 10 dias. O experimento foi montado em
delineamento inteiramente casualizado e os dados foram submetidos ao teste de Dunnett a 5%
de probabilidade, para comparar cada tratamento com a testemunha. Os valores de pH
variaram entre 5,70 a 7,62 (extrato aquoso) e 4,60 a 5,70 (extrato etanólico), e os do potencial
osmótico entre -0,000 a -0.0244 (extrato aquoso) e -0,000 a -0,0244 (extrato etanólico). O
conteúdo de fenóis totais variam de 216,06 mg EAG/g para o extrato aquoso à 342,2499243
mg EAG/g para o extrato etanólico. Observou-se ainda a presença de metabolitos como
taninos flobafênicos, flavonas, flavonóis, e xantonas, catequinas, saponinas. Os resultados do
teste alelopático demonstraram redução da porcentagem de germinação, diminuição do índice
de velocidade de germinação, redução da porcentagem de plântulas com anormalidades e
diminuição do comprimento da raíz e parte aérea a partir da concentração de 0,25, 0,5 e
1mg/mL para B. pilosa e D. insularis, quando submetidas ao extrato etanólico e aquoso,
evidenciando a efeito alelopático dos extratos da C. heliotropiifolus pela redução da
porcentagem de germinação e comprimento da raiz, parâmetros estes consideradas
determinantes para o bioensaio de germinação. Portanto, constatou-se maior sensibilidade das
espécies B. pilosa e D. insularis quando submetidas ao extrato aquoso a partir das
concentrações de 0,25, 0,5 e 1mg/mL, isto devido à presença de compostos como ácidos
fenólicos e flavonoides no extrato aquoso e que dentre as espécies alvo a D. insularis revelou
ser mais sensível.
Palavras-chave: Plantas infestantes. Controle. Alelopatia. Metabolitos secundários.
ABSTRACT
The expansion of weeds in different agricultural areas has interfered in the development of the
cultivars, leading to decrease of production and economic losses. One of the forms of cultural
management of these species occurs through allelopathy. This management occurs through
the mechanism in which the plants according to their chemical composition from certain
plants apply positive and / or negative effects on other plants, playing an important role by
minimizing impacts in agriculture. This work aims to evaluate the allelopathic potential and
chemical composition of Croton heliotropiifolius Kunth extracts in the control of Bidens
pilosa (L.) and Digitaria insularis (L.) Fedde. The vegetal material was collected, dried,
crushed and used for the preparation of the crude extracts by maceration with ethanol and
decoction. The determination of the compounds was performed quantitatively, respectively,
by the Folin Ciocalteau test, flavonoid content in UV-Vis spectrophotometer, preliminary
phytochemical screening and High Performance Liquid Chromatography (HPLC). The extract
solutions were prepared at 1mg / mL (100%), from which test solutions were obtained at the
concentrations of 0,10;0,25;0,5 and 1 mg/mL, having distilled water as control. After
preparation of the solutions, pH was checked and the osmotic potential was evaluated in
aliquots of 10μL of these solutions.7 mL of each stock solution were applied in four
replicates and 25 seeds of the target plants were distributed ; these were kept in a BOD type
chamber with alternating photoperiod (12L: 12E) for 10 days. The experiment was set up in a
completely randomized design and the data were submitted to the Dunnett test at 5%
probability, to compare each treatment with the control. The pH values ranged from 5.70 to
7.62 (aqueous extract) and 4.60 to 5.70 (ethanolic extract), and the osmotic potential between
-0,000 to -0,0244 (aqueous extract) and -0,000 to -0 , 0244 (ethanolic extract). The total
phenol content ranged from 216.06 mg GAE / g for the aqueous extract to 342.22499243 mg
GAE / g for the ethanolic extract. It was also observed the presence of metabolites such as
flobafenic tannins, flavones, flavonols, xanthones, catechins and saponins. The results of the
allelopathic test showed a reduction in the percentage of germination, a reduction in the rate
of germination, a reduction in the percentage of seedlings with abnormalities and a decrease
in root and shoot length from the 0,25; 0,5 and 1mg/mL concentrations for B. pilosa and
Digitaria insularis, when submitted to the ethanolic and aqueous extract, evidencing the
allelopathic effect of C. heliotropiifolus extracts by reducing the percentage of germination
and root length, which are considered determinant parameters for the germination
bioassay.Therefore, a greater sensitivity of the species Bidens pilosa and D. insularis when
submitted to the aqueous extract from the concentrations of 0,25; 0,5 and 1 mg/mL, due to the
presence of compounds like phenolic acids and flavonoids in the aqueous extract and that the
species D. insularis revealed be more sensitive to extracts than B. pilosa, characterizing the
strong potential of C. heliotropiifolius.
Keywords: Weed plants. Control. Allelopathy. Secondary metabolites.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1. Vias de biossíntese dos metabolitos secundários em plantas...................................29
Figura 2. Fatores que podem influenciar no acúmulo de metabólitos secundários.................31
Figura 3. Estruturas químicas dos compostos fenólicos..........................................................33
Figura 4. Obtenção do extrato etanólico: Amostras vegetais do campo (A).
Amostra pesada
(B). Estufa Nova Ática (C). Amostra após o processo de trituração (D). Amostra com etanol
P.A. (E). Filtração da amostra (F). Processo de rotaevaporação (G). Solubilização da amostra
no ultrassom e Retirada da amostra do balão (H, I). Extrato etanólico (J). Capela com
circulação de ar (K)..................................................................................................................37
Figura 5. Obtenção do extrato aquoso: Amostras vegetais do campo (A).
Amostra pesada
(B). Estufa Nova Ática (C). Amostra após o processo de trituração (D). Amostra pesada (E).
Amostra e água destilada (F). Medição da temperatura (G). Homogeneização da amostra. (H).
Filtração da amostra (I). Extrato aquoso (J). Extrato em freezer (K). Processo de liofilização
(L). Extrato aquoso liofilizado (M)..........................................................................................38
Figura 6. Obtenção do potencial osmótico das diferentes concentrações dos extratos vegetais
da C. heliotropiifolius: Disco de papel (A). Pinça (B). Gaveta da porta-a mostra (C). Pipeta
automática (D). Extratos vegetais (E). Retirada de uma alíquota da amostra vegetal (F). Com a
ponta da pipeta sobre o centro do disco da amostra (G). Fecha o porta amostra (H). Fecha a
manivela (I). Inicia o ciclo de medição (J)................................................................................39
Figura 7. Croqui do teste alelopático.......................................................................................44
Figura 8. Perfis cromatográficos dos padrões de compostos 200 e 500 µg/mL-1: A- Ácido
caféico, B-Quercetina, C-Apigenina, D-Acacetina..................................................................52
Figura 9. Curvas ilustrando os parâmetros porcentagem de germinação (A), índice de
velocidade de germinação (B), porcentagem de plamntulas anormais (C), comprimento da raiz
(D), Comrpiemento da parte aérea (E), massa da matéria seca (F), em diferentes
concentrações do extrato etanólico da C. heliotropiifolius sobre B. pilosa e D. insularis.......57
Figura 10. Curvas ilustrando os parâmetros porcentagem de germinação (A), índice de
velocidade de germinação (B), porcentagem de plamntulas anormais (C), comprimento da raiz
(D), Comrpiemento da parte aérea (E), massa da matéria seca (F), em diferentes
concentrações do extrato aquoso da C. heliotropiifolius sobre B. pilosa e D. insularis...........58
LISTA DE TABELAS
Tabela 1- A presença de plantas infestantes em diferentes culturas de importância
agrícola......................................................................................................................................18
Tabela 2 - Métodos de controle de plantas daninhas na agricultura........................................22
Tabela 3. Culturas com propriedades alelopáticas..................................................................26
Tabela 4. Espécies vegetais no controle de plantas daninhas..................................................27
Tabela 5. Número de metabólitos secundários relatados a partir de plantas superiores..........28
Tabela 6. Identificação de metabólitos secundários em plantas medicinais............................30
Tabela 7. Teste para antocianina e antocianidinas, flavonas, flavonóis xantonas, chalconas e
auronas, flavonóis em prospecção de constituintes químicos de extratos vegetais..................41
Tabela 8. Teste para leucoantonocianidinas, catequinas e flavononas...................................41
Tabela 9. Condições empregadas para a determinação por HPLC de compostos presentes em
extratos aquoso e etanólico da C. heliotropiifolius Kunth........................................................43
Tabela 10. Foi obtido o rendimento percentual (%) do extrato etanólico através da massa da
amostra vegetal fresca do fruto em relação a sua massa dos extrato etanólico bruto...............47
Tabela 11. Caracterização físico química dos extratos da C. heliotropiifolius........................48
Tabela 12. Teor fenóis pelo método Folin - Cioucalteau dos extratos vegetais da C.
heliotropiifolius.........................................................................................................................49
Tabela 13. Diferentes classes de fitoquímicos nos extratos da C. heliotropiifolius.................50
Tabela 14. Padrões utilizados para identificação dos compostos presentes nos extratos da C.
heliotropiifolius com seus repectivos tempos de retenção e comprimentos de onda que
absorvem na região do UV/Vis.................................................................................................54
Tabela 15. Efeito de diferentes concentrações dos extratos da C. heliotropiifolius sobre B.
pilosa e D. insularis..................................................................................................................55
Tabela 16. Efeito de diferentes concentrações dos extratos da C. heliotropiifolius B. pilosa e
D. insularis................................................................................................................................56
LISTA DE GRÁFICOS
Gráfico 1. Curva de calibração do ácido gálico.......................................................................48
LISTA DE ABREVIATURA E SIGLAS
(FR)
Fase reversa
(CLAE/ HPLC) Cromatografia líquida de alta eficiência
(FEQL)
Fases estacionárias quimicamente ligadas
(Mpa)
Potencial osmótico
(HCl)
Ácido clorídrico
(NaOH)
Hidróxido de sódio
(CLAE-DAD)
Cromatografia líquida de alta eficiência com detector de arranjo de diodos.
(pH)
Potencial Hidrogeniônico
(LOQ)
Limite de quantificação
(Na2CO3)
Carbonato de sódio
(MS)
Massa da matéria seca
(DAD)
Detector de díodos da matriz
(IVG)
Índice de velocidade de germinação
(G%)
Porcentagem de germinação
(CPA)
Comprimento da parte aérea
(CR)
Comprimento da radícula
(R²)
r-quadrado
(TR)
Tempo de retenção
(UV/Vis)
Ultravioleta
(HPLC/CLAE)
Cromatógrafo líquido de ultra - alta eficiência
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO...................................................................................................................15
2. REVISÃO DE LITERATURA..........................................................................................17
2.1. Plantas daninhas.................................................................................................................17
2.1.1. Bidens pilosa (L)............................................................................................................19
2.1.2. Digitaria insularis(L.) Fedde .........................................................................................20
2.2.Condições climáticas que favorecem as plantas daninhas..................................................21
2.3. Métodos e estratégia de controle........................................................................................22
2.4. Alelopatia...........................................................................................................................23
2.5.Origem metabólica (Biosíntese)..........................................................................................27
2.5.1. Classes de metabolitos....................................................................................................27
2.5.2.Fatores ambientais............................................................................................................31
2.5.3.Compostos fenólicos........................................................................................................32
2.6. Croton heliotropiffiolis Kunth...........................................................................................35
3. MATERIAL E MÉTODOS...............................................................................................36
3.1. Local de realização da pesquisa.........................................................................................36
3.2. Obtenção do material botânico das espécies vegetais........................................................36
3.3. Obtenção dos extratos brutos.............................................................................................36
3.3.1. Extrato etanólico.............................................................................................................36
3.3.2. Extrato aquoso ...............................................................................................................37
3.4.Caracterização físico-química.............................................................................................38
3.4.1.Potencial de hidrogênio (pH)...........................................................................................38
3.4.2. Potencial osmótico (MPa)...............................................................................................38
3.5. Identificação e quantificação de metabolitos.....................................................................39
3.5.1. Teor de fenóis totais........................................................................................................39
3.5.2. Prospecção fitoquímica preliminar ................................................................................40
3.5.2.1.Testes para fenóis, taninos pirógalicos e taninos flobafênicos.....................................40
3.5.2.2.Teste para antocianina e antocianidinas, flavonas, flavonóis e xantonas, chalconas e
auronas, flavononois.................................................................................................................41
3.5.2.3.Teste para leucoantocianidinas, catequinas e flavanonas.............................................41
3.5.2.4.Testes para flavonóis, flavanonas, flavononois e xantonas .........................................42
3.5.2.5.Teste para esteroides e triterpenóides...........................................................................42
3.5.2.6.Teste para saponinas.....................................................................................................42
3.5.3. Identificação de compostos por HPLC...........................................................................42
3.6. Teste alelopático................................................................................................................43
3.7.Análise estatística...............................................................................................................46
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO.......................................................................................47
4.1. Caracterização físico - química .......................................................................................47
4.2. Determinação do conteúdo de fenóis totais......................................................................48
4.3. Classes de metabólitos secundários identificados.............................................................49
4.4. Perfil cromatográfico.........................................................................................................51
4.5. Avaliação do potencial alelopático....................................................................................55
5. CONCLUSÕES...................................................................................................................61
6. ANEXOS............................................................................................................................62
6.1. Cromatograma no comprimento de onda 290 nm para o extrato aquoso da parte aérea da
C. heliotropiifolius Kunth com os principais compostos identificados: 1- Flavonoide
(quercetina), 2- Flavona (acacetina)..........................................................................................62
6.2. Cromatograma no comprimento de onda 290 nm para o extrato aquoso da parte aérea da
C. heliotropiifolius Kunth com os principais compostos identificados: 1- Flavonoide
(quercetina)...............................................................................................................................62
6.3. Cromatograma no comprimento de onda 320 nm para o extrato aquoso da parte aérea da
C. heliotropiifolius Kunth com os principais compostos identificados: 1-Ácido fenólico (ácido
caféico), 2-Flavonoide (quercetina)..........................................................................................63
6.4. Cromatograma no comprimento de onda 350 nm para o extrato aquoso da parte aérea da
C. heliotropiifolius Kunth com os principais compostos identificados: 1- Ácido fenólico
(ácido caféico), 2-Flavonoide (quercetina), 3- Flavona (apigenina). .......................................63
6.5. Cromatograma no comprimento de onda 254 nm para o extrato etanólico da parte aérea
da C. heliotropiifolius Kunth com os principais compostos fenólicos identificados: 1- Flavona
(apigenina)................................................................................................................................64
6.6. Cromatograma no comprimento de onda 290 nm para o extrato etanólico da parte aérea
da C. heliotropiifolius Kunth com os principais compostos fenólicos identificados: 1Flavonoide (quercetina),2- Flavona (apigenina).......................................................................64
6.7. Cromatograma no comprimento de onda 320 nm para o extrato etanólico da parte aérea
da C. heliotropiifolius Kunth com os principais compostos fenólicos identificados: 1Flavonoide (quercetina), 2-Flavona (apigenina).......................................................................65
6.8. Cromatograma no comprimento de onda 350 nm para o extrato etanólico da parte aérea
da C. heliotropiifolius Kunth com os principais compostos fenólicos identificados: 1Flavonoide (quercetina), 2- Flavona (apigenina)....................................................................65
6. REFERÊNCIAS................................................................................................................66
15
1.
INTRODUÇÃO
Muitos estudos de ecologia das plantas daninhas dão ênfase as características e
adaptações de crescimento, que permitem a essas espécies explorar os nichos ecológicos
deixados em aberto nas terras cultivadas e os mecanismos de adaptação que lhes possibilitam
sobreviver sob condições de perturbações máximas do solo, como ocorre nos sistemas
convencionais de cultivo (RIZZARDI et al., 2008; JAKELAITIS et al., 2014; CARVALHO et
al., 2008).
Há um grande interesse em reduzir a proliferação de plantas daninhas por
representarem um dos principais problemas para agricultura, em decorrência da competição
por água, luz e nutrientes, dificultando a colheita e reduzindo a produtividade de culturas de
relevância econômica em inúmeras regiões brasileiras (MANO, 2006; VASCONCELOS et
al., 2012).
O manejo das plantas daninhas é de grande importância, pois visa reduzir o nível de
expansão sem erradicá-las, pois algumas são benéficas para a lavoura. Portanto, recomenda-se
o uso de práticas que evitem a ressemeadura de invasoras, como a manutenção de quantidade
de palha suficiente para recobrir o solo, o uso de plantas de cobertura, com efeito, alelopático
e o plantio em época adequada (GONÇALVES et al., 2015; MEHMOOD et al ., 2014).
. A alelopatia é conhecida pelos seus efeitos potivos e/ou negativos sobre o
desenvolvimento da vegetação, estes efeitos são atribuídos por substâncias químicas
produzidas e liberadas para o ambiente pelas espécies vegetais, desempenhando papel
primordial na agricultura, e na descoberta de novos compostos. Substâncias com potencial
alelopático contribuem para o controle de espécies invasoras, reduzindo o desenvolvimento
das plântulas e interferindo no seu crescimento (ISMAIL et al., 2016; KHANAM et al., 2007,
SILVA e AQUILA, 2006).
A realização de um estudo mais aprofundado sobre a importância da alelopatia
permite buscar novas substâncias de origem vegetal no controle de plantas daninhas,
proporcionando a oferta de produtos desprovidos de resíduos e agentes contaminantes (ATAK
et al., 2016). Essas substâncias alelopáticas estão distribuídas em concentrações variadas nos
diversos órgãos vegetais das plantas durante o seu ciclo de vida e podem inibir o
desenvolvimento fisiológico de outras plantas (BORELLA e PASTOLINE, 2009).
O desenvolvimento de pesquisas acerca do potencial alelopático em plantas tem se
tornado relevante, pois quando determinado através de analises e bioensaios em laboratório e
campo passa-se a ser uma opção de controle que diminui a proliferação de plantas infestantes
16
sem agredir o homem e ao meio ambiente (CREPALDI et al., 2016; CREMONEZ et al.,
2013).
Dentre as diversidades de famílias de espécies vegetais, podem-se destacar as oriundas
da família Euphorbiaceae, pois ao se estudá-la inferiram-se as mais diversas relações
existentes entre espécies do gênero Croton a presença de alcalóides, terpenóides (diterpenos,
triterpenos pentacíclicos), esteróides, proantocianidinas e flavonóides entre outras substâncias,
ditos classes de metabolitos secundários, estas estimulam e inibem o crescimento de plântulas
invasoras (SALATINO et al., 2007).
A espécie da família Euphorbiaceae Croton heliotropiifolius Kunth é conhecida como
“velame da caatinga,” “velaminho”, “velande”. A espécie possui estudos que indicam que
suas folhas e raízes possuem metabólitos como proantocianidinas condensadas e flavonoides.
Diante disso, inúmeras espécies do gênero Croton tem se tornado alvo para estudo de vários
pesquisadores, acerca da viabilidade de seus benefícios para setores como farmacêutico e
agrícola (ANGÉLICO, 2011; GOMES e BANDEIRA, 2012).
Nesse contexto, o presente trabalho teve por objetivo determinar o potencial
alelopático e a composição química de extratos vegetais da espécie Croton heliotropiifolis
kunth no controle de Bidens pilosa (L.) e Digitaria insularis (L.) Fedde.
17
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1.Plantas daninhas
A agricultura brasileira incorporar novas técnicas e métodos de controle de plantas
infestantes consideradas degradantes a natureza e a saúde do ser humano. Consequentemente
houve um aumento nas pesquisas em busca de alternativas um controle que não provoque
danos ambientais, econômicos e a saúde humana como é o caso da utilização de plantas de
cobertura como ervilha (Vicea sativa), possibilitando uma supressão de 50% de nitrogênio na
cultura do milho, bem como o cultivo das mesmas como alternativa de manejo no controle de
plantas infestantes na agricultura e das substâncias químicas presentes nas plantas com
potencial alelopático (CAPELLESSO, et al, 2016, SONEGO, 2012).
As plantas daninhas são dotadas de determinadas características que lhes são
peculiares e que interferem na estratégia de seu controle, muitas destas espécies são ditas
responsáveis pela redução da produtividade em áreas agrícolas subsequentes. Para melhorar o
sistema de manejo agrícola há necessidade de se conhecer algumas características como
rápido crescimento, alta capacidade de florescimento, habilidade de dispersão, tolerância de
variação ambiental e adaptação de práticas de manejo (OLIVEIRA et al., 2011; BINI et al.,
2015).
Essas plantas abrangem uma diversidade de espécies pioneiras que crescem e si
proliferam rapidamente em áreas agrícolas de importância econômica, exibindo sérios
problemas para as culturas agrícolas pelos múltiplos prejuízos que ocasionam baixa
produtividade (CARVALHO, 2013; PEREIRA et al., 2014).
Algumas pesquisas estão sendo feitas relacionadas ao processo seletivo de espécies
daninhas que abrangem boa parte da flora brasileira, tais pesquisas tendem a permitir uma
melhor identificação das plantas com potenciais de seleção em sistema de colheita na cultura
da cana crua possibilitando novas formas preventivas de controle alternativo (MONQUERO
et al.,2008). Para tanto, foram aproveitadas as plantas de maior ocorrência na área, tais como
Phyllanthus tenellus, Portulaca oleracea, Lepidium virginicum, Cyperus rotundus, Brachiaria
decumbens, Solanum americanum, Ipomoea grandifolia e Amaranthus retroflexus.
Essas espécies dominam culturas subsequentes com elevada capacidade de germinar
sob grandes profundidades no solo, facilidade de dispersão dos propágulos (vento, água,
animais, homem e máquinas), e rápido crescimento inicial com grande longevidade dos
dissemino-os, Conforme exposto na Tabela 1 (CUTTI et al., 2016).
18
Tabela 1. A presença de plantas infestantes em diferentes culturas de importância agrícola.
Espécie infestante
Culturas agrícolas
Citação
Dactyloctenium aegyptium
Mão-de-sapo
Euphorbia hyssopifolia Burra
Leiteira
Brachiaria plantaginea
Milhã
COSTA et al., 2013
Cana-de-açúcar
Digitaria horizontalis Willd.
Capim-colchão
Eleusine indica (L.) Gaertn.
Capim-pé-de-galinha
Pennisetum setosum (Sw.)
Capim-custódio
Bidens pilosa L.
Picão-preto
Bidens pilosa
Picão-preto
Emilia coccínea
Falsa-serralha
Malvastrum americanum
Vassourinha
Solanum americanum
Maria-pretinha
Alternanthera Philoxeroides
Carrapicho-do-brejo
Brachiaria decumbens Stapf
Braquiária Decumbens
Cyperus rotundus L.
Erva-coco
Mimosa pudica L.
Dormi-dormi
Euphorbia heterophylla Leiteiro
Physalis angulata
Bucho de rã
Brachiaria decumbens
Capim brachiaria
Commelina benghalensis
Trapoeraba
LIMA e GOMES, 2014
Soja
RONCHI et al.,2008
Mamoneira
LIMA et al., 2015
Pomar de goiaba
CRUZ et al., 2009
Milho e arroz
Fonte: Autor, 2018.
Nessa perspectiva, os ambientes agrícolas dispõem de uma gama de hortaliças,
leguminosas e frutíferas com destaque para goiabeira e o mamoeiro, frutíferas de
metabolismo fotossintético do tipo C3, caracterizado por apresentar baixa eficiência
19
fotossintética, crescimento inicial lento e pouca competitividade (COSTA et al., 2013;
ULGUIM et al., 2013).
Esses fatores favorecem plantas como Brachiaria plantaginea, Cenchrus echinatus,
Digitaria sanginalis, Bidens pilosa e Galinsoga parviflora (PEREIRA et al., 2014). Assim
como caruru-de-mancha (Amaranthus viridis), picão-preto (Bidens pilosa), tiririca (Cyperus
rotundus) e Maria-pretinha (Solanum americanum), plantas daninhas que causam
interferência em hortaliças de importância econômica como é o caso do tomateiro, além de
outras como picão-preto (Bidens subalternans D.C.), amendoim-bravo (Euphorbia
heterophylla L.), buva (Conyza canadensis L. Cronquist), capim-amargoso (Digitaria
insularis (L.) Fedde) e capim-massambará (Sorghum halepense L. Pers.) presentes em
diferentes ambientes agrícolas (RONCHI et al., 2008; SILVA et al., 2010; NUNES et al.,
2014).
2.1.1. Bidens pilosa (L.)
Um dos maiores problemas enfrentados pelos agricultores nas lavouras e culturas de
interesse econômico, comercial e ambiental é a rápida proliferação e interferência direta de
plantas daninhas. Dentre as espécies consideradas infestantes em tais ambientes pode-se
mensurar a Bidens pilosa L., pertencente à família das Asteraceas, mais conhecida como
picão-preto, é uma espécie herbácea, tem origem da América Tropical com maior incidência
na América do Sul, está presente em uma parte do território brasileiro, concentrando-se em
regiões agrícolas do Sul e Centro-Oeste, constitui uma das mais importantes ervam daninhas
anuais e perenes, além de competir com a cultura pode servir de hospedeiro de pragas e
doenças (RABÊLO et al., 2008).
A espécie B. pilosa apresenta resistências à aplicação de herbicidas de origem
sintético, sendo necessário o uso de alternativas de controle de baixo custo e fácil obtenção.
As técnicas de manejo são de fundamental importância tanto para o pequeno quanto para o
grande agricultor, através do uso de espécies, com efeito, alelopático favorecendo a
sustentabilidade das áreas agrícolas (LOUSADA et al., 2012).
Esse potencial alelopático advém de plantas com características e propriedades
medicinais fundamentais para indústria farmacêutica e medicinal e alimentícia, pois
apresentam em sua constituição os mesmos compostos químicos que são responsáveis pela
atividade medicinal, podendo influenciar positivo e negativamente sobre o desenvolvimento
de ervas daninhas (LIMA et al., 2011).
20
Sendo assim, o uso de extratos aquosos de espécies como Phytolacca dioica L.
(umbu) e Capim-limão (Cymbopogon citratus Stapf.), respectivamente nas doses de 4%, 2% e
1% (m/v) e 1 e 5%, tem sido comumente utilizado no controle de Bidens pilosa (L.).Como
forma de manejo e pratica cultural antiga que está ocupando espaço no cenário de estudo da
alelopatia, pois partir da técnica de bioensaios pode-se verificar a presença de compostos que
lhes conferem o potencial alelopático (BORELLA e PASTORINE, 2009; DALMOLIN et al.,
2012).
Segundo França et al. (2008), “a germinação de sementes de picão-preto foi reduzida
a partir da aplicação de 2,5% (p/v) do extrato metanólico de Nin (Azadirachita indica A. Jun)
atingindo uma média de inibição do crescimento de 46%”.
2.1.2. Digitaria insularis (L.) Fedde
O Brasil abrange uma diversidade de plantas do gênero Digitaria, compreendendo
cerca de 26 espécies nativas e 12 exóticas, as quais pode-se mencionar a espécie Digitaria
insulares, planta nativa de regiões tropicais e subtropicais encontrada em diversas áreas
agrícolas (cultivos anuais e perenes). A planta é caracterizada por apresentar rota
fotossintético do tipo C4, onde o ocorre maior aproveitamento de luz com maiores respostas
fotossintéticas em condições ambientais de elevada temperatura, por apresentar pequenas
sementes pilosas, facilmente dispersas pelo vento (MARTINS, 2013; MACHADO et al.,
2008).
A espécie conhecida popularmente como capim amargoso, capim-açu, capim-pororó,
pertencente à família Poaceae, destaca-se por desenvolver-se rapidamente em solos com alta
ou baixa fertilidade, reproduzindo-se anualmente, com relação à morfologia, ainda pode ser
distinguidos por apresentar colmos cilíndricos e entrenós longos, rizomas curtos e
ramificados. As folhas apresentam bainha longa e pilosa, com lígula membranácea, lâminas
foliares são lineares e acuminadas, as panículas são grandes com longas hastes, as espiguetas
são lanceoladas, estreitas e ovaladas com pelos sedosos (CARVALHO, 2011; ZOBIOLE,
2016; GOMES, 2016).
A incidência das infestantes nas áreas de cultivo depende de vários fatores, que
variam de acordo com o tipo de hortaliça, uma vez que são cultivadas em diferentes
espaçamentos, arranjos, densidades populacionais e ciclos culturais (PEREIRA e MELO,
2008).
21
A persistência da espécie no campo vem sendo de ampla velocidade de crescimento
de fácil adaptabilidade às condições edafoclimáticas e por apresentar população de biótipos
resistentes ao herbicida sintético glyphosate. Evidenciando que após 45 dias de germinação,
as raízes formam rizomas que dificultam o controle do capim, após, esse período fica difícil
de manejar em cultivos como no caso da soja, reduzindo até 45% na presença de 6 a 8 plantas
por metro quadrado (SILVA et al., 2017; BARROSO, 2013).
De acordo com Mendonça et al. (2014), a luz é considerada um fator primordial para
a germinação de algumas espécies, sendo estas classificadas de acordo a resposta à luz como
fotoblástica positiva (capacidade de germinar aumenta na presença de luz) e fotoblástica
negativa (a germinação não é afetada pela luz). Plantas do gênero digitaria demonstram
respostas diferentes à presença ou ausência de luz, como é o caso de D. horizontalis são
positivamente fotoblástica e as de D. insularis que são neutras.
Plantas de D. insularis provenientes de sementes, ainda jovens, apresentam bom
controle; em plantas perenizadas e com a presença de rizomas. É uma espécie que
desenvolve-se bem em pastagens, áreas não-agrícolas e sistemas de plantio direto. A
reprodução se dá por propagação através do vento, água, veículos, seres humanos, animais e
têm taxas de germinação de 90% maiores em comparação com outras Gramíneas (GALEANO,
2016; MORAES et al., 2011; TIMOSSI, 2009).
O ponto chave no desenvolvimento do capim amargoso é que, quando a planta esteja
estabelecida com o início da formação dos rizomas e posterior formação de grandes touceiras,
tornando-se de difícil erradicação. Quando sucedido o processo de perenização, a espécie
acaba florescendo e disseminando sementes com baixos níveis de dormência no decorrer do
ano todo, os fluxos de emergência dessa espécie é dependente da profundidade em que as
sementes se encontram e também da umidade do solo (GEMELLI et al., 2013).
2.2.Condições climáticas que favorecem as plantas daninhas
A ocorrência das plantas daninhas na comunidade agrícola pode ser alterada pelos
efeitos como qualidade de luz, esta pode ser influenciada pelas práticas de manejo da cultura.
Sendo assim, algumas plantas conseguem absorver e acumular nutrientes do solo quando
comparadas a uma erva cultivada, em virtude da elevada capacidade competitiva que expõem
(MALUTA et al.,2011).
Existem plantas que somente germinam sob condições climáticas e temperaturas
consideradas ideias para seu desenvolvimento fisiológico e regulação da absorção de água e
22
das reações bioquímicas. Essas faixas de limite consideradas máxima e mínima podem
provocar a morte do embrião, sendo necessária a utilização de temperaturas na faixa de 15 a
30ºC ou 20 a 30ºC, estas recomendadas para espécies vegetais de clima tropical e subtropical
(REGO et al., 2011; REBOUÇAS e SANTOS, 2007).
A luminosidade é considerada um dos fatores primordiais na germinação, porém,
existem plantas que germinam na ausência de luz, isso quando expostas a condições
fisiológicas e adversas do ambiente (CANOSSA et al., 2008; MONDO et al.; 2010). Cada
estímulo de luz desencadeia uma resposta que é denominada de fotoblástia, está por sua vez,
pode ser classificada em fotoblástica negativa (germinação promovida na ausência da luz) e
fotobástica positiva (germinação promovida na presença de luz).
2.3.Manejo e estratégia de controle
A dinâmica de estudo das plantas daninhas tem proporcionado novas técnicas de
manejo para serem acionadas, como alternativos métodos de controle que possam atuar na
identificação das espécies infestantes. Os herbicidas tem sido uma das formas de controle
químico de uso indispensável comumente utilizado, visto que, tem dependido de métodos e
equipamentos de aplicação, de condições edafoclimáticas, das ervas daninhas e das
propriedades físico químicas do solo (AMARAL et al., 2015; ALVES et al., 2014).
Desse modo, pode mencionar três períodos de interferência, tais como: período
anterior à interferência (PAI), período total de prevenção à interferência (PTPI) e o período
crítico de prevenção à interferência (PCPI) (SILVA et al.,2014; MELLONI et al., 2013).
É necessária a adoção de estratégias de controle que sejam adaptáveis as condições
edafoclimáticas de cada região, a fim de melhorar a qualidade do grão no País (Tabela 2).
Dentre os diversos métodos de controle pode-se mensurar o controle químico, mecânico,
cultural e biológico, mais comumente abordados em estudos relacionados a minimização de
perdas dos grãos nos cultivares anuais e perenes devido a interferência das ervas daninhas
(DUARTE et al., 2016; RONCHI et al, 2010).
Tabela 2. Métodos de controle de plantas daninhas na agricultura.
Tipos de controle
Descrição
É a utilização de produtos químicos, herbicidas,
como forma de manejo capaz de proporcionar maior
eficiência pela redução da população de espécies
daninhas em sistema produtivo agrícola.
Químico
Citado
MANCUSO
et al., 2016
23
O controle consiste na utilização de todas as práticas
agrícolas que possam ser capazes de promover
melhor desenvolvimento da cultura, através do uso
de vantagens na competição de espécies infestantes.
SILVA et
al.,2012
Cultural
O método de controle consiste no uso de capina
manual, roçagem e cultivo mecanizado como forma
de eliminação de espécies de plantas daninhas.
SANTOS et
al., 2014
Mecânico
Biológico
Corresponde à regulação do número de espécies
vegetais e animais por inimigos naturais resultante
de interações antagonísticas como parasitismo,
predação e competição.
SILVA e
BRITO,
2015
Fonte: Autor, 2018.
As técnicas de controle integrado mais eficientes e econômicos como o preventivo,
mecânico, físico, cultural, biológico e químico controle de plantas daninhas tem sido um dos
diferentes métodos de manejo que tem promovido o revolvimento do solo (MELLONI et al.,
2013; SANTOS et al., 2014).
A rápida proliferação da comunidade infestante nos ambientes agricolas
está
intimamente relacionada à composição especifica, densidade e distribuição, a própria cultura,
espécie, variedade ou cultivar e a época de extensão do período (ALVINO et al., 2011;
SOUSA, 2008). De tal modo, a seleção do método mais eficiente de controle vai depender do
período de efetivação do controle, do clima, da técnica de rotação de cultura, da
disponibilidade de produtos químicos e equipamentos.
2.4. Alelopatia
A alelopatia pode ser definida como um tipo de interferência causada por alguns
organismos, quando transferem para o ambiente, substâncias químicas ou produtos do
metabolismo secundário, denominados de aleloquímicos, sintetizados através de processos
metabólicos. Esses compostos possuem mecanismos de defesa que estão relacionados a
processos fisiológicos da planta. (SANGEETHA e BASKAR, 2015).
A
alelopatia
pode
desempenhar
um
papel
benéfico
em
várias
sistemas de cultivo agricola em rotação de cultura e no campo, fazendo uso de plantas como
girrasol (Helianthus annuus L.), este é capaz de interferir na germinação de plantas daninhas
24
em virtude da presença de compostos que são liberados através das diferentes partes do
vegetal (LOURENTE et al., 2010).
As substâncias alelopáticas liberadas pelas plantas são capazes de interferir na
germinação das sementes, no crescimento das plântulas, na assimilação de nutrientes, na
fotossíntese, na atividade de várias enzimas e na perda de nutrientes pela permeabilidade da
membrana celular (JABRAN et al., 2015; BHOWMIK, 2003).
A concepção de que o efeito alelopático esta relacionado a uma diversidade de
substâncias, podendo ser produzidos desde raízes, caule, casca do caule, folhas, frutos e
inflorecencia dos vegetais, tem permitido uma análise mais abrangente das habilidades
defensivas e agressivas de uma planta infestantes. Existem algumas condições de clima e solo
ditas primodriais para que os compostos sejam liberados no ambiente, podendo apresentar
composição diferente a depender também dos orgãos reprodutivos da espécie sob condições
de clima e solo (WANG et al., 2011;AMB e AHLUWALIA, 2016).
Na natureza as plantas produzem e liberam compostos classifcados como fenóis,
terpenos e alcalóides via exsudados radiculares no solo ou por substâncias volateis no ar.
Esses metabolitos liberados no ambiente podem afetar os componentes da comunidade,
atraves da redução de espécies vizinhas pelas propriedades fisico-quimicas (SANGEETHA e
BASKAR, 2015; SILVA, 2012).
Estas manifestações são de origem secundária com efeitos a nível celular e molecular
e seus efeitos podem ser mediados a partir de substâncias oriundos de diversas classes de
compostos, como terpenos, ácidos graxos, peptídeos, fenóis e outros (SILVA et al., 2014;
OLIVEIRA et al., 2011; RIBEIRO e LIMA, 2011).Esses compostos tem ocupado espaço
promissor na química de produtos naturais a partir de
métodos modernos de extração,
isolamento, purificação e identificação (SANTORE, 2013; MORAIS, 2013).
Os órgãos vegetais das plantas apresentam materiais alelopáticos que quando
liberados influenciam nos fenômenos vitais como fotossíntese celular, respiração, meiose e
absorção de água e nutrientes minerais (BAZIAR, 2015).
A maioria desses compostos está presente em ramos, folhas, sementes e raízes de
plantas, podendo ser facilmente liberados pela decomposição de resíduos vegetais,
volatização, lixiviação. Muitos desses compostos ao serem isolados podem ser usados na
produção de herbicidas de origem natural contribuindo para permanência a sadia das
cultivares (ISLAM e KATO-NOGUCHI, 2012; OLIVEIRA et al., 2011; CARVALHO et
al.,2016).
25
Esses metabolitos secundários na maioria das vezes são avaliados pelos impactos que
estão causando no crescimento e desenvolvimento das plantas, tendo em vista, a sequência de
eventos celulares que se dá após a redução do crescimento (BOMFIN e SCOPEL, 2017).
Fatores abióticos como temperatura, radiação, nutriente e água, e os bióticos como
doenças e pragas durante o crescimento das plântulas, podem aumentar ou diminuir a
produção de metabólitos secundários. Essas mudanças metabólicas são de fundamental
relevância atuando como mecanismo de defesa da planta, favorecendo uma maior produção
de compostos alelopáticos, modificando as estratégias de manejo da alelopátia (CORSATO et
al., 2010; CARVALHO et al.,2014).
Dentre as espécies que apresentam em sua composição princípios ativos capazes de
reduzir o crescimento e interferir no desenvolvimento de plantas daninhas pode-se mencionar
a Ficus benjamina L. espécie pertencente à família Moraceae que apresenta em sua
composição flavonoides, terpenos e cumarinas, fontes promissoras de atividade alelopática no
controle de plantas infestantes (SILVA et al., 2015; RODRIGUES, 2016).
Para uma melhor especificidade da ação alelopática, em que espécies vegetais que
depende da composição bioquímica e das características biológicas da planta doadora e
receptora, é necessário que as substâncias liberadas apresentem efeito persistente, este vai
depender da quantidade de compostos lixiviados do tecido, idade e condições edafoclimáticas
das plantas (SEAL e PRATLEY, 2010; KUNZ et al., 2016).
Os potenciais alelopáticos dos extratos vegetais das diferentes partes das espécies
doadoras têm sido determinados através de seus efeitos sobre a germinação e o alongamento
da radícula de plantas daninhas. Para se obter determinado tipo de extrato seja aquoso ou
mesmo orgânico (etanólico), pode-se utilizar diversas partes de uma mesma planta, tendo
como solvente o álcool etílico P.A. 99,5% com graus de polaridade e/ou água destilada
(GRISI et al., 2016).
De acordo com Serafin (2007), diferentes substâncias, com efeito, alelopático são
ditas de fundamental importância no processo de interação entre várias espécies em
ecossistemas naturais e agrícolas. Assim a diversidade compostos alelopáticos indica
diferentes mecanismos de ação.
Durante o processo de análises físico-química de extratos vegetais pode-se mensurar
os valores de pH entre 6,0 e 7,5 e do potencial osmótico, este considera-se adequado para a
germinação de sementes que o valor não ultrapasse – 0,2Mpa. Esses tem sido um dos
parâmetros de avaliação do período de germinação que quando relacionado as concentrações
26
de extratos para realização de ensaios alelopáticos podem influenciar no processo germinativo
(FILHO et al., 2011; BORELLA et al., 2011; LUIZ et al., 2010).
Existe uma diversidade de espécies vegetais apresentam propriedades alelopáticas,
que fornecem subsídios para serem usadas como defensivos na agricultura, quer seja pela
estimulação do crescimento da planta ou mesmo por dispor de ação biológica no controle de
ervas daninhas (Tabela 3). Com a utilização de extratos vegetais como modos alternativos de
ação, causando menos danos aos ambientes agrícolas (SANTORE, 2013; SANTOS e SILVA,
2016).
Tabela 3. Espécies vegetais no controle de plantas daninhas.
Espécie doadora
Espécie receptora
Extratos
Concentrações
brutos
Myracrodruon
urundeuva e Mimosa
tenuiflora
Allium fistulosum
L.(cebolinha)
Aquosos
PastoTanzania
(Panicum maximum
cv. Tanzania)
Maíz (Zea mays).
Bidens pilosa L.
Digitaria
horizontalis
Melinis
minutiflora
Caryocar brasiliense
Qualiea parviflora
Eugenia dysenterica
Digitaria insularis
(L.) Fedde
Ipê (Bignoniaceae)
Soja (Glycine
max (L.) Merr.) e
Milho (Zea mays)
Bidens
subalternans D.C,
Digitaria
insularis (L.)
Fedde
Citado
10, 25, 50, 75 e
100%
BRITO et al.,
2016
Etanólicos
0; 2,5; 5; 7,5 e
10%
SONEGO et al.,
2012
Aquosos
1, 3 e 5%
AIRES, 2007
0,25, 50,75 e
100%
MOREIRA e
MANDRICK,
2012
Aquosos
Aquoso e
Metanólico
5,10 e15%
NUNES et al.,
2014
Fonte: Autor, 2018.
A maioria da propriedade biológicas antes mencionadas são consideradas causadoras
da inibição do desenvolvimento das cultivares pela presença de metabolitos secundários
determinantes do potencial alelopático de uma diversidade de espécies vegetais (Tabela 4).
Sendo assim, pode-se observar a diminuição do processo germinativo de plantas daninhas
como do Bidens pilosa, Lollium multiflorum e Amaranthus retroflexus, quando submetidas
27
respectivamente aos extratos aquosos de tecidos de plantas de Leucaena Leucocephala e
Crotalária juncea, e Brassica juncea (CREMONEZ et al., 2013).
Tabela 4. Culturas com propriedades alelopáticas.
Cultura doadora
Cultura receptora
Helianthus annus
(girassol)
Gycine max (soja),
Sorghum spp.(sorgo)
Brassica campestres
(nabo)
Virginia radiata (feijão
mungo-verde)
Glycine max (soja)
Brassica rapa (mostarda),
Medicago sativa (alfafa)
Lupinus albus (tremoço)
Amaranthus retroflexus
(caruru),Chenopodium
álbum (ançarinha-branca)
Efeito causado sobre espécies
receptoras
Folhas secas quando misturadas
ao solo inibem a germinação e
reduzem o crescimento das
plântulas
Extrato aquoso de resíduos inibe
a germinação e reduz o
crescimento das plântulas
Extrato aquoso inibe a
germinação de quatro espécies e
o crescimento inicial de milho
Exsudados radiculares reduzem
o crescimento e aumentam a
atividade enzimática da catalase
Fonte: Adaptado de Oliveira et al., 2011.
Além do potencial alelopático existe também a aquisição de consórcios (Cajanus
cajan, Helianthus annus e a Vigna unguiculata) como medida de controle cultural capaz de
reduzir os valores gastos no combate de plantas infestantes (SILVAb et al., 2012).
Coffea arábica, mais conhecido como cafeeiro é conhecido como principal inibidor
do processo germinativo, visto que, possui compostos como alcaloide cafeína, este atua como
precursor do efeito alelopático de extratos obtidos a partir de folhas de 49 plantas na inibição
de Amaranthus spinosus (FRANÇA, 2007)
2.5. Origem metabólica (biossíntese)
2.5.1. Classes de metabólitos
Muitas espécies vegetais são fontes naturais de uma infinidade de substâncias
químicas que podem ser biossíntetizadas com várias finalidades, entre elas, protegê-las contra
predadores ou atrair polinizadores. As plantas produzem uma infinidade de metabolitos como
terpenos, compostos fenólicos, alcaloides com funções específicas de defesa contra o ataque
de herbívoros e microrganismos, proteção contra os raios UV, atração de polinizadores, bem
como produção de substâncias alelopáticas (VIZZOTTO et al., 2010; SILVA e LIMA, 2016).
Esses compostos orgânicos apresentam efeito defensivo são produzidos e estocados
em tecidos mais vulneráveis das plantas como gemas em estado de desenvolvimento e /ou
folhas jovens (BULGAKOB et al., 2016; KHANAM, 2007).Os metabólitos são normalmente
28
exigidos em processos preliminares do ciclo de vida das plantas e desempenham papel
primordial na interação planta e ambiente através da presença de fatores bióticos, estando
quimicamente divididos em
terpenos, compostos fenólicos e componentes contendo
nitrogênio (Tabela 5).
Tabela 5. Número de metabólitos secundários relatados a partir de plantas superiores.
Tipo de metabólitos secundários
Números aproximados
Metabólitos secundários com nitrogênio
Alcalóides
21000
Aminoácidos não-proteínas (PNAA)
700
Glucosinolatos
100
Alcamidas
150
Metabólitos secundários sem nitrogênio
Monoterpenos incluindo iridóides
2500
Sesquiterpenos
5000
Díterpenos
2500
Triterpenos, esteroides, saponinas
5000
Flavonoides, taninos
5000
Fonte: Adaptado de IRCHHAIYA et al., 2015.
Os terpenóides podem ser classificados estruturalmente como a classe mais variada
de produtos vegetais naturais e são formados pela junção de monoterpenos (C10),
sesquiterpenos (C15), díterpenos (C20), triterpenos (C30) e os tetraterpenos (C40), estes
atuam na defesa de plantas contra pragas e doenças, como defensivos desencorajando os
herbívoros, no alongamento caulinar e expansão das frutos de espécies vegetais como é o caso
dos díterpenos que tem a giberilinas como representante (NCUBE e STADEN, 2015; MANO,
2006; TURNES et al., 2014).
Os terpenóides, alcaloides e taninos presentes em quantidades consideráveis nas
plantas abrangem diversidade de compostos produzidos pelas plantas com múltiplas funções,
como é caso da ação desempenhada pelos alcaloides no sistema nervoso central e dos
terpenóides atuando como hormônio de crescimento e desenvolvimento de plantas. Assim
como voláteis utilizados por espécies de plantas para atrair polinizadores e os terpenóides
destacando-se pelo papel de defesa, sendo indicativo de respostas evolutivas a herbívoros
específicos (SILVAa, 2012; OLIVEIRA et al., 2014; VIZZOTTO et al., 2010).
Muitos desses fitoquímicos surgiram em uma época em que existia pouco oxigênio
livre na atmosfera, acredita-se que com a diminuição do oxigênio na atmosfera, as plantas
retiravam dióxido de carbono liberando oxigênio, aumentando a concentração deste oxigênio
no ar. Para se protegerem deste gás, as plantas desenvolveram componentes antioxidantes
29
precursores de compostos com efeito alelopático, antioxidante, anti-inflamatório e inseticida
(PANDEY e RIZVI, 2009; MORAIS et al., 2016).
Muitos metabolitos secundários produzidos são classificados como substâncias
nitrogenadas, as quais pode-se citar alcaloides, glicosilatose glicosídeos cianogênios são
sintetizadas a partir de aminoácidos. Sendo que, a maioria dos compostos como alcaloides,
terpenos e fenólicos, são derivados do ácido chiquímico e/ ou ácido mevalônico como é o
caso dos fenólicos, ou mesmo produzidos a partir do ácido mevalônico no citoplasma, atuam
na defesa contra fatores bióticos e abióticos (SANTOS, 2015).
A maioria desses compostos tem origem a partir dos metabolismos da glicose,
podendo atuar sob dois intermediários, o ácido chiquímico e o acetato. O ácido chiquímico
tem em comum compostos que apresentam um anel aromático na sua constituição, como é o
caso das cumarinas, taninos hidrolisáveis, alcalóides derivados dos aminoácidos
e
aromáticos
fenilpropanóides, enquanto que os acetatos dispõem de seus derivados que são os
aminoácidos alifáticos e os alcalóides (PEREIRA e CARDOSO, 2012; OLIVEIRA et al.,
2014).
As classes de metabolitos secundários, bem como a produção de alcalóides são
sintetizadas por diferentes vias metabólicas, podem ser influenciados por fatores como
hormônios, nutrientes, luz, água, fatores bióticos e abióticos em cultura de células, tecidos e
órgãos (Figura 1). Os efeitos causados pelos metabolitos nos vegetais são observados em
parte nas possíveis formas de adaptabilidade desses metabolitos aumentando assim a
produção de princípios ativos em condimentos e ervas (VELLOSO et al., 2009; FUMAGALI
et al., 2008).
Figura 1. Vias de biossíntese dos Metabolitos secundários em plantas.
Fonte: Adaptado de OLIVEIRA et al., 2014.
30
O metabolismo secundário tem seu organismo produtor oriundo da biossíntese do
metabolismo primário, tal processo depende de vias catabolicas, anfibólicas e anabólicas do
metabolismo primário. A produção de compostos como alcalóides, compostos glycolipids
fenólicos, tem sido uma alternativa promissora em relação a sua síntese química e extração e
compostos ativos extraídos de plantas como Ipomoea carnea spp. (ROJAS-IDRONGO, 2014;
INOUE, 2006).
O processo de resgate de informações e identificação de espécies medicinais tem
avançado em virtude de novos estudos químicos sobre as classes de compostos presentes em
órgãos vegetativos (Tabela 6), com função especifica (defesa), através da realização de testes
químicos qualitativos rápidos como a prospecção fitoquímica (BESSA et al., 2013).
Tabela 6. Identificação de metabolitos secundários em plantas medicinais.
Classes de compostos
Espécie vegetal
Tipo de extrato
identificados
Schinus terebenthifolius
Raddi (Família:
Anacardiaceae)
Ext. Etanólico
(folhas)
Alcaloides, glicosídeos
cardiotônicos, flavonoides
e taninos hidrolisáveis
Alcaloides Glicosídeos
Cardiotônicos, Cumarinas,
Flavonoides, Taninos,
Saponinas, Triterpenos,
Esteroides Antracênicos
Livres
Antraquinonas, esteroides
e triterpenóides,
flavonoides e saponinas
Solanum jamaicense
(Família: Solanaceae)
Ext. etanólico
(folhas)
Copaifera langsdorffii
(Família:Caesalpiniaceae)
Ext. Aquoso
(folhas)
Solanum paniculatum
(Família: Piperaceae)
Ext. Extratos
etanólicos
(frutos e
folhas)
Eugenia uniflora L.
(Familia: Myrtaceae)
Ext. etanólico
dos frutos e
folhas
Alcaloides, glicosídeos
cardiotônicos, cumarinas,
flavonoides e taninos
Anadenanthera colubrina
(Familia: Fabaceae);
Cariniana rubra
(Familia:Lecythidaceae)
Ext. etanólicos
(folha e caule)
Flavonoides, alcaloides,
saponinas e taninos
Fonte: Autor, 2018.
Alcaloides, taninos,
saponinas e triterpenos
Citado
SILVA et
al., 2015
ANSELMO
e LIMA,
2014
GONÇALV
ES et al.,
2016
TERÇO e
LIMA,
2016
SILVA e
LIMA,
2016
LIMA
NETO et
al., 2015,
31
Desse modo, a realização da análise fitoquímica utilizada permite conhecer os
constituintes químicos das espécies vegetais e consequentemente avaliar a presença nos
mesmos, para utilização adequada das plantas. O estudo de determinadas espécies vegetais
permite um melhor entendimento relacionado ao uso e aplicabilidade no desenvolvimento de
fitoterápicos de baixo custo e a descoberta de novas drogas (COLACITE, 2015).
2.5.2. Fatores ambientais
A síntese desses compostos nas plantas pode alterar a natureza química de seus
constituintes ativos presentes no tecido vegetal, através de fatores como ataque de patógenos,
disponibilidade hídrica (Fatores fisiológicos críticos, tais como fotossíntese, mobilização de
reservas, expansão foliar e crescimento), ritmo circadiano, sazonalidade, poluição atmosférica
(níveis elevados de O3 ou de CO2 no metabolismo de derivados fenólicos), nutrientes na
agricultura, a adição de nutrientes, particularmente nitrogênio, é geralmente empregada para
aumentar a produção de biomassa, (Figura 2) (NETO e LOPES, 2007).
Figura 2. Fatores que podem influenciar no acúmulo de metabólitos secundários.
Fonte: NETO e LOPES, 2007.
A produção desses metabolitos pode ser determinada a partir de interações químicas
entre diferentes espécies vegetais, animais e ambiente, este possibilita um estimulo as plantas
desencadeando a síntese de diferentes compostos devido o redirecionamento das diferentes
rotas metabólicas. Dentre os fatores que podem estar diretamente interligados a produção
desses compostos, pode-se mencionar a temperatura, disponibilidade de nutrientes no solo,
intensa luminosidade, estagio de desenvolvimentos das plantas e pluviosidade (VENTRELLA
e MARINHO, 2008).
32
Um dos fatores relevantes que podem influenciar, diretamente, não somente o
metabolismo primário, bem como a síntese de metabólitos secundários em plantas é a
sazonalidade, esta engloba uma série de alterações na temperatura e umidade do solo
possibilitando desvios de rotas biossintéticas de metabólitos primários e secundários. De um
modo geral, as plantas podem produzir em épocas distintas uma quantidade significativa de
princípios ativos em seus tecidos vegetais, como monoterpenos produzidos sob condições de
temperatura e luminosidade controlada (VIECELLI e SILVA, 2009; MORAIS, 2009; LIMA
et al., 2003).
2.5.3. Compostos fenólicos
Diversas substâncias com ação inibitória podem estar atuando em diferentes
categorias químicas, como é o caso dos fenóis, estes demonstram efeitos sinergéticos no
alongamento da radícula, crescimento de plântulas, no consumo de oxigênio durante o
processo de oxidação, restringindo a quantidade de oxigênio que chega ao embrião como, por
exemplo, o ácido clorogênico, substância de natureza fenólica capaz de inibira germinação de
sementes e o brotamento de gemas (TOKUHISA, 2007).
Os
fenóis
são
classificados
em
flavonoides
(catequinas,
epicatequinas,
epigalocatequinas, caempferol, quercetina, miricetina, antocianinas, rutina e naringenina) e
não flavonoides (ácidos fenólicos, ácido hidroxibenzóico, ácido hidrocinâmino e o
resveratrol), dos quais se destaca a rutina, miricetina, quercetina e naringenina. Tais
compostos dispõem de produtos com atividade antioxidante relativamente estável em virtude
da ressonância do anel aromático existente na estrutura (ACHKAR et al., 2013; SILVA et al.,
2012).
Os fenóis originam uma gama de compostos presentes no odor, sabor e cor de
diversos vegetais, além disso, também protegem os tecidos da planta contra injúria, insetos e
ataque de animais. Os compostos são essenciais na proteção de plantas contra fatores
ambientais e bióticos adversos, acredita-se que os fenólicos são fundamentais para a própria
conquista do ambiente terrestre pelas plantas. (VIZZOTTO et al., 2010).
As substâncias fenólicas presentes em plantas abrangem uma classe química
diversificada em estrutura, com a presença de um ou mais anéis aromáticos, ligados a
hidroxilas livres ou substituídos. No entanto, essa estrutura básica se complexifica de tal
forma que permite a formação de milhares de derivados, estes oriundos da via dos ácidos
33
malônico e chiquímico, onde este é um dos responsáveis da grande maioria desses compostos
(BRITO, 2014).
Esses compostos são oriundos do metabolismo secundário, dos quais pode-se
destacar além dos fenólicos (Figura 3), terpenóides, os ácidos fenólicos, derivados do ácido
cinâmico, cumarinas, flavonoides, catequinas, quinonas e taninos como representantes com
maior parte dos compostos com atividades alelopáticas identificados (SANTOS et al., 2011).
Figura 3. Estruturas químicas dos compostos fenólicos.
Fonte: LAGE, 2009; MENG et al., 2013; BECHO, 2009.
De acordo com Reis (2015), entre os grupos de compostos fenólicos que apresentam
potencial alelopático estão as subclasses de flavonoides, possuem uma estrutura em forma de
anel aromático com uma ligação dupla nas posições 2-3. A rutina, pertence à subclasse dos
flavonoides, o flavonol. E a isoquercitrina é um flavonol glicosado, quercetina que é uma
flavona sem molécula de açúcar presente na estrutura classificado como aglicona.
Compostos como cumarinas, flavonoides, lignanas e diversos díterpenos estão
presentes em uma diversidade de plantas, as quais pode-se citar o eucalipto (Eucalyptus
globulus Labill.) e a guaçatonga (Casearia sylvestris Swartz), ditos fontes promissoras de
compostos com efeito alelopático no controle alternativo de plantas daninhas (LIMA et al.,
2011; YAMAGUSHI et al., 2011).
Os terpenos compreendem a maior classe de metabólitos secundários existentes nas
espécies vegetais, a maioria são polares e solúveis em água formados a partir da união de
34
unidades de isopreno, os exemplos destes têm-se as giberilinas, os esteroides de membrana
celular, os carotenoides e o ácido abscisico. Entre os compostos fenólicos mais importantes
estão os derivados de ácido benzoico, ácido caféico e outros fenilpropanóides simples,
cumarinas, 6 ligninas, taninos e flavonoides, este último compreende a maior classe de
compostos fenólicos existentes (SANTORE, 2013).
De acordo com Borela et al. (2017), A canola possui compostos fenólicos capazes de
possibilitar a diminuição do desenvolvimento de sementes, bem como captação iônica,
expansão foliar, fotossíntese, conteúdo de clorofila e transporte de elétrons. Esses compostos
são classificados em ácido sinápico e a sinapina.
Muitas das alterações apresentadas no decorrer de ensaios de germinação são
oriundas de compostos com ação alelopática presentes em uma diversidade de espécies
vegetais desde fruto, caule, raiz e folhas, esta última quando retirada de plantas como
Machaerium acutifolium Vog.; abrange uma enorme quantidade de fenóis ocasionadores da
inibição do crescimento e desenvolvimento de plântulas de alface (POVH et al., 2007).
Os flavonoides representam um dos mais importantes classes de composto naturais
presentes em todos os órgãos vegetativos das plantas, dispondo de características especificas
de cada classe. Em espécies vegetais podem ser desencadeadoras de funções como proteção
da radiação UV, ação antioxidante, inibição enzimática, proteção contra micro-organismos e
outros (FLAMBÓ, 2013).
A maioria dessas subclasses de compostos está presentes na dieta do ser humano,
sendo de relevância importância fisiológica e biológica, divisão celular, alongamento celular e
outras atribuídas de efeitos benéficos à saúde no combate de doenças cardiovasculares e
câncer, pois atuam como sequestradores de radicais livres possuindo atividade antioxidante
(CUNHA, 2013).
Muitas dessas classes são ditos compostos alelopáticos seletivos em suas respostas e
seus efeitos sujeitos a solubilidade do veículo usado na sua administração, uma vez que é dita
insolúvel em água e a disponibilidade para absorção, destacando-se em meios a tantos grupos
os flavonoides, terpenóides, glicosídeos, ácidos fenólicos, alcaloides, carotenoides, catequinas
e taninos com atividade alelopática. Dentre os quais pode-se citar a quercetina, antioxidante
que é facilmente absorvido na forma livre ou glicosilada pelo trato gastrintestinal, sendo
encontrado nos alimentos na forma de quercetina-3-rutinosídeo. (BEHLING et al., 2004;
SILVA, 2014).
35
2.6.Croton heliotropiifolius Kunth
A Croton heliotropiifolius é uma das espécies da família Euphorbiacea, está é
considerada uma importante família que tem se destacado entre as angiospermas como uma
das representantes da flora brasileira, comporta mais de 300 gêneros e 800 espécies, está
apresenta um elevado valor econômico e ecológico além de evidenciar na sua composição
química compostos com atividade biológica (terpenos, alcaloides, flavonoides, fenóis), que
podem ser identificados na folha, caule, casca do caule e fruto das espécies que compõem essa
família (SOUZA et al., 2014; LIMA et al., 2013; SANTOS, 2014).
Estudos fitoquímicos realizados por Oliveira et al. (2016), ressaltam que as plantas
desse gênero apresentam em sua composição química constituinte como alcalóides,
terpenóides (díterpenos, triterpenos pentacíclicos), esteroides, proantocianinas e flavonoides
entre outras substâncias.
A C. heliotropiifolius é conhecida popularmente como velame, velaminho, valamede-cheiro e marmeleiro está distribuída em em regiões do nordeste brasileiro, em áreas de
Caatinga, possui indicações de uso na prevenção de infecções na pele, sífilis, úlceras, tosse e
gripes, no sertão é usada para arear panelas(SILVA et al., 2016; SODRÉ e SILVA, 2015).
A espécie possui um indumento denso em ambas as faces foliares, suas folhas
dispõem de uma camada de epiderme simples com paredes ériclinais, externas espessas e
cutícula delgada na face adaxial. Enquanto na face abaxial evidenciam-se os conspícuos e os
tricomas tectores que recobrem a superfície (BARROS e SOARES, 2013; CARUSO et al.,
2010).
De acordo com Sisodia e Siddiqui (2010), os extratos aquosos da raiz, caule e folha
da Croton bonplasdinum exibiram níveis de inibição com efeito severo sobre Melitótus alba
em relação a outras espécies de plantas daninhas.
A atividade alelopática é complexa, atuando de várias maneiras dependendo de
muitos fatores intrínsecos à planta alvo, à planta teste ou ambientais. Por exemplo, Brito e
Santos (2012, p. 140), verificaram que dentre as várias espécies do gênero Croton, muitas são
descritas na literatura com potencialidades alelopáticas, como é o caso da Croton
bonplandianum, e de extratos aquosos de espécies como crotalária, feijão-de-porco e gergelim
na inibição do processo germinativo da Bidens pilosa (BRITO e SANTOS, 2012; THAPAR e
SINGH, 2006).
36
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. Local de realização da pesquisa
O trabalho foi realizado no Centro de Ciências Agrárias no Mnicipio de Rio Largo,
Alagoas, no Laboratório de Pesquisa em Recursos Naturais e no Laboratório de Análises
Farmacêutica e Alimentícia da Universidade Federal de Alagoas, Campus A.C. Simões, no
Município de Maceió – AL.
3.2. Obtenção do material botânico das espécies vegetais
As amostras vegetais das plantas B. pilosa e D. insularis, foram coletados no Centro
de Ciências Agrárias da Universidade Federal de Alagoas, localizado no Campus Delza Gitaí,
BR 104 Norte, Km 85, no Município de Rio Largo (latitude 9º27’S, longitude 35º27 W,
altitude média de 127m, temperatura máxima de 29ºC e pluviosidade média anual de
1.267,7).E as amostras da C. heliotropiifolius
no Bairro Primavera do Município de
Arapiraca (latitude 09º45’09”S e longitude 36º39’40’’W; altitude média de 264 m), Alagoas,
Brasil.
As espécies coletadas tiveram parte de suas amostras vegetais como raiz, caule, folha
inflorescência e fruto, depositados em uma prensa de madeira e direcionados ao herbário
MAC do Instituto do meio Ambiente do Estado de Alagoas – IMA. Os exemplares botânicos
foram identificados pela curadora Rosangela Pereira de Lyra Lemos, e estão depositadas no
herbário com número de registro 54392 – IB/MAC (Croton heliotropiifolius Kunth); 62206 –
IB/MAC (Digitaria insularis (L.) Fedde); 62207 – IB/MAC (Bidens pilosa L.).
3.3. Obtenção dos extratos brutos
3.3.1. Extrato etanólico
As partes aéreas da espécie C. heliotropiifolius após a limpeza, foram direcionado a
estufa de circulação de ar a 50ºC, por 24 horas. Em seguida trituradas em moinho de facas,
obtendo o pó, este foi submetido ao processo de maceração etanólica com solvente etanol
P.A. 99,5%, seguido de filtragem (em funil de Büchner), a cada 24 horas no período de cinco
dias, seguido de rotaevopação em evaporador rotativo de marca BUCHI Heating Bath B-490,
até a evaporação total do solvente, retirado do balão e colocado em vidro âmbar escuro,
rotulado e mantido em uma capela circulação de ar (Figura4).
37
Figura 4. Processo de obtenção do extrato etanólico da parte aérea da C. heliotropiifolius:
Amostra vegetal do campo (A). Amostra pesada (B). Estufa Nova Ática (C). Amostra após
o processo de trituração (D). Amostra com etanol P.A.99,5% (E). Filtração da amostra (F).
Processo de rotaevaporação (G). Solubilização da amostra no ultrassom e Retirada da amostra
do balão (H, I). Extrato etanólico (J). Capela com circulação de ar (K).
Fonte: Autor, 2018.
3.3.2. Extrato aquoso
Para obtenção do extrato aquoso por decocção foi pesado 113g da parte aérea do
velame colocado no bequér de 500 mL, adicionado 1700 mL de água destilada, mantido em
uma chapa de aquecimento até homogeneizar na temperatura de 50ºC, durante 5 minutos.
Após o período de resfriamento, após o resfriamento a solução homogênea foi filtrada a
temperatura (25ºC±2ºC) ambiente.
No processo de liofilização o filtrado foi transferido para tubos de Falcon de 50 mL
e congelado em freezer a -18ºC durante 72h e em seguida submetido a secagem por
liofilização até a obtenção do extrato seco (Figura 5).
Posteriormente foi calculado o
Rendimento percentual (R%) dos extratos brutos pela seguinte fórmula (1):
38
Figura 5. Processo de obtenção dos extratos aquosos da parte aérea da C. heliotropiifolius:
Amostras vegetais frescas (A).
Pesagem das amostras (B). Secagem das amostras (C). Pó
obtido (D). Peso do pó (E). Pó e água destilada (F). Medição da temperatura (G). Extração
(H). Filtração (I). Extrato aquoso (J). Amostras pra congelar (K). Processo de liofilização (L).
Extrato aquoso (M).
Fonte: AUTOR, 2018.
3.4.Caracterização físico-química
3.4.1. Potencial de hidrogênio (pH)
Tendo em vista, que o grau de acidez ou basicidade são capazes de mascarar o efeito
alelopático, determinou-se o pH dos extratos vegetais nas concentrações de 0,1;0,25;0,5 e1
mg/mL, com auxílio de um pHmetro (Q400AS) (FORMAGIO et al., 2010).
3.4.2. Potencial osmótico (MPa)
A determinação da osmolalidade dos extratos vegetais da área foliar da C.
heliotropiifolius foi realizada mediante a metodologia proposta por Coelho (2012), onde foi
retirada uma alíquota de 10µL do sobrenadante de cada amostra contida nos tubos de Falcon,
disposto sobre o disco de papel, este já sobreposto na porta amostras do osmométro de
pressão de vapor, modelo Wescar 5520 para realização da leitura da amostra (Figura 6).
39
Figura 6. Processo de obtenção do potencial osmótico das diferentes concentrações dos
extratos vegetais da C. heliotropiifolius: Disco de papel (A). Pinça (B). Gaveta da porta-a
mostra (C). Pipeta automática (D). Extratos vegetais (E). Retirada de uma alíquota da amostra
vegetal (F). Com a ponta da pipeta sobre o centro do disco da amostra (G). Fecha o porta
amostra (H). Fecha a manivela (I). Inicia o ciclo de medição (J).
Fonte: AUTOR, 2018.
Os valores obtidos em mol/kg foram submetidos a equação de Van T Hoff (Fórmula
2), e expressos em atmosferas (atm), as quais foram convertidas em MPa.
Fórmula (2):
Onde:
Ψº = Potencial osmótico (atm);
R= Constante universal dos gases (0,082 atm.ºK-1.L.mol-1);
T= Temperatura absoluta da solução (ºK);
C= Concentração de solutos na solução (mol L-1).
3.5.Identificação e quantificação de metabolitos secundários
3.5.1. Teor de fenóis totais
O conteúdo de compostos fenólicos totais foi determinado pelo método de Follin –
Ciocalteau, com modificações para realização do teste em microplacas. Em ependorf
(triplicata) foi adicionado 100 µL da solução metanólica da amostra, 500 µL da solução
40
aquosa de Folin 1: 11 (v/v) e 400 µL da solução aquosa de Na2CO3 (7,5 %). Foi preparado um
branco em ependorf (triplicata), onde foram adicionados 100 µL de metanol, 500µL da
solução aquosa de Folin – Ciocalteau e 400µL da solução aquosa de Na2CO3 (7,5 %). Em
seguida agitaram-se as soluções no vórtex por 30 segundos. Em uma microplaca de 96 poços
foi adicionado 250 µL da solução em triplicata contida no ependorf nos poços, a placa foi
mantida ao abrigo da luz por 2 horas. A leitura foi realizada num espectrofotômetro leitor de
placas a 740nm (SCHERER e GODOY, 2014).
A curva de calibração do ácido gálico foi construída nas concentrações de 0,1 à
0,005 mg/mL. Os resultados do teor de fenóis totais foram determinados pela interpolação da
média das absorbâncias das amostras, contra a equação da reta obtida na curva de calibração
do ácido gálico, e expressos em mg de EAG (equivalente de ácido gálico) / por g do extrato.
3.5.2. Prospecção fitoquímica preliminar
Para a realização da etapa de triagem fitoquímica tomou-se como base a metodologia
proposta por Matos (1989), a qual foi trabalhada com algumas adaptações a fim de realizar
prospecção dos seguintes metabólitos: fenóis, taninos pirógalicos, taninos flobafênicos,
antocianina e antocianidinas, flavonas, flavonóis, xantonas, chalconas, auronas, flavononois,
leucoantocianidinas, catequinas, flavononas, flavonóis, xantonas, esteroides, triterpenóides e
saponinas.
Uma alíquota de cada extrato foi diluída em 35 mL de água destilada obtendo-se uma
solução aquosa da amostra. A partir de 25 mL da solução aquosa da amostra, foi distribuído 3
mL desta solução em tubos de ensaios numerados para identificação de fenóis, taninos
pirógalicos, taninos flobafênicos, antocianina e antocianidinas, flavonas, flavonóis, xantonas,
chalconas, auronas, flavononois, leucoantocianidinas, catequinas, flavononas, flavonóis,
xantonas. Uma porção de 10 mL da solução aquosa da amostra foi colocada em béquer
mantido em banho-maria, por meio de uma placa de aquecimento com agitação, até a
evaporação total da parte liquida, e o material obtido foi utilizado nos testes para esteroides,
triterpenóides e saponinas.
3.5.2.1.Testes para fenóis, taninos pirógalicos e taninos flobafênicos
No tubo de ensaio “1” foi adicionado três gotas de solução etanólica de cloreto
férrico (FeCl3), após agitação foi observada a ocorrência de variação de cor ou formação de
precipitado abundante escuro. A coloração entre o azul e o vermelho é indicativa de fenóis,
41
precipitado escuro de tonalidade azul é indicativa da presença de taninos pirógalicos (taninos
hidrolisáveis) e verde da presença de taninos flobafênicos (taninos condensados ou
catéquicos). Para comparação foi realizado um teste em branco usando apenas água e o
cloreto férrico.
3.5.2.2.Teste para antocianina e antocianidinas, flavonas, flavonóis e xantonas,
chalconas e auronas, flavononois
No tubo de ensaio “2” foi acidulado com ácido clorídrico (HCl) até pH 3, enquanto o
tubo "3" foi alcalinizado a pH 8,5 e o tubo “4’ alcalinizado a pH 11, através da adição de
hidróxido de sódio (NaOH). A variação de cor conforme a Tabela 7, indicou a presença ou
ausência dos compostos.
Tabela 7. Teste para antocianina e antocianidinas, flavonas, flavonóis xantonas, chalconas e
auronas, flavonóis em prospecção de constituintes químicos de extratos vegetais.
Tubos de ensaio com pHs diferentes
Compostos
Ácido pH 3
(tubo “2”)
Alcalinizado pH
8,5 (tubo“3”)
Antocianinas e
Antocianidinas
Flavonas, flavonóis e
xantonas
e
Chalconas e auronas
Flavononois
Vermelha
Lilás
-
-
Vermelha
-
-
Alcalinizado pH 11
(tubo“4”)
Azul - púrpura
Amarela
Vermelho púrpura
Vermelho laranja
Fonte: MATOS, 1989.
3.5.2.3.Teste para leucoantocianidinas, catequinas e flavanonas
O tubo de ensaio "5" foi acidulado por adição de HCl até pH 2, e o tubo "6" foi
alcalinizado pela adição de NaOH até pH 11. Ambos foram aquecidos com o auxílio de uma
lamparina de álcool durante 3 minutos. A variação de cor conforme a Tabela 8, indicou a
presença ou ausência dos compostos.
Tabela 8. Teste para leucoantonocianidinas, catequinas e flavononas.
Cor e pH do meio
Constituintes
Ácido pH 2 -Tubo 5
Alcalino pH 11-Tubo 6
Leucoantocianidinas
Catequinas
Flavanonas
Fonte: MATOS, 1989.
vermelha
pardo - amarelada
-
vermelho - laranja
42
3.5.2.4.Testes para flavonóis, flavanonas, flavononois e xantonas
Ao Tubo de ensaio "7' foi adicionado uma pequena fita de magnésio e 1,0 ml de HCl
concentrado. Após o termino da reação indicada pela total efervescência de consumo da fita, o
tubo “7" foi comparado com o tubo "5" (ambos acidulados). Esperando-se o aparecimento ou
a intensificação de cor vermelha indicando a presença de flavonóis, flavononas, flavononois e
xantonas.
3.5.2.5.Teste para esteroides e triterpenóides
O resíduo seco do béquer foi extraído 3 vezes com 2 mL (6 mL) de clorofórmio e
homogeneizado. A solução foi filtrada gota a gota em um pequeno funil com algodão, coberta
com alguns decigramas de sulfato de sódio anidro Na2SO4 (depois de seco na estufa a 50°C).
No tubo de ensaio foi adicionado 1 mL de anidrido acético e agitou-se suavemente. Em
seguida adicionou - se 3 gotas de ácido sulfúrico (H2SO4) concentrado e agitou-se novamente
o tubo e observou-se a projeção de cores indicando: coloração azul evanescente seguida de
verde permanente é indicativa da presença de esteroides livres. A coloração parda até
vermelha indica triterpenóides pentacíclicos livres.
3.5.2.6.Teste para saponinas
O resíduo insolúvel em clorofórmio separado na operação anterior, foi redissolvido
em 8 mL de água destilada e a solução foi filtrada para um tubo de ensaio. Agitou-se o tubo
com a solução fortemente por 3 minutos, e observou-se a formação de espuma a qual se fosse
persistente e abundante (colarinho) é indicativa da presença de saponinas (heteróides
saponinicos).
3.5.3.
Identificação de compostos por HPLC
Para a avaliação cromatográfica dos compostos foi pesado 0,0815 g do extratos
(etanólico e aquoso), diluídos em 10mL de etanol P.A. 99,7%.Em seguida as soluções
passaram por filtros de membrana PTFE Milipore® 0,45 µm e em seguida desgaseificadas em
banho de ultrassom.
A análise por Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) foi realizada no
aparelho (Shimadzu, Kyoto, Japão) equipado com auto injetor Shimadzu (SIL-20A), com
bombas alternativas (Shimadzu LC-20AT) ligadas a um desgaseificador (20A5 DGU) com
um integrador (CBM 20A) e detector de arranjo de diodos (SPD-M20A).
43
A separação dos compostos foi realizada em fase reversa sob condições de gradiente
utilizando coluna Kinetex 2.6 uC18 100A (100x4,6mm) 00D-4462-E0, e um detector UV-VIS
Shimadzu LabSolutions Multi - Chromatogram ʎ = 254, 290,320 e 350 nm. A fase móvel,
composta por solvente A (Acetonitrila); solvente B (água contendo 0,1% de ácido fórmico,
com fluxo de fase móvel de 0,4 mL/min em modo gradiente para o extrato aquoso liofilizado
e 10 mL/min para o extrato etanólico, com volume da amostra em Loop de 4mg/mL (extrato
aquoso) e 8mg/mL (extrato etanólico), tendo início com 3-75% de A em um tempo de análise
de 40 min.
Os picos cromatográficos foram confirmados pela comparação do tempo de retenção
e comprimentos de onda dos padrões de referência (ácido caféico, quercetina, acacetina e
apigenina). As condições empregadas para análise dos extratos vegetais estão ilustradas na
Tabela 9.
Tabela 9. Condições empregadas para a determinação por HPLC de compostos presentes em
extratos aquoso e etanólico da Croton heliotropiifolius.
Categorias
Extratos
Aquoso
Etanólico
Coluna
Col. Kinetex 2.6uC18 100A (100x4,6mm) 00D-4462-E0
Temperatura da Coluna
35ºC
Detector
UV-VIS Shimadzu LabSolutions Multi-Chromatogram ʎ =
254, 290,320 e 350 nm
Fase Móvel
Solvente A (Acetonitrila); Solvente B (água contendo 0,1% de
ácido fórmico)
Fluxo da Fase Móvel
0,4 mL/min
10mL/min
Programação do gradiente
3-75% de A em 40 min
Volume da Amostra
Loop de 4mg/mL
Loop de 8mg/mL
Tempo de análise
40 min
Fonte: AUTOR, 2018.
3.6.Teste alelopático
O ensaio alelopático foi determinado a partir do preparo de soluções estoque dos
extratos brutos da parte aérea da C. heliotropiifolius à 1mg/mL (100%), destes foram obtidos
soluções testes nas concentrações de 0,1mg/mL; 0,25mg/mL; 0,5mg/mL; 1mg/mL, tendo
água destilada como controle. Durante a montagem experimental do teste foram utilizadas
recipientes com 9 cm de diâmetro esterilizadas contendo 2 folhas de papel Germitest
previamente autoclavado, onde foram umedecidos com 7 ml dos extratos vegetais da C.
heliotropiifolius em quatro repetições (Figura 7).
44
Figura 7. Croqui do teste alelopático.
Fonte. AUTOR, 2018.
Em seguida foram distribuídas 25 sementes de cada espécie alvo (B. pilosa e D.
insularis), e mantido em câmara de germinação tipo BOD com temperatura de 25ºC e
fotoperíodo de (12L:12E), durante de 10 dias (GUSMAN et al., 2011).
No final do experimento foram avaliadas as seguintes variáveis: Porcentagem de
germinação (G%), Índice de Velocidade de Germinação (IVG/Fórmula 3), Percentual de
plântulas anormais (PA/ Fórmula 4), Massa da matéria seca (MS/ Fórmula 5), Comprimento
da raíz (CR/ Fórmula 6) e Comprimento da parte aérea (CPA/ Fórmula 7).Os parâmetros
IVG, CR e CPA foram medidos com auxílio de Paquímetro Digital JOMARCA DIGITAL
CALIPER (REFNO205509), com capacidade de medição de 0-150 mm/ 0.01 mm
(MAGUIRE, 1962).
Porcentagem de germinação pela Fórmula (3):
⁄
Onde,
G %= Porcentagem de germinação;
N = Número de sementes germinadas ao final do teste;
A ou 100 = Número de sementes na amostra
Unidade= Porcentagem (%).
Índice de velocidade de germinação pela Fórmula (4):
⁄
Onde,
IVG= Índice de velocidade de germinação
ni = Número de sementes que germinam no tempo “i”;
45
Ti = Tempo após a instalação do teste;
i =
Dias;
Unidade = Milímetro (mm).
Porcentagem de plântulas anormais pela Fórmula (5):
⁄
Onde,
PA%= Porcentagem de plântulas anormais
A= Número de sementes na amostra
Unidade = Porcentagem (%).
Massa da matéria seca pela Fórmula (6):
⁄
Onde,
MS= Massa da matéria seca
A= Número de sementes na amostra
Unidade = Gramas (g).
Comprimento da parte aérea pela Fórmula (7):
⁄
Onde,
CPA= Comprimento da parte aérea
N = Número de sementes germinadas ao final do teste
Unidade = Milímetro (mm).
Comprimento da raíz pela Fórmula (8):
⁄
Onde,
CR=Comprimento da raíz
N = Número de sementes germinadas ao final do teste
Unidade = Milímetro (mm).
46
3.6. Análise estatística
O experimento foi montado em delineamento inteiramente casualizado com quatro
repetições, onde os dados foram submetidos à análise de variância e foi utilizado o teste de
Dunnett a 5% de probabilidade, para comparar cada tratamento com a testemunha.
47
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os extratos etanólico e aquoso foram obtidos das partes aéreas da C. heliotropiifolius
pelo método de extração, respectivamente, maceração etanólica e decocção com rendimento
de 16,7 para o extrato etanólico e 28,7% para o aquoso, este obteve um maior rendimento
percentual. As massas do material vegetal seco usado e dos extratos etanólico e aquoso
obtido, assim como os rendimentos em extrativos constam na Tabela 10.
Tabela 10. Rendimento (%) dos extratos vegetais da parte aérea da C. heliotropiifolius.
Tipo de
Parte
Massa da
Massa do
Rendimento
Planta
extração
utilizada
amostra vegetal
extrato bruto
percentual
(g)
(g)
(%)
Etanólico
50
8,369
16,7
Velame
Folha
Aquoso
113
32,517
28,7
Fonte: AUTOR, 2018.
De acordo com Vasconcelos et al. (2005) e Araújo (2017), o extrato etanólico com a
presença do solvente etanol e/ou metanol mantem suas características físicas, aumentando a
quantidade de sólidos, dificultando a aspersão da solução extrativa, influenciando no
rendimento durante o processo de secagem.Nesse sentido, a utilização de diferentes métodos
extrativos tem sido um dos desafios de muitos estudiosos na busca por compostos bioativos
de origem natural com atividade antioxidante e outros (OLIVEIRA et al., 2016).
4.1. Caracterização físico - química
As soluções dos extratos vegetais da C. heliotropiifolius nas concentrações de 0,1;
0,25; 0,5 e 1 mg/mL apresentaram valores pH que variaram de 5,70-7,62 para o extrato
aquoso e 4,60-5,70 para o extrato etanólico (Tabela 11). Resultado este corrobora com o
apresentado por Pacheco et al. (2017), onde verificou que os extratos aquosos da espécie
Pityrocarpa moniliformis apresentaram valores de pH entre 4,5- 4,8 para o fruto e 5,0-5,4
para as partes aéreas, visto que, o potencial hidrogeniônico só é capaz de interferir na
germinação, quando estiver em condições alcalinas ou ácidas apresentando efeito nocivo na
faixa de pH abaixo de 4 (ácido) e superior a 10 (alcalino).
Assim como, o potencial osmótico da C. heliotropiifolius demonstrou valores com
variação de -0,000 a -0.0244 para o extrato aquoso e -0,000 a -0,0244 para o extrato etanólico
(Tabela 11). Resultado este se assemelha ao apresentado por Borela et al.(2012), que ressalta
a variação de -0,0146 a -0,0488 MPa para extratos aquosos de folhas frescas de Piper
mikanianum (Kunth), estando dentro da faixa de tolerância sem afetar a germinação.
48
Tabela 11. Caracterização - físico química dos extratos vegetais da C. heliotropiifolius.
Concentração
Extrato aquoso
Extrato etanólico
mg/mL
pH
Potencial osmótico (MPa)
pH Potencial osmótico (MPa)
Controle
0,1
0,25
0,5
1
5,70
7,62
7,29
7,00
6,71
-0,000
-0,002
-0,006
-0,0122
-0,0244
5,70
5,50
5,16
4,85
4,60
-0,000
-0,002
-0,006
-0,0122
-0,0244
Fonte: AUTOR, 2018.
Os resultados de potencial osmótico não podem ultrapassar -0,2 MPa, devido a
presença de solutos que podem modificar as propriedades da água, ocasionando na solução
uma pressão osmótica diferente de zero. Sendo estes valores expresso em extratos de plantas
como no caso da H. dulcis entre –0,085 e –0,017 MPa(WANDESCHEER et al., 2011).
4.2.Determinação do conteúdo de fenóis totais
O conteúdo de fenóis totais foi determinado através de técnicas espectrométricas
fazendo uso do reagente de Folin-Ciocalteu, onde foi construída uma curva de calibração do
padrão de ácido gálico com uma equação da reta de y=10,207x+0,0352 e um coeficiente de
determinação (R²) igual a 0,9904, utilizado como parâmetro para a determinação do índice de
fenóis totais nos extratos vegetais da parte aérea da C. heliotropiifolius (Gráfico 1).
Gráfico 1. Curva de calibração para o ácido gálico.
0,5
0,45
Absorbância 740 nm
0,4
y = 10,207x - 0,0352
R² = 0,9904
0,35
0,3
0,25
Série1
0,2
Linear (Série1)
0,15
0,1
0,05
0
0
0,01
0,02
0,03
0,04
Concentração de ácido gálico [mg/mL]
0,05
Fonte: AUTOR, 2018.
Os extratos vegetais da espécie C. heliotropiifolius analisados apresentaram conteúdo
de fenóis totais que variaram de 330,55 mg EAG/g para o extrato aquoso à 342,25 mg EAG/g
49
para o extrato etanólico (Tabela 12), este contendo maior teor de fenóis na amostra analisada,
demonstrando que o conteúdo de fenóis totais pode ser influenciando pelo tipo de solvente ,
podendo contribuir para sua maior atividade antioxidante e alelopática (ALVES e KUBOTA,
2013).
Tabela 12. Teor fenóis pelo método Folin - Cioucalteau dos extratos vegetais da C.
heliotropiifolius.
Espécie vegetal
Tipo de extração
Fenóis totais (mg EAG/g da amostra)
Aquoso
330,5574606
Velame (Folha)
Etanólico
342,2499243
Fonte: AUTOR, 2018.
Os compostos fenólicos abrangem uma diversidade de compostos químicos oriundos
do metabolismo secundário, interferindo na elasticidade da parede celular. Oliveira et al.
(2014), ressalta que casca de Pouteria ramiflora apresenta efeito alelopático mediante a
presença de cumarinas, estes são apontados como inibidores de crescimento de plântulas e as
saponinas que podem atuar no processo fotossintético das membranas celulares.
A Baccharis dracunculifolia é outra espécie que abrange uma classe compostos
como fenóis, taninos, terpenos e alcaloides (GUSMAN et al.,2008). Os quais pode-se inferir
as saponinas e taninos, estas ditas substâncias alelopáticas que apresentam mecanismos de
ação direto (capazes de causar alteração nas propriedades e no estado nutricional do solo) e
indireto (causam alterações no metabolismo vegetal).
A grande variedade de compostos encontrados em plantas do gênero Croton advém
de características diagnosticas, com a descoberta de novas classes químicas como terpenos,
óleos voláteis, alcaloides e flavonoides, estes já foram descobertos em espécies desse gênero
como C. Schideanus Schlecht. Essa composição química está relacionada a distribuição
geográfica, molecular e a combinação de dados químicos (MATOS, 2011).
O estudo fitoquímico do extrato etanólico de Croton pedicellatus culminou no
isolamento de metabólitos secundários de natureza terpênica e fenólica, comuns em espécies
do gênero Croton (LOPES et al., 2012). Assim como, a Croton bonplandianum, planta
detentora de compostos quimicos com efeito alelopático na inibição do processo germinativo
de plantas daninhas (BRITO e SANTOS, 2012).
4.3.Classes de metabolitos secundários
A prospecção fitoquímica revelou a presença de compostos como taninos
flobafênicos, Flavonas, flavonóis, e xantonas, Catequinas e saponinas nos extratos das partes
50
aéreas da C. heliotropiifolius (Tabela 13).Os Taninos flobafênicos, Flavonas, flavonóis, e
xantonas, catequinas, esteróis e saponinas foram detectados no extrato etanólico.No extrato
foram
verificados
a
presença
de
Taninos
flobafênicos,
Flavonas,
flavonóis,
e
xantonas,catequinas, flavononas e saponinas.
Tabela 13. Diferentes classes de fitoquímicos nos extratos da C. heliotropiifolius.
Classes de Metabolitos
Extrato aquoso
Extrato etanólico
Secundários
Folha
Fenóis
Ausência
Ausência
Taninos pirogálicos
Ausência
Ausência
Taninos flobafênicos
Presença
Presença
Antocianina e antocianidina
Ausência
Ausência
Flavonas, flavonóis, e xantonas
Presença
Presença
Chalconas e auronas
Ausência
Ausência
Flavononois
Ausência
Ausência
Leucocianidinas
Ausência
Ausência
Catequinas
Presença
Presença
Flavononas
Presença
Ausência
Esteroides
Ausência
Presença
Triterpenoides
Ausência
Ausência
Saponinas
Presença
Presença
Fonte: AUTOR, 2018.
Dentre os metabolitos ditos regulador do crescimento condicionando adaptação e
sobrevivência à maioria dos vegetais pode citar as saponinas, esta abrange uma classe de
terpenos presente em ambos os extratos vegetais da espécie C. heliotropiifolius. Para Luiz et
al. (2010), uma gama de compostos pertencente a classes de terpenóides foram notificadas em
leguminosas e se constituem no segundo maior grupo (depois dos fenólicos) de metabólitos
secundários implicados na alelopátia.
Compostos como flavonas, flavanonas, catequinas, antocianinas, proantocianinas,
isoflavonoides, estão presentes em diversos órgãos das plantas, e apresentam múltiplas
funções seja atratividade ou mesmo repelência, com efeito, alelopático na inibição do
desenvolvimento fisiológico de plantas (FIORENZA et al., 2016).
O extrato aquoso da madeira da Croton sonderianus Mull. Arg., mais conhecida
como marmeleiro, tem demonstrado eficiência na inibição do desenvolvimento de plantas
daninhas, efeito atribuído a diminuição dos pigmentos fotossintetizantes, por apresentar em
sua composição uma classe de metabolitos como os dípertenos (BRITO e SANTOS, 2012).
Esses constituintes químicos pertencem à classe de fitoquímicos, com propriedades
alelopáticas comumente presentes em plantas superiores, quantidade que varia entre as
51
espécies vegetais, é facilmente observado pelo precipitado de cores que pode ser modificado
de forma quantitativa, em virtude da temperatura, reagente biotecnológico, idade da planta,
radicação ultravioleta, sazonalidade, poluição atmosférica e outros (FORMÁGIO et al.,2014).
Dentre as classes de metabolitos secundários com graus de polaridade, destacam-se
os os terpenóides, esteroides, alcalóides, acetogeninas e fenilpropanóides, pertencentes aos
grupos dos flavonoides e taninos, apontados como possíveis substâncias químicas com efeito
alelopático atuando como inibidores de crescimento e defesa das plantas (TAIZ e ZEIGER,
2006; FORMÁGIO et al.,2014).
Estudos fitoquímicos com extratos da espécie Lafoensia pacari demonstram a
presença de classes de metabolitos como flavonoides, esteroides, triterpenóides, alcaloides e
taninos (FIRMO et al.,2014). Para Trevisan. (2012), outras classes foram identificadas, tais
como triterpenos pentacíclicos, triterpenos na casca de Celtis sinensis, como aleloquímicos
em plantas, responsáveis pelos processos fisiológicos no decorrer do processo germinativo de
monocotiledôneas e dicotiledôneas.
Muitas das respostas fisiológicas e morfologias de algumas plântulas quando
submetidas a compostos com ação alelopática são oriundas de alterações moleculares e
celulares. De um modo geral, a presença desses fitoquímicos está mais persistente na folha,
que é dito o órgão mais ativo metabolicamente (GUSMAN et al., 2015).
Os metabolitos podem promover alterações em relação ao sistema água-planta,
desencadeando desordens nas membranas celulares das raízes com a diminuição da massa da
matéria da área foliar e vegetal (SILVA, 2012; MOŻDŻEŃ e REPKA, 2014).
De acordo com Santos. (2012), a presença dos compostos fenólicos na prospecção
fitoquímica pode ser atribuída a uma série de fatores responsáveis pela determinação do efeito
alelopático em bioensaios de germinação, crescimento de raiz e fitotoxicidade. Isso em
virtude das propriedades químicas, da capacidade de algumas classes de fenóis em capturar
elétrons e de atuar como reguladores de canais iônicos envolvidos na fosforilação oxidativa,
como também catalisadores durante a fase fotoquímica da fotossíntese.
4.4. Perfil cromatográfico dos extratos vegetais
Os cromatogramas foram gerados pelas amostras analisadas e a comparação dos
tempos de retenção dos compostos presentes nas amostras com os dos padrões de específicos
para aqueles compostos durante as análises, possibilitando uma melhor compreensão dos
52
diferentes comprimentos responsáveis por evidenciar com maior intensidade o pico em
determinada área (Figura 8).
Figura 8. Perfis cromatográficos dos padrões de compostos 200 e 500 µg/mL-1: A- Ácido
caféico, B-Quercetina, C-Apigenina, D-Acacetina.
53
Fonte: AUTOR, 2018.
As amostras foram analisadas em diferentes comprimentos de onda (254, 290, 320 e
350 nm), na região ultravioleta visível possibilitando seletividade entre os compostos, levando
a determinação de compostos nos extratos vegetais da C. heliotropiifolius. As figuras 8-15
(Anexo) ilustram os cromatogramas com seus respectivos tempos de retenção, picos e
comprimentos de onda em nm para cada extrato vegetal avaliado.
54
De um modo geral, foi possível identificar compostos como ácidos fenólicos
(ácido caféico), flavonoides (quercetina) e flavonas (apigenina e acacetina) no extrato aquoso
da C. heliotropiifolius, e flavonoides (quercetina) e flavonas (apigenina) no extrato etanólico.
Dentre os compostos identificados, o ácido caféico já havia sido identificados em estudos
anteriores realizado por Bitterncount (2017), em extratos das folhas de capim annoni-2.
Existe uma diversidade substancias, com efeito, alelopático atuando na redução do
processo germinativo pela diversidade e quantidade, os quais se podem citar os taninos,
glicosídeos cianogênicos, alcalóides, sesquiterpenos, flavonóides, ácidos fenólicos e outros.
Essas substâncias alelopáticas podem interferir no desenvolvimento e na germinação de
sementes de muitas espécies vegetais (BORELLA et al., 2011; TUR et al., 2010; CORSATO
et al., 2010).
Os flavonoides além de inferirem na pigmentação das plantas exercem diversos
efeitos comuns às substâncias fenólicas, também interferem na absorção de minerais
essenciais ao desenvolvimento das espécies vegetais (CORSATO et al., 2010; CARVALHO
et al., 2014; SILVA et al., 2017; PERGO, 2005).
A análise conjunta dos cromatogramas obtidos nos comprimentos de onda
determinaram os compostos pelo enriquecimento dos extratos com os padrões de referência.
Nesse caso, verificou-se que a presença dos compostos não foi dificultada e que os tempos de
retenção nas amostras foram compatíveis com os tempos de retenção dos padrões ácidos
caféico (200 µg/mL), quercetina (500 µg/mL), apigenina (200 µg/mL), acacetina (200
µg/mL), como a variação dos tamanhos dos picos nos diferentes comprimentos de onda, que
reafirmam a presença dos compostos (Tabela 14).
Tabela 14. Padrões utilizados para identificação dos compostos presentes nos extratos da C.
heliotropiifolius com seus repectivos tempos de retenção e comprimentos de onda que
absorvem na região do UV-Vis.
Extrato etanólico
Padrão/ Composto
TR (min)
Comprimento de onda (nm)
Padrão Composto
Padrão
Composto
Quercetina/ Flavonóide
23,74
23,77
203,255 e 366
290, 320 e 350
Apigenina/ Flavona
24, 91
24, 95
227, 267 e 312 254, 290, 320 e 350
Extrato aquoso liofilizado
Padrão/ Composto
TR (min)
Comprimento de onda (nm)
Padrão Composto
Padrão
Composto
Ácido caféico/ Ácido fenólico 15,39
15,39
220, 240, 323
320, 350
Quercetina/ Flavonóide
23,74
23,74
203, 255, 366 254, 290, 320 e 350
Apigenina/ Flavona
24, 91
24, 94
227, 267, 337
350
Acacetina/ Flavona
26,84
26,88
268, 331
254
Fonte: AUTOR, 2018.
55
Sendo assim, os resultados apresentados por Xu et al. (2009), demonstram a
identificação de compostos fenólicos (ácidos fenólicos, ácidos gálico e caféico) em amostras
vegetais de Avena nuda L., por análise cromatográfica em HPLC, evidenciando que a espécie
apresenta uma crescente atividade antioxidante atraves da germinação, esta é resultante de
uma diminuição significativa do fenólico e no aumento fenólicos livres e totais.
O desenvolvimento dessa técnica analítica tem permitido o isolamento de moléculas
constituidoras da base da fitoquímica dos produtos naturais, estes são classificadas de acordo
com sua rota biossintética em compostos fenólicos e outros (QUINTANA, 2017).
4.5.Avaliação do potencial alelopático
A análise dos dados revelou resultados expressivos, onde foi possível observar que
a relação da concentração x extrato alcançou a significância (p>0,05), demonstrando que os
parâmetros porcentagem de germinação, índice de velocidade de germinação, porcentagem de
plântulas anormais, comprimento da raiz e parte aérea e massa da matéria seca, quando
aplicado o teste de Dunnnett apresentam significância ao nível de 5% de probabilidade
quando comparado ao tratamento controle, evidenciando o efeito alelopático dos extratos da
C. heliotropiifolius na germinação de sementes de B. pilosa e D. insularis, de modo a inibir
tal processo (Tabela 15 e 16).
Tabela 15. Efeito de diferentes concentrações dos extratos da Croton heliotropiifolius sobre
a especíe Bidens pilosa.
Extrato etanólico
Concentração
G
IVG
PA
MS
CPA
CR
(mg/mL)
(%)
(mm)
(%)
(g)
(mm)
(mm)
Controle
87,00a
2,175a
0,00a
0,050a
19,71a
20,00a
0,1
23,00b
0,550b
3,00b
0,003b
16,89b
19,73b
0,25
13,00b
0,325b
4,00b
0,001b
15,06b
17,41b
0,5
13,00b
0,325b
5,00b
0,001b
14,94b
17,32b
1
9,00b
0,225b
6,00b
0,000b
13,47b
14,68b
Extrato aquoso
Concentração
G
IVG
PA
MS
CPA
CR
(mg/mL)
(%)
(mm)
(%)
(g)
(mm)
(mm)
Controle
87,00a
2,175a
0,00a
0,001a
20,06a
19,13a
0,1
53,00b
1,325b
8,00b
0,001b
19,27b
18,61b
0,25
27,00b
0,675b
10,00b
0,001b
17,11b
10,95b
0,5
28,00b
0,625b
12,00b
0,001b
15,79b
9,52b
1
19,00b
0,475b
15,00b
0,001b
13,55b
8,34b
Médias seguidas de mesma letra não diferem entre si pelo teste Dunnett ao nível de 5% de probabilidade.
Porcentagem de germinação (G%), Índice de velocidade de germinação (IVG mm), Porcentagem de plântulas
anormais (PA%), Massa da matéria seca (MS g), Comprimento da parte aérea (CPA mm) e da raíz (CR mm).
56
Foi observado que o extrato etanólico e aquoso da C. heliotropiifolius, causaram
interferência na germinação das sementes de B. pilosa, a partir da concentração de 0,25 mg/
mL com valores que variam de 13,00% quando submetido ao extrato etanólico e 27,00% ao
extrato aquoso, quando comparado ao tratamento controle com 87,00% que está na próximo a
faixa de 100% de sementes germinadas (Tabela 15).Resultado semelhante foi verificado para
os demais parâmetros analisados na requerida concentração demonstrando a eficiência do
extrato aquoso sobre a espécie Bidens pilosa em relação ao extrato etanólico.
Em relação a espécie D. insularis submetida aos extratos etanólico e aquoso da C.
heliotropiifolius foi perceptível interferência das diferentes concentrações quando comparadas
ao controle com 100% das sementes germinadas para todos os parâmetros analisados a partir
da concentração de 0,25mg;mL (Tabela 16). Segundo Navas et al. (2016), esse efeito
alelopático advém de compostos como fenóis, terpenos, alcaloides e poliacetilinas, classes de
fitoquímicos oriundos do metabolismo secundário das plantas.
Tabela 16. Efeito de diferentes concentrações dos extratos da Croton heliotropiifolius sobre
a espécie Digitaria insularis.
Concentração
G
IVG
PA
MS
CPA
CR
(mg/mL)
(%)
(mm)
(%)
(g)
(mm)
(mm)
Controle
100,00a
2,500a
0,00a
0,001a
12,53a
16,44a
0,1
42,00b
1,050b
18,00b
0,0003b
11,29b
9,07b
0,25
44,00b
1,100b
19,00b
0,0005b
10,67b
8,96b
0,5
37,00b
0,925b
22,00b
0,001b
10,07b
8,58b
1
33,00b
0,825b
27,00b
0,001b
9,69b
8,26b
Concentração
G
IVG
PA
MS
CPA
CR
(mg/mL)
(%)
(mm)
(%)
(g)
(mm)
(mm)
Controle
100,00a
2,500a
0,00a
0,0011a
13,92a
16,57a
0,1
69,00b
1,725b
18,00b
0,0007b
13,40b
14,11b
0,25
54,00b
1,350b
20,00b
0,0007b
13,31b
12,89b
0,5
42,00b
1,050b
22,00b
0,0005b
13,17b
12,62b
1
40,00b
1,000b
29,00b
0,0005b
11,95b
11,27b
Médias seguidas de mesma letra não diferem entre si pelo teste Dunnett ao nível de 5% de probabilidade.
Porcentagem de germinação (G%), Índice de velocidade de germinação (IVG mm), Porcentagem de plântulas
anormais (PA%), Massa da matéria seca (MS g), Comprimento da parte aérea (CPA mm) e da raíz (CR mm).
Nota-se ainda que as médias dos tratamentos dispostas na tablea 16, evidenciam que
as concentrações de 0,5 e 1 mg/mL ocorreu maior inibição, indicando que quanto maior for a
concentração do do extrato menor a quantidade de sementes germinadas, maior formação de
plântulas anormais, menor comprimento daraiz e parte aérea e consequente,mente menor
acumulo de matéria seca das plântulas de D. insularis.
Foi observada redução da germinação e do índice de velocidade de germinação de B.
pilosa e D. insularis nas concentrações de 0,25; 0,5 e 1 mg/mL do extrato etanólico da parte
57
aérea da C. heliotropiifolius, onde os dados obtidos para as espécies alvo se ajustaram ao
modelo regressão possibilitando a obtenção da curva dose –resposta com R2 que varia de 0,86
á 0,99 para os parâmetros analisados (Figura 9). Duarte et al.(2017) ressalva que a variável
índice de velocidade de germinação é considerada um dos parâmetros de fundamental
importância para avaliação do vigor de sementes, visto que, quando reduzido acarreta em uma
perda da uniformidade e da produção de sementes.
Figura 9. Curvas ilustrando os parâmetros porcentagem de germinação (A), índice de
velocidade de germinação (B), porcentagem de plamntulas anormais (C), comprimento da raiz
(D), Comrpiemento da parte aérea (E), massa da matéria seca (F), em diferentes
concentrações do extrato etanólico da C. heliotropiifolius sobre B. pilosa e D. insularis.
Fonte: AUTOR, 2018.
58
Segundo Sarton et al.(2015) a velocidade de germinação da B. pilosa foi reduzida
quando submetido a solução do extrato aquoso da espécie mucunã preta (Stilozobiem
aterrimem). Resultado este diferi do apresentado no presente trabalho, onde foi revelado que
das duas espécies alvo utilizadas a D. insularis foi sensível aos extratos vegetais da C.
heliotropiifolius a partir da concentração de 0,25 mg/mL, com 44% para porcentagem de
germinação, 1,1 mm para o índice de velocidade de germinação, 19% de plântulas anormais,
13,97mm comprimento da raiz, 12, 05 mm comprimento da parte aérea e 0,002 g para a
massa da matéria seca (Figura 9).
Stulp et al. (2011), apresenta resultados que corraboram com os dados apresentados
no trabalho, onde registraram anormalidades nas plântulas, estas apresentaram raízes curtas e
grossas, constatando também que as substâncias alelopáticas presentes nos extratos são
capazes de induzir a formação de plântulas anormais, sendo a planta incapaz de absorver
nutrientes reduzindo o acumulo de matéria seca.Essa redução da massa foi revelada de forma
mais reduzida na concentração 1 mg/mL sobre as plantas D. insularis, quando submetida ao
extrato aquoso com 0,004g e etanólico com 0,002g (Figura 9 e 10).
Figura 10. Curvas ilustrando os parâmetros porcentagem de germinação (A), índice de
velocidade de germinação (B), porcentagem de plamntulas anormais (C), comprimento da raiz
(D), Comrpiemento da parte aérea (E), massa da matéria seca (F), em diferentes
concentrações do extrato aquoso da C. heliotropiifolius sobre B. pilosa e D. insularis.
59
Fonte: AUTOR, 2018.
Foi observado ainda diminuição do alongamento da raiz das plântulas de B. pilosa e
C. amargoso submetidas aos extratos de C. heliotropiifolius, resultado explicado pela
aplicação do extrato etanólico e aquoso a partir das concentrações de 0,25 mg/mL, destacando
a de 1 mg/mL, onde visualizou 11,2 mm para d. insularis e 6,6 mm para B. pilosa ao serem
submetidas ao extrato aquoso. Enquanto que 11,74 mm para D. insularis e 6,6 para B. pilosa
sobre a apliação do extrato etanólico (Figuras 9 e 10).
Segundo Silva et al. (2010), o efeito alelopático dos extratos de Astronium
graveviolens e Astronium mocroporpa possuem sobre sementes de Lactuca sativa e Bidens
chinersis advém das propriedades fitoquímicas do extrato, visto que, o gênero Astronium
compreende diversos compostos, os quais pode-se citar flavonoides, protocianidinas e os
taninos.
Estudos realizados avaliando o efeito alelopático de extratos aquoso de folhas da
espécie Pityrocarpa moniliformis spbre a germinação de sementes de Mimosa
caesalpiniifolia, foi possível observar que o extrato reduziu o comprimento da raiz e a
velocidade de germinação à medida que se aumentava a concentração até 57 g.L-1, mais não
interferiu na variável germinação, demonstrando que as raízes são os órgão mais afetados
devido o contato direto com extrato e pela presença de compostos como saponinas,
flavonoides e taninos gálicos no extrato aquoso da folha (PACHECO e tal., 2017).
O presente estudo verificou pouca ocorrência de plântulas de B. pilosa com
anormalidades em comparação com D. insularis que demonstrou ser mais sensível extrato
aquoso e etanólico da C. heliotropiifolius, evidenciando maior formação de anormalidades nas
concentrações de 0,25; 0,5 e 1 mg/mL, parâmetro de enorme de expressão da alelopatia
(Figuras 9 e 10).Em estudo realizado por Filho (2013), são relatados que o aparecimento de
substâncias alelopáticas em extratos de plantas podem induzir a formação de plântulas com
60
algumas anormalidades, as quais menciona-se necrose nas raízes, manchas amareladas e
escuras, como também a formação de podridões na ponta da raiz.
De um modo geral, algumas espécies vegetais são indicativas de possíveis potenciais
alelopáticos no controle de B. pilosa, os quais pode-se citar o extrato aquoso do capim limão
(Cymbopogum citratus stopf.), arruda (Ruta graveolens L.), mirra (Tetradenia riparia Ness),
cânfora (Arteminia comphorata Rydb), alecrim (Rosmorinus Officinalis L.) e citronela
(Cymbopogan winteranus Rendle) e outras 10 espécies (TEIXEIRA et al., 2014; MORAES et
al., 2011; SHOKOUHIAN et al., 2016).
Sendo assim, a sensibilidade existente entre plantas receptoras tem sido bastante
comum em bioensaios de germinação, em virtude de diferentes mecanismos de absorção,
translocação e sitio ativo das substâncias alelopáticas presentes nos órgãos e tecidos das
plantas. A sensibilidade pode ser alterada devido à concentração da solução nos extratos,
indicando mudanças nas rotas metabólicas, na permeabilidade das membranas, na transição e
tradução do DNA (SILVA, 2014; MAHBOOBI et al., 2016).
61
5. CONCLUSÕES
Portanto, foi possível constatar maior sensibilidade das plantas Bidens pilosa e
Digitaria insularis, quando submetidas ao extrato aquoso nas concentrações de 0,1; 0,25 e 0,5
e 1 mg/mL.
A espécie Digitaria insularis revelou ser mais sensíveis para parâmetros analisados,
sob a aplicação dos extratos vegetais da C. heliotropiifolius.
Foram identificados compostos como ácidos fenólicos, flavonoides e flavonas nos
extratos aquosos, os quais somente flavonoides e flavonas foram encontrados nos extrato
etanólico. Esses compostos conferem a C. heliotropiifolius efeito alelopático no controle de
plantas daninhas como B. pilosa e D. insularis.
O conhecimento obtido no decorrer do presente trabalho constituiu a base para
futuras investigações acerca de extratos vegetais como fontes promissoras no controle de
espécies infestantes.
62
6.
ANEXOS
6.1.Cromatograma no comprimento de onda 290 nm para o extrato aquoso da parte
aérea da C. heliotropiifolius Kunth com os principais compostos identificados: 1Flavonoide (quercetina), 2- Flavona (acacetina).
6.2.Cromatograma no comprimento de onda 290 nm para o extrato aquoso da parte
aérea da C. heliotropiifolius Kunth com os principais compostos identificados: 1Flavonoide (quercetina).
Fonte: AUTOR, 2018.
63
6.3.Cromatograma no comprimento de onda 320 nm para o extrato aquoso da parte
aérea da C. heliotropiifolius Kunth com os principais compostos identificados: 1Ácido fenólico (ácido caféico), 2-Flavonoide (quercetina).
6.4.Cromatograma no comprimento de onda 350 nm para o extrato aquoso da parte
aérea da C. heliotropiifolius Kunth com os principais compostos identificados: 1Ácido fenólico (ácido caféico), 2-Flavonoide (quercetina), 3- Flavona (apigenina).
Fonte: AUTOR, 2018.
64
6.5. Cromatograma no comprimento de onda 254 nm para o extrato etanólico da parte
aérea da C. heliotropiifolius Kunth com os principais compostos fenólicos
identificados: 1- Flavona (apigenina).
Fonte: Autor, 2018.
6.6. Cromatograma no comprimento de onda 290 nm para o extrato etanólico da parte
aérea da C. heliotropiifolius Kunth com os principais compostos fenólicos
identificados: 1- Flavonoide (quercetina),2- Flavona (apigenina).
Fonte: AUTOR, 2018.
65
6.7. Cromatograma no comprimento de onda 320 nm para o extrato etanólico da parte
aérea da C. heliotropiifolius Kunth com os principais compostos fenólicos
identificados: 1- Flavonoide (quercetina), 2-Flavona (apigenina).
Fonte: Autor, 2018.
6.8. Cromatograma no comprimento de onda 350 nm para o extrato etanólico da parte
aérea da C. heliotropiifolius Kunth com os principais compostos fenólicos
identificados: 1- Flavonoide (quercetina), 2- Flavona (apigenina).
Fonte: AUTOR, 2018.
66
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