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                    UNIVERSIDADE FEDERAL DE ALAGOAS
CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM
PROTEÇÃO DE PLANTAS

MARIA HELLOÁ COSTA DE OLIVEIRA

CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE UM NOVO BEGOMOVIRUS QUE
INFECTA Cnidoscolus urens (L.) Arthur

Rio Largo - AL
2019

MARIA HELLOÁ COSTA DE OLIVEIRA

CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE UM NOVO BEGOMOVÍRUS QUE
INFECTA Cnidoscolus urens (L.) Arthur

Dissertação apresentada ao Programa de PósGraduação em Proteção de Plantas do Centro de
Ciências Agrárias da Universidade Federal de
Alagoas como requisito parcial para obtenção do
grau de Mestre em Proteção de Plantas.
Orientadora: Prof. Dra. Iraildes Pereira Assunção
Coorientador: Prof. Dra. Sarah Cavalcanti da Silva

Rio Largo - AL
2019

MARIA HELLOÁ COSTA DE OLIVEIRA

CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE UM NOVO BEGOMOVÍRUS QUE
INFECTA Cnidoscolus urens

Dissertação submetida ao corpo docente do
Programa de Pós Graduação em Proteção de
Plantas, do Centro de Ciências Agrárias da
Universidade Federal de Alagoas. E aprovada em
27 de Fevereiro de 2019.

Rio Largo - AL
2019

AGRADECIMENTOS

A Deus, por guiar todos os meus passos e dar-me coragem para enfrentar os desafios e
adversidades;
Aos meus queridos pais, José Cleber (em memória) e Marleide Costa, pelo amor, incentivo e
exemplo de força e esperança.
As minhas irmãs, que me agraciaram com a benção de ser tia;
Ao meu esposo por todo amor, companheirismo, amizade e paciência;
A todos familiares e amigos que contribuíram para meu crescimento;
Aos professores Drs. Iraildes Pereira Assunção e Gaus Silvestre de Andrade Lima pela
oportunidade, confiança, orientação, ensinamentos que foram fundamentais para minha
formação;
A Dra. Sarah Jacqueline Cavalcanti da Silva pela amizade, orientação, partilha de seu
conhecimento, e apoio durante minha trajetória no mestrado.
A todos do Laboratório de Fitopatologia Molecular e Virologia Vegetal pela amizade, ajuda
mútua e ensinamentos durante todo esse período, em especial a Mayra Ferro por sempre estar
disposta a ajudar, me guiando na execução deste trabalho;
A todos os professores do Programa de Pós-graduação em Proteção de Plantas CECA-UFAL
pelos conhecimentos passados, que contribuíram para a minha formação;
A CAPES pela bolsa de mestrado concedida, o que me permitiu adquirir inúmeros
conhecimentos incluindo os fundamentais para a realização desse trabalho;
A todos aqueles que de alguma forma contribuíram para a realização deste trabalho.

RESUMO
A família Geminiviridae engloba fitovírus com genoma de DNA circular de fita simples
encapsidado em partículas geminadas quasi-icosaédricas, sendo dividida em nove gêneros
(Becurtovirus, Begomovirus, Curtovirus, Eragrovirus, Mastrevirus, Topocuvirus,
Turncurtovirus, Grablovirus e Capulavirus) com base na gama de hospedeiros, tipo de inseto
vetor, organização genômica e relacionamento filogenético. Os begomovírus são transmitidos
pelo complexo de espécies crípticas de Bemisia tabaci, com hospedeiros selvagens/nãocultivados desempenhando um papel epidemiológico relevante, atuando como reservatórios
desses vírus. O presente estudo teve como objetivo a detecção e caracterização de
Begomovírus que infectam C. urens nos estados de Alagoas e Piauí. Amostras foliares de C.
urens (cansanção), apresentando sintomas indicativos de infecção por begomovírus, foram
coletadas nos estados de Alagoas e Piauí. O DNA total foi extraído e usado como molde para
amplificação dos genomas virais por círculo rolante. Estes genomas foram clonados e
sequenciados comercialmente por primer walking. Para atribuir corretamente taxonomia aos
novos isolados, foram utilizadas comparações pareadas do genoma completo com outros
begomovírus previamente relatados. Alinhamentos múltiplos de sequências nucleotídicas
foram preparados para o conjunto de dados DNA-A, CP e Rep que foram utilizados para
realização de análises filogenéticas e de recombinação. Um total de seis clones
correspondentes ao DNA-A foi obtido a partir de três amostras de C. urens e as comparações
pareadas indicaram a presença de duas espécies de begomovírus: Cnidoscolus mosaic leaf
deformation virus (CnMLDV) a partir de amostras coletadas em Alagoas; e uma nova espécie
para a qual foi proposto o nome Cnidoscolus blistering yellow mosaic virus (CnBYMV), a
partir da amostra coletada no Piauí. Árvores filogenéticas bayesianas mostraram que os
isolados obtidos foram distribuídos em dois grandes grupos bem suportados. O grupo I
englobou as espécies de CnMLDV obtidas no presente estudo, outros isolados provenientes
do estado de Alagoas e o isolado de PSLDV. Enquanto o grupo II englobou a espécie
CnBYMV e begomovírus descritos em plantas cultivadas e não cultivadas. Um evento de
recombinação foi detectado na RC e no gene Rep, tendo CnMLDV e SiMoV como prováveis
parentais.
Palavras-chave: Geminiviridae. Plantas não cultivadas. Euphorbiaceae. Cansanção.

.

ABSTRACT

The Geminiviridae family encompasses phytoviruses with a single-stranded circular DNA
genome encapsidated in quasi-icosahedral geminated particles and divided into nine genera
(Becurtovirus, Begomovirus, Curtovirus, Eragrovirus, Mastrevirus, Topocuvirus,
Turncurtovirus, Grablovirus and Capulavirus) based on the range of hosts, insect vector type,
genomic organization and phylogenetic relationship. Begomoviruses are transmitted by the
Bemisia tabaci cryptic species complex, with wild / uncultivated hosts playing a relevant
epidemiological role, acting as reservoirs of these viruses. The present study aimed to detect
and characterize Begomoviruses that infect C. urens in the states of Alagoas and Piauí. Leaf
samples of C. urens (fatigue), presenting symptoms indicative of begomovirus infection, were
collected in the states of Alagoas and Piauí. Total DNA was extracted and used as template
for amplification of the viral genomes by rolling circle. These genomes were cloned and
sequenced commercially by first walking. To correctly assign taxonomy to the new isolates,
we compared paired comparisons of the complete genome with other previously reported
begomoviruses. Multiple nucleotide sequence alignments were prepared for the DNA-A, CP
and Rep data set that were used for phylogenetic and recombination analyzes. A total of six
clones corresponding to DNA-A were obtained from three C. urens samples and the paired
comparisons indicated the presence of two begomovirus species: Cnidoscolus mosaic leaf
deformation virus (CnMLDV) from samples collected in Alagoas; and a new species for
which the name Cnidoscolus blistering yellow mosaic virus (CnBYMV) was proposed, from
the sample collected in Piauí. Bayesian phylogenetic trees showed that the isolates obtained
were distributed in two large well-supported groups. Group I comprised the species of
CnMLDV obtained in the present study, other isolates from the State of Alagoas and the
isolate of PSLDV. While group II encompassed the CnBYMV and begomovirus species
described in cultivated and uncultivated plants. A recombination event was detected in RC
and in the Rep gene, having CnMLDV and SiMoV as likely parental.

Key words: Geminiviridae. Uncultivated plants. Euphorbiaceae. Tense.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Representação esquemática do genoma do Bean golden yellow mosaic virus
(BGYMV), espécie-tipo do gênero Begomovirus. .................................................................................18
Figura 2 - Replicação via ciclo rolante em geminivírus .......................................................................20
Figura 3- Sintomas em Cnidoscolus urens infectadas por begomovírus..................................30
Figura 4 - Matriz bidimensional representando porcentagem de identidade de comparações
pareadas de sequências nucleotídicas do DNA-A coletadas nos estados de Alagoas e Piauí
com amostras de begomovírus disponíveis no GenBank .....................................................................31
Figura 5 - Análise filogenética de inferência Bayesiana baseada no DNA-A, mostrando a
formação de dois grupos ................................................................................................................................33
Figura 6 - Análise filogenética de inferência Bayesiana baseada no gene CP ..............................34
Figura 7 - Análise filogenética de inferência Bayesiana baseada no gene Rep .............................35

LISTA DE ANEXO

Tabela 1 - Sequências de begomovírus mais proximamente relacionados com isolados deste
trabalho

obtidas

a

partir

do

banco

de

dados

não-redundante

Genbank................................................................................................................................... 50
Tabela 2 – Isolados de C. urens obtidos neste trabalho.......................................................... 51

SUMÁRIO

1.INTRODUÇÃO GERAL .................................................................................................... 11
2. REVISÃO DE LITERATURA .......................................................................................... 13
2.1. Cnidoscolus urens (L.) Arthur ................................................................................................. 13
2.2A família Geminiviridae ............................................................................................................. 13
2.3 O gênero Begomovirus .............................................................................................................. 14
2.4Organização genômica e função das proteínas ........................................................................ 17
2.5 Replicação viral ......................................................................................................................... 19
2.6Variabilidade e estrutura genética de populações de begomovírus ....................................... 21
2.6.1 Mutação .................................................................................................................................................. 21
2.6.2 Recombinação ........................................................................................................................................ 22
2.6.3 Pseudorecombinação ............................................................................................................................. 23

2.7 Diversidade de begomovírus infectando plantas da família Euphobiaceae no Brasil.......... 25

3.MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................................ 26
3.1Coleta do material vegetal ......................................................................................................... 26
3.2Clonagem e sequenciamento do genoma completo de begomovírus...................................... 26
3.3Análise de sequências e demarcação de espécie ....................................................................... 27
3.4Análise filogenética..................................................................................................................... 27
3.5Análises de recombinação.......................................................................................................... 28

4.RESULTADOS E DISCUSSÃO ........................................................................................ 29
4.1 Análises de sequências e demarcação de espécie .................................................................... 29
4.2 Análises filogenéticas................................................................................................................. 31
4.3Análise de recombinação ........................................................................................................... 34

CONCLUSÃO......................................................................................................................... 36
REFERÊNCIAS ..................................................................................................................... 37
ANEXOS ................................................................................................................................. 50

11

1. INTRODUÇÃO GERAL
A família Geminiviridae engloba os vírus cujo genoma é constituído por DNA circular
de fita simples (ssDNA) encapsidado em partícula geminada quasi-icosaédrica (BROWN et
al., 2015; GILBERTSON et al., 2015). Esta é composta pelos gêneros Becurtovirus,
Begomovirus, Capulavirus, Curtovirus, Eragrovirus, Grablovirus, Mastrevirus, Topocuvirus,
Turncurtovirus, que são classificados a partir de características como gama de hospedeiros,
tipo de inseto vetor, organização genômica e relacionamento filogenético (VARSANI et al.,
2017; ZERBINI et al., 2017).
O gênero Begomovirus possui um (monopartido) ou dois (bipartido) componentes
genômicos, DNA-A e DNA-B, são transmitidos por um complexo de espécies crípticas da
mosca-branca Bemisia tabaci (BARBOSA et al., 2014; NAVAS-CASTILLO et al., 2011) e
infectam plantas dicotiledôneas. No DNA-A encontram-se os genes envolvidos na replicação
e encapsidação da progênie viral, enquanto no DNA-B encontram-se os genes responsáveis
pelos movimentos intra e intercelular (LAZAROWITZ, 1992). E ambos são requeridos para
ocorrência de infecção sistêmica do hospedeiro (BROWN et al., 2012; 2015).
Esse gênero vem se destacando nos últimos 20 anos pelo crescente número de espécies
descritas de vírus de plantas que causam prejuízos em culturas de importância econômica por
todo o mundo (GILBERTSON et al., 2015; INOUE-NAGATA; LIMA; GILBERTSON,
2016). No Brasil, Bean golden mosaic virus (BGMV) e Macroptilium yellow spot virus
(MaYSV) que infectam leguminosas, são os vírus de maior importância econômica em
feijoeiro (Phaseolus spp.) (FAUQUET et al., 2008; LIMA et al., 2013; RAMOS-SOBRINHO
et al., 2014). Além de várias doenças em tomateiro causada por um complexo de
begomovírus, onde prevalecem duas espécies Tomato severe rugose virus (ToSRV) e Tomato
mottle leaf curl virus (ToMoLCV) (INOUE-NAGATA; LIMA; GILBERTSON, 2016).
Begomovírus de plantas cultivadas podem infectam plantas não cultivadas em
diferentes famílias botânicas, que servem como hospedeiras alternativas (MORALES et al.,
2001; ALABI et al., 2008; BARBOSA et al., 2009; BARRETO et al., 2013; ROCHA et al.,
2013). O contrário também pode ocorrer, ou seja, vírus detectados em plantas não cultivadas
são capazes de infectar plantas cultivadas (IDRIS et al., 1999; BARRETO et al., 2013; LIMA
et al., 2013; RAMOS-SOBRINHO et al., 2014). Além disso, infecções mistas podem ocorrer,
possibilitando o surgimento de eventos de recombinação e pseudorecombinação entre
espécies e estirpes distintas, contribuindo assim para a evolução desses vírus (SEAL; VAN
DEN BOSCH; JEGER, 2006; ALABI et al., 2008; GARCÍA-ANDRÉS et al., 2006; MONDE

12

et al., 2010; ROCHA et al., 2013; STEWART et al., 2014; VAGHI MEDINA; MARTIN;
LÓPEZ LAMBERTINI, 2015).
Algumas espécies de begomovírus têm sido relatadas em plantas não cultivadas
pertencentes à família Euphorbiaceae: Euphorbia mosaic virus (EuMV; (HERNÁNDEZZEPEDA et al., 2007), Croton yellow vein virus (CYVV; HUSSAIN et al., 2011), Euphorbia
yellow mosaic virus (EuYMV; FERNANDES et al., 2011), Dalechampia chlorotic mosaic
virus (DCMV; FIALLO-OLIVÉ et al., 2013), Jatropha mosaic virus (JMV; SIMMONDSGORDON et al., 2014), e Cnidoscolus mosaic leaf deformation virus (CnMLDV; MELO et
al., 2016)
Estudos sobre a diversidade e estrutura genética de populações de begomovírus têm
ajudado a entender as forças evolutivas atuando sobre esses patógenos em condições de
campo (PRASANNA et al., 2010; GONZÁLEZ-AGUILERA et al., 2012; SILVA et al., 2012;
LIMA et al., 2013; ROCHA et al., 2013; RAMOS-SOBRINHO et al., 2014; FERRO, M. et
al., 2017), e tais informações podem ser úteis para o desenvolvimento de estratégias de
manejo voltadas para a obtenção de plantas resistentes (GONZÁLEZ-AGUILERA et al.,
2012).

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2. REVISÃO DE LITERATURA

2.1. Cnidoscolus urens (L.) Arthur

O gênero Cnidoscolus Pohl integrante da família Euphorbiaceae é composto por cerca
de 50 espécies que têm como característica marcante tricomas urticantes (BURGER; HUFT,
1995). Endêmicas do Novo Mundo, são encontradas especialmente no México e região
Nordeste do Brasil (WEBSTER, 1994; BURGER; HUFT, 1995; MELO; SALES, 2008), na
qual já foram relatadas aproximadamente dez espécies (MELO; SALES, 2008).
A espécie C. urens, popularmente conhecida como cansanção ou urtiga-cansanção se
destaca no gênero por ser a mais amplamente distribuída, presente desde o Leste do México
até a Argentina (BURGER; HUFT, 1995; MELO; SALES, 2008). No Brasil, C. urens foi
relatada nas regiões Nordeste (exceto nos Estados do Ceará e Maranhão), Sudeste, CentroOeste, Norte em Rondônia e no Sul no estado do Paraná (CORDEIRO; SECCO, 2015).
Infecção por begomovírus nesta espécie já foi relatada (ASSUNÇÃO et al., 2006), e
recentemente o primeiro genoma completo de um begomovírus ocorrendo naturalmente neste
hospedeiro foi relatado e identificado como Cnidoscolus mosaic leaf deformation virus
(CnMLDV)(MELO, 2016).

2.2 A família Geminiviridae

A família Geminiviridae é composta por vírus de genoma circular de fita simples
ssDNA, encapsidados, com partícula geminada quasi-icosaédrica de tamanho variável entre
2,6kb e 5,2kb. Podem se apresentar com monopartidos, como ocorre em sua maioria, ou
bipartido (DNA-A e DNA-B) particularidade do gênero Begomovirus, que para estabelecer
uma infecção sistêmica necessita da presença dos dois componentes genômicos (BROWN et
al., 2012; 2015).
Composta pelos gêneros Becurtovirus, Begomovirus, Capulavirus, Curtovirus,
Eragrovirus, Grablovirus, Mastrevirus, Topocuvirus, e Turncurtovirus, que se distinguem a
partir de características como gama de hospedeiros, tipo de inseto vetor, organização
genômica e relacionamento filogenético (VARSANI et al, 2014; 2017; ZERBINI et al., 2017),
podem ser transmitidos a plantas monocotiledôneas e dicotiledônea via cigarrinha,
membracídeos, afídeos e mosca-branca, ocasionando perdas de produtividade em algumas

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culturas de importância econômica (VARSANI et al., 2014; INOUE-NAGATA; LIMA;
GILBERTSON, 2016).
Além das plantas cultivadas, podem ainda infectar plantas ornamentais e silvestres
(HANLEY-BOWDOIN et al., 2013). Os sintomas característicos de infecção são facilmente
notados, como deformação foliar, enrolamento, amarelecimento, nanismo, mosaico e estrias.
Até o momento, dois gêneros desta família, Eragrovirus e Grablovirus, ainda tem seus
vetores desconhecidos (VARSANI et al., 2014; 2017).
Devido sua ampla distribuição geográfica, é possível observar em diferentes
continentes os efeitos e impactos ocasionados por geminivírus. Nas Américas, Bean golden
mosaic virus (BGMV) e Bean golden yellow mosaic virus (BGYMV) têm maior relevância
em feijoeiros; na América do Norte e Oriente Médio o Beet curly top virus (BCTV;
Curtovirus) em beterraba açucareira; na cultura do tomate o Tomato yellow leaf curl virus
(TYLCV; Begomovirus) está presente na Europa, África, Ásia, América Central, Caribe,
Estados Unidos e Austrália; African cassava mosaic virus (ACMV; Begomovirus) causa
prejuízos em mandioca e em milho Maize streak virus (MSV; Mastrevirus) na África; Wheat
dwarf virus (WDV; Mastrevirus) em trigo na Europa; e na Ásia o Cotton leaf curl virus
(CLCuV; Begomovirus) em algodoeiro (HANLEY-BOWDOIN et al., 2013; SCHUBERT et
al., 2014; INOUE-NAGATA; LIMA; GILBERTSON, 2016).

2.3 O gênero Begomovirus

Dentre os membros de Geminiviridae, o gênero Begomovirus (espécie tipo Bean
golden yellow mosaic virus - BGYMV) tem maior relevância devido ao seu grande número de
espécies, atualmente o International Comitee on Taxonomy of Viruses – ICTV
(http://www.ictvonline.org/virusTaxonomy.asp) reconhece 388 espécies (VARSANI et al.,
2014; BROWN et al., 2015; ICTV, 2018).
Considerados emergentes nas regiões tropicais e subtropicais do mundo, os
begomovírus são os mais importantes devido à sua alta incidência e severidade das doenças
em culturas de importância econômica (MORALES, ANDERSON, 2001; MORALES, 2006).
Este notável aumento na ocorrência das doenças causadas por begomovírus foi impulsionado
pelo vetor mosca-branca (Homoptera: Aleyrodidae), especialmente o biótipo B que se
espalhou pelo mundo (GILBERTSON et al., 2015). Os sintomas dos begomovírus em plantas
variam a depender da planta hospedeira, da fase da cultura em que ocorre a infecção e a
espécie viral. Contudo os sintomas mais frequentes são nanismo; uma combinação de

15

mosaico/mosqueado verde-amarelo-dourado,

enrolamento, enrugamento, deformarção,

manchas amarelas e amarelecimento das nervuras ou internervuras nas folhas (PICÓ et al.,
1996; MORALES; ANDERSON, 2001; INOUE-NAGATA; LIMA; GILBERTSON, 2016).
Os begomovírus são classificados em dois grupos de acordo com sua diversidade
genética e sua distribuição geográfica, begomovírus do “Velho Mundo” (VM), que podem
apresentar um ou dois componentes genômicos e frequentemente estão associados a
moléculas de ssDNA satélites denominados alfassatélites (anteriormente DNA-1) e
betassatélites (FAUQUET; STANLEY, 2005; ZHOU et al., 2013; LOZANO et al., 2016;
ROSARIO et al., 2016), os quais desempenham funções essenciais para o vírus auxiliar, como
ocorre no DNA-B dos begomovírus bissegmentados (ROJAS et al., 2005) e begomovírus do
“Novo Mundo” (NV).
O primeiro relato de betassatélites associado à begomovírus foi o Ageratum yellow
vein virus (AYVV), outros begomovírus vêm sendo relatados e seguem a proposta de
classificação e nomenclatura de Briddon et al., (2008). Atualmente estão listadas 61 espécies
no ICTV, e nenhum betassatélite foi detectado em associação com vírus nativos do NM
(ROMAY et al., 2010; ROSARIO et al., 2016).
Begomovírus do NV apresentam em sua maioria dois componentes genômicos DNAA e DNA-B, com relatos de ocorrência de associação a alfassatélites (PAPROTKA;
METZLER; JESKE, 2010; ROMAY et al., 2010). São poucos os begomovírus monopartidos
nativos do NM, Tomato leaf deformation virus (ToLDeV; SÁNCHEZ-CAMPOS et al., 2013;
MELGAREJO et al., 2013), Tomato mottle leaf curl virus (ToMoLCV; VU et al., 2015) e
Tomato severe leaf curl virus (ToSLCV; GILBERTSON et al., 2015).
Alfassatélites foram descritos ocorrendo naturalmente no Novo Mundo (Brasil e
Venezuela) associados aos begomovírus bipartidos Cleome leaf crumple virus (ClLCrV),
Euphorbia mosaic virus (EuMV) e Melon chlorotic mosaic virus (MeCMV), ocorrendo
naturalmente no Novo Mundo (PAPROTKA; METZLER; JESKE, 2010; ROMAY et al.,
2010). Recentemente, DNAs satélites foram detectados em mosca-branca com a abordagem
VEM (vector enabled metagenomics) na Guatemala e em Porto Rico, sendo demonstradas
associações entre begomovírus e alfassatélites, o que sugere que a distribuição destas
moléculas está bem difundida pelo continente americano (ROSARIO et al., 2016).
Não é possível afirmar a função dos satélites, porém, parecem estar associados à
virulência do patógeno (BRIDDON et al., 2008), atuando na supressão do silenciamento
gênico da planta, com a proteína βC1, codificada pelo betassatélite (CUI et al., 2005). Estudos
indicam que os satélites de DNA podem atuar como fatores de patogenicidade, uma vez que,

16

begomovírus distintos quando interagem com um mesmo DNA satélite causam os mesmos
sintomas nas plantas infectadas (MANSOOR et al., 2003). Sabe-se ainda que associação de
alfassatélites com begomovírus (com ou sem betassatélites) não está relacionada ao
desenvolvimento de sintomas na planta hospedeira, porém, podem atenuá-los (ZHOU et al.,
2013).
Uma nova classe de DNAs satélites foi descrita associada a begomovírus bipartidos do
NM infectando plantas não-cultivadas (família Malvaceae) em Cuba (FIALLO-OLIVÉ et al.,
2012). Moléculas semelhantes foram detectadas em adultos de mosca-branca ultilizando a
abordagem VEM no sul da Flórida (WfVEM-Sat) (NG et al., 2011), porém a estrutura do
genoma não foi descrita em detalhes (FIALLO-OLIVÉ et al., 2012). O nome proposto para a
classe foi deltassatélites (LOZANO et al., 2016) que inclui ToLCV-Sat, primeiro DNA
satélite associado ao begomovírus Tomato leaf curl virus (DRY et al., 1997), os satélites
relatados em Cuba (que juntamente com os satélites da Flórida são chamados de
deltassatélites do NM) (FIALLO-OLIVÉ et al., 2016) e os DNAs satélites associados a
sweepovírus infectando convolvuláceas na Espanha e Venezuela (LOZANO et al., 2016;
FIALLO-OLIVÉ et al., 2016).
O método de identificação e determinação de espécies de begomovírus se dá a partir
da sequência completa de nucleotídeos do DNA-A, seguindo o critério de identidade de
sequencia nucleotídica do DNA-A de ≥91% em comparações pareadas usando o programa
Sequence Demarcation Tool (BROWN et al., 2015; SDT; MUHIRE; VARSANI; MARTIN,
2014).
Um método simples para clonagem de genoma completo de begomovírus foi
desenvolvido por Inoue-Nagata el al. (2004) baseado na amplificação por círculo rolante
(rolling-circle amplification - RCA) dos componentes genômicos, seguido de digestão com
enzima de restrição e ligação ao vetor plasmidial, tornando mais rápido os procedimentos de
clonagem e sequenciamento para estudos com grande número de isolados (MAR et al. 2017;
RAMOS-SOBRINHO et al., 2014; ROCHA et al., 2013; SILVA et al., 2012).
Outra técnica que vem sendo usada é a de clones infecciosos, facilitando estudos de
diferentes viroses, assim como na compreensão da interação vírus/hospedeiro/vetor
(BREWER et al., 2018). Além disso, tem facilitado a realização de estudos de variabilidade
genética e epidemiologia molecular, fornecendo suporte a programas de melhoramento
genético de espécies cultivadas.

17

2.4 Organização genômica e função das proteínas

A maioria dos begomovírus do NV possuem dois componentes genômicos (DNA-A e
DNA-B) encapsidados separadamente em partículas icosaédricas geminadas, e para o
desenvolvimento de infecção sistêmica se faz necessário à presença de ambos. O DNA-A e o
DNA-B possuem uma região conservada (RC) com aproximadamente 200pb, onde
compartilham

identidade

de

sequência

acima

de

90%

(LAZAROWITZ,

1992;

LAZAROWITZ et al., 1992; FONTES et al., 1994b). A RC abriga a origem de replicação
viral (ori) numa estrutura em forma de grampo com o nonanucleotídeo conservado 5’TAATATTAC-3’ (JESKE, 2009; BROWN et al., 2012; BROWN et al., 2015).
Em 2011, Lima et al. relatou um nonanucleotídeo não usual (5’-TAGTATTAC-3’) no
begomovírus Malvaviscus yellow mosaic virus (MYMV), provenientes de plantas
ornamentais da família Malvaceae (LIMA et al., 2011). Este nonanucleotídeo está inserido
numa sequencia de 30 nucleotídeos que formam uma estrutura em forma de grampo. Foi
observado que mesmo ocorrendo variação na sequencia de 30 nucleotídeos, a estrutura em
forma de grampo sempre está presente (FARIA; ZERBINI, 2000).
O componente DNA-A dos begomovírus codifica para as proteínas: Rep (“replication
associated protein”), TrAP (“trans activating protein”), REn (“replication enhancer protein”),
C4 e CP (“coat protein”). Esta última é transcrita no sentido viral e as outras quatro no sentido
complementar, sendo estes genes os responsáveis pela replicação e encapsidação viral.
(FARIA, ZERBINI, 2000). As proteínas: NSP (“nuclear shuttle protein” ou BV1) no sentido
viral, e MP (“moviment protein” ou BC1) no sentido complementar, são encarregadas pelo
movimento do vírus no hospedeiro (célula-a-célula e a através do envelope nuclear), e são
codificadas pelos genes presentes no DNA-B (Figura 1; TIMMERMANS, DAS, MESSING,
1994; BROWN, 1997; FARIA et al., 2000).

18

Figura 1. Representação esquemática do genoma do Bean golden yellow mosaic virus (BGYMV), espécie-tipo
do gênero Begomovirus. Os círculos representam o genoma viral, com dois componentes (DNA-A e DNA-B) de
aproximadamente 2.600 nucleotídeos cada. Uma sequência de aproximadamente 200 nucleotídeos, denominada
região comum (CR), contém a origem de replicação viral, com uma estrutura em forma de grampo e uma
sequência invariável de nove nucleotídeos (TAATATT↓AC), conservada em todos os membros da família
Geminiviridae. A seta (↓) indica o sítio de início da replicação do DNA viral por círculo rolante. As setas azuis e
vermelhas indicam os genes virais e a direção em que ocorre a transcrição (viral e complementar,
respectivamente). Reproduzido de (GUTIERREZ et al., 2004).

A proteína capsidial (CP) tem a função de proteger o genoma viral contra a
degradação, determina a especificidade do vírus pelo inseto vetor e é fundamental para a
transmissão (HÖFER et al., 1997a BRIDDON et al., 1990;). Em begomovírus monopartidos
também tem a função de transportar o DNA viral do núcleo para o citoplasma e do citoplasma
para o núcleo (LIU et al., 1999).
A proteína Rep é fundamental e a única indispensável para a replicação do ssDNA
viral no núcleo da célula hospedeira iniciando a replicação por círculo rolante (BRIDDON,
2015; JESKE, 2009). A função desta proteína é ligar ao sítio de início da replicação viral e
clivar umas das fitas de DNA (FONTES; LUCKOW; HANLEY-BOWDOIN, 1992).
A proteína transativadora da transcrição (TrAP), atua na expressão de genes de sentido
viral (CP e NSP). Ainda é possível que esta proteína desempenhe função de interagir e
inativar enzimas que estão envolvidas na defesa do hospedeiro, como a ADK (“adenosine
kinase”) e SNF1 (“sucrose nonfermenting 1”) (SUNTER et al., 2001).
A proteína REn embora não seja fundamental para a replicação, quando está presente,
há um aumento no acúmulo de DNA viral na célula hospedeira (ZERBINI; CARVALHO;
MACIEL-ZAMBOLIM, 2000). Isso ocorre pelo aumento da afinidade da proteína Rep na
origem de replicação, ocasionado REn (HANLEY-BOWDOIN et al., 1999). Mutação em seus

19

genes parece estar relacionada ao retardamento ou atenuação de sintomas, mesmo não sendo
fundamental para o aparecimento deles (ELMER et al., 1988; ETESSAMI et al., 1991).
A C4 é responsável por suprimir a resposta do hospedeiro à ação da Rep (ROJAS et al,
2005; STANLEY et al, 2005), podendo determinar a severidade dos sintomas (JUPIN et al.,
1995). Vanitharani et al. (2004) demostraram em estudos que esta proteína está envolvida na
supressão do silenciamento gênico póstranscricional em plantas infectadas com African
cassava mosaic virus (ACMV) e Sri Lanka cassava mosaic virus (SLCMV).
O componente DNA-B tem sentido complementar (MP) que codifica a proteína
(Moviment Protein - MP) relacionada com o movimento célula-a-célula do vírus por meio do
aumento do limite de exclusão dos plasmodesmas. E no sentido viral o gene (NSP) codifica
uma proteína (Nuclear Shuttle Protein - NSP) que realiza o transporte do DNA através do
envelope nuclear (FARIA; ZERBINI, 2000; ZERBINI; CARVALHO; MACIELZAMBOLIN, 2002). Essas duas proteínas atuam de forma a mediar o tráfego intra e
intercelular do DNA viral (SANDERFOOT; LAZAROWITZ, 1995), proporcinando ao vírus
infectar sistemicamente a planta.

2.5 Replicação viral

O processo de infecção dos geminivírus se inicia com entrada das partículas virais na
hospedeira por meio da inoculação pelo inseto vetor. Uma vez no interior da célula, este irá
espontaneamente se desassociar do capsídeo, e será transportado até o núcleo, onde ocorrerá a
replicação do vírus (LAZAROWITZ, 1992; PALMER; RYBICKI, 1998). No núcleo celular o
ssDNA é convertido em um intermediário de fita dupla (dsDNA) chamado de Forma
Replicativa (FR). Não é possível afirmar, mas provavelmente essa conversão ocorra através
de fatores do hospedeiro (STENGER et al., 1991; STANLEY, 1995; ZERBINI;
CARVALHO; MACIEL-ZAMBOLIN, 2000). Dentro da célula essa FR irá servir como
molde para a síntese de novos componentes genômicos e na transcrição dos genes virais. A
replicação do vírus ocorre via mecanismo de círculo rolante, semelhante ao utilizado pelos
bacteriófagos ϕX174 e M13 (Figura 2) (STENGER et al., 1991; STANLEY, 1995).
Nos dois componentes genômicos (DNA-A e DNA-B) a RC, composta por uma
sequência conservada em forma de grampo (“structurally conserved element”, SCE), onde
está localizada a origem de replicação (ori), formada por um nonanucleotídeo encontrado em
todos os geminivírus e que constitui o domínio funcional da origem de replicação
(HEYRAUD-NITSCHKE et al., 1995; OROZCO; HANLEY-BOWDOIN, 1999).

20

A replicação por circulo rolante se inicia com a clivagem do dsDNA exatamente no
nonanucleotídeo (TAATATTAC); (FONTES et al., 1994; LAUFS et al., 1995). A replicação
ocorre da mesma forma tanto para o DNA-A, como para o DNA-B (LAUFS et al., 1995;
FARIA; ZERBINI, 2000; STANLEY et al., 2005).
A clivagem do dsDNA na RC é realizada pela proteína Rep. Nessa região existe uma
sequência específica de ligação desta proteína (FONTES; LUCKOW; HANLEY-BOWDOIN,
1992; FONTES et al., 1994a) e regiões promotoras da RNA polimerase tipo II de plantas,
responsável pela transcrição dos genes virais (HANLEY-BOWDOIN et al., 1999). O
reconhecimento pela proteína Rep é considerado vírus-específico (HARRISON; ROBINSON,
1999; RAMOS et al., 2003).
A partir do momento em que Rep é ligada ao DNA viral ocorre a estabilização do
complexo formado por Rep, REn e fatores do hospedeiro, inciando-se a replicação por círculo
rolante e finalizada com a encapsidação do ssDNA genômico circular maduro em partículas
virais (GUTIERREZ, 1999).

Figura 2. Replicação via ciclo rolante em geminivírus. ssDNA circular viral (em azul) é convertida em dsDNA
pela DNA polimerase da hospedeira (passo 1). A Rep (em vermelho) é expressa e se associa aos sítios de ligação
na origem de replicação (passo 2). À medida que a replicação ocorre a fita de DNA mais antiga é liberada

21

(passos 4 e 5). O genoma viral monomérico pode ser liberado (passo 6a) ou mais ciclos de replicação podem
ocorrer (passo 6b e 7). Monômeros ou dímeros de ssDNA (passos 6a e 7) podem ser convertidos em dsDNA pela
DNA polimerase do hospedeiro para que novos ciclos de replicação ocorram. O genoma viral produzido no
passo 6a pode também ser encapsidado. Sucessivas gerações de ssDNA são coloridas em azul, amarelo e rosa
(Figura extraída de MARTIN et al., 2011).

A Replicação Dependente de Recombinação (RDR), uma forma secundária de
replicação dos geminivírus, foi sugerida com base na identificação de intermediários de
replicação viral do Abutilon mosaic virus (AbMV) que não podem ser explicados pelo
mecanismo de círculo rolante (JESKE et al., 2001). Outos estudos demostraram que esses
intermediários também foram encontrados em African cassava mosaic virus (ACMV), Beet
curly top virus (BCTV), Tomato golden mosaic virus (TGMV) e Tomato yellow leaf curl
virus (TYLCV) (PREISS e JESKE, 2003), indicando que a RDR é um mecanismo comum
entre esses vírus.

2.6 Variabilidade e estrutura genética de populações de begomovírus

A estrutura genética de populações de fitovírus refere-se à quantidade e à distribuição da
variabilidade genética dentro e entre subpopulações (GARCÍA-ARENAL et al., 2001).
Populações de geminivírus possuem um elevado grau de diversidade genética e a sua análise é
fundamental para melhor compreender a evolução do vírus e sua interação com a planta
hospedeira (GARCÍA-ARENAL; FRAILE; MALPICA, 2003; SEAL; VAN DEN BOSCH;
JEGER, 2006).
As principais fontes de variabilidade genética são os eventos de mutação,
recombinação e pseudorecombinação (GARCÍA-ARENAL; FRAILE; MALPICA, 2003;
SEAL; VAN DEN BOSCH; JEGER, 2006), tornando com que os vírus se adaptem a novos
hospedeiros e a mudanças nas condições ambientais (ROOSSINCK, 1997).

2.6.1 Mutação

Mutações são alterações na molécula de DNA por meio de substituições em pares de
bases, originando mutações pontuais que vem sendo estudadas nesse grupo de vírus sob
diferentes condições de seleção, como a presença de um efeito gargalo, transferências

22

sucessivas entre hospedeiros sem emprego do vetor, e a inoculação de plantas resistentes
(ISNARD et al., 1998). A evolução de todos os vírus, assim como para os geminivírus,
depende primordialmente de mutações (HARKINS et al., 2009)
Duffy e Holmes (2009) realizaram análises estruturadas no tempo, em isolados de East
African cassava mosaic virus (EACMV) para estimar a taxa de evolução dessa espécie de
begomovírus. As taxas foram estimadas em 1,6x10-3 e 1,33x10-4 substituições/sítio/ano para o
DNA-A e DNA-B, respectivamente. A região que codifica a proteína CP apresentou 1,37x103

subs/sítio/ano e a região que codifica a proteína associada à replicação mostrou 1,24x10-3

subs/sítio/ano. As regiões codificadoras presentes no DNA-B, ORFs BV1 e BC1,
apresentaram 2,77x10-4 e 3,45x10-4, respectivamente. Os autores concluíram que as mutações
observadas refletem uma rápida dinâmica mutacional, entretanto, validaram esses altos níveis
de heterogeneidade apenas para o DNA-A e a ORF AV1. Begomovírus brasileiros bipartidos
foram analisados por Rocha et al. (2013), e exibiram alta frequência de mutação, sendo as
regiões intergênica e do gene CP as de maiores valores.

2.6.2 Recombinação

O processo de recombinação se dá pela incorporação de partes de uma fita de DNA ou
RNA na fita de um indivíduo diferente durante o mecanismo de replicação (PADIDAM;
BEACHY; FAUQUET, 1999). Atuando na manutenção e no reparo das moléculas de DNA
(CROMIE et al., 2001), a recombinação é de extrema importância para evolução, pois
defende o genoma do acúmulo de mutações deletérias (KEIGHTLEY; OTTO, 2006) e ainda
permite o surgimento de novas combinações genéticas (CRAMERI et al., 1998).
Ocorrendo corriqueiramente em geminivírus, este processo (PADIDAM; BEACHY;
FAUQUET, 1999) parece contribuir em grande para a diversificação genética dos
begomovírus, aumentando seu potencial evolutivo e adaptação local (MONCI et al., 2002).
Possivelmente, isto se reflita no surgimento de algumas das espécies virais mais importantes
para a agricultura mundial (ZHOU et al., 1997; MONCI et al., 2002; GARCIA-ANDRES et
al., 2007).
Em plantas não cultivadas a recombinação é responsável pela alta variabilidade
genética observada em populações de begomovirus (LIMA et al., 2013; RAMOSSOBRINHO et al., 2014). Com relação a plantas cultivadas, eventos de recombinação
implicam diretamente no surgimento de novas doenças e epidemias, como por exemplo, a
epidemia devastadora do mosaico da mandioca (Manihot esculenta), causada pelo

23

recombinante EACMV em Uganda e países vizinhos (PITA et al., 2001); as epidemias do
complexo TYLCV na Bacia Ocidental do Mediterrâneo, com o surgimento dos recombinantes
Tomato yellow leaf curl Malaga virus (TYLCMalV) e Tomato yellow leaf curl Axarquia virus
(TYLCAxV) nos campos de tomate na Espanha; e as epidemias de Cotton leaf curl virus
(CLCuV) no Paquistão causadas por um complexo de espécies incluindo diversos
begomovírus recombinantes (IDRIS; BROWN, 2002; MONCI et al., 2002).
Alguns fatores contribuem expressivamente para a ocorrência de eventos de
recombinação, como as infecções mistas, um pré-requisito para que este evento ocorra
(PADIDAM et al., 1995; UMAHARAN et al., 1998). O biótipo B de B. tabaci, inseto
polífago e que apresenta um alto grau de adaptação e dispersão, assim como a grande
produção de cópias do genoma através da replicação via “forma replicativa” dsDNA
(BEDFORD et al., 1994). Estes três fatores resultam em recombinações virais e o
aparecimento de infecções em novas hospedeiras.
Não é possível afirmar quais mecanismos controlam a recombinação em begomovírus
(PADIDAM; BEACHY; FAUQUET, 1999). Porém, já foi constatado que sítios
recombinantes não são uniformemente distribuídos ao longo do genoma, existindo sítios
frequentes (“hot spots”) e infrequentes (“cold spots”) de recombinação (STANLEY, 1995;
FAUQUET et al., 2005; GARCIA-ANDRES et al., 2007; LEFEUVRE et al., 2007),
constatando-se, via análises de bioinformática para detecção de vírus recombinantes de
ocorrência natural, que a origem de replicação viral é um sítio frequente de recombinação
(HANLEY-BOWDOIN et al., 1999).
Lefeuvre et al. (2007) analisaram e compararam sequências de begomovírus mono e
bissegmentados depositadas no GenBank,

constatando

que a região do gene Rep que

codifica a porção N-terminal da proteína Rep, e a região intergênica adjacente (RC) são
frequentemente intercambiadas durante a replicação. Sítios frequentes de recombinação
localizados na região intergênica entre os genes CP e Ren também foram identificados.

2.6.3 Pseudorecombinação

O mecanismo alternativo de pseudorecombinação ocorre na maioria dos begomovírus
que apresentam dois componentes genômicos, onde a troca de material genético pode ocorrer
sem necessidade de recombinação intermolecular, ocorrendo apenas troca de componentes

24

genômicos entre dois vírus distintos (SUNG; COUTTS, 1995; ANDRADE et al., 2006). A
formação de pseudorecombinantes é mais viável entre estirpes de uma mesma espécie de
begomovírus (HOFER, et al. 1997a; UNSELD, 2000; GARRIDO-RAMIREZ et al, 2000).
Experimentos com pseudorecombinação são ferramentas úteis no estudo de funções de
genes e podem revelar relações filogenéticas, como é o caso da mistura de componentes
genômicos do BGYMV e do Bean golden mosaic virus (BGMV), que possuem identidade
inferior a 75% em suas sequências de nucleotídeos e não formam pseudorecombinantes
infecciosos (GILBERTSON et al., 1993a).
Por outro lado, pseudorecombinantes formados a partir da mistura de componentes
genômicos de dois isolados de BGYMV mostraram-se infecciosos. Quando inoculada, a
mistura formada a partir de DNA-A do isolado da Guatemala (BGYMV-GA) e DNA-B do
isolado da República Dominicana (BGYMV-DR) foi capaz de induzir os mesmos sintomas
apresentados pelos parentais, enquanto o pseudorecombinante recíproco induziu sintomas
atenuados e tardios. Esses resultados demonstraram que geminivírus com regiões comuns
suficientemente similares podem formar pseudorecombinantes infecciosos, mas ressaltam que
frequentemente os pseudorecombinantes recíprocos apresentam diferenças na eficiência de
replicação e infecção sistêmica (FARIA et al., 1994). Esse fato foi também observado para o
African cassava mosaic virus (ACMV) e TGMV (STANLEY et al., 2005; VON ARNIM;
STANLEY, 1992).
Andrade et al. (2006) descreveram a espécie Tomato yellow spot virus (ToYSV)
originalmente isolado de tomate, mas filogeneticamente próximo aos vírus isolados de Sida
sp. Apesar disso, o ToYSV foi capaz de formar pseudorecombinantes com vírus de tomate.
Pseudorecombinantes infectivos formados entre o DNA-A de ToYSV e o DNA-B de Tomato
crinkle leaf yellow virus (TCrLYV) induziram sintomas severos em N. benthamiana.
Esse potencial para formar pseudorecombinantes foi, em parte, atribuído ao fato de
que a origem de replicação de ambos os componentes possui a sequência do sítio de ligação
da Rep idêntica. Apesar disto, o mesmo não ocorre com o pseudorecombinante viável
formado entre o DNA-A de Tomato golden mosaic virus (TGMV) e o DNA-B de ToYSV,
que possuem a sequência do sítio de ligação da Rep diferente. Estes resultados reforçam a
hipótese de que a formação de pseudorecombinantes viáveis não se baseia apenas nas relações
filogenéticas e nas sequências conservadas dos iterons (ANDRADE et al., 2006).
Contudo, a especificidade da ligação da proteína Rep aos iterons é considerada
determinante na formação de pseudo-recombinantes viáveis entre diferentes espécies/estirpes
de begomovírus (EAGLE; OROZCO; HANLEY-BOWDOIN, 1994; FONTES et al., 1994;

25

CHATTERJI et al., 1999; ANDRADE et al., 2006a; BULL et al., 2007). Outro fator
importante é a conservação da sequência de aminoácidos da proteína Rep, especialmente os
três aminoácidos do IRD que estariam envolvidos diretamente na ligação aos iterons
(ARGUELLO-ASTORGA; RUIZ-MEDRANO, 2001; RUIZ-MEDRANO; XOCONOSTRECAZARES; LUCAS, 2001).

2.7 Diversidade de begomovírus infectando plantas da família Euphobiaceae no Brasil

Nas últimas décadas os begomovírus têm emergido como um dos principais patógenos
de plantas, ocasionando perdas econômicas severas, particularmente nas regiões tropicais e
subtropicais do mundo (MORALES, 2010) em culturas importantes como feijão (Phaseolus
vulgaris), mandioca (Manihot esculenta), algodão (Gossypium sp.), tabaco (Nicotiana
tabacum) e tomate (GRAHAM; MARTIN; ROYE, 2010).
No entanto, plantas não-cultivadas vêm sendo relatadas como hospedeiras de
begomovírus por todo o mundo, incluindo o Brasil, com destaque para aquelas pertencentes
às famílias Malvaceae, Euphorbiaceae e Fabaceae (MORALES; ANDERSON, 2001; IDRIS
et al., 2003; JOVEL et al., 2004; VARSANI et al., 2009; FIALLO-OLIVE et al., 2010;
MUBIN et al., 2010).
Plantas não-cultivadas da família Euphorbiaceae têm sido relatadas como hospedeiras
naturais de begomovírus há bastante tempo. Na década de 1930, Jatropha gossypifolia L. foi
descrita como hospedeira de begomovírus (COOK, 1931 apud SIMMONDS-GORDON,
2014). Desde então diversas espécies têm sido descritas e caracterizadas incluindo Euphorbia
mosaic vírus (EuMV), Croton yellow vein vírus (CrYVV), Euphorbia yellow mosaic virus,
(EuYMV), Dalechampia chlorotic mosaic vírus (DaClMV) e Jatropha mosaic vírus (JMV).
No Brasil, um begomovírus causando mosaico em Euphorbia heterophylla L. (syn.
Euphorbia prunifolia) foi relatado em 1950 (COSTA; BENNET, 1950), e provavelmente
corresponde a EuYMV, o primeiro begomovírus de euforbiáceas completamente
caracterizado no país (FERNANDES et al., 2011). Adicionalmete

EuYMV tem sido

encontrado infectando naturalmente Macrotilium artopurpureum, Sida santaremensis,
Crotalaria juncea e Solanum lycopersicum.
Em 2006, foi detectada por meio de Polymerase Chain reaction (PCR) a infecção por
begomovírus em plantas de Cnidoscolus urens proveniente do estado de Alagoas
apresentando sintomas de mosaico e deformação foliar (Assunção et al., 2006). Contudo, a
sequência completa do genoma deste begomovírus levou dez anos para ser conhecida, e este

26

foi nomeado Cnidoscolus mosaic leaf deformation virus (CnMLDV). Até o momento
CnMLDV é o único begomovírus descrito infectar C. urens o país.

3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1 Coleta do material vegetal

Amostras foliares de cansanção apresentando sintomas indicativos de infecção por
begomovírus (amarelecimento, mosaico, deformação foliar, nanismo e bolhosidade) foram
coletadas no estado de Alagoas e Piauí em 2018 (Figura 4). Sendo duas amostras provenientes
da cidade de Atalaia (AL) e uma de Teresina (PI). O material vegetal foi armazenado em
ultra-freezer (-80ºC) no Laboratório de Fitopatologia Molecular e Virologia Vegetal do
Centro de Ciências Agrárias da Universidade Federal de Alagoas.
3.2 Clonagem e sequenciamento do genoma completo de begomovírus

DNA total foi extraído a partir de cada amostra vegetal segundo protocolo de Doyle &
Doyle (1987) e utilizado como molde para reações de amplificação dos genomas virais
completos via círculo rolante na presença da enzima DNA polimerase do bacteriófago phi29,
de acordo com o método descrito por Inoue-Nagata et al. (2004). Alíquotas das reações de
amplificação foram submetidas, individualmente, a clivagens com enzimas de restrição (ApaI
e HindIII) para linearizar o genoma. Os produtos das reações de clivagem enzimática foram
analisados em gel de agarose a 0,8%, corados com brometo de etídio (5 µg/mL) e
visualizados sob luz UV. Alíquotas das reações de clivagem contendo fragmentos de
aproximadamente 2600 nucleotídeos (nt), correspondente a uma cópia de cada componente
genômico, foram utilizadas para ligação no vetor pBluescript KS+ (Stratagene) previamente
linearizado com a mesma enzima e defosforilado. O produto da reação de ligação foi utilizado
para transformação de células ultracompetentes de Escherichia coli estirpe DH10B pelo
método de choque térmico (SAMBROOK, et al., 2001). Colônias contendo os possíveis
plasmídeos recombinantes foram repicadas para meio LB líquido contendo ampicilina
(Ampicilin, sodium salt USB©) e incubadas a 37oC sob agitação orbital de 180 rpm durante
12h. Após incubação, as culturas foram submetidas à extração de DNA plasmidial com KIT
illustraTM plasmidPrep Mini Spin (GE Healthcare). O DNA plasmidial foi então digerido com
a enzima utilizada para clonagem e o padão de bandas em gel de agarose 0,8% foi utilizado

27

para confirmação do processo de clonagem. Clones foram digeridos com a enzima HaeIII
para seleção de isolados a serem completamente sequenciados comercialmente por primer
walking.
3.3 Análise de sequências e demarcação de espécie
Sequências nucleotídicas correspondentes ao componente genômico viral (DNA-A)
completo foram montadas utilizando-se o programa CodonCode Aligner v. 4.1.1
(www.codoncode.com). As sequências obtidas foram inicialmente analisadas com o algoritmo
BLASTn (ALTSCHUL et al., 1990) e o banco de dados de nucleotídeos não-redundante
GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank) para determinar as espécies virais com as quais
elas compartilham maior identidade de sequência. Sequências similares obtidas a partir do
GenBank (Anexo1) foram utilizadas para demarcação de espécie dos novos isolados de
begomovírus utilizando-se o programa Sequence Demarcation Tool v. 1.2 (MUHIRE et al.,
2013).
3.4 Análise filogenética

Alinhamentos múltiplos de sequências nucleotídicas dos begomovírus provenientes de
C. urens do presente trabalho (Anexo2) e outros isolados disponíveis no GenBank (Anexo1)
foram preparados para o conjunto de dados DNA-A, gene CP e Rep, utilizando-se o algoritmo
MUSCLE implementado no pacote MEGA 6 (TAMURA et al 2013), e ajustadas
manualmente. Árvores de Inferência Bayesiana para cada conjunto de dados foram geradas no
web portal CIPRES (MILLER et al., 2010) usando MrBayes v. 3.2.3 (RONQUIST et al.,
2012). O melhor modelo de substituição de nucleotídeos foi determinado para cada conjunto
de dados usando MrModeltest 2.3 (POSADA; BUCKLEY, 2004) de acordo com o Akaike
Information Criterion (AIC). O modelos evolutivo GTR+I+G, foi utilizado para o conjunto de
dados DNA-A. Análises foram rodadas para cada conjunto de dados por 10 milhões de
gerações usando quatro cadeias e amostrando a cada 1.000 gerações, para um total de 10.000
árvores. As primeiras 2.500 árvores foram descartadas como uma fase de burn-in.
Probabilidades posteriores (RANNALA; YANG, 1996) foram determinadas a partir de uma
árvore consenso majority-rule gerada com as 7.500 árvores remanescentes. As árvores foram
visualizadas e editadas nos programas FigTree v. 1.4 (ztree.bio.ed.ac.uk/software/figtree) e
Inkscape (https://inkscape.org/pt/).

28

3.5 Análises de recombinação

A determinação dos locais (breakpoints) de recombinação e identificação de prováveis
sequências parentais foram realizadas, utilizando os métodos RDP, Geneconv, Boot-scan,
Maximum Chi Square, Chimaera, SisterScan e 3Seq implementados no pacote RDP v. 4.0
(MARTIN et al., 2015). Nesta análise, o mesmo banco de dados de sequencias de DNA-A
utilizado na análise filogenética (Anexo1) foi analisado com definições padrão para os
diferentes métodos e a significância estatística foi inferida por um P-valor menor que o
Bonferroni corrigido de 0,05. Somente eventos de recombinação detectados no mínimo por
quatro diferentes métodos foram considerados confiáveis.

29

4.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1 Análises de sequências e demarcação de espécie

Um total de seis clones do DNA-A obtidos a partir de três amostras C. urens foram
completamente sequenciados. Seguindo o critério de ≥91% de identidade nucleotídica para
sequências completas de DNA-A para dermarcação de espécies de begomovírus estabelecido
pelo Geminiviridae Study Group do International Committe on Taxonomy of Viruses (ICTV)
(BROWN et al., 2015), as análises BLASTn e de comparações pareadas utilizando SDT
revelaram a presença de duas espécies. Os clones BR_Ata3_18A, BR_Ata4_18A,
BR_Ata5_18A, BR_Ata7_18A e BR_Ata8_18A correspondem a isolados da espécie
Cnidoscolus mosaic leaf deformation virus (CnMLDV) previamente descrita em Alagoas,
com a qual compartilharam identidade variando entre 94,8 – 99,8% (Figura 3). O clone
BR_Ter3_18A representa uma nova espécie que é mais proximamente relacionada com o
Tomato yellow spot virus (ToYSV; número de acesso KJ742419) com 80,6% de identidade
nucleotídica, para qual foi proposto o nome Cnidoscolus blistering yellow mosaic virus
(CnBYMV). Quando a sequência da nova espécie (CnBYMV) foi compara da com a espécie
tipo de CnMLDV e outros isolados obtidos nesse trabalho a porcentagem de identidade variou
entre 79,4 e 79,8 % (Figura 3).
As sequências dos isolados virais do presente trabalho variaram em comprimento entre
2585 a 2672 nucleotídeos de comprimento e exibiram organização genômica típica dos
begomovírus bissegmentados do “Novo Mundo” com quatro ORFs no DNA-A (CP, Rep,
TrAP, REn e AC4) (Tabela 1). Os isolados de CnMLDV obtidos neste estudo não
apresentaram a ORF AC5.
Na região comum dos isolados virais foi detectado o nonanucleotídeo conservado (5’
TAATATT/AC 3’), o qual faz parte do stem-loop que contém a origem de replicação viral; e
iterons de sequência GGGG para CnMLDV e GGAG para CnBYMV, sítio de ligação de Rep
essencial para o início da replicação viral.
Uma evidência que reforça a presença de duas espécies de begomovírus nas amostras
avaliadas é a diferença na expressão de sintomas na planta hospedeira. As amostras CN8 e
CN9 infectadas por CnMLDV exibiram sintomas de mosaico e deformação foliar,
semelhantes àqueles previamente descritos para outros isolados dessa espécie (MELO et al.,
2016). Enquanto a amostra C1 infectada por CnBYMV, exibiu sintomas de bolhosidade e
mosaico amarelo (Figura 4).

30

Figura 3. Matriz bidimensional representando porcentagem de identidade de comparações pareadas de
sequências nucleotídicas do DNA-A coletadas nos estados de AL (BR_Ata3_18A, BR_Ata4_18A, BR_Ata5_18A,
BR_Ata7_18A, BR_Ata8_18A) e PI (BR_Ter3_18A) com amostras de begomovírus disponíveis no GenBank.

Tabela 1. Open Reading frame (ORFs), com seus respectivos números de aminoácidos (aa), encontradas no componente
genômico DNA-A dos begomovívrus descritos neste trabalho.
Amostra/

Origem

Isolado

Clones
CN8

Tamanho
DNA-A

ORFs
CP

Rep

TrAP

Espécie
REn

AC4

Atalaia

CnMLDV

CN8.3

BR_Ata3_18A

2672 nt

251 aa

357 aa

129 aa

132 aa

97 aa

CN8.4

BR_Ata4_18A

2641 nt

257 aa

357 aa

129 aa

132 aa

97 aa

CN8.7

BR_Ata3_18A

2663 nt

257 aa

357 aa

129 aa

129 aa

97 aa

CN9

Atalaia

CnMLDV

CN9.5

BR_Ata5_18A

2641 nt

257 aa

357 aa

129 aa

132 aa

97 aa

CN9.8

BR_Ata8_18A

2663 nt

257 aa

357 aa

129 aa

132 aa

97 aa

C1
C1.3

Teresina

CnBYMV
BR_Ter3_18A

2585 nt

254aa

359aa

129aa

132aa

85aa

(nova)

31

A

B

Figura 4. Sintomas em Cnidoscolus urens infectadas por begomovírus obtidos neste estudo. A. Sintomas de
mosaico e deformação foliar causados por Cnidoscolus mosaic leaf deformation virus (CnMLDV). B. Sintomas
de bolhosidade e mosaico amarelo caudados por Cnidoscolus blistering yellow mosaic virus (CnBYMV).

4.2 Análises filogenéticas

Para determinar o relacionamento filogenético dos begomovírus desse trabalho e
outros begomovírus de plantas cultivadas e não cultivadas, árvores baseadas nas sequências
completas do DNA-A, genes CP e Rep foram construídas utilizando Inferência Bayesiana. Na
árvore filogenética os seis clones de DNA-A obtidos foram distribuídos em dois grandes
grupos bem suportados (Figura 5). No grupo I os clones BR_Ata3_18A, BR_Ata4_18A,
BR_Ata5_18A, BR_Ata7_18A, BR_Ata8_18A se agruparam com outros isolados de
CnMLDV, provenientes do estado de Alagoas e com o isolado de PSLDV. No entanto, estes
foram mais proximamente relacionados a isolados de CnMLDV oriundos de Branquinha,
Maceió, Marechal Deodoro e Messias (subpopulação Sul). Enquanto os isolados de CnMLDV
provenientes de Japaratinga, Paripueira e Porto de Pedras formaram um outro subgrupo
(subpopulação Norte). Estes diferem dos demais isolados da subpopulação sul por apresentar
uma ORF adicional AC5, a qual codifica uma proteína relacionada com silenciamento
transcricional de genes (TGS), silenciamento pós-transcricional de genes (PTGS) e/ou
resposta semelhante à de hipersensibilidade (LI et al., 2015). Esse resultado confirma a
existência de estruturação por região geográfica de subpopulações de CnMLDV em Alagoas,
como sugerido por Mendes (2017). Enquanto o grupo II englobou a espécie CnBYMV

32

representada pelo clone BR_Ter3_18A e begomovírus descritos em plantas cultivadas e não
cultivadas.
Nas filogenias baseadas nas sequências nucleotídicas dos genes CP e Rep (figura 6 e
7) os isolados de CnMLDV (BR_Ata3_18A, BR_Ata4_18A, BR_Ata5_18A, BR_Ata7_18A,
BR_Ata8_18A) continuaram se agrupando geograficamente com outros isolados pertencentes
a população Sul descrita por Mendes et al (2017). No entanto, na filogenia para o gene CP a
espécie CnBYMV agrupou mais proximamente com a espécie CnMLDV proveniente de
Messias (BR_Mes_15A), ocupando um grupo contendo todos os isolados de CnMLDV de
Alagoas. Enquanto na filogeia do gene Rep a espécie CnBYMV agrupou mais proximamente
com a espécie CnMLDV proveniente de Messias (BR_Mes_15A), porém ocupou o grupo que
contém outros begomovírus de planta cultivadas e não cultivadas. As incongruências
topológicas encontadas nas árvores flogenéticas do DNA-A, gene CP e gene Rep sugerem a
existência de recombinação na espécie CnBYMV.

Figura 5. Análise filogenética de inferência Bayesiana baseada no DNA-A, mostrando a formação de dois
grupos principais. Grupo I = isolados de provenientes de Alagoas e PSLDV, e Grupo II = isolado de C. urens
proveniente do Piauí e begomovírus que infectam plantas cultivadas e não cultivadas.

33

Figura 6. Árvores filogenéticas de inferência Bayesiana construídas para Gene CP. Isolados de CnMLDV por
descrito por Mendes (2017) estão marcados em azul, e os do presente trabalho estão indicados em vermelho.

34

Figura 7. Árvore filogenética de inferência Bayesiana construída para gene Rep. Isolados de CnMLDV por
descrito por Mendes (2017) estão marcados em azul, e os do presente trabalho estão indicados em vermelho.

4.3 Análise de recombinação

Um conjunto de dados composto pelos isolados deste estudo (BR_Ata3_18A,
BR_Ata4_18A, BR_Ata5_18A, BR_Ata7_18A, BR_Ter3_18A), isolados recuperados de
MENDES (2017) provenientes de C. urens, e outros begomovírus mais proximamente
relacionados (Anexo1) foi submetido à análise no pacote RDP4 para confirmar prováveis
eventos de recombinação. Nenhuma evidência para eventos de recombinação foi observada
para os isolados de Alagoas. Diferindo dos resultados encontrados por MENDES (2017), que
observou a ocorrência de vários eventos de recombinação intraespecifica e interespecíficas
entre os isolados de CnMLDV. Um evento de recombinação foi detectado envolvendo o
isolado BR_Ter3_18A (breakpoint inicial no nucleotídeo 2142 e breakpoint final no 53)

35

compreendendo a RC e o gene Rep, identificando CnMLDV como provável maior parental
(84,2% de similaridade) e SiMoV (86,7%) como menor parental.
Recombinação é um dos principais fatores atuando para a variabilidade genética e
evolução dos begomovírus (LEFEUVRE et al., 2007; 2009; PRASANNA; RAI, 2007;
MARTIN et al., 2011; SILVA et al., 2011; 2012; LIMA et al., 2013; ROCHA et al., 2013;
HOSSEINZADEH

et

al.,

2014;

RAMOS-SOBRINHO

et

al.,

2014;

VENKATARAVANAPPA et al., 2014), sendo responsável pelo surgimento de novas
espécies e/ou isolados causando grandes prejuízos em culturas de importância econômica em
todo o mundo (ZHOU et al., 1997; MONCI et al., 2002; IDRIS; BROWN, 2002; BRIDDON
et al., 2014).
A maioria dos eventos de recombinação em begomovírus apresentam breakpoints
localizados nos genes Rep, REn e RC, corraborando com estudos anteriores os quais
identificaram estas regiões como hotspot, já a região do gene CP é um coldspot de
recombinação (STANLEY, 1995; FAUQUET et al., 2005; GARCÍA-ANDRÉS et al., 2007b;
LEFEUVRE et al., 2007; SILVA et al., 2012; ROCHA et al., 2013; LIMA et al., 2013;
RAMOS-SOBRINHO et al., 2014). O gene Rep contem múltiplos domínios relacionados com
o processo de replicação viral (ILYINA; KOONIN, 1992; HEYRAUD-NITSCHKE et al.,
1995; OROZCO et al., 1997; NASH et al., 2011). Mendes et al. (2017), estudando a estrutura
de populações de CnMLDV no estado de Alagoas observaram que esta espécie é altamente
recombinante, possui alta variabilidade nucleotítica, porém suas ORFs CP e REP se encotram
sobre forte seleção purificadora (dN/dS < 0,2). Isso significa que grande parte das mutações
que ocorrem em CnMLDV são sinônimas, resultando em poucas alterações na sequência de
aminoácidos, e consequentemente na conservação da estrutura e função dessas proteínas. No
caso da proteína REP, a conservação de sua estrutura é importante para a manutenção dos
principais processos biológicos dos begomovírus, especialmente a replicação.

36

CONCLUSÃO


Cnidoscolus mosaic leaf deformation vírus (CnMLDV) é o único begomovírus
descrito infectando C. ures no estado de Alagoas;



Uma nova espécie foi descrita, Cnidoscolus blistering yellow mosaic virus
(CnBYMV), em C. urens no estado do Piauí;



Estudos adicionais são necessários para detecção e obtenção do componente genômico
DNA-B para caracterização do genoma completo dessa nova espécie.

37

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50

ANEXO I
Tabela1. Sequências de begomovírus obtidas a partir do banco de dados não-redundante Genbank.

Espécie (Acrônino)

Nº de acesso no
Genbank

Hospedeiro

Local

Sida yellow net virus (SiYNV)
Tomato leaf curl New Delhi virus (ToLCNDV)
Sida mottle Alagoas vírus (SiMoAV)
Sida mosaic Bolivia vírus (SiMBoV)
Passionfruit severe leaf distortion virus (PSLDV)
Oxalis yellow vein virus (OYVV)
Melochia mosaic virus (MeMV)
Sida mottle vírus (SiMoV)
Leonurus mosaic virus (LeMV)
Tomato yellow spot virus (ToYSV)
Okra mottle virus (OMoV)
Cnidoscolus mosaic leaf deformation virus (CnMLDV)
Cnidoscolus mosaic leaf deformation virus (CnMLDV)
Cnidoscolus mosaic leaf deformation virus (CnMLDV)
Cnidoscolus mosaic leaf deformation virus (CnMLDV)
Cnidoscolus mosaic leaf deformation virus (CnMLDV)
Cnidoscolus mosaic leaf deformation virus (CnMLDV)
Cnidoscolus mosaic leaf deformation virus (CnMLDV)
Cnidoscolus mosaic leaf deformation virus (CnMLDV)

MF957206
NC_004611
JX871386
HM585441
FJ972767
KM887907
KT201151
JX871377
JX863082
KJ742419
EU914817
NC038982
BR-Mes3-15A*
BR-Bra4-16
BR-Mac2-15A
BR-Md1-15A
BR-Jap1-15
BR-Par3-15A
BR-Pdp1-15

Passiflora edulis f . flavicarpa
Solanum lycopersicon
Sida sp.
Sida micrantha
Passiflora edulis f. flavicarpa
Oxalis debilis
Melochia sp
Sida santaremensis
Leonurus sibiricus
Salvia hispanica
Okra
Cnidoscolus ures
Cnidoscolus ures
Cnidoscolus ures
Cnidoscolus ures
Cnidoscolus ures
Cnidoscolus ures
Cnidoscolus ures
Cnidoscolus ures

Brasil
Índia
Brasil
Bolívia
Brasil
EUA
Brasil
Brasil
Brasil
Argentina
Brasil
Brasil
Brasil
Brasil
Brasil
Brasil
Brasil
Brasil
Brasil

*Isolados em negrito foram recuperados do trabalho de Mendes (2017).

51

ANEXOII
Tabela2. Isolados de C. urens obtidos neste trabalho.

Código da
Amostra
DNA-A
CN8
CN8.3
CN8.4
CN8.7
CN9
CN9.5
CN9.8
C1
C1.3

Local de
Coleta

Isolado*

Tamanho do
DNA

CP

Rep

TrAP

REn

AC4

MP

NSp

BR-Ata3-18A
BR-Ata4-18A
BR-Ata7-18A

2672 nt
2641 nt
2663 nt

251 aa
257 aa
257 aa

357 aa
357 aa
357 aa

129 aa
129 aa
132 aa

132 aa
132 aa
129 aa

97 aa
97 aa
97 aa

-

-

BR-Ata5-18A
BR-Ata8-18A

2641 nt
2663 nt

257 aa
257 aa

357 aa
357 aa

129 aa
129 aa

132 aa
132 aa

97 aa
97 aa

-

-

BR-Ter3-18A

2585 nt

254aa

359aa

129aa

132aa

85aa

-

-

Atalaia- AL

Atalaia- AL

Teresina-Piauí

52