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                    UNIVERSIDADE FEDERAL DE ALAGOAS
CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO
EM PROTEÇÃO DE PLANTAS

MARIA QUITERIA CARDOSO DOS SANTOS

Caracterização de Pythium cucurbitacearum, e controle alternativo da podridão do colo
e das raízes do mamoeiro, grupo solo, cultivar Golden

RIO LARGO
2015

MARIA QUITERIA CARDOSO DOS SANTOS

Caracterização de Pythium cucurbitacearum, e controle alternativo da podridão do colo
e das raízes do mamoeiro, grupo solo, cultivar Golden

Defesa de Tese apresentada ao Programa de PósGraduação em Proteção de Plantas da Universidade
Federal de Alagoas, como requisito parcial para
obtenção do grau de Doutor em Proteção de Plantas.

Orientadora: Prof.ª Dr.ª Edna Peixoto da Rocha
Amorim

RIO LARGO
2015

Catalogação na fonte
Universidade Federal de Alagoas
Biblioteca Central
Divisão de Tratamento Técnico
S237c

Santos, Maria Quiteria Cardoso dos.
Caracterização de Pythium Cucurbitacearum, e controle alternativo da podridão do
colo e das raízes do mamoeiro, grupo solo, cultivar Golden / Maria Quiteria
Cardoso dos Santos. – 2015.
96 f. : il.
Orientadora: Edna Peixoto da Rocha Amorim.
Tese (doutorado em Proteção de Plantas) – Universidade Federal de Alagoas.
Centro de Ciências Agrárias, Rio Largo-AL, 2015.

Bibliografias: f. 93-96.
1. Carica papaya L. 2. Tombamento. 3. Óleos essenciais. 4. Extratos vegetais. 5.
Mecanismo de defesa. Molecular. I. Título.
CDU: 634.651:581.2

Folha de Aprovação

MARIA QUITERIA CARDOSO DOS SANTOS

Caracterização de Pythium cucurbitacearum, e controle alternativo da podridão do colo
e das raízes do mamoeiro, grupo solo, cultivar Golden
Tese submetida ao corpo docente do Programa de PósGraduação em Proteção de Plantas da Universidade
Federal de Alagoas e aprovada em 27 de maio de 2015.

______________________________________________________________________
Prof.ª Dr.ª Edna Peixoto da Rocha Amorim, Universidade Federal de Alagoas.
(Orientadora)
Banca examinadora:
______________________________________________________________________
Prof.ª Dr.ª Juliana Paiva Carnaúba Ramos, Instituto Federal de Alagoas
(Examinador Externo)
______________________________________________________________________
Dr.ª Claudiana Moura dos Santos, Pós-Doutorado/ PNPD – CECA, Universidade Federal de
Alagoas (Examinador Externo)

____________________________________________________________________
Prof.ª Dr.ª Iraildes Pereira Assunção, Universidade Federal de Alagoas
(Examinador Interno)

DEDICATÓRIA

Aos meus pais, Amaro Paulo dos Santos e Marileide Maria Cardoso dos Santos.
A quem devo todo respeito e amo imensamente.
A minha filhinha Maria Sofia Cardoso dos Santos Melo
Que tanto amo.
Ao meu Esposo Flavio de Araújo Barros Melo
Pelo carinho, amor e apoio.
Aos meus sobrinhos Arthur Felipe Cardoso dos Santos e Luan Ferreira Cardoso dos Santos
Aos meus irmãos Alan Cardoso dos Santos e Amaro Paulo dos Santos Junior
Pelo amor que nos une pela família que somos.

AGRADECIMENTOS

A Deus, primeiramente, pois, sem ele nada do que foi feito se fez. Por toda graça e
sabedoria a mim concebida;
À Prof.ª Dr.ª Edna Peixoto da Rocha Amorim, pela oportunidade, amizade,
ensinamentos e apoio para realização deste trabalho;
À Prof.ª Dr.ª Iraildes Pereira Assunção pela contribuição ao realizar as correções e
pelas sugestões;
À Drª Juliana Paiva Carnaúba pela contribuição ao realizar as correções e pelas
sugestões;
À Dr.ª Claudiana Moura dos Santos pela contribuição ao realizar as correções;
Aos Profs. Drs. Gaus Silvestre de Andrade Lima e Iraildes Pereira Assunção pelo
apoio;
À CAPES pela concessão da bolsa de estudo para realização do curso;
Ao corpo docente do Programa de Pós-graduação em Proteção de Plantas do Centro
de Ciências Agrárias, pelos ensinamentos;
Aos funcionários da Secretaria da pós-graduação, Geraldo de Lima, Marcos Antonio
Lopes e Michele Cristina pela ótima convivência;
Aos amigos Leila de Paula Rezende, Jaqueline Figueiredo de Oliveira, Hully Monaísy
Alencar Lima, Vanessa de Melo Rodrigues, Paulo Nogueira de Barros, Maria Erika Francisca
de Sales Oliveira e Isabella Cardoso pela amizade e grande apoio dado ao trabalho;
Aos que fazem parte do Laboratório de Fitopatologia, em especial aos amigos Deyse
Ferreira Rocha, Paulo Nogueira de Barros, Izael Oliveira Silva, Nelson Augusto do
Nascimento Júnior, David Vitor, por todo apoio, amizade e ótima convivência;
Aos colegas e amigos da pós-graduação, Ellen Carine Neves Valente, Paulo Nogueira
de Barros, Joseani Castro da Silva, Jaqueline Figueiredo de Oliveira, Deyse Ferreira Rocha,
Danilo César Oliveira, Wellington Costa da Silva, Jorge Portella, Izael Oliveira Silva, Débora
Teresa Ferreira, Clemens Rocha Fortes, Maria Lausanne Damasceno, Jakeline Maria dos
Santos, Djison Silvestre dos Santos, e Andrezo Adenilton Santos, pelo excelente convívio
durante a realização do curso;

RESUMO
O tombamento de plântulas de mamoeiro (Carica papaya L.) causadas por espécies de Pythium
já vem sendo notificado há algum tempo no mundo e recentemente no Brasil. A doença pode
levar a cultura danos irreversíveis, comprometendo o seu desenvolvimento. A implementação
de um método alternativo de controle, com o uso de produtos naturais pode surgir como uma
solução viável durante o processo de produção de mudas. Este trabalho objetivou caracterizar
molecular e morfologicamente a espécie de Pythium cucurbitacearum e avaliar o efeito dos
produtos naturais na inibição in vitro do patógeno, e no controle da podridão radicular através
da indução de resistência em mudas de mamoeiro. Para tanto, experimentos foram conduzidos
nos Laboratórios de Fitopatologia e Fisiologia Vegetal do Centro de Ciências Agrárias da
Universidade Federal de Alagoas (CECA-UFAL). No primeiro experimento, estudou-se a
espécie de Pythium, causadora da podridão do colo e das raízes do mamoeiro grupo solo,
cultivar Golden, a partir da caracterização molecular e morfológica, patogenicidade, virulência
em diferentes hospedeiros e estabelecimento de meios de cultura para um bom desenvolvimento
micelial do patógeno. Posteriormente, em um segundo experimento, avaliou-se a atividade
antifúngica, incorporando ao meio CA (Cenoura e Ágar), diferentes concentrações de óleos
essenciais de hortelã-pimenta (Mentha piperita L.), citronela (Cymbopogon nardus L.) e
eucalipto glóbulos (Eucalyptus globulus L.), o indutor Ecolife®, extrato aquoso de alho
(Allium sativum L.) e óleo de nim (Azadirachta indica A. Juss) emulsificado, obtido a partir
da extração a frio de sementes (Natuneem ®). O terceiro experimento avaliou o potencial dos
produtos alternativos testados in vitro em doses selecionadas para controlar nas condições de
viveiro as mudas de mamoeiros infectadas por Pythium cucurbitacearum. Baseado nos
melhores resultados da ação dos produtos, foi realizado um ensaio em mudas de mamoeiro com
60 dias de idade, a fim de avaliar a ação dos produtos alternativos e do ácido LD β-amino–n–
butírico (BABA), na atividade de enzimas relacionadas com a indução de resistência em folhas
de mamoeiro, através do incremento da atividade das enzimas Peroxidase (POX) e Fenilalanina
Amonia-Liase (FAL), relacionadas com as respostas de defesa vegetal. Os resultados obtidos
mostraram 100% de similaridade genética do patógeno estudado com a espécie Pythium
cucurbitacearum, através do estudo filogenético baseado na região Cox1 do DNA construído
usando o método de ‘‘maximum Likelihood Tree’’ com base em 1000 réplicas de “bootstrap.
O isolado mostrou-se patogênico aos frutos e as plantas de mamão, apresentou virulência em
diferentes hospedeiros. Os meios de cultura BDA, CA, V8, CMA, CFMA e FMA
proporcionaram bom desenvolvimento a espécie de Pythium estudada. Os óleos essenciais
testados, o indutor Ecolife®, o extrato aquoso de alho e o produto comercial Natuneem®,
mostraram-se eficientes no controle in vitro de Pythium cucurbitacearum. O óleo essencial de
hortelã-pimenta e o indutor Ecolife® mostraram controle sobre a podridão das raízes nas mudas
de mamoeiros. O óleo essencial de hortelã-pimenta aumentou a atividade de POX, apresentando
pico enzimático nas folhas coletadas após 72 horas da inoculação. A atividade da FAL
aumentou nas folhas coletadas 24 horas após a inoculação, nas plantas tratadas com Água
Destilada Esterilizada (ADE) e com o indutor Ecolife ®. Também foi observado incremento da
FAL 96 horas após a inoculação, nas plantas pulverizadas com o indutor BABA.
Palavras-chave: Carica papaya L. Tombamento. Molecular. Óleos essenciais. Extratos
vegetais. Mecanismo de defesa.

CHARACTERIZATION OF Pythium cucurbitacearum, AND ALTERNATIVE
CONTROL OF THE STEM ROT AND PAPAYA TREE ROOTS, SOIL GROUP,
CULTIVATE GOLDEN
ABSTRACT
The damping-off of seedlings of papaya (Carica papaya L.) caused by species of Pythium has
already been notified sometime in the world and recently in Brazil. The disease can lead to
irreversible damage Culture, compromising its development. The implementation of an
alternative control method with the use of natural products can arise as a viable solution for the
production of the seedlings. This study aimed to characterize molecular and morphological
species of Pythium cucurbitacearum and evaluate the effect of the products in the in vitro
inhibition of the pathogen, and in control of root rot through the induction of resistance in
papaya, seedlings, soil group, Golden cultivar. To this end, experiments were conducted in the
Laboratories of Plant Pathology and Plant Pathology Molecular and and Plant Physiology of
Center Agrarian Sciences, Federal University of Alagoas (CSA/UFAL). In the first experiment,
we studied the species of Pythium, causal agent of stem rot and in roots of papaya, Soil group,
cultivar Golden, from molecular and morphological characterization, pathogenicity, virulence
in different hosts and establishment of culture media for mycelial growth of the pathogen. Later,
in a second experiment, we evaluated the antifungal activity, incorporating the medium CA
(Carrot and Agar), different concentrations of essential oils of peppermint (Mentha piperita L.),
citronella (Cymbopogon nardus L.) and eucalyptus globules (Eucalyptus globulus L.), the
inductor Ecolife®, aqueous extract of garlic (Allium sativum L.) and neem (Azadirachta indica
A. Juss) emulsified, obtained from cold extraction of seeds (Natuneem®). The third experiment
evaluated the potential of alternative products tested in vitro in selected doses to control in
nursery conditions the papaya seedlings infected by Pythium cucurbitacearum. Based on the
best results from the action of the products, it was performed a test in papaya seedlings with 60
days of age in order to evaluate the action of alternative products and LD β-amino-n-butyric
acid (BABA), in activity of enzymes related to the induction of resistance in papaya leaves, by
increasing activity enzyme Peroxidase (POX) and Phenylalanine Ammonia-Lyase (PAL),
related with to plant defense responses. The results showed 100% genetic similarity of pathogen
studied with the species Pythium cucurbitacearum, by phylogenetic analysis based on the Cox1
of DNA region constructed using the method of 'maximum likelihood tree' based on 1000
replicates the "bootstrap". The isolate was shown to be pathogenic to fruits and papaya plants
showed virulence in different hosts. The means of culture PDA, CA, V8, CMA, CFMA and
FMA provided good development of Pythium species studied. The essential oils tested, the
inductor Ecolife®, the aqueous extract of garlic and the commercial product Natuneem®, Were
effective in the in vitro control of Pythium cucurbitacearum. The essential oil of peppermint
and inductor Ecolife® they had control of root rot in papaya. The essential oil of peppermint
increased POX activity, with enzymatic peak in leaves collected 72 hours after the inoculation.
The activity of PAL rose in the leaves collected at 24 hours after inoculation in the plants treated
with the WDE and inductor Ecolife®. Increase of the enzyme was also observed PAL 96 hours
after inoculation in the plants with the inductor BABA.
Keywords: Carica papaya L. Damping-off. Molecular. Essential oils. Plant extracts. Defense
mechanism.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 -

Área implantada com mamoeiro, com algumas plantas tombadas (A); Planta
de mamão tombada (B); Sistema radicular com sintoma típico de podridão
(C) .................................................................................................................. 40

Figura 2 -

Inoculação de Pythium cucurbitacearum em frutos de mamão. Fruto
inoculado com isolado do patógeno (A); frutos inoculados mantidos em
câmara úmida (B)........................................................................................... 41

Figura 3 -

Mudas de mamão com 45 dias de idade (A); ferimento no caule (B);
inoculação de disco de BDA contendo micélio de Pythium cucurbitacearum
(C); Copos em placas de Petri com água e um chumaço de algodão úmido
(D).................................................................................................................. 42

Figura 4 -

Mudas de mamoeiro aos 45 dias de idade. Sistema radicular imerso em uma
suspensão homogeneizada em liquidificador composta por micélio em 200
mL de ADE (A); transplante das mudas inoculadas para vasos de 400 mL
(B); plantas inoculadas replantadas (C).......................................................... 43

Figura
Estrutur
5Estruturas propagativas de Pythium cucurbitacearum, esporângios (A-C);
oósporos (D-E); oogônio com anterídio (F)...................................................... 47
Figura 6 -

Fruto de mamão com aspecto de podridão aquosa, com crescimento
cotonoso de coloração esbranquiçada, após quatro dias da inoculação........... 48

Figura 7 -

Planta de mamoeiro em desenvolvimento no viveiro aos dez dias após a
inoculadas, apresentando lesão no colo (A); detalhe da lesão (B)................... 49

Figura 8 -

Planta de mamoeiro aos quatro dias após a inoculação. Sintoma de murcha
(A); sistema radicular lesionado (B); planta tombada (C)............................... 49

Figura 9 -

Frutos inoculados com o isolado de Pythium cucurbitacearum obtido de
mamoeiro com sintomas de podridão de colo, após quatro dias de
inoculação: (a) fruto de mamão (Carica papaya L.); (b) melão (Cucumis
melo L.); (c) tomate (Solanum lycopersicume L.); (d) pepino (Cucumis
sativus L.); (e) batata (Solanum tuberosum L.) ............................................... 51

Figura 10 -

Aspecto das colônias de Pythium sp. aos dez dias, em diferentes meios de
cultura: BDA (A); CA (B); V8 (C); CFMA (D); FMA (E) e CMA
(F)................................................................................................................... 53

Figura 11 -

Árvore filogenética baseada na região citocromo c oxidase subunidade I
(Cox1) do DNA, do isolado de Pythium (MC1A), construída usando o
método de ‘‘maximum Likelihood Tree’’. O isolado Phytophthora
drechsleri foi utilizado como “outgroup”. A barra de escala representa
mudança de 0,1 e valores de suporte de bootstrap de 1000 repetições são
apresentados nos ramos.................................................................................. 54

Figura 12 -

Efeito de diferentes concentrações de óleo essencial de hortelã-pimenta
(Mentha piperita L.) na porcentagem de inibição do crescimento micelial de
Pythium cucurbitacearum.............................................................................. 69

Figura 13 -

Efeito de diferentes concentrações de óleo essencial de citronela
(Cymbopogon nardus L.) na porcentagem de inibição do crescimento
micelial de Pythium cucurbitacearum............................................................ 69

Figura 14 -

Efeito de diferentes concentrações de óleo essencial de eucalipto
(Eucalyptus globulus L.) na porcentagem de inibição do crescimento
micelial de Pythium cucurbitacearum............................................................ 70

Figura 15 -

Efeito de diferentes concentrações de Ecolife® na porcentagem de inibição
do crescimento micelial de Pythium cucurbitacearum ................................... 70

Figura 16 -

Efeito de diferentes concentrações de extrato aquoso de alho (Allium
sativum L.) na porcentagem de inibição do crescimento micelial de Pythium
cucurbitacearum ............................................................................................ 72

Figura 17 -

Efeito de diferentes concentrações do óleo comercial Natuneem® na
porcentagem de inibição do crescimento micelial de Pythium
cucurbitacearum............................................................................................ 72

Figura 18 -

Efeito de óleos essenciais de hortelã-pimenta (Mentha piperita L.); citronela
(Cymbopogon nardus L.); eucalipto (Eucalyptus globulus L.); indutor
Ecolife® e extrato aquoso de alho (Allium sativum L.), sobre a incidência de
Pythium cucurbitacearum em mudas de mamoeiro....................................... 86

Figura 19 -

Atividade de peroxidase (POX) em folhas de mamoeiros induzidas com
ácido LD β-amino–n–butírico (BABA), Ecolife®, Óleo essencial de hortelãpimenta (Mentha piperita L.), e testemunha (ADE), às 24, 48, 72 e 96 horas
após a inoculação com Pythium cucurbitacearum.......................................... 88

Figura 20 -

Atividade de fenilalanina-amônia liase (FAL) em folhas de mamoeiros
induzidas com, BABA, Ecolife®, óleo essencial de hortelã-pimenta (Mentha
piperita L.), e testemunha (ADE), às 24, 48, 72 e 96 horas após a inoculação
com Pythium cucurbitacearum ...................................................................... 90

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 -

Espécies de Pythium obtidos do GenBank usados para este estudo............... 47

Tabela 2 -

Média do diâmetro das lesões (cm) causadas pela infecção cruzada do
isolado de Pythium cucurbitacearum em diferentes hospedeiros.................. 53

Tabela 3 -

Médias dos diâmetros das colônias de Pythium cucurbitacearum em seis
meios diferentes, após 96 horas de cultivo.................................................... 54

Tabela 4 -

Efeito da interação de óleos essenciais e Ecolife® sob diferentes
concentrações (µL. mL-1), na porcentagem de inibição do crescimento
micelial (P.I.C) de Pythium cucurbitacearum............................................... 68

Tabela 5 -

Efeito da interação do extrato aquoso de alho (Allium sativum L.) e
Natuneem® sob diferentes concentrações (%), na porcentagem de inibição
do
crescimento
micelial
(P.I.C)
de
Pythium
cucurbitacearum........................................................................................... 72

Tabela 6 -

Modo de ação dos produtos testados que apresentaram inibição total do
crescimento micelial de Pythium cucurbitacearum.................................
75

13

Sumário
1 INTRODUÇÃO GERAL ............................................................................................. 16
2 REVISÃO DE LITERATURA ..................................................................................... 18
2.1 A cultura do mamoeiro ............................................................................................. 18
2.2 Problemas fitossanitários na cultura do mamão ........................................................ 19
2.3 O Patógeno Pythium sp. ............................................................................................ 20
2.4 Caracterização molecular .......................................................................................... 21
2.5 Controle da doença ................................................................................................... 22
2.5.1 Controle alternativo com óleos essenciais e extratos vegetais ................................ 22
2.6 Indução de resistência em plantas contra fitopatógenos ............................................ 25
REFERÊNCIAS.............................................................................................................. 28
3 ESTUDO DA PODRIDÃO DO COLO E DAS RAÍZES DO MAMOEIRO (Carica
papaya L.): CARACTERIZAÇÃO MORFOFISIOLÓGICA E MOLECULAR DE Pythium
cucurbitacearum ............................................................................................................. 36
RESUMO ....................................................................................................................... 36
ABSTRACT ................................................................................................................... 37
3.1 INTRODUÇÃO ........................................................................................................ 38
3.2 MATERIAL E MÉTODOS ....................................................................................... 39
3.2.1 Local de execução dos experimentos ..................................................................... 39
3.2.2 Isolamento da espécie e incidência da doença em campo ....................................... 39
3.2.3 Identificação do isolado e caracterização morfológica ........................................... 40
3.2.4 Teste de patogenicidade e reisolamento de Pythium cucurbitacearum ................... 41
3.2.5 Patogenicidade de Pythium cucurbitacearum em diferentes hospedeiros ............... 43
3.2.6 Caracterização morfofisiológica ............................................................................ 43
3.2.7 Caracterização molecular ....................................................................................... 44
3.2.7.1 Extração de DNA ................................................................................................ 44
3.2.7.2 Sequenciamento da região Cox1 análise filogenética do isolado ......................... 45
3.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................... 46
3.3.1 Incidência da doença no campo .............................................................................. 46
3.3.2 Identificação e caracterização morfológica do isolado ........................................... 46
3.3.3 Patogenicidade ....................................................................................................... 48
3.3.4 Patogenicidade em diferentes hospedeiros ............................................................. 50
3.3.5 Caracterização morfofisiológica ............................................................................ 52

14

3.3.5.1 Influencia dos meios de cultura sobre o aspecto das colônias e crescimento micelial
de Pythium cucurbitacearum. ......................................................................................... 52
3.3.6 Caracterização molecular ....................................................................................... 54
3.3.6.1 Amplificação do DNA, purificação e sequenciamento dos produtos da PCR ...... 54
3.4 CONCLUSÕES ........................................................................................................ 56
REFERÊNCIAS.............................................................................................................. 57
4 EFICIÊNCIA DE PRODUTOS ALTERNATIVOS E INDUTOR DE RESISTÊNCIA NO
CONTROLE IN VITRO DE Pythium cucurbitacearum, CAUSADOR DA PODRIDÃO DA
RAIZ E DO COLO DO MAMAOEIRO (Carica papaya L.)........................................... 60
RESUMO ....................................................................................................................... 60
ABSTRACT ................................................................................................................... 61
4.1 INTRODUÇÃO ........................................................................................................ 62
4.2 MATERIAL E MÉTODOS ....................................................................................... 63
4.2.1 Local de execução dos experimentos ..................................................................... 63
4.2.2 Obtenção dos produtos alternativos ....................................................................... 63
4.2.3 Efeito dos produtos sob o crescimento micelial de Pythium cucurbitacearum ....... 64
4.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................... 65
4.3.1 Inibição do crescimento micelial de Pythium cucurbitacearum com óleos essenciais
e Ecolife ® ....................................................................................................................... 65
4.3.2 Inibição do crescimento micelial de Pythium cucurbitacearum com extrato aquoso
de alho e Natuneem® ...................................................................................................... 71
4.3.3 Modo de ação dos produtos .................................................................................... 73
4.4 CONCLUSÕES ........................................................................................................ 75
REFERÊNCIAS.............................................................................................................. 76
5 AVALIAÇÃO DE PRODUTOS ALTERNATIVOS SOBRE A PODRIDÃO
RADICULAR EM MUDAS DE MAMOEIRO OCASIONADA POR Pythium
cucurbitacearum, E QUANTIFICAÇÃO DE ENZIMAS RELACIONADAS A DEFESA
VEGETAL ...................................................................................................................... 80
RESUMO ....................................................................................................................... 80
ABSTRACT ................................................................................................................... 81
5.1 INTRODUÇÃO ........................................................................................................ 82
5.2 MATERIAL E MÉTODOS ....................................................................................... 83
5.2.1 Local de execução dos experimentos ..................................................................... 83
5.2.2 Avaliação in vivo de produtos alternativos no controle da podridão do colo e das
raízes, causada por Pythium cucurbitacearum ................................................................ 83

15

5.2.3 Avaliação dos produtos alternativos sobre a atividade de enzimas relacionadas com
indução de resistência em folhas de mamoeiro ............................................................... 84
5.2.3.1 Obtenção do extrato proteico .............................................................................. 84
5.2.3.2 Determinação da atividade de POX ..................................................................... 85
5.2.3.3 Determinação da atividade de FAL ..................................................................... 85
5.2.3.4 Quantificação de proteínas .................................................................................. 85
5.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO................................................................................ 86
5.3.1 Incidência da doença .............................................................................................. 86
5.3.2 Atividade enzimática ............................................................................................. 88
5.4 CONCLUSÕES ........................................................................................................ 92
REFERÊNCIAS.............................................................................................................. 93

16

1 INTRODUÇÃO GERAL

O mamoeiro (Carica papaya L.) é cultivado praticamente em todo Brasil, desde o Norte
até o Sul do País, entretanto, a região Nordeste merece destaque com uma produção de 978.140
toneladas, numa área colhida de 19.388 ha, totalizando mais de 60% da produção nacional. No
estado de Alagoas, dados de 2013 indicam que a área colhida foi de 186 ha com produção de
6.968 toneladas e um rendimento de 37,46 t/ha (IBGE, 2014).
Os frutos do mamoeiro apresentam grande aceitação de mercado e é muito consumido
na forma in natura ou industrializado. O mamão é também importante fonte de papaína, enzima
proteolítica empregada para os mais variados fins nas indústrias farmacêutica, de alimentos e
de cosméticos (DANTAS et al., 2013).
Na cultura do mamoeiro alguns pontos devem ser considerados, a fim de melhorar
resultados de produção. Dentre esses, pode-se destacar alguns cuidados com fitopatógenos,
visto que, o mamoeiro sofre o ataque de diferentes agentes etiológicos de relevante importância
para a cultura. Diversas doenças já foram relatadas, dentre elas, destaca-se o tombamento e a
podridão do pé, que pode ser causada por Rhizoctonia solani, Phytophthora palmivora, Pythium
aphanidermatum e Pythium sp. (CAMPOS, 2008; CARNAÚBA et al., 2006; DIANESE et al.,
2007; KOFFI et al., 2010).
O tombamento causado por espécies de Pythium em mamoeiro já foi descrito em
diferentes Países (OLUMA; OLADIRAN, 1993; ALVARADO, 2001; KOFFI et al., 2010). No
Brasil, Pythium sp., já foi notificado nos estados do Ceará e Pará como sendo agente etiológico
responsável pela podridão do colo, estiolamento e tombamento de mudas de mamão
(BARRETO; SANTOS, 2002; RITZINGER; SOUZA, 2000; COSTA et al., 2007).
O tombamento e a podridão do pé normalmente ocorrem em plantas jovens ainda no
viveiro, durante o processo de produção de mudas, comprometendo a implantação e
estabelecimento da cultura no campo, uma vez que, mudas sadias e vigorosas, asseguram um
pomar com alto potencial de produtividade e qualidade dos frutos (OLIVEIRA et al., 2013).
Segundo Michereff; Andrade; Peruch (2005), o controle do tombamento causado por
Pythium spp. é realizado por fungicidas, como o Fosetyl-Al e o Metalaxyl, sendo os mais
recomendados pela eficiência apresentada. Entretanto, o surgimento da resistência do patógeno
é uma das desvantagens da sua utilização.
De uma maneira geral, custos elevados da prática do controle químico, associado ao
surgimento de resistência aos produtos comumente empregados, bem como a proibição do uso

17

de outros produtos, como o brometo de metila, torna essencial o desenvolvimento de técnicas
alternativas de controle.
O controle alternativo com substâncias obtidas a partir de produtos naturais já vem
sendo estudado há algum tempo com o desígnio de controlar fitopatógenos. Essa estratégia vem
sendo bem vista devido ao atual interesse mundial de utilizar produtos menos agressivos ao
ambiente, promovendo assim, a sustentabilidade agrícola (SOUSA et al., 2012; SILVA;
MELO, 2013). Segundo Stadnik; Talamini (2004); Silva et al. (2009), os produtos naturais de
plantas podem apresentar três atividades principais: antimicrobiana, com ação direta sobre o
patógeno; indutores de resistência, ativando os mecanismos de defesa da planta através de
moléculas bioativas; e também como bioestimulantes do crescimento da planta.
Dessa maneira, considerando que o patógeno em questão apresenta problemas
consideráveis a cultura do mamoeiro, e que o uso de produtos naturais vem sendo estudado com
êxito no controle de patógenos causadores de doenças de plantas, o objetivo do trabalho foi
caracterizar a espécie de Pythium, avaliar a virulência do patógeno em diferentes hospedeiros e
avaliar a capacidade dos produtos naturais na inibição in vitro do patógeno, e no controle da
podridão radicular através da indução de resistência em mudas de mamoeiro, grupo solo,
cultivar Golden.

18

2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 A cultura do mamoeiro
O mamoeiro (Carica papaya L.) é uma fruteira que pertence à classe das dicotiledôneas,
família Caricaceae a qual possui seis gêneros. Dentre esses, o gênero Carica possui uma única
espécie, a C. papaya, que corresponde ao mamoeiro cultivado comercialmente (DANTAS et
al., 2013).
O centro de origem do mamoeiro é provavelmente o Noroeste da América do Sul,
vertente oriental dos Andes, mais precisamente a Bacia Amazônica Superior, onde sua
diversidade genética é máxima, estendendo-se até a América Central e sul do México
(DANTAS et al., 2013). De acordo com Serrano; Cattaneo (2010), após a descoberta, o
mamoeiro foi amplamente distribuído em várias regiões tropicais, e provavelmente sua
introdução no Brasil se deu em 1587.
De acordo com Souza (2013), o mamão é a quarta fruta tropical em importância
econômica, e a segunda entre as frutas de origem neotropical. Os frutos são consumidos
principalmente na forma in natura, contudo, diversos produtos são produzidos, sendo os
principais, a polpa ou purê, o néctar, o doce em calda, o doce cristalizado e a geleia
(MATSUURA et al., 2013).

Dos frutos também são extraídos a papaína, uma enzima

proteolítica de ampla utilização para os mais variados fins nas indústrias farmacêutica, de
alimentos e de cosméticos.
O mamoeiro é uma planta herbácea, de ciclo semi-perene. A cultura possui grande
importância social, uma vez que gera empregos e absorve mão de obra abundante durante todo
o ano, visto que, os tratos culturais, a colheita e a comercialização são efetuadas de maneira
contínua nas lavouras, além dos plantios serem renovados, em média, a cada dois ou três anos
(SOUZA, 2013).
A Índia é a maior produtor mundial de mamão, com uma produção de mais de 5 milhões
de toneladas e uma área colhida em torno de 130 mil hectares (FAO, 2014). O Brasil é o
segundo maior produtor mundial de mamão, com uma participação de 12,2% da produção
mundial, correspondendo a mais de 1,5 milhões de toneladas; numa área de 31,9 mil hectares
(FAO, 2012). Em nível regional, o Nordeste destaca-se como o maior produtor, englobando
mais de 60% da produção nacional, com destaque para o Estado da Bahia com uma produção
718.726 toneladas. O Estado do Espirito Santo, representante da região Sudeste, apresenta a
segunda maior produção com 404.720 toneladas de frutos (IBGE, 2014).

19

As cultivares de mamoeiro mais exploradas no Brasil são classificadas em dois grupos:
‘Solo’ e ‘Formosa’. As cultivares do grupo ‘Solo’ possuem alto potencial de endogamia
(autofecundação) e apresentam frutos de menor tamanho, com peso médio de 350 a 700 g,
sendo destinados para o mercado interno e, principalmente, para o mercado externo. As
principais cultivares do grupo ‘Formosa’ são híbridas importadas que produzem frutos de maior
tamanho, com peso de mais de 1,0 kg, sendo, principalmente, destinados ao mercado interno
(SERRANO; CAETANO, 2010).
Os frutos de mamão produzidos no Brasil apresentam qualidades excelentes, tais como,
ótimo sabor e boa aparência, podendo ser produzido e exportado durante o ano todo. Essa
regularidade de suprimento é uma das vantagens competitivas do fruto brasileiro com relação
aos diversos países produtores (COSTA et al., 2010). A demanda interna pelos frutos é grande
e há tendência de crescimento das exportações brasileiras de mamão com a inclusão de novas
áreas dentro do conceito de ‘system approach’, produção integrada e produção orgânica
(COSTA et al., 2010; SOUZA, 2013).
2.2 Problemas fitossanitários na cultura do mamão
Vários fatores podem limitar a produção de mamão, tais como, a ocorrência de insetospraga e fitopatógenos causadores de doenças. Segundo Ventura et al. (2003), as doenças
acarretam severas perdas econômicas na produção, comercialização e exportação de frutos in
natura, podendo chegar, em alguns casos, a 100%. Dentre as doenças de importância, destacamse o tombamento, a antracnose, a varíola, a podridão do pé e doenças causadas por vírus
(SIMÃO, 1998; MEISSNER FILHO et al., 2013).
As doenças radiculares são caracterizadas por diversas sintomatologias nas plantas,
incluindo podridões de sementes, tombamento de plântulas de pré e pós-emergência, podridões
de raízes, murchas vasculares e podridões moles (MICHEREFF; ANDRADE; PERUCH,
2005).
O tombamento, também denominado ‘‘damping-off’’, caracteriza-se pelo tombamento
de plântulas, resultado da podridão de tecidos tenros da base do caulículo. Se a podridão ocorrer
antes da emergência da planta, é denominado "tombamento de pré-emergência", se a ocorrência
se der após a emergência da planta é denominado "tombamento de pós-emergência"
(BEDENDO, 1995; AUER; GRIGOLETTI; SANTOS, 2001; CAMPOS, 2008).
Na fase de produção de mudas e no estabelecimento do plantio no campo, a podridão
do colo e o tombamento são as doenças de maior importância, sendo os agentes causais
habitantes do solo, e, dentre esses, se destacam os fitopatógenos do gênero Rhizoctonia,

20

Phytophthora, Pythium e Fusarium (BEDENDO, 1995; OLIVEIRA, 2000; MICHEREFF;
ANDRADE; PERUCH, 2005; MEISSNER FILHO et al., 2013).
No mamoeiro, a podridão das raízes é considerada uma das principais doenças da
cultura, ocasionando danos econômicos que variam grandemente de uma região para outra
(LUZ et al., 2001). A sintomatologia de plantas de mamoeiro que apresentam ‘‘damping-off’’
são: encharcamento dos tecidos na região do colo; constrição da área afetada; e apodrecimento
das raízes, com posterior tombamento das plantas, seguido de morte (OLIVEIRA, 2000).
2.3 O Patógeno Pythium sp.
O gênero Pythium foi descrito em 1958, por Pringsheim. As espécies desse gênero
pertencem ao reino Chromista, filo Oomycota, classe Oomycetes, ordem Pythiales e família
Pythiaceae, apresentando atualmente 262 espécies registradas (INDEX FUNGORUM, 2014).
Algumas características que compreendem a classificação deste microrganismo neste Reino
são: parede celular composta de celulose; micélio diplóide na maior parte do ciclo de vida;
presença de centríolos; produção de esporos assexuais biflagelados tendo pelos em um dos
flagelos, denominados zoósporos; e produção de esporos sexuais de parede espessa, chamados
oósporos; distinguindo assim, estes, dos fungos verdadeiros, ou seja, os pertencentes ao reino
Fungi (CORLISS, 1994; AGRIOS, 2005; HARDHAM, 2007).
De acordo com as características morfológicas do gênero Pythium, Van Der PlaatsNiterink (1981), realizou um dos mais completos estudos sobre as espécies desse gênero,
descrevendo caracteristicas morfológicas de 86 isolados diferentes, e propôs uma chave de
identificcação. A principal característica morfológica para identificação do gênero Pythium é a
reprodução assexuada por meio de zoósporos biflagelados, onde a maturação e
desenvolvimento dos zóosporos não ocorrem dentro do zoosporângio, e sim, no interior de uma
vesícula evanescente formada no ápice do tubo de descarga do zoosporângio, o que os diferem
das espécies do gênero Phytophthora (KUCHAREK; MITCHELL, 2000; LUZ et al., 2001;
HARDHAM, 2007).
O patógeno pode produzir um micélio incolor, amarelado ou acinzentado, podendo,
ainda este, ser aéreo, dependendo do meio de cultura no qual é cultivado (VAN DER PLAATSNITERINK, 1981). O micélio pode ter coloração branca, de rápido crescimento, no qual são
produzidos os esporângios responsáveis pela reprodução assexuada e oósporos ornamentados
(AGRIOS, 2005; BARRETO; REZENDE; BLUM, 2011). As espécies do gênero Pythium
destacam-se, principalmente, pela patogenicidade de muitas espécies em plantas de interesse
econômico. Trata-se de um importante agente causador da podridão de sementes, tombamento

21

de mudas e podridão de raízes, podendo ainda causar podridões de frutos carnosos em contato
com o solo (AGRIOS, 2004). No sistema hidropônico de diversas culturas, como pepino
(Cucumis sativus L.), tomate (Solanum lycopersicum L.), pimentão (Capsicum annum L.),
alface (Lactuca sativa L.) e rúcula (Eruca sativa L.), a podridão radicular apresenta uma grande
ameaça à produtividade (SUTTON et al, 2006).
Na cultura do mamoeiro, espécies de Pythium têm sido notificadas como o agente causador
da podridão do colo em diversos países. Em 1993, Oluma e Oladiran, notificaram a doença na
Nigéria; Alvarado (2001) comunicou a doença no México; e Koffi et al. (2010), confirmaram
a doença na Costa do Marfim. No Brasil, o complexo podridão do colo ou tombamento do
mamoeiro vem sendo bastante estudado. Embora a doença possa ser causada por Pythium
sp., Fusarium e Rhizoctonia solani, comumente a espécie Phytophthota palmivora é
diagnosticada como sendo o principal agente causal. No entanto, Pythium sp. já foi notificada
nos estados do Ceará e Pará como sendo agente etiológico responsável pelo podridão do colo,
estiolamento e tombamento de mudas de mamão (RITZINGER; SOUZA, 2000; BARRETO;
SANTOS, 2002; COSTA et al.,2007).

2.4 Caracterização molecular
Avanços de técnicas moleculares têm sido de grande importância para diagnósticos,
identificação e estudos filogenéticos de oomicetos, dentre esses, as espécies do gênero
Phytophthora e Pythium.
Estudos tem relatado que a região DNA a ser utilizada para a identificação dos
oomicetos ao nível de espécie é o espaço interno transcrito (ITS) da região de rDNA
(ROBIDEAU et al., 2011). A região ITS em oomicetos é facilmente amplificada por
sequenciamento do DNA na maioria das espécies com o uso de PCR (reação em cadeia da
polimerase), sendo o sequenciamento dessa região muito utilizado na detecção de novas
espécies de Pythium (PAUL ,2001).
Wang; Wang; White (2003), destacaram sucesso na identificação de espécies de
Pythium usando amplificação por PCR. Os autores ainda destacaram o método como eficaz na
identificação de espécies de Pythium devido à sua facilidade e rapidez dos resultados.
A filogenia molecular de espécies do gênero Pythium, baseada em suas sequências e
taxonomia, está dividida em 11 clados do A ao K (LEVESQUE; DE COCK, 2004). No clado
K encontram-se sete espécies diferenciadas, cujas sequências parecem estar mais próximas das

22

espécies do gênero Phytophthora. Entretanto, foi proposto que estas espécies pertençam a um
novo gênero denominado Phytopythium (De COCK et al., 2012).
Ao estudar as relações filogenéticas entre as espécies do gênero Pythium, com base nas
sequências de diferentes regiões, ITS1 e ITS2 do rDNA, gene β-tubulina e gene do citocromo
c oxidase subunidade II (COX II), Villa et al. (2006), revelaram clados com referência nas
características da morfologia dos esporângios e destacou sua importância para a taxonomia das
espécies de Pythium.
Robideau et al. (2011), utilizando iniciadores específicos para oomicetos, para
sequenciar a região citocromo c oxidase subunidade I (COI), concluíram que o COI, em alguns
casos

de

maior

dificuldade

na

conceituação

de

espécies

de

Phytophthora e Pythium, proporcionou melhor resultado.

2.5 Controle da doença
Vários fatores podem contribuir para a ocorrência do tombamento de plantas, uma vez
que os patógenos causadores da doença são habitantes de solo. Dentre esses fatores destacamse: o cultivo em solos mal drenados, a presença do inóculo no substrato, o adensamento entre
as plantas, alto índice pluviométrico, entre outros.
Agrios (2005), destaca que as doenças causadas por Pythium spp.,

podem ser

controladas mediante a utilização de solo esterilizado ou pasteurizado pelo vapor ou por calor
seco e através do uso de tratamento químico da semente.
Entretanto, o controle do tombamento de plântulas é realizado tradicionalmente com a
utilização de fungicidas e a desinfestação química do substrato. Para os oomicetos Pythium e
Phytophthora, o produto químico Fosetyl-Al, no tratamento de solo e via foliar, e o Metalaxyl,
no tratamento de sementes, são os mais recomendados pela eficiência apresentada. Por outro
lado, o surgimento da resistência do patógeno é uma das desvantagens da utilização desses
fungicidas (MICHEREFF; ANDRADE; PERUCH, 2005). De uma maneira geral, custos
elevados da prática do controle químico, associado ao surgimento de resistência aos produtos
comumente empregados, bem como a proibição do uso de outros, como o brometo de metila,
torna essencial o desenvolvimento de técnicas alternativas de controle.
2.5.1 Controle alternativo com óleos essenciais e extratos vegetais
Pesquisas recentes têm mostrado que produtos naturais, como os extratos vegetais e os
óleos essenciais, apresentam ação fungitóxica, despertando grande interesse científico no
emprego do controle alternativo de fitopatógenos. A ação fungitóxica pode ser decorrente da

23

atividade antimicrobiana exercida diretamente contra o patógeno, retardando o crescimento
micelial ou inibindo a esporulação e a germinação de esporos (VENTUROSO et al., 2011;
GARCIA et al., 2012)
Morandi e Bettiol (2009) destacaram que os vegetais são fontes inesgotáveis de
moléculas, muitas ainda desconhecidas, que podem servir de modelo para síntese química,
gerando produtos de baixo custo, eficazes, ambientalmente seguros, que atendam as
necessidades de produtores. Sendo assim, o controle de doenças de plantas, baseados na
utilização de substâncias naturais provenientes de plantas medicinais, aromáticas e
condimentares, muitas vezes de fácil obtenção, baixo custo que não tenham toxidez residual,
podem ser uma alternativa segura para o controle de doenças de plantas (MORAIS, 2009).
Segundo Bakkali et al. (2008), os óleos essenciais têm sido amplamente utilizados desde
a Idade Média para fins bactericidas, fungicidas, antiparasitários, inseticidas, aplicações
medicinais e cosméticos. Os óleos essenciais são compostos naturais, misturas complexas de
substâncias voláteis, lipofílicas, com baixo peso molecular, caracterizada por possuírem um
odor agradável e forte, produzidos por plantas aromáticas com metabólitos secundários
(STANGARLIN et al., 1999; BAKKALI et al., 2008; MORAIS, 2009; SCHERER et al., 2009).
De acordo com Bakkali et al. (2008), as propriedades biológicas dos óleos essenciais
devem ser consideradas, uma vez que trata-se de misturas complexas de muitas moléculas, pois,
os efeitos biológicos podem ser resultado de um sinergismo de todas as moléculas ou de
compostos majoritários.
Vários óleos essenciais extraídos de diferentes espécies vegetais vêm mostrando a
eficiência no controle de fitopatógenos, tanto na ação antimicrobiana como indutora de
resistência (KNAAK; FIUZA, 2010; PEREIRA et al., 2012; MAIA et al., 2014).
Pesquisas têm evidenciado com sucesso o uso do óleo essencial de eucalipto
(Eucalyptus globulus L.) no controle de fitopatógenos (PIATI; SCHNEIDER; NOZAKI, 2011;
SOUZA; SERRA; MELO, 2012). Os óleos essenciais isolados do gênero Eucalyptus,
pertencentes à família Myrtaceae, possuem aromas característicos de acordo com a espécie. São
classificados em três tipos, em função da sua composição e utilização final, como, medicinal,
de perfumaria e industrial. Dentre estes, o mais importante em termos de mercado é o medicinal,
caracterizado pelo elevado teor em 1,8-cineole também chamado de eucaliptol (FIGUEIREDO
et al., 2013). A espécie Eucalyptus globulus é a referência da Farmacopeia Portuguesa, obtido
por destilação das folhas ou ramos terminais jovens. Segundo Figueiredo et al., (2013), a norma
nacional quanto ao teor mínimo de 1,8-cineole é semelhante às internacionais, com
determinação do teor mínimo de cerca de 70% no óleo essencial.

24

Outro óleo essencial que vem sendo estudado é o extraído do capim citronela
(Cymbopogon nardus L.), planta originária da Índia, pertencente à família Poaceae, com
propriedades calmantes e digestivas e que apresenta atividade repelente, ação bactericida e
fungicida (MENEZES, 2005). A composição química do óleo essencial de citronela apresenta
como compostos majoritários citronelal, geraniol e citronelol. A produção desses metabólitos
secundários podem variar com as relações ecológicas e genéticas da planta. (CASTRO et al.,
2010; OLIVEIRA et al., 2011; OOTANI et al., 2013).
O óleo essencial de hotelã-pimenta (Mentha piperita L.), pertencente à família
Lamiaceae e muito conhecida por possui ação medicinal, também vem sendo utilizado com
êxito no controle de fungos fitopatogênicos (FREIRE, 2006).

A composição química do seu

óleo essencial é muito importante para a indústria farmacêutica, de cosmético e de alimentos
(SOUZA et al., 2006).
Segundo Freire (2006), análises cromatográficas permitiram a identificação de 57
compostos no óleo essencial de M. piperita, sendo o mentol identificado como o componente
majoritário do óleo. Conforme Haber et al. (2005), o mentol apresenta propriedades
antiespasmódica, antiinflamatória, antiúlcera e antiviral.
Com relação aos extratos vegetais, Diniz et al. (2006), ressalva que esses podem conter
moléculas complexas na sua composição, como, compostos fenólicos, terpenoides e alcaloides,
que são sintetizados pelo metabolismo secundários das plantas e são de grande importância nas
relações ecológicas entre as próprias plantas, plantas e animais e plantas e microrganismos
fitopatogênicos.
De acordo com a definição estabelecida pela ANVISA (2009), os extratos vegetais são
preparações de consistência líquida, sólida ou intermediária, e podem ser preparados por
percolação, maceração ou outro método adequado e validado, utilizando frequentemente como
solvente, o etanol ou a água.
Extratos aquosos de diversas espécies vegetais são eficientes no controle de fungos
fitopatogênicos. Dentre esses, o extrato de alho (Allium sativum L.) encontra-se entre os mais
pesquisados e o seu efeito inibitório tem sido demonstrado para uma extensa gama de fungos,
envolvendo não só patógenos de pós-colheita, mas também patógenos foliares e de solo
(SEALY; EVANS; ROTHROCK, 2007; LEITE et al., 2011; LEITE et al., 2012; PERELLÓ;
NOLL; SLUSARENKO, 2013).
O alho tem como principal componente a alicina, que é responsável pelo odor
característico do alho, sendo a substancia ativa produzida quando o alho é danificado, isto é,
quando é cortado ou triturado (MENDES, 2008).

25

Para os oomicetos, Sealy; Evans; Rothrock (2007), observaram a capacidade fungicida
do extrato de alho nas espécies Pythium aphanidermatum, P. irregulare, P. ultimum,
Phytophthora cinnomomi e P. nicotianae.
Outro extrato vegetal que tem se destacado com relação ao controle de pragas e doenças
de plantas é o da Azadirachta indica A. Juss. (Meliaceae). Trata-se de uma planta conhecida
popularmente como nim, originária da Índia e que possui como princípio ativo a azadiractina,
componente de amplo espectro de ação derivado de diferentes partes da planta. A azadiractina
é um complexo tetranortriterpenoide, limonoide, encontrado principalmente nas sementes, e
devido à sua complexidade, até o momento, não foi sintetizado. O nim é a espécie botânica
mais estudada para fins agronômicos e destaca-se por sua alta eficiência e baixíssima toxicidade
(MENEZES, 2005).
O óleo emulsionável de nim é amplamente comercializado, e seu modo de ação no
controle de fitopatógenos tem sido investigado por alguns pesquisadores (NEVES; OLIVEIRA;
MOHN, 2003; CARNEIRO, 2003; PIGNONI; CARNEIRO, 2005). Dinis et al. (2006),
destacou o óleo de nim como produto alternativo promissor para o controle da requeima do
tomateiro (S. lycopersicum L.).
Segundo Dias-Arieira et al. (2010), o óleo de nim reduziu o abortamento floral e a
ocorrência de frutos de morangueiro

(Fragaria vesca L.) doentes, advindos de flores

inoculadas com Colletotrichum acutatum. Carneiro et al. (2007), observaram que o óleo de nim
foi eficiente no controle do oídio em feijoeiro (Phaseolus vulgaris L.). De acordo com Medice
et al. (2007), o efeito fungistático ou inibitório do óleo de nim, provavelmente se deve à
presença da azadiractina, substância bioativa de alto poder biológico.
2.6 Indução de resistência em plantas contra fitopatógenos
As plantas possuem diversos mecanismos de defesa, inativos ou latentes, e quando estes
são acionados ou ativados são, por sua vez, expressos. De acordo com Agrios (2005), a indução
de resistência de plantas consiste em ativar mecanismos de defesa da planta ou parte destas,
fazendo com que ela própria se defenda contra o ataque de patógenos.
Segundo Barros (2013), a defesa vegetal contra fitopatógenos são alterações
metabólicas que estão correlacionadas com mudanças na atividade de enzimas chaves no
metabolismo primário e secundário das plantas.
A resistência induzida pode ativar mecanismos estruturais, de lignificação, formação de
papilas, ou respostas bioquímicas, como o acúmulo de fitoalexinas e de proteínas relacionadas
com a patogênese do tipo β-1-3-glucanases e quitinases (PASCHOLATI; LEITE, 1995).

26

A atividade enzimática tem efeitos expressivos na resistência à infecção, com redução
significativa do ataque de patógenos. Indutores de resistência bióticos e abióticos são utilizados
na defesa de plantas a patógeno, e acréscimos nas atividades das enzimas Peroxidase (POX),
fenilalanina amônia-liase (FAL) têm sido demonstrados durante o processo de indução de
resistência (CAMPOS et al., 2004; RODRIGUES; NETO; COELHO, 2006; SILVA, 2007;
ALAMINO et al., 2013).
A POX é uma importante enzima das plantas e está envolvida em diversas reações,
ligações de polissacarídeos, oxidação do ácido indol-3-acético, ligações de monômeros,
lignificação, cicatrização de ferimentos, oxidação de fenóis e defesa de patógenos (CAMPOS
et al., 2004). A enzima atua na remoção do peróxido de hidrogênio (H2O2), na oxidação de
fenóis, na síntese de compostos fenólicos tóxicos aos fungos, e na síntese de lignina (CAMPOS
et al., 2004).
A FAL é uma enzima importante envolvida no mecanismo de defesa da planta ao ataque
de patógenos, sendo responsável pela conversão da L-fenilalanina em ácido trans-cinâmico,
que é um intermediário importante para produção de diversos fenilpropanoides, tais como, a
lignina, os flavonoides e o ácido salicílico. Essa enzima já foi isolada de algas, fungos e,
principalmente, de plantas superiores, não tendo sido ainda detectada em células bacterianas ou
tecidos animais (STANGARLIN et al., 2011).
A indução de resistência com indutores abióticos como o Acibenzolar-S-metil (ASM)
vem sendo largamente utilizado em diversos patossistemas, apresentando amplo espectro de
ação contra fungos, vírus e bactérias. Trata-se de um potente ativador de defesa de plantas,
entretanto, não possui ação direta contra patógenos. Ao ser aplicado na parte aérea das plantas,
o ASM ativa os seus próprios mecanismos naturais de defesa e aumenta sua resistência às
doenças. O Produto é registrado no Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento MAPA sob nº 005801; é comercializado como Bion® (Syngenta, Basel, Suíça) e indicado para
o Manejo Integrado de Doenças (MID). Diversos pesquisadores já comprovaram a ação do
ASM na indução de resistência a doenças fúngicas de plantas (SILVA, 2007; ARAUJO;
MENEZES, 2009).
Dentre os indutores mais utilizados, além do ASM, destacam-se o ácido β-aminobutírico
(BABA) e quitosana (JAKAB et al., 2001). Provavelmente, o BABA induz a produção de
proteínas PR, como ocorre com o ASM. Andreu et al. (2006) observaram uma diminuição
significativa na infecção causada por Phytophthora infestans em cultivares de batata (Solanum
tuberosum L.) quando tratadas com BABA.

27

Contudo, extratos vegetais e óleos essenciais derivados de plantas medicinais vêm sendo
curiosamente estudados a fim de serem utilizados como indutores de resistência efetivos em
diversos patossistemas.
Uma referência de produto obtido de extratos vegetais na indução de resistência de
plantas contra patógenos é produto comercial Ecolife®. Trata-se de um extrato adquirido de
biomassa cítrica, registrado como fertilizante junto ao Ministério da Agricultura, Pecuária e
Abastecimento (MAPA) e que possui selo de certificação orgânica, composto por
bioflavonoides cítricos, fitoalexinas cítricas e ácido ascórbico (CAVALCANTI al., 2006;
FURTADO et al., 2010).
O produto possui ação sinérgica entre seus componentes, agem regulando o vigor
vegetativo, ocasionando um melhor direcionamento energético para necessidades reprodutivas
das plantas. De acordo com Furtado et al. (2010), o Ecolife® pode atuar por indução de
resistência ou por ação direta contra os fitopatógenos. Cavalcanti et al. (2006), evidenciou a
ação do produto contra a mancha bacteriana (Xanthomonas vesicatoria) do tomateiro, com
aumento da atividade de peroxidases e polifenoloxidases.
Resende et al. (2007), utilizando extrato de lobeira (Solanum lycocarpum) na indução
de resistência em cacaueiro (Theobroma cacao L.) contra a vassoura-de-bruxa, observaram
ativação de respostas de defesa das plantas. Segundo Stangarlin et al. (2011), extrato aquoso de
Eucalipto citriodora foi capaz de induzir resistência local em plantas de pepino contra
Colletotrichum lagenarium.
De acordo com Vergnes et al. (2014), estudo realizado com o óleo essencial de gualteria
(Gaultheria procumbens) mostrou que o óleo possui a mesma eficácia que o produto comercial
BION® na resistência contra Colletotrichum higginsianum testado em Arabidopsis. Itako;
Tolentino Júnior; Schwan-Estrada (2013), observaram que o óleo essencial de citronela
(Cymbopogon citratus), aplicado em plantas de tomate, mostrou ação direta sobre Alternaria
solani e induziu mecanismos de resistência local e sistêmica. Segundo Maia et al. (2014), o
óleo essencial de alecrim (Rosmarinus officinalis L.) induziu a resistência em videira contra o
míldio e a mancha das folhas.
Dessa maneira, o desenvolvimento de uma agricultura que colabore com o meio
ambiente, induz a busca de estratégias alternativas de controle, destacando-se o uso de
compostos naturais capazes de estimular o sistema imune das plantas.

28

REFERÊNCIAS

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36

3 ESTUDO DA PODRIDÃO DO COLO E DAS RAÍZES DO MAMOEIRO (Carica
papaya L.): CARACTERIZAÇÃO DE Pythium cucurbitacearum

RESUMO

O presente estudo foi realizado com o objetivo de identificar a espécie de Pythium, causadora
da podridão das raízes e do colo do mamoeiro, coletado no município de Coruripe, a partir da
caracterização morfofisiológica e molecular. O isolado de Pythium sp. foi obtido de material
vegetal com sintomas de podridão de colo e apodrecimento de raízes. Posteriormente, o
patógeno foi identificado e caracterizado molecularmente através do sequenciamento da região
Citocromo Oxidase subunidade I (Cox1) e análise filogenética. A caracterização morfológica
foi realizada através de medições de cada tipo de estrutura produzida. Em seguida avaliou-se a
patogenicidade em frutos e plantas de mamão (Carica papaya L.); a virulência em diferentes
hospedeiros, frutos de: melão (Cucumis melo L.), pepino (Cucumis sativus L.), tomate
(Solanum lycopersicume L.) e tubérculos de batata (Solanum tuberosum L.), e em frutos de
mamoeiro da variedade ‘Golden’. A incidência da doença foi determinada em uma área de
cultivo de mamoeiro situada no município de Coruripe-AL. Foi realizado um ensaio
objetivando caracterizar morfologicamente, o patógeno em diferentes meios de cultura. O
estudo filogenético baseado na região Cox1 do DNA construído usando o método de
‘‘maximum Likelihood Tree’’ com base em 1000 réplicas de “bootstrap”, mostrou 100% de
similaridade genética com a espécie Pythium cucurbitacearum. O isolado apresentou as
seguintes características morfológicas: esporângios globosos, não papilados, com diâmetro
variando de 11,04 – 21,01 µm (média = 16,20 µm); oósporos apleróticos, esféricos, 12,17 –
19,49 µm de diâmetro (média = 14,77 µm); parede lisa e dupla com 1,64 µm de espessura;
oogônio esférico com 12,24 – 18,88 µm de diâmetro (média =16,04 µm); anterídios presentes,
sendo encontrado 1 por oogônio. O levantamento realizado em campo revelou incidência de
20,2% de tombamento causado pela espécie de Pythium estudada. O isolado mostrou-se
patogênico não só aos frutos de mamão, mas também aos frutos de melão, pepino, tomate e
tubérculos batata. Os diferentes meios de cultura testados não mostraram diferenças com
relação ao desenvolvimento do patógeno.
Palavras-chave: Mamão. Tombamento. Cox1. Virulência.

37

STUDY OF STEM ROT AND ROOTS OF PAPAYA (Carica papaya L.):
CHARACTERIZATION OF Pythium cucurbitacearum.

ABSTRACT
This study was conducted with the objective to identify the species of Pythium, causal agent of
stem rot and in roots of papaya, collected in the municipality of Coruripe, from the
Morphophysiological and molecular characterization. The isolated from Pythium sp. It was
obtained from plant material with symptoms of collar rot and root rot. Subsequently, the
pathogen has been identified and molecularly characterized by sequencing of Cytochrome
Oxidase subunit I region (COX1) and phylogenetic analysis. The morphological
characterization was performed through measurements of each type of structure produced. Then
the pathogenicity was evaluated in fruits and papaya plant (Carica papaya L.); virulence in different
host, fruit: melon (Cucumis melo L.), cucumber (Cucumis sativus L.), tomato (Solanum lycopersicume
L.) and potato tubers (Solanum tuberosum L.), and papaya fruit of the variety 'Golden'. The incidence
of the disease was determined in a papaya growing area in the municipality of Coruripe, AL. We

conducted a test in order to characterize morphologically, the pathogen in different culture
media. The phylogenetic analysis based on DNA COX1 region constructed using the "method"
maximum likelihood tree 'based on 1000 replicates the "bootstrap", showed 100% genetic
similarity to the species Pythium cucurbitacearum. The isolate showed the following
morphological characteristics: globose sporangia, not papillate, with diameters ranging from
11.04 to 21.01 µm (mean = 16.20 µm); oospores apleróticos, spherical, from 12.17 to 19.49 µm
in diameter (mean = 14.77 µm); smooth wall and double with 1.64 µm thick; oogônio spherical
with 12.24 to 18.88 µm in diameter (mean = 16.04 µm); antheridia present, being found one by
oogônio. The survey conducted in the field revealed an incidence of 20.2% of damping-off
caused by Pythium species studied. The isolate was shown to be pathogenic not only the papaya
fruits, but too the fruits of melon, cucumber, tomato and potato tubers. The different tested
media showed no differences with relation in the development of the pathogen. The
phylogenetic analysis based on the region Cox1 of DNA constructed using the method of
'maximum likelihood tree' based on 1000 replicates the "bootstrap" showed 100% genetic
similarity to the specie Pythium cucurbitacearum.
Keywords: Carica papaya. Damping-off. Cox1. Virulence.

38

3.1 INTRODUÇÃO

O mamoeiro (Carica papaya L.), pertencente à família Caricaceae, é considerada uma
das fruteiras mais cultivadas e consumidas nas regiões tropicais e subtropicais do mundo. Além
da grande aceitação de seus frutos sob a forma ‘in natura’, o mamoeiro também tem sido
utilizado na produção de derivados na indústria de alimentos; apresenta ainda importância
social gerando empregos, devido à grande absorção de mão de obra (DANTAS; JUNGHANS;
LIMA, 2013).
A cultura apresenta alguns problemas fitossanitários, como a podridão do colo e
raízes, que é uma doença que pode ser encontrada em todas as áreas produtoras de mamão do
mundo (OLIVEIRA, 2000). A doença pode ser causada por oomicetos, tais como
Phytophthora palmivora e Pythium sp., podendo levar a cultura a perdas consideráveis,
normalmente plantas jovens ainda no viveiro (MEISSNER FILHO et al., 2013).
Espécies do gênero Pythium têm sido notificadas como o agente causador da podridão
do

colo

em

mamoeiro

em

alguns

países,

assim

como,

a

espécie

Pythium

aphanidermatum notificada no México (ALVARADO, 2001), Costa do marfim (KOFFI et al.,
2010) e Nigéria (OLUMA; OLADIRAN, 1993). No Brasil, Pythium sp., já foi notificado em
mamoeiro nos estados do Ceará e Pará como sendo agente etiológico responsável pelo podridão
do colo, estiolamento e tombamento de mudas de mamão (RITZINGER; SOUZA, 2000;
BARRETO; SANTOS, 2002; COSTA et al.,2007).
A caracterização taxonômica para as espécies de Pythium está fundamentalmente
baseadas em características morfológicas, tais como, o tamanho e tipo dos esporângios; forma,
ausência ou presença de clamidósporo; forma, tamanho e posição de oogônio; e tamanho de
oósporos (VAN DER PLAATS-NITERINK, 1981).
Considerando que a descrição de espécies é um processo exigente, envolvendo estudo
morfológico detalhado, é de grande valia a utilização de técnicas moleculares para confirmar a
identificação e classificação de patógenos. Desse modo, através de sequenciamento de regiões
conservadas, como as que estão presentes nos nucleotídeos das regiões internas transcritas (ITS)
dos genes ribosomais (rDNA), vem sendo empregado com sucesso na análise filogenética de
oomicetos dos gêneros Pythium e Phytophthora (WANG; WANG; WHITE, 2003;
LEVESQUE; DE COCK, 2004; ROSA et al., 2006).
Dessa maneira, o presente estudo teve como objetivo identificar o agente causador da
podridão do colo e das raízes do mamoeiro, através de estudos morfofisiológico e molecular, e
determinar a incidência da doença no estado de Alagoas.

39

3.2 MATERIAL E MÉTODOS
3.2.1 Local de execução dos experimentos
Os experimentos foram conduzidos no Laboratório de Fitopatologia e casa de
vegetação, do Centro de Ciências Agrárias (CECA) da Universidade Federal de Alagoas
(UFAL) em Rio Largo-AL (9º 27’57” de latitude Sul, 34º 50’1’’ de longitude Oeste e 127 m de
altitude.
3.2.2 Isolamento do patógeno e incidência da doença em campo
O isolado de Pythium sp., utilizado no experimento foi obtido a partir de material vegetal
de mamoeiro com sintomas de podridão de colo, proveniente de uma propriedade produtora de
mamão, situada no município de Coruripe Estado de Alagoas a 10°07'32" de latitude Sul,
36°10'32" de longitude Oeste e 16 m de altitude, em maio de 2012. O isolamento do patógeno
foi realizado a partir de fragmentos de caule apresentando sintomas da doença.
A incidência da podridão radicular no campo foi determinada com base no número total
de plantas e no número de plantas com sintoma de tombamento. Sintomas secundários da
doença não foram contabilizados no momento da avaliação, pela impossibilidade de coleta de
material, e também pela possibilidade de poder tratar-se de outra agente patogênico. Foram
realizadas duas contagens de 100 plantas, em três áreas diferentes, totalizando 600 plantas. A
contagem foi realizada nas fileiras de plantio de maneira aleatória. Avaliou-se as plantas que
apresentavam-se tombadas devido a podridão radicular (Figura 1). Amostras de material com
sintomas foram coletadas, acondicionadas em sacos plástico e levadas ao laboratório para
posterior identificação.
Os tecidos da margem da lesão foram desinfestados em hipoclorito de sódio a 0,1%
(produto comercial com 2%) por dois minutos, lavados em água estéril e colocados para secar
em papel de filtro esterilizado. Após desinfestação, fragmentos do caule (5 mm de
comprimento) foram transferidos para placas de Petri contendo meio de cultura BDA (Batata –
200 g, Ágar – 18 g, Dextrose – 20 g e água destilada – 1000 mL), e incubados em BOD à
temperatura de 25°C. Após sete dias, verificou-se o crescimento da colônia. Posteriormente, o
patógeno foi preservado em BDA em temperatura ambiente.

40

Figura 1 – Área implantada com mamoeiro, com algumas plantas tombadas (A); Planta de mamão tombada (B);
Sistema radicular com sintoma típico de podridão (C).

A

B
Foto: Autora (2014).

B

C
C

3.2.3 Identificação do isolado e caracterização morfológica
O isolado de Pythium sp. foi repicado para placas contendo meio V8 (200 mL de suco
V8, 3 g de CaCO3, 17 g de ágar e 800 mL de água destilada). Após sete dias, foram feitas
observações em lâminas para identificar as estruturas do patógeno. As medições das estruturas
propagativas foram realizadas através de imagens capturadas por câmera digital (Olympus®
IX2-SLP) acoplada ao microscópio óptico com aumento de 400x, projetada em monitor de
computador, através do software Cellsenses Standard (SAMSUNG SDC-415®). Foram
efetuadas 50 medições de cada tipo de estrutura produzida.

41

3.2.4 Teste de patogenicidade e reisolamento de Pythium cucurbitacearum
A patogenicidade foi realizada em frutos de mamão e em plantas da variedade Golden
com 45 dias após a germinação. Para os frutos, foram utilizados 10 frutos sadios no estádio 2
de maturação. Os frutos foram lavados com água e sabão, sendo em seguida, imersos em uma
solução de hipoclorito de sódio a 2,5%, durante 20 minutos, secos em condições ambientais e
postos em bandejas plásticas. A inoculação foi realizada mediante a inserção de um disco do
meio de cultura contendo micélios de Pythium sp., em ferimentos provocados nos frutos,
provocado com o auxílio de alça flambada (Figura 2). Nos frutos testemunha, utilizaram-se
discos contendo apenas meio de cultura BDA. Os frutos foram colocados em câmara úmida por
48 h.
Figura 2 – Inoculação de Pythium cucurbitacearum em frutos de mamão. Fruto inoculado com isolado do
patógeno (A); frutos inoculados mantidos em câmara úmida (B).

A

B

Fonte: Autora, 2014.

A patogenicidade em plantas foi realizada utilizando dois diferentes métodos de
inoculação: o método de deposição de disco de inoculo e método de dipping.
O primeiro método foi realizado para confirmar os sintomas de podridão de colo, através
da inoculação de 10 plantas com 45 dias de idade, cujas sementes foram obtidas de frutos sadios
de mamão da variedade Golden, plantadas em copos descartáveis de 400 mL contendo o
substrato comercial Bioplant® esterilizado. Com o auxílio de uma alça esterilizada faz-se
ferimento no colo das plantas e sobre o ferimento depositou-se disco de BDA contendo micelio
do isolado do patógeno. Posteriormente, os copos foram colocados em placas de Petri contendo
água e um chumaço de algodão umedecido com ADE úmido por 48 h, a fim de manter a
umidade (Figura 3).

42

Figura 3 – Mudas de mamão com 45 dias de idade (A); ferimento no caule (B); inoculação de disco de BDA
contendo micélio de Pythium cucurbitacearum (C); Copos em placas de Petri com água e um chumaço de algodão
úmido (D).

A

B

C

D
Fonte: Autora, 2014.

Para avaliar os sintomas de podridão de raiz, as mudas foram desenvolvidas em tubetes,
com capacidade para 288 cm3, contendo Biopant® esterilizado e autoclavado, as plantas com
45 dias de idade foram retiradas dos tubetes e o sistema radicular foi imerso em uma suspensão
homogeneizada

em liquidificador composta por micélio, numa proporção de uma placa de

Petri em 200 mL de ADE, por 20 minutos. Posteriormente, as plantas foram transplantadas em
copos descartáveis com capacidade de 400 mL (Figura 4), os copos foram colocados em
bandejas com aproximadamente 2cm de nível de água, onde permaneceu por 48 h.
Os frutos e as plantas que apresentaram sintomas típicos da doença foram utilizadas para
o reisolamento do patógeno em placas de Petri contendo meio BDA, sob condições de ambiente.

43

Figura 4 – Mudas de mamoeiro aos 45 dias de idade. Sistema radicular imerso em uma suspensão homogeneizada
em liquidificador composta por micélio em 200 mL de ADE (A); transplante das mudas inoculadas para vasos de
400 mL (B); plantas inoculadas replantadas (C).

A

B

C
Fonte: Autora, 2014.

3.2.5 Patogenicidade de Pythium sp. em diferentes hospedeiros
Frutos sadios de melão (Cucumis melo L.), pepino (Cucumis sativus L.), tomate
(Solanum lycopersicume L.) e tubérculos de batata (Solanum tuberosum L.) foram
desinfestados, lavados com água corrente e sabão, tratados com solução de hipoclorito de sódio
a 1%, por 5 min. lavados por duas vezes em ADE e secos sobre papel toalha em temperatura
ambiente. Posteriormente, os frutos receberam ferimento e foram inoculados com discos de
meio de cultura (6 mm de diâmetro) contendo estruturas do patógeno. Após quatro dias da
inoculação, foram realizadas medições da área lesionada, através do comprimento e largura das
lesões. O delineamento experimental utilizado foi o inteiramente casualizado, com cinco
tratamento e dez repetições para cada fruto. Os dados foram submetidos à análise de variância
e as médias comparadas entre si pelo tukey ao nível de 5% de probabilidade.

3.2.6 Caracterização morfofisiológica
A fim de selecionar um meio que proporcionasse adequado crescimento micelial, foram
testados os seguintes meios de cultura: BDA; CA (20 g de cenoura, 17 g de ágar e 1000 mL

44

ADE); V8 (200 mL de suco V8, 3 g de CaCO3, 17 g de ágar e 800 mL de ADE); CMA (20 g de
fubá, 17 g de ágar e 1000 mL de ADE); e dois meios desenvolvidos para Asperisporium caricae,
o FMA (200g de folhas de mamão e 17 g de ágar) e o CFMA (200g de mamão verde e 17 g de
ágar) (SILVA, 2010).
Foram utilizadas 10 placas para cada tratamento e discos contendo micélio de Pythium
sp. com 15 dias de idade foram repicados para o centro de cada placa contendo os diferentes
meios de cultura. Posteriormente, as placas foram mantidas em temperatura de
aproximadamente 25ºC. Após 72 horas, foram realizadas medições do diâmetro das colônias e
observação do aspecto do crescimento micelial.
O delineamento experimental adotado foi inteiramente casualizado, com seis
tratamentos (meios de cultura) e dez repetições. O programa estatístico usado foi o SISVAR
versão 5.6 (FERREIRA, 2010).
3.2.7 Caracterização molecular

3.2.7.1 Extração de DNA
Para obtenção da massa de micélio do isolado de Pythium sp., três discos de BDA
contendo o micélio foram transferidos para frascos de Erlenmeyer (50 ml), contendo 30 mL do
meio Sacarose-Extrato de levedura-asparagina (sacarose 10 g.L-1, asparagina 2 g, extrato de
levedura 2 g, KH2PO4 1 g, MgSO4.7H2O 0,1 g, ZnSO4.7H2O 0,44 mg, FeCl3.6H2O 0,48 mg
e MnCl2.H2O 0,36 mg) (ZAUZA et al., 2007). As culturas foram incubadas por sete dias, sob
a temperatura de 25±1°C, sem agitação, e fotoperíodo de 12 horas.
Para a extração de DNA foi utilizado o protocolo de Doyle; Doyle (1987), onde o
micélio do isolado foi macerado com nitrogênio líquido em almofariz de porcelana com auxílio
de um pistilo.
O micélio triturado foi transferido para dois tubos de micro-centrífuga com capacidade
de 1,5 mL. Em seguida, adicionou-se 1 mL de tampão de extração (CTAB 4%, NaCl 1,4M,
EDTA 20 mM, Tris-HCl 100 mM, PVP 1%), 4 µL de β-mercaptoetanol, e depois, os tubos
foram mantidos em banho-maria a 65°C por 30 minutos. Posteriormente, as amostras foram
centrifugadas a 12.000 rpm por 15 minutos. O sobrenadante foi transferido para um novo tubo,
onde foi adicionado 600 µL de CIA (clorofórmio: álcool isoamílico 24:1). Após centrifugação,
a fase aquosa foi transferida para um novo tubo e foi acrescentando 400 µL de etanol absoluto.
O DNA precipitado foi lavado com etanol 70% e seco em temperatura ambiente e, em
seguida, ressuspendido com 40 µL de TE (Tris-EDTA; Tris-HCl 10 mM, EDTA 1mM) +

45

RNAse (10µg/mL). A qualidade do DNA foi estimada visualmente em gel de agarose 0,8%. O
material foi armazenado sob a temperatura de -20°C.

3.2.7.2 Amplificação do DNA
A técnica empregada para a amplificação do rDNA foi a PCR (Reação em Cadeia da
Polimerase). Foram utilizados os oligonucleotídeos de sequenciamento específicos para
oomicetos, COX1 OomCoxI-Levup (5'-TCAWCWMGATGGCTTTTTTCAAC-3') e
Fm85mod (5' RRHWACKTGACTDATRATACCAAA-3') (ROBIDEAU et al., 2011).
A reação de PCR foi preparada com tampão 10X, MgCl2 50 mM, dNTP’s 10 mM, 10
µM de cada oligonucleotídeo, 1U de Taq DNA Polimerase e 1μL de DNA diluído (1:20). O
volume final da reação foi ajustado para 60 μL com água Milli-Q. As condições de
termociclagem da PCR para amplificação da região COI ou Cox1 foram: desnaturação inicial
a 95°C durante 2 min., seguida por 35 ciclos de 95°C durante 1 min, 55°C durante 1 min,
72°C durante 1 min., e extensão final a 72°C durante 10 min.
Após a amplificação, os produtos PCR da região Cox1 foi enviando para purificação
e sequenciamento na Macrogen Inc. (Seoul, Coréia do Sul).
3.2.7.3 Sequenciamento da região Cox1 e análise filogenética do isolado
A sequência foi inicialmente analisada com o algoritmo BLASTn (Nucleotide Basic
Local Alignment Search Tool) para a identificação preliminar da espécie do patógeno com
maior porcentagem de identidade. Posteriormente, foi editada com o auxílio do programa
Staden Package (1998).
Para análise filogenética, o sequenciamento foi inicialmente alinhado utilizando o
software MUSCLE (EDGAR, 2004), disponível no pacote computacional MEGA 5 (Molecular
Evolutionary Genetics Analysis) (TAMURA et al., 2011). O alinhamento da sequência serviu
como base para construção filogenética, gerando uma árvore filogenética de ‘‘maximum
Likelihood Tree’’ com o gene Cox1. A confiabilidade da árvore gerada foi obtida a partir 1000
repetições “bootstrap”. Sequências de outras espécies de Phytium disponíveis no GenBank
(www.ncbi.nlm.nih.gov/) (Tabela 1) foram incluídas nas análises. A árvore foi utilizada para
determinar o estado taxonômico do isolado. A espécie Phytophthora drechsleri (CBS119.80)
foi utilizada como grupo externo (outgroup).

46

Tabela 1 – Espécies de Pythium spp. obtidos do GenBank usados para este estudo.

Espécies 1

1

Número de acesso 2

Pythium cucurbitacearum

HQ708428.1

Pythium periilum

HQ708781.1

Pythium graminicola

HQ708589.1

Phytopythium chamaehyphon

HQ708421.1

Pythium oopapillum

FJ655179.1

Pythium mamillatum

AB512918.1

Pythium chamaehyphon

GU133523.1

Pythium vexans

GU133518

Pythium deliense

HQ708566.1

Pythium myriotylum

KF761209.1

Pythium monospermum

HQ708743.1

Pythium acanthicum

HQ708459.1

Pythium hydnosporum

HQ708608.1

Pythium nagaii

JX397977.1

Pythium irregulare

GU071822.1

Pythium mamillatum

GU071819.1

Pythium debaryanum

HQ708565.1

Espécies e 2 números de acesso dos mesmos no GenBank – NCBI.

3.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO

3.3.1 Incidência da doença no campo
De acordo com o levantamento de incidência da doença no campo, as plantas de
mamoeiro apresentaram tombamento de 20,2%. Entretanto, nas áreas avaliadas forma
observadas muitas plantas com sintomas aparente na parte aérea, tais como, murchamento,
amarelecimento das folhas e subdesenvolvimento das plantas.

3.3.2 Identificação e caracterização morfológica do isolado
No presente estudo, obteve-se um isolado de Pythium e a constatação em nível de gênero
do agente causal da podridão de raízes e colo do mamoeiro pôde ser confirmada, visto que, o

47

isolado apresentou todas as estruturas características do gênero. Os esporângios, mostraram-se
globosos, não papilados, com diâmetro variando de 11,04 – 21,01 µm ( média = 16,20);
oósporos apleróticos, esféricos com 12,17 – 19,49 µm diâmetro (média = 14,77) µm); parede
lisa e dupla com 1,64 µm de espessura; oogônio esférico com 12,24 – 18,88 µm de diâmetro (
media =16,04 ); anterídios presentes, sendo encontrado 1 por oogônio (Figura 5).
Figura 5 – Estruturas propagativas de Pythium cucurbitacearum. Esporângios (A-C); oósporos (D-E); oogônio
com anterídio (F).

A

C

B

D

E

F

Fonte: Autora, 2014.

De acordo com a chave taxonômica proposta por Van der Plaats-Niterink (1981), as
descrições morfológicas da espécie do isolado de Pythium aproximaram-se da espécie
chamaehyphon, entretanto, esta espécie possui esporângios e oósporos maiores. O autor ainda
destacou que P. chamaehyphon é muito próximo de P. vexans e P. cucurbitacearum, no entanto,
o primeiro, apresenta oogônios maiores e uma diferença no contato do anterídio com o oogônio,
e o segundo apesar da semelhança do ponto de contato do anterídio com oogônio, diferem no
formato dos esporângios, por serem papilados.
De um modo geral, as espécies de Pythium são microrganismos que apresentam hifas
não septadas e estruturas de reprodução assexuada e sexuada. Na reprodução assexuada, as
espécies produzem esporângios e, tais estruturas, podem variar de filamentosa a globular. Com
a maturação, os esporângios podem germinar e produzir hifas ou ainda originar uma vesícula,
onde são produzidos os esporos móveis assexuados chamados de zoósporos. No entanto, na
reprodução sexuada as estruturas reprodutivas incluem o oogônio (estrutura feminina),

48

anterídio (estrutura masculina) e o oósporo (esporo sexual) (ALLEN; MARTINEZ; BURPEE,
2004).

3.3.3 Patogenicidade
Nos testes realizados em frutos, aos 4 dias após a inoculação, foram observados
sintomas iniciais de podridão, de aspecto amolecido e crescimento cotonoso de coloração
esbranquiçada, foi evidenciado (Figura 6). Foi feito o reisolamento e o material plaqueado
apresentou as mesmas características, confirmando, dessa forma, que a espécie de Pythium
estudada pode causar podridão em frutos de mamoeiro.
De acordo com Agrios (2005), é comum à ocorrência de podridão ocasionada por
Pythium spp., em frutos, e a infecção por sua vez, resulta em crescimento micelial de aspecto
felpudo sobre a superfície do órgão e aparência aquosa apodrecida.
Figura 6 – Fruto de mamão com aspecto de podridão aquosa, com crescimento cotonoso de coloração
esbranquiçada, após quatro dias da inoculação.

Fonte: Autora, 2014.

O isolado de Pythium mostrou-se patogênico às plantas em inoculadas nos dois métodos
de inoculação. Após 10 dias, as plantas que receberam ferimento no caule inoculadas com um
disco contendo micélio, apresentaram lesões características de podridão na região do colo,
conforme pode ser visto na Figura 7. A partir do quarto dia, algumas plantas que tiveram seu
sistema radicular imerso na suspensão de micélio apresentaram murcha; e após quinze dias,
apresentaram lesões de apodrecimento no sistema radicular e posterior tombamento (Figura 8).

49

Figura 7 – Planta de mamoeiro em desenvolvimento no viveiro aos dez dias após a inoculadas, apresentando lesão
no colo (A); detalhe da lesão (B).

B

A
Fonte: Autora, 2014.

Figura 8 – Planta de mamoeiro aos quatro dias após a inoculação. Sintoma de murcha (A); sistema radicular
lesionado (B); planta tombada (C).

A

B

C

Fonte: Autora, 2014.

Tais resultados confirmam a capacidade de Pythium, em causar doença em mudas de
mamoeiro. Durante o processo de infecção foi observado a destruição parcial ou total do sistema
radicular das plantas infectadas. De acordo com Oluma; Oladiran (1993), infecções causadas
por Pythium sp. em mamoeiro apresentam sintomatologia de raízes escurecidas de coloração
marrom, ausência de raízes secundárias e desintegração do tecido interno da raiz principal,
declínio progressivo da parte aérea da planta, culminando com o tombamento e morte da
mesma.

50

O desenvolvimento destes sintomas assemelham-se aos de podridão de raízes de
mamoeiro ocasionado por Phytophthora palmivora, estudados por Carnaúba et al. (2006);
Tocafundo (2008). Resultados semelhantes foram relatados por Koffi et al. (2010), quando
comprovaram a patogenicidade de P. aphanidermatum causando a podridão do colo e raízes
em mamoeiro na Costa do Marfim.

3.3.4 Virulência de Pythium em diferentes hospedeiros
O teste de patogenicidade cruzada revelou a capacidade de P. cucurbitacearum, em
causar lesões em frutos de melão, pepino, tomate e tubérculos de batata (Figura 9). Estes
resultados indicam a não especificidade patogênica do isolado testado, não sendo, portanto,
apenas patogênico a frutos de mamão, uma vez que este foi isolado de plantas de mamoeiro.
De acordo com a análise dos dados, frutos de melão, pepino e tomate apresentaram diâmetros
maiores quando comparado com tubérculos de babata, contudo, não diferiu dos frutos de
mamão (Tabela 2).
Segundo Plaats-Niterink (1981), muitas espécies de Pythium podem parasitar uma
ampla variedade de hospedeiros, enquanto que outras são restritas a apenas uma espécie de
hospedeiro. Um exemplo é a espécie P. aphanidermatum que, de acordo com Lodhi et al (2013),
pode ser isolado de várias espécies vegetais e ocasionar perdas em diversas culturas. No Japão,
a espécie P. curcubitacearum já foi relatado causando doença em tomate e batata (PLAATSNITERINK, 1981).

51

Figura 9. Frutos inoculados com o isolado de Pythium cucurbitacearum obtido de mamoeiro com sintomas de
podridão de colo, após quatro dias de inoculação: (a) fruto de mamão (Carica papaya L.); (b) melão (Cucumis
melo L.); (c) tomate (Solanum lycopersicume L.); (d) pepino (Cucumis sativus L.); (e) batata (Solanum tuberosum
L.).

A

D
Foto: Autora (2014).

B

C

E

52

Tabela 2 – Média do diâmetro das lesões (cm) causadas pela infecção cruzada do isolado de Pythium
cucurbitacearum em diferentes hospedeiros.

Frutos inoculados com P. cucurbitacearum

Diâmetro das lesões (cm)

Pepino

6,23 ± 0,62 a

Tomate

5,59 ± 0,18 a

Melão

4,72 ± 1,65 a

Mamão

3,54 ±0,71 ab

Batata

0,78 ±0,35 b

CV (%)

0,99

Médias seguidas pela mesma letra nas colunas não diferem estatisticamente entre si pelo teste de Tukey ao nível
de 5% de probabilidade. Média ± o erro padrão.

3.3.5 Caracterização morfofisiológica

3.3.5.1 Influencia dos meios de cultura sobre o aspecto das colônias e crescimento micelial de
Pythium sp.
De acordo com as análises estatísticas, os diâmetros de crescimento micelial não
mostraram diferenças significativas entre os meios BDA, CA, V8, CMA, CFMA e FMA
(Tabela 3). Desse modo, todos os meios testados foram eficazes para o desenvolvimento do
patógeno, proporcionando um bom crescimento micelial. Após 72 horas, as placas já mostraram
máximo crescimento, e, após sete dias, pôde ser feita visualizações de micélio aéreo nas
colônias, variando de ralo a cotonoso, conforme pode ser visto na figura 10.
As observações microscópicas mostraram pouca produção de esporângio nos meios
estudados, com excessão do BDA, o qual não foi visualizada a produção de esporângios, apenas
oosporos. Este, por sua vez, foi abundante em todos os meios utilizados. Entretanto, em nenhum
dos meios testados foi obseravada diferenças morfológicas nas estruturas.

53

Tabela 3 – Média dos diâmetros das colônias (cm) de Pythium sp. em seis meios diferentes, após 96 horas de
cultivo.

ns –

Meios

Crescimento micelial diâmetro (cm)

BDA

8,63 ±0,07

CA

8,81 ±0,12

V8

8,92 ±0,04

CMA

8,57 ±0,19

CFMA

8,72 0,22

FMA

8,46±0,10

Teste F

1,37 ns

CV%

3,66

Não significativo. Média ± o erro padrão.

Figura 10 – Aspecto das colônias de Pythium sp. aos dez dias, em diferentes meios de cultura: BDA (A); CA (B);
V8 (C); CFMA (D); FMA (E) e CMA (F).

A

B

C

D

E

F

Fonte: Autora, 2014.

Um dos trabalhos pioneiros referentes ao desenvolvimento de espécies de Pythium em
meios de cultura foi realizado por Van der Plaats-Niterink (1981). Este autor, por sua vez,
destacou o meio de fubá ágar (CMA) para um bom desenvolvimento de estrutiuras reprodutivas
do patógeno. Aparecido; Camilo; Vaz Lobo (2013), obtiveram abundante produção de oósporos
no meio V8 e destaca o meio como indutor na formação dessas estruturas.

54

3.3.5 Caracterização molecular

3.3.5.2 Amplificação do DNA, purificação e sequenciamento dos produtos da PCR
O produto da amplificação da PCR com os primers OomCoxI-Levup e Fm85mod
(sequência MC1A) resultou num fragmento de aproximadamente 700 pares de bases (pb). O
sequenciamento do isolado utilizado no presente estudo apresentou identidade de 99% com a
sequência de P. cucurbitacearum depositada no GenBank (CBS74896).
A análise filogenética baseada nas sequências gênicas da região citocromo c oxidase
subunidade I (Cox1) do DNA do isolado, usando o método de ‘‘maximum Likelihood Tree’’
com base em 1000 réplicas de “bootstrap”, mostrou 100% de similaridade genética com P.
cucurbitacearum (Figura 11).
Figura 11 – Árvore filogenética baseada na região citocromo c oxidase subunidade I (Cox1) do DNA, do isolado
de Pythium (MC1A), construída usando o método de ‘‘maximum Likelihood Tree’’. O isolado Phytophthora
drechsleri foi utilizado como “outgroup”. A barra de escala representa mudança de 0,1 e valores de suporte de
bootstrap de 1000 repetições são apresentados nos ramos.

99
57
34
45

70

Pythium periilum CBS16968
Pythium graminicola CBS32762
Pythium oopapillum DAOM BR641

Pythium deliense CBS11484
Pythium myriotylum OJ6 11 33

66

Pythium monospermum BR1031
Pythium acanthicum BR0500

92

99

Pythium hydnosporum CBS25360
Pythium nagaii P16712

85

Pythium irregulare CBS250.28

89
74

Pythium mamillatum PPRI8609

58

Pythium debaryanum CBS75296
Phytopythium chamaehyphon CBS25930

99

MC1A
100 Pythium cucurbitacearum CBS74896

Pythium mamillatum CBS 251.28
Pythium chamaihyphon PPRI8625
100
95

Pythium vexans CBS119.80

Phytophthora drechsleri Sr1
0.1

55

Os resultados são aceitáveis para conclusão em nível de espécie, pois, o valor de
similaridade de 100% é considerado adequado. Ho et al. (2012), estudando a ocorrência e
distribuição de espécies de Pythium, determinaram que apenas isolados com pelo menos 97%
de identidade com espécies de Pythium conhecidos no GenBank fossem aceitas. Lestari et al.
(2013), objetivando a identificação filogenética de isolados de fungos patogênicos a macieira,
destacaram valores de similaridade de 99% para conclusão a nível de espécie de Pythium.
Robideau et al. (2011), destacaram que, comumente, a região do DNA a ser utilizada
para a identificação dos oomicetos ao nível de espécie é o espaço interno transcrito (ITS) da
região de rDNA. Contudo, os autores destacaram que em alguns casos o citocromo c oxidase
subunidade I (COI ou Cox1) apresenta-se mais discriminativo em nível de espécie.
Lévesque e de Cock (2004), estudando a taxonomia e filogenia molecular de espécies
do gênero Pythium, destacaram que a espécie P. cucurbitacearum está classificada no mesmo
Clado, que engloba as espécies P. boreale; P. oedochilum, P. chamaehyphon, P. helicoides, P.
vexans e P. Indigoferae, no qual as espécies apresentam algumas características morfológicas
congruentes. Comumente, tais espécies apresentam esporângios ovóides e muitas vezes
papilados.
Contudo De Cock et al. ( 2012), em um estudo comparativo da taxonomia morfológica
após revisão molecular, destacaram que a análise das sequências das espécies do Clado em
questão, mostraram-se estar muito próxima ao gênero Phytophthora, por conta da semelhança
dos esporângios e dos oogônios. Entretanto, a descarga de zoósporos é semelhante a Pythium,
com a possibilidade de se tratar de um gênero intermediário, sugerido como Phytopythium. Os
autores ainda destacaram que os esporângios desse Clado podem ser globosos a ovoides com
papilas.
Segundo Ho et al. (2012), a espécie P. cucurbitacearum raramente tem sido relatada no
mundo e sua taxonomia é controversa. A espécie foi relatada pela primeira vez por Takimoto
(1941), no Japão, causando tombamento de plântulas e podridão mole em frutos de pepino, e
apresentou como principais características, esporângios esféricos ou ovóides papilados, o que
corrobora, em parte, com os resultados morfológicos do presente estudo, visto que, o isolado
de Pythium estudado mostrou-se globoso, porém, não foram visualizados esporângios do tipo
ovoides papilados.

56

3.4 CONCLUSÕES


O oomyceto P. cucurbitacearum, é agente causal da podridão das raízes e do colo do
mamoeiro, e causa danos em plantas em desenvolvimento;



O isolado mostra-se patogênico aos frutos de mamão, pepino, tomate, melão e
tubérculos de batata;



Os meios de cultura BDA, CA, V8, CMA, CFMA e FMA proporcionam bom
desenvolvimento à espécie de Pythium estudada;



O isolado apresenta 100% de similaridade com a espécie P. cucurbitacearum.

57

REFERÊNCIAS

AGRIOS, G. N. Plant pathology. 5. ed. Amsterdam: Elsevier, 2005. 922 p.

ALLEN, T. W.; MARTINEZ, A.; BURPEE, L. L. Pythium blight of turfgrass. The Plant
Health Instructor, 10, 1094, 2004.

ALVARADO, G. R. et al. Pythium aphanidermatum Causing Collar Rot on Papaya in Baja
California Sur, Mexico. Plant Disease, v. 85, n.4, p. 444.3, 2001.

APARECIDO, C.C.; CAMILO, C.; VAZ LOBO, R. S. Preservação de Pythium e
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60

4 EFICIÊNCIA DE PRODUTOS ALTERNATIVOS NO CONTROLE IN VITRO DE
Pythium cucurbitacearum, CAUSADOR DA PODRIDÃO DA RAIZ E DO COLO DO
MAMAOEIRO (Carica papaya L.)
RESUMO
Este trabalho foi realizado com o objetivo de avaliar o efeito de produtos alternativos em
diferentes concentrações sobre o crescimento micelial de Pythium cucurbitacearum,
causador da podridão da raiz e do colo do mamoeiro. Foram realizados dois bioensaios,
onde, no primeiro, foram avaliados os óleos essenciais de hortelã-pimenta (Mentha piperita
L.), citronela (Cymbopogon nardus L.), eucalipto glóbulos (Eucalyptus globulus L.) e o indutor
Ecolife® nas concentrações de 0,125; 0,25; 0,5; 1; 2 e 4 µL.mL-1. No segundo, foram
avaliados o extrato aquoso de alho (Allium sativum L.) nas concentrações de 5% (5 mg. mL1
), 10 %(10 mg. mL-1), 15% (15 mg. mL-1) e 20% (20 mg. mL-1); e óleo de nim (Azadirachta
indica A. Juss) emulsificado, obtido a partir da extração a frio de sementes (Natuneem®)
nas concentrações de 5; 10; 15 e 20%. A atividade fungitóxica dos tratamentos foi
determinada por meio das medições do diâmetro das colônias do patógeno após 96 horas da
instalação do experimento. O delineamento experimental adotado para os óleos essenciais e
Ecolife® foi inteiramente casualizado em esquema fatorial (4x6) + testemunha, totalizando 25
tratamentos; e para o extrato aquoso de alho e o Natuneem® em esquema fatorial (2x4) +
testemunha, totalizando 9 tratamentos. Para os dois bioensaios utilizaram-se cinco repetições.
Os dados foram submetidos à análise de variância e as médias comparadas pelo teste de Tukey
ao nível de 5% de probabilidade. Para as variáveis qualitativas, e quantitativas aplicou-se
regressão. Os produtos alternativos apresentaram efeito fungitóxico sobre a espécie de Pythium
estudada, mostrando-se eficiente no controle in vitro do patógeno. O óleo essencial de hortelãpimenta e o indutor Ecolife® apresentaram ação fungicida quando utilizados nas concentrações
de 2 e 4 µL.mL-1. O extrato aquoso de alho na menor concentração testada de 5% (5 mg.mL1
) proporciona efeito fugitóxico e fungicida, sendo superior ao produto comercial
Natuneem® na mesma concentração.
Palavras-chave: Mamão. Óleos essenciais. Extratos vegetais.

61

EFFICIENCY OF ALTERNATIVE PRODUCTS AND INDUCER OF RESISTANCE IN
CONTROL IN VITRO OF Pythium cucurbitacearum, CAUSAL AGENT OF STEM
ROT AND ROOTS OF PAPAYA (Carica papaya L.)

ABSTRACT
This work was carried out to evaluate the effect of alternative products in different
concentrations on mycelial growth of Pythium cucurbitacearum, causal agent of stem rot and
in roots of papaya. Two experiments were performed, in the first, were assessed essential oils
of peppermint (Mentha piperita L.), citronella (Cymbopogon nardus L.), Eucalyptus globules
(Eucalyptus globulus L.) and the inductor Ecolife® at the concentrations 0.125; 0.25; 0.5; 1; 2
and 4 μL.mL-1. In second, were evaluated the aqueous extract of garlic (Allium sativum L.) at
concentrations of 5% (5 mg.mL-1), 10% (10 mg.mL-1), 15% (15 mg.mL-1) and 20% (20 mg mL1
); and neem oil (Azadirachta indica A. Juss) emulsified, obtained from cold extraction of seeds
(Natuneem®) at concentrations of 5; 10; 15 and 20%. The fungitoxic activity of the treatments
was determined by means of measurements of the colony diameter of pathogen after 96 hours
of the experiment. The experimental design for the essential oils and Ecolife® was completely
randomized in factorial (4x6) + control, totaling 25 treatments; and the aqueous extract of garlic
and Natuneem® in factorial (2x4) + control, totaling nine treatments. For the two experiments
were used five replicates. Data were subjected to analysis of variance and means were compared
by Tukey test at 5% probability. For qualitative variables; and applied regression to quantitative
variables. Alternative products submitted fungitoxic effect on the specie of Pythium studied,
being effective in controlling the pathogen in vitro. The essential oil of peppermint and the
inductor Ecolife® submitted fungicidal action when used in concentrations of 2 and 4 μL.mL1
. The aqueous extract of garlic at the lowest tested concentration of 5% (5 mg.mL-1) provides
fugitoxic and fungicidal effect, higher than the commercial product Natuneem® at the same
concentration.
Keywords: Papaya. Essential oils. Plant extracts.

62

4.1 INTRODUÇÃO

O mamoeiro (Carica papaya L.) é uma espécie tropical de grande expressão
econômica, com excelente aceitação de mercado. O Brasil é o segundo maior produtor
mundial de mamão, com 12,2% da produção global, correspondendo a mais de 1,5 milhões de
toneladas, numa área de 31,3 mil hectares (FAO, 2012). A região Nordeste engloba mais de
60% da produção nacional, com destaque para o Estado da Bahia com mais de 45% dessa
produção (IBGE, 2014).
As doenças do mamoeiro acarretam sérios prejuízos à cultura, destacando-se, dentre
elas, a podridão das raízes e do colo do mamoeiro. A doença pode ser causada por diversos
patógenos habitantes de solo, como por exemplo, os oomicetos Pythium sp. e Phytophthora
palmivora (MEISSNER FILHO et al., 2013; OLIVEIRA, 2000).
O controle do tombamento de plântulas é realizado mediante a utilização de fungicidas
e a desinfestação química do substrato. Para os oomicetos Pythium spp. e Phytophthora spp. o
químico Fosetyl-Al no tratamento de solo e via foliar, e o Metalaxyl no tratamento de sementes,
são os mais recomendados pela eficiência apresentada; entretanto, o surgimento da resistência
do patógeno é uma das desvantagens da utilização desses fungicidas (MICHEREFF;
ANDRADE; PERUCH, 2005).
A utilização de produtos vegetais com propriedades fungicidas poderá constituir um
método alternativo e promissor no controle de doenças de plantas, pois, além de serem de
fácil obtenção e baixo custo, minimizam os problemas de toxicidade apresentados pelos
produtos químicos sintéticos (ROMERO et al., 2009), podendo minimizar o aparecimento
de microrganismos resistentes e a contaminação do meio ambiente (AMORIM et al.,
2011).
Os óleos essenciais são misturas complexas de substâncias voláteis, lipofílicas, com
baixo peso molecular, geralmente odorífera e líquida. Frequentemente apresentam odor
agradável e marcante; e são importantes substâncias orgânicas, fonte de matérias-primas para
as indústrias cosmética, farmacêutica e alimentícia (MORAIS, 2009; OOTANI, 2013).
Os extratos vegetais são preparações de consistência líquida, sólida ou intermediária, e
podem ser preparados por percolação, maceração ou outro método adequado e validado,
utilizando frequentemente como solvente, o etanol ou a água (ANVISA, 2009). Os extratos
podem conter na sua composição, moléculas complexas, como, compostos fenólicos,
terpenoides e alcaloides que são sintetizados pelo metabolismo secundários das plantas e são

63

de grande importância nas relações ecológicas entre as próprias plantas, plantas e animais e
plantas e microrganismos fitopatogênicos (DINIZ et al,. 2006).
A utilização de produtos alternativos, como os óleos essenciais e extratos vegetais vêm
sendo testados com êxito no controle de fitopatógenos, principalmente, em algumas espécies
de fungos, tanto na pós-colheita (RIBEIRO; BEDENDO, 1999; CARNELOSSI, 2009;
ANARUMA et al., 2010), quanto em espécies de fungos radiculares ou habitantes do solo,
como Fusarium sp. e Rhizoctonia solani (SILVA et al., 2009; BENINI et al., 2010; HILLEN
et al., 2012; SARMENTO-BRUM et al., 2013). Entretanto, em oomicetos existem poucos
estudos abordados com a utilização desses produtos.
Dessa forma, o objetivo desse trabalho foi avaliar o efeito de óleos essenciais de
hortelã-pimenta (Mentha piperita L.), citronela (Cymbopogon nardus L.) e eucalipto
(Eucalyptus globulus L.); indutor Ecolife®; extrato aquoso de alho (Allium sativum L.) e do
óleo de nim (Azadirachta indica A. Juss) emulsificado obtido a partir da extração a frio de
sementes (Natuneem ®), em diferentes concentrações, na inibição do crescimento micelial
de P. cucurbitacearum causador da podridão da raiz do colo do mamoeiro.

4.2 MATERIAL E MÉTODOS

4.2.1 Local de execução dos experimentos
Os experimentos foram conduzidos no Laboratório de Fitopatologia do Centro de
Ciências Agrárias (CECA) da Universidade Federal de Alagoas (UFAL) em Rio Largo-AL (9º
27’57” de latitude Sul, 34º 50’1’’ de longitude Oeste e 127 m de altitude.

4.2.2 Obtenção dos produtos alternativos
O extrato vegetal aquoso de alho foi preparado pesando-se 10g do material e triturandoo em 100 mL de ADE em liquidificador por um período de 10 minutos. Posteriormente, o
material foi filtrado em gaze dupla e papel de filtro whaltman nº1, sendo utilizado em seguida.
O óleo de nim emulsificado obtido a partir da extração a frio de sementes
(Natuneem ®, Natural Rural Ltda., Araraquara-SP, Brasil) e os óleos essenciais de citronela,
eucalipto e hortelã-pimenta foram adquiridos de forma comercial, produzido por BioEssencia
(Óleos Essenciais Ltda., Jaú-SP, Brasil).
O indutor de resistência Ecolife®, produto a base de biomassa cítrica, também foi
adquirido de forma comercial e o produto foi fornecido por Quinabra S.A. (Química Natural
Brasileira, São José dos Campos – SP, Brasil).

64

4.2.3 Efeito dos produtos sobre o crescimento micelial de Pythium cucurbitacearum
Os produtos foram adicionados ao meio de cultura Cenoura Agar (CA), fundente
(aproximadamente 45°C) e vertidos em placas de Petri. Foram utilizadas concentrações de 5,
10, 15 e 20 % para o extrato aquoso de alho e para Natuneem®; e 0,125; 0,25; 0,5; 1; 2 e 4
µL.mL-1 para os óleos essenciais e Ecolife®. Placas contendo apenas meio CA sem adição dos
tratamentos serviram como testemunha.
No centro de cada placa foi depositado um disco de meio CA de 0,5 cm de diâmetro,
contendo micélio jovem, com sete dias de idade, retirado das bordas de colônias de P.
cucurbitacearum.
A atividade fungitóxica dos tratamentos foi determinada por meio das medições do
diâmetro das colônias do patógeno após 96 horas da instalação do experimento. A Percentagem
de Inibição do Crescimento micelial (P.I.C.) foi determinada segundo Edginton et al. (1971):
P.I.C =[(crtest – crtrat) /crtest] x 100, onde: cresc. test.= Crescimento micelial da testemunha;
cresc. trat. = Crescimento micelial do tratamento.
O delineamento experimental utilizado foi o inteiramente casualizado, em esquema
fatorial (4x6) + testemunha (óleos essenciais e Ecolife® x concentrações), totalizando 25
tratamentos com cinco repetições, para os óleos essenciais e Ecolife®. E para o extrato aquoso
de alho e o Natuneem ®, em esquema fatorial (2x4) + testemunha (extrato e Natuneem ® x
concentrações), totalizando 9 tratamentos com cinco repetições.
Os dados foram submetidos à análise de variância, e quando F foi significativo, as
médias foram comparadas pelo teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade, para as
variáveis qualitativas; e para as quantitativa aplicou-se regressão polinomial. O programa
estatístico usado foi o SISVAR versão 5,6 (FERREIRA, 2010).
Para verificar o efeito fungicida ou fungistatico dos produtos testados, os discos de
inóculo a partir dos quais não apresentaram crescimento micelial, foram transferidos após a
avaliação (96 horas) para placas de Petri contendo CA, sem a presença do agente inibidor e
incubadas a temperatura ambiente (aproximadamente 25°C) e sob luz constante. Após 96 horas,
foi avaliado quanto à presença ou não de crescimento do microrganismo.

65

4.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.3.1 Inibição do crescimento micelial de Pythium cucurbitacearum com óleos essenciais e
Ecolife®
O efeito da interação dos óleos essenciais e do Ecolife® sob diferentes concentrações,
na porcentagem de inibição do crescimento micelial in vitro de P. cucurbitacearum, mostrouse significativo (p<0,01). Desse modo, as variáveis foram desdobradas para os óleos essenciais
e Ecolife® dentro de cada concentração, e as médias comparadas pelo teste de Tukey (p< 0,05),
conforme pode ser visto na Tabela 4; e para porcentagem de inibição do crescimento micelial,
em função das concentrações utilizadas para cada produto, aplicou-se regressão.
A testemunha apresentou 100% de crescimento micelial, ou seja, zero de inibição de
crescimento do patógeno, o que já era previsto, em virtude do meio de cultura utilizado, pois, o
mesmo, proporciona ao patógeno adequado desenvolvimento. Na menor concentração estudada
0,125 (µL.mL-1), os produtos avaliados não proporcionaram inibição de crescimento micelial;
todavia, na segunda menor dose, o óleo essencial de citronela, mostrou inibição de mais de
43,74%. Os óleos de hortelã, citronela e o indutor Ecolife® não apresentaram diferença
significativa nas concentrações de 0,5; 1 e 2 (µL.mL-1) inibindo o crescimento micelial do
patógeno, variando de 80 a 100%. Quando utilizado óleo essencial de eucalipto nas mesmas
concentrações, observou-se baixa inibição do crescimento micelial (0 a 45%). Contudo, na
maior concentração analisada, 4µL. mL-1 os óleos e o Ecolife® mostraram-se eficientes, não
diferindo significativamente proporcionando inibição de até 100% (Tabela 4).
Os resultados do presente estudo indicam a eficiência dos óleos essenciais de hortelã,
citronela, eucalipto e o indutor Ecolife® no desenvolvimento in vitro do oomiceto P.
cucurbitacearum. Provavelmente, o sucesso da inibição micelial deve-se a alguns
componentes específicos dos produtos testados.
De acordo com Singh; Shushni; Belkheir (2011), a atividade antibacteriana e
antifúngica do óleo essencial de hortelã está, principalmente, associada aos compostos
majoritários como o mentol e a mentona. Scherer (2009), destaca a forte ação antimicrobiana
do óleo essencial de citronela, sendo esse majoritariamente composto pelo citronelal e o
geraniol. Segundo Furtado et al. (2010), o produto comercial Ecolife®, composto de
bioflavonóides cítricos, fitoalexinas cítricas e ácido ascórbico, pode atuar diretamente contra
fitopatógenos. Vitte; Brito (2003), destacam o cineol ou citronelal como componente principal
do óleo essencial de eucalipto. Brito et al. (2012), confirmaram a inibição dos fungos

66

Aspergillus sp., Fusarium sp., Penicillium sp. e Colletotrichum sp., utilizando o composto
citronelal.
De acordo com Costa et al. (2011), a atividade antifúngica de óleos essenciais sobre
alguns fungos fitopatogênicos, tais como: Rhizoctonia solani, Fusarium solani, Fusarium
oxysporum e Macrophomina phaseolina está relacionada com sua hidrofobicidade, a qual os
permitem interagir com os lipídios da parede, membrana celular e da mitocôndria, alterando a
permeabilidade e causando distúrbios nessas estruturas.

67

Tabela 4 - Efeito da interação de óleos essenciais e Ecolife® sob diferentes concentrações (µL. mL-1), na porcentagem de inibição do crescimento micelial (P.I.C) de Pythium
cucurbitacearum.

--------------------------------------------------------------- Concentrações ( µL. mL-1)-------------------------------------------------------------------------------------Produtos

0

0,125

0,25

0,5

1

2

4

Hortelã

0,00± 0,00 a

0,00± 0,00 a

0,00± 0,00 b

82,76 ± 1,59a

100,00 ± 0,00 a

100,00 ± 0,0 a

100,00 ± 0,00 a

Citronela

0,00± 0,00 a

0,00± 0,00 a

43,74 ± 17,87a

82,84 ± 16,84a

100,00 ± 0,00 a

100,00 ± 0,0 a

100,00 ± 0,00 a

Eucalipto

0,00± 0,00 a

0,00± 0,00 a

0,00± 0,00 b

0,00± 0,00 b

0,00 a± 0,00 b

45,9 ±22,23b

75,2 ±10,90a

Ecolife®

0,00± 0,00 a

0,00± 0,00 a

0,00± 0,00 b

52,50 ± 2,42a

65,17± 0,93 a

100,00 ± 0,00 a

100,00 ± 0,00 a

CV (%)

35,09

Médias seguidas pela mesma letra nas colunas não diferem estatisticamente entre si pelo teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade. Média ± o erro padrão.

68

Diversos trabalhos vêm atestando a eficiência de óleos essenciais na atividade
antimicrobiana. Salgado et al. (2003), avaliando o efeito do óleo essencial de eucalipto,
confirmaram a inibição do crescimento micelial dos fungos Fusarium oxysporum e Botrytis
cinerea. Carnelossi et al. (2009),

também comprovaram sua eficiência na inibição do

crescimento micelial de Colletotrichum gloeosporioides in vitro.
Anaruma et al. (2010), estudando óleos essenciais, observaram redução significativa
do crescimento micelial do patógeno C. gloeosporioides pelo óleo essencial hortelã-pimenta.
Soriano (2011), estudando óleos essenciais de eucalipto, citronela e o Ecolife® sobre
o crescimento micelial do oomiceto Phytophthora sp., observou uma inibição no crescimento
micelial do patógeno superior a 80%, o que corrobora com os resultados obtidos nessa pesquisa.
De acordo com as análises de regressão, as inibições do crescimento micelial de P.
cucurbitacearum diante das concentrações dos produtos estudados, apresentaram um melhor
ajuste quadrático, exceto para o óleo essencial de eucalipto, que melhor se ajustou a uma
equação linear.
A curva dose-resposta para o óleo essencial de hortelã, com um coeficiente de
determinação de 80% entre a porcentagem de inibição do crescimento micelial e as
concentrações do óleo, mostrou que concentrações a partir de 0,5 µL.mL-1 apresentaram efeitos
satisfatórios de inibição, entretanto, melhores porcentagens de inibição podem ser estimadas
quando se utilizam as concentrações de 1; 2 e 4 µL.mL-1, podendo-se dessa forma, proporcionar
fungitoxidade de até 100%, contudo, a concentração de maior eficiência estimada para inibir
100% do crescimento micelial é de 2,63 µL.mL-1 do óleo essencial (Figura 12).
Para o óleo essencial de citronela, o efeito fungitóxico foi observado na segunda menor
concentração estudada e manteve a atividade quando essas foram duplicadas, dessa forma, as
concentrações entre 1 e 4 µL.mL-1 inibiram totalmente o patógeno (Figura 13); e de acordo com
o ajuste quadrático a concentração de 2,59 µL.mL-1 é a de maior eficiência na inibição micelial
do patógeno.
As concentrações do óleo essencial de eucalipto apresentou comportamento linear com
coeficiente de determinação de 93% sob a porcentagem de inibição do crescimento micelial.
Dessa forma, as menores concentrações 0,125; 0,5 e 1 µL.mL-1 não mostraram qualquer
eficiência na porcentagem de inibição micelial do patógeno. No entanto, a partir de 2 µL.mL-1,
já foi possível observar os efeitos de inibição, que foi aumentada quando a concentração dobrou,
podendo-se aferir que aumento nas concentrações do óleo podem proporcionar maiores
porcentagens de inibição de crescimento micelial (Figura 14).

69

Para o indutor Ecolife®, observou-se inibição micelial acima de 80% a partir de 0,5
µL.mL-1 e atividade fungitóxica comprovada pela inibição micelial, podendo chegar em 100%
com o aumento das concentrações (Figura 15). Contudo, a dose de maior eficiência calculada
do indutor para inibição do patógeno é de 2,9 µL.mL-1.
Figura 12 – Efeito de diferentes concentrações de óleo essencial de hortelã-pimenta (Mentha piperita L.) na
porcentagem de inibição do crescimento micelial de Pythium cucurbitacearum.

Porcentagem de inibição do
crescimento micelial

140
120
100
80
60
y = 0,36 + 99,30 x - 18,86x2
R² = 0,80 **

40
20
0
0

1
2
3
4
Concentração ( µL. mL-1 ) de óleo essencial de hortelã pimenta

5

Figura 13 – Efeito de diferentes concentrações de óleo essencial de citronela (Cymbopogon nardus L.) na
porcentagem de inibição do crescimento micelial de Pythium cucurbitacearum.

Porcentagem de inibição do
crescimento micelial

140

120
100
80
60
y = 12,05+ 90,24x - 17,38 x2
R² = 0,80*

40
20
0

0

1
2
3
4
-1
Concentração ( µL. mL ) de óleo essencial de citronela

5

70

Figura 14 – Efeito de diferentes concentrações de óleo essencial de eucalipto (Eucalyptus globulus L.) na
porcentagem de inibição do crescimento micelial de Pythium cucurbitacearum.

Porcentagem de inibição do
crescimento micelial

100
80
60
40

y = -5,85 + 20,57x
R² = 0,90*

20
0
0

1
2
3
4
-1
Concentração ( µL. mL ) de óleo essencial de Eucalipto

5

Figura 15 – Efeito de diferentes concentrações de Ecolife® na porcentagem de inibição do crescimento micelial de
Pythium cucurbitacearum.

Porcentagem de inibição do
crescimento micelial

120
100
80
60
40

y = - 4,81 + 83,54 x - 14,39 x2
R² = 0,94 **

20
0
0

1
2
3
4
Concentração ( µL. mL-1 ) de Ecolife®

5

O efeito das concentrações dos referidos produtos testados, indicam que a inibição do
crescimento micelial de P. cucurbitacearum, pode ser alcançada, mostrando que a quantidade
de óleos essenciais e o indutor Ecolife® deve ser levada em consideração na atividade
antimicrobiana exercida diretamente contra o patógeno.
Os resultados obitidos nesse estudo corroboram com o observado por Sarmento-Brum
et al. (2013), ao estudar o efeito do óleo essencial de hortelã na inibição micelial de
Colletotrichum graminicolanas, observaram que concentrações de 1 e 1,25 µL.mL-1 foram
capazes de inibir totalmente o desenvolvimento do patógeno.

71

Seixas et al. (2011), avaliaram o efeito do óleo essencial de citronela, ao utilizar
alíquotas de 5, 10, 15, 20 e 25 µL/placa, comprovaram 100% de inibição do crescimento
micelial de Fusarium subglutinans apenas nas maiores quantidades estudadas, alíquotas de 15
a 25 µL.
Segundo Piati; Schneider; Nozaki (2011), pesquisaram o efeito do óleo essencial de
eucalipto sobre o crescimento e desenvolvimento Penicillium sp, e verificaram que o óleo
possui capacidade de inibição micelial do patógeno em concentrações superiores a 0,25%,
destacando a eficiência da referida concentração no controle do fungo.

4.3.2 Inibição do crescimento micelial de Pythium cucurbitacearum com extrato aquoso
de alho e Natuneem®
Os resultados da análise de variância revelaram interação significativa entre o extrato
de alho, o produto comercial Natuneem ® e as concentrações utilizadas, sobre a inibição do
crescimento micelial de P. cucurbitacearum. O desdobramento mostrou diferenças entre os
extratos nas concentrações de 5 e 10%, enquanto que, nas concentrações entre 15 e 20%, a
inibição do crescimento micelial foi de 100% para os produtos (Tabela 5).
Tabela 5 - Efeito da interação do extrato aquoso de alho (Allium sativum L.) e Natuneem® sob diferentes
concentrações (%), na porcentagem de inibição do crescimento micelial (P.I.C) de P. cucurbitacearum.
------------------------------------------ Concentrações (%)-----------------------------------Produto

0

5

10

15

20

Extrato de Alho

0,00 ± 0,00 a

100,00 ± 0,00 a

100,00 ± 0,00 a

100,00 ± 0,00 a

100,00 ± 0,00 a

Natuneem ®

0,00 ± 0,00 a

30,54 ± 6,45b

45,5 ± 4,39 b

100,00 ± 0,00 a

100,00 ± 0,00 a

CV (%)
8,17
Médias seguidas pela mesma letra nas colunas não diferem estatisticamente entre si pelo teste de Tukey ao nível
de 5% de probabilidade. Média ± o erro padrão.

De acordo com as análises de regressão, as referidas concentrações influenciaram na
porcentagem de inibições do crescimento micelial de P. cucurbitacearum. Para o extrato aquoso
de alho, a dose-resposta obteve um ajuste quadrático com um coeficiente de determinação de
85%. Desse modo, concentração de 5 % do extrato, adicionado ao meio, pode estimar mais de
74% de inibição micelial, e a concentração de 13,52% do extrato é suficiente para total inibição
do crescimento micelial (Figura 16). O óleo comercial Natuneem ® também mostrou um melhor
ajuste quadrático com o coeficiente de determinação de 93%, estimando melhor resposta na
inibição do crescimento micelial nas concentrações entre 15 e 20% (Figura 17).

72

Inibição do crescimento micelial
%

Figura 16 – Efeito de diferentes concentrações de extrato aquoso de alho (Allium sativum L.) na porcentagem de
inibição do crescimento micelial de Pythium cucurbitacearum.
120
100
80

y = 11,42 + 15,42x - 0,57 x2
R² = 0,85**

60
40
20
0
0

5
10
15
20
Concentração extrato aquoso de alho %

25

Inibição do crescimento micelia
%

Figura 17 – Efeito de diferentes concentrações do óleo comercial Natuneem® na porcentagem de inibição do
crescimento micelial de Pythium cucurbitacearum.
120
100
80
60
y = -1,76 + 6,6 x - 0,06 x2
R² = 0,93 *

40
20
0
0

5

10
15
20
Concentrações Natuneem® %

25

No presente estudo, ficou evidente que as concentrações de extrato aquoso de alho são
capazes de inibir totalmente o crescimento micelial de P. cucurbitacearum. Possivelmente, a
alicina, principal substância ativa do extrato de alho fresco, que é responsável pelo típico cheiro
acre, seja responsável por tal feito. De acordo com Almeida; Suyenaga (2009), quando o alho
é processado, ocorre à interação entre vários compostos, que por sua vez desencadeia reações
químicas, como a formação do composto volátil alicina.
Segundo Slusarenko, Patel, Portz (2008), a alicina é a base da ação microbiana do
alho e já se mostrou efetiva controlando queima das folhas de tomate e dos tubérculos de
batata causada pelo oomiceto Phytophthora.

73

Souza; Araújo; Nascimento (2007), estudando os efeitos de concentrações de extrato de
alho sobre crescimento micelial de Fusarium proliferatum, observaram efeito fungitóxico nas
0,5%, 1,0%, 2,5%, 5,0% e 10,0%, contudo, destacaram maior eficiência na inibição micelial
com 10%, ou seja, na maior concentração analisada do extrato. Venturoso et al. (2011),
verificaram que concentrações de 10 e 20% do extrato aquoso de alho apresentaram resultados
promissores no controle de Phomopsis sp., sendo que tais resultados corroboram, em partes, no
que foi observado no presente estudo, visto que 5% do extrato inibiu 30,54% o crescimento
micelial de P. cucurbitacearum, sendo este promissor no controle do patógeno.
Os resultados obtidos demonstraram uma ação fungistática do óleo comercial
Natuneem® sob o crescimento micelial de P. cucurbitacearum. Diversos trabalhos já foram
notificados atestando o efeito do nim sobre fungos fitopatogênicos (CARNEIRO, 2003;
CARNEIRO et al., 2007; GARCIA et al., 2012). A ação fungistática do óleo e do extrato de
nim deve-se, possivelmente, à presença de substâncias bioativas, principalmente da azadiractina
(DIAS-AIEIRA et al., 2010; SOLINO et al., 2012). Diniz et al. (2006), destacaram o óleo de
nim como um produto promissor no controle do oomiceto Phytophthora infestans, agente
causal da requeima do tomateiro, constatando a diminuição no progresso da doença.
4.3.3 Modo de ação dos produtos
Todos os produtos testados mostraram efeito fungitóxico, impedindo o
desenvolvimento do patógeno. No entanto, o efeito fungicida foi observado apenas para os
tratamentos de óleo essencial de hortelã e o indutor Ecolife®, nas maiores concentrações de 2 e
4 µL.mL-1; no extrato aquoso de alho, em todas as concentrações avaliadas; e no óleo comercial
Natuneem®, nas concentrações de 15 e 20% (Tabela 6).
Possivelmente, a ação fungicida dos produtos alternativos pode ser atribuída à atuação
direta sobre o patógeno, como na biossíntese de fosfolipídios e a deposição da parede celular,
causando o rompimento e a morte celular. Segundo Bianchi et al. (1997), as alterações podem
ser proveniente da atividade enzimática envolvida na formação da parede celular, provocando
um desenvolvimento anormal do patógeno. Pesquisadores observaram colapso de hifas do
oomiceto Pythium ultimum Trow var. ultimum utilizando extrato de alho na concentração de 10
mL.L-1. Tais resultados corroboram com os resultados obtidos neste estudo, visto que, todas as
concentrações de alho testadas proporcionaram efeito fungicida, impossibilitando retomada do
crescimento do patógeno.
De acordo com Soriano (2011), os princípios ativos presentes em extratos e óleos
essenciais podem apresentar efeito fungicida, quando ocorre inviabilidade do micélio e

74

estruturas reprodutivas do patógeno; ou efeito fungistático, quando o crescimento micelial é
apenas paralisado, podendo o patógeno voltar a se desenvolver caso o tratamento seja
eliminado. O autor ainda concluiu que os óleos essenciais de citronela e o indutor Ecolife® não
apresentaram efeito fungicida para o oomiceto Phytophthora sp., proporcionando apenas efeito
fungistático, o que difere do modo de ação desses produtos no presente estudo para o isolado
de Pythuim sp.
Tabela 6 – Modo de ação dos produtos testados que apresentaram inibição total do crescimento micelial
de Pythium cucurbitacearum.

Produtos

Modo de ação
Fungicida
Fungistática
x

Óleo hortelã 1 (µL.mL-1)
Óleo hortelã 2 (µL.mL-1)

x

Óleo hortelã 4 (µL.mL-1)

x

Óleo citronela 1 (µL.mL-1)

x

Óleo citronela 2 (µL.mL-1)

x

1

x

Óleo citronela 4 (µL.mL- )
Ecolife® 2 (µL.mL-1)

x

Ecolife® 4 (µL.mL-1)

x

Extrato de alho 5%

x

Extrato de alho 10%

x

Extrato de alho 15%

x

Extrato de alho 20%

x

Natuneem® 15%

x

Natuneem® 20%

x

75

4.4 CONCLUSÕES


O óleo essencial de M. piperita, C. nardus, E. globulus e o indutor Ecolife® possui

atividade fungistática, mostrando-se eficiente no controle in vitro de P. cucurbitacearum;


O óleo essencial de hortelã e o indutor Ecolife® apresentam, de maneira semelhante,

efeito fungicida sobre o patógeno, nas concentrações de 2 e 4 µL.mL-1;


O extrato aquoso de alho na menor concentração testada de 5% (5 mg.mL-1)

proporciona efeito fungistático e fungicida sobre P. cucurbitacearum;


O produto comercial Natuneem® proporciona efeito fungistático nas concentrações

entre 10 e 20%, e ação fungicida nas concentrações de 15 e 20%.

76

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80

5 AVALIAÇÃO DE PRODUTOS ALTERNATIVOS SOBRE A PODRIDÃO
RADICULAR EM MUDAS DE MAMOEIRO OCASIONADA POR Pythium
cucurbitacearum, E ATIVIDADE DE ENZIMAS RELACIONADAS A DEFESA
VEGETAL
RESUMO

Os produtos alternativos surgem como uma estratégia de controle que já vêm sendo aferidos
para diversos fitopatógenos com êxito. Tais produtos, incluindo os indutores de resistência,
além de atuar diretamente no desenvolvimento do patógeno, podem agir também na ativação
do sistema de defesa natural da planta. Desse modo, o presente trabalho objetivou avaliar o
efeito do Ecolife ®, do ácido LD β-amino–n–butírico (BABA), extrato de alho (Allium
sativum L.) e óleos essenciais na redução da podridão do colo e de raízes em mudas de
mamoeiro Carica papaya L. Foram realizados dois ensaios experimentais, sendo que, no
primeiro, mudas de mamoeiro aos 45 dias de idade foram inoculadas com Pythium
cucurbitacearum, e após 48 horas receberam tratamento com óleos essenciais de hortelãpimenta (Mentha piperita L.), citronela (Cymbopogon nardus L.), e indutor Ecolife® na
concentração de 2 µL.mL-1, extrato de alho a 5% (5 mg.mL-1), e testemunha tratada apenas
com Água Destilada Esterilizada (ADE). Decorridos 15 dias, foram feitas avaliações com
relação à presença de sintomas. No segundo ensaio experimental, mudas com 60 dias de idade,
receberam tratamento com indutor BABA na concentração de 300 µg.mL-1, óleo essencial
de hortelã-pimenta e o indutor Ecolife® na concentração de 2 µL.mL-1. As mudas foram
inoculadas 24 horas após tratadas, e a quantificação da atividade das enzimas Peroxidases
(POX) e Fenilalanina Amonia-Liase (FAL), relacionadas com as respostas de defesa
vegetal, foram realizadas após 24, 48, 72 e 96 horas da inoculação. Os dados obtidos foram
submetidos à análise da variância (ANOVA) e as médias foram comparadas pelo teste de Tukey
ao nível de 5% de probabilidade. Dos produtos alternativos testados, apenas o óleo essencial de
hortelã-pimenta e o indutor Ecolife® apresentaram controle sobre a podridão das raízes em
mamoeiro causada por P. cucurbitacearum. De acordo com a quantificação de enzimas, apenas
o óleo essencial de hortelã-pimenta mostrou incremento na atividade de POX, apresentando
pico enzimático nas folhas coletadas após 72 horas da inoculação. Para a atividade da FAL, foi
observado aumento da atividade da enzima nas folhas coletadas 24 horas após a inoculação das
plantas tratadas apenas com Água destilada esterilizada (ADE) e com o indutor Ecolife ®.
Incremento significativo da enzima também foi observado 96 horas após a inoculação nas
plantas pulverizadas com o indutor BABA.

Palavras-chave: Óleos essenciais. Atividade enzimática. Controle alternativo.

81

EVALUATION OF ALTERNATIVE PRODUCTS ON THE ROOT ROT IN
SEEDLINGS PAPAYA ARISING IN Pythium cucurbitacearum, AND ACTIVITY OF
ENZYMES RELATED TO DEFENSE VEGETABLE
ABSTRACT
Alternative products arise as a strategy of control that have already been measured for various
pathogens successfully. Such products, including resistance inducers, besides acting directly in
the development of the pathogen, can act also in the activation of the plant's natural defense
system. Thus, this study aimed to evaluate the Ecolife®, acid LD β-amino–n–butírico (BABA),
garlic extract (Allium sativum L.) and essential oils in reducing stem rot and root in papaya
Carica papaya L. Two experimental assays were performed, and at first, papaya seedlings at
45 days of age were inoculated with Pythium cucurbitacearum.; and after 48 hours were treated
with essential oils of peppermint (Mentha piperita L.), citronella (Cymbopogon nardus L.) and
inductor Ecolife® at a concentration of 2 μL.mL-1, garlic extract of 5% (5 mg.mL-1), and control
treated with Sterilized Distilled Water (SDW). After 15 days, evaluations were made for the
presence of symptoms. In the second experimental test, plants 60 days old were treated with
inductor BABA at a concentration of 300 μg.mL-1, essential oil of peppermint and inductor
Ecolife® in concentration 2 μL.mL-1. The seedlings were inoculated 24 hours after treated, and
the quantification of enzymes activity Peroxidases (POX) and Phenylalanine Ammonia-Lyase
(PAL), related to plant defense responses, were performed after 24, 48, 72 and 96 hours of
inoculation. The data were submitted to analysis of variance (ANOVA) and the means were
compared by Tukey test at 5% probability. Among alternative products tested, only the essential
oil of peppermint and inductor Ecolife® they had control of root rot in papaya caused by P.
cucurbitacearum. According to the quantification of enzymes, only the essential oil of
peppermint showed increase in activity POX, with enzymatic peak in leaves collected after 72
hours of inoculation. To the activity of PAL was observed increased enzyme activity in leaves
collected 24 hours after inoculation of the plants treated only with SDW and the inductor
Ecolife®. Significant increase of the enzyme was also observed 96 hours after inoculation in the
plants with the inductor BABA.
Keywords: Essential oils. Enzyme activity. Alternative control.

82

5.1 INTRODUÇÃO

O mamoeiro (Carica papaya L.) é uma cultura de grande importância econômica que
encontra-se distribuído em todas as regiões do Brasil, entretanto, a maior produção encontra-se
na região Nordeste com uma produção de 978.140 toneladas (IBGE, 2014). Os frutos do
mamoeiro são consumidos, principalmente, na forma 'in natura' e deles também é extraída a
papaína, uma enzima proteolítica de ampla utilização para os mais variados fins nas indústrias
farmacêutica, de alimentos e de cosméticos.
A cultura do mamoeiro pode ser atingida por diversas doenças, destacando-se a
podridão das raízes e do colo, que pode acarretar perdas consideráveis à cultura, sobretudo
em plantas jovens ainda no viveiro. A sintomatologia da doença pode ser ocasionada por
diversos patógenos, como Phytophthora sp., Rhizoctonia solani, Fusarium sp. e Pythium
sp. (MEISSNER FILHO et al., 2013; OLIVEIRA, 2000).
O controle do tombamento, da podridão do colo e raízes do mamoeiro, causados por
Pythium sp., é realizado mediante a utilização de fungicidas. Entretanto, uma das
desvantagens da utilização desses fungicidas, quando aplicados continuamente, é a ocorrência
da resistência do patógeno (MICHEREFF; ANDRADE; PERUCH, 2005), além de constituir
sérios riscos ao ambiente e à saúde humana, principalmente pela presença de resíduos
tóxicos.
Desse modo, métodos alternativos, mediante o uso de indutores abióticos e produtos
naturais, tais como, extratos vegetais e óleos essenciais, vêm sendo frequentemente
testados, com objetivo de não apenas controlar fitopatógenos, mas também de ativar
mecanismos de defesa natural das plantas tratadas (RODRIGUES; NETO; COELHO, 2006);
(RESENDE et al., 2007).
A atividade enzimática tem efeitos expressivos na resistência à infecção, com redução
significativa do ataque de patógenos. Indutores de resistência bióticos e abióticos são utilizados
na defesa de plantas a patógeno, e acréscimos nas atividades das enzimas Peroxidase (POX),
fenilalanina amônia-liase (FAL) têm sido demonstrados durante o processo de indução de
resistência (CAMPOS et al., 2004; RODRIGUES; NETO; COELHO, 2006; SILVA, 2007;
ALAMINO et al., 2013).
O ácido LD β-amino–n–butírico (BABA), da Sigma Chemical, vem sendo estudado e
tem demonstrado possuir efeito protetor contra alguns patógenos (ALTAMIRANDA et al.,
2008; (LUNA et al., 2014).

83

Informações têm demonstrado que o Ecolife ®, extrato obtido de biomassa cítrica,
composto por bioflavonoides, além de melhorar a resistência das plantas ao “stress”, tem
sido utilizado com êxito como ativador de resistência a doenças causadas por bactérias e
fungos (CAVALCANTI, 2006; FURTADO et al., 2010).
Lucas (2012) constatou que o óleo essencial de capim limão (Cymbopogon citratus
DC Stapf) induziu o controle da pinta preta do tomateiro (Lycopersicon esculentum L.),
aumentando a atividade de enzimas de defesa. Em estudos realizados por Silva (2007), o
extrato de alho (Allium sativum L.) e óleo de citronela (Cymbopogon nardus L.) induziu a
resistência em mudas de bananeira (Musa spp. L.), reduzindo a incidência de Fusarium
oxysporum f. sp. cubense.
Sendo assim, o objetivo do estudo foi avaliar o efeito do uso dos indutores BABA e
Ecolife ®; extrato de alho e óleos essenciais de hortelã-pimenta, citronela e eucaliptos na
redução da podridão do colo e de raízes em mudas de mamoeiro e quantificar a atividade
de enzimas relacionadas a defesa vegetal.

5.2 MATERIAL E MÉTODOS

5.2.1 Local de execução dos experimentos
Os experimentos foram conduzidos no Laboratório de Fitopatologia, Fisiologia Vegetal
e na casa de vegetação do Laboratório de Biotecnologia (BIOVEG) do Centro de Ciências
Agrárias (CECA) da Universidade Federal de Alagoas (UFAL) em Rio Largo-AL (9º 27’57”
de latitude Sul, 34º 50’1’’ de longitude Oeste e 127 m de altitude.

5.2.2 Avaliação in vivo de produtos alternativos no controle da podridão do colo e das
raízes, causada por Pythium cucurbitacearum
As mudas de mamoeiro foram plantadas em bandejas contendo 54 tubetes com
capacidade para 288 cm3 de substrato, preenchidas com mistura de 50% de Plantmax floresta
(Eucatex, Brasil) e 50% de solo esterilizado. Foram plantadas três sementes por tubete a,
aproximadamente, 1 cm de profundidade. Após a germinação, foi realizado o desbaste,
deixando-se apenas uma muda por tubete.
Foram avaliadas as concentrações que apresentaram melhor efeito fungitóxico dos
ensaios in vitro. Mudas de mamoeiro aos 45 dias após a semeadura foram inoculadas. As
plantas tiveram seu sistema radicular imerso, por 20 minutos, em uma suspensão
homogeneizada em liquidificador, composta por micélio, numa proporção de uma placa de Petri

84

em 200 mL de Água Destilada Esterilizada (ADE) conforme Carnaúba (2006). Posteriormente,
foram transplantadas para copos descartáveis com capacidade de 400 mL e colocadas, por 48
horas, em bandejas com nível de água, aproximadamente, 2 cm. Após 48 horas da inoculação,
receberam pulverização via folia com os seguintes produtos: óleos essenciais de eucalipto,
hortelã-pimenta, citronela e indutor Ecolife® na concentração de 2 µL.mL-1; extrato de alho a
5% (5 mg.mL-1) e testemunha apenas com ADE. Decorridos 15 dias, foram realizadas
avaliações com relação à presença de sintomas, tais como: murcha, amarelecimento e
tombamento.
O delineamento experimental adotado foi o inteiramente casualizado, com seis
tratamentos e quatro repetições, sendo cada repetição composta por quatro plantas, em cada
tratamento. As análises foram realizadas no programa estatístico SISVAR versão 5.6
(FERREIRA, 2010).

5.2.3 Avaliação dos produtos alternativos sobre a atividade de enzimas relacionadas com
indução de resistência em folhas de mamoeiro
Os produtos que apresentaram melhor efeito de controle do ensaio in vivo foram
avaliados. O efeito de não indução de resistência foi avaliado em plantas tratadas apenas com
água e a resposta positiva de indução foi verificada com aplicação do indutor de resistência
BABA (300 µg.mL-1).
Mudas de mamoeiro aos 60 dias de idade receberam tratamentos com óleos
essenciais de hortelã-pimenta e indutor Ecolife®, na concentração de 2 µL.mL-1; BABA (300
µg.mL-1) e testemunha inoculada com P. cucurbitacearum. e tratada apenas com ADE. Após
24 horas de tratadas, as mudas foram inoculadas utilizando-se 30 mL em cada planta de uma
suspensão homogeneizada em liquidificador composta por micélio, conforme metodologia
descrita no experimento anterior.
Para a realização das análises bioquímicas, foram coletadas folhas de mamoeiro das
plantas de cada tratamento, às 24, 48, 72 e 96 horas após a inoculação. Após a coleta, as
amostras foram imediatamente congeladas em nitrogênio líquido, acondicionadas em tubos
falcon e armazenadas em freezer vertical (-86ºC), para posterior análise.

5.2.3.1 Obtenção do extrato proteico
As amostras de folhas de mamoeiro (0,5g) coletadas conforme descrito acima, foram
homogeneizadas mecanicamente em 5 mL de tampão de acetato de sódio 100mM (pH 5,0),
com auxílio de pistilo e cadinho de porcelana até a obtenção de massa homogênea, que foi

85

centrifugada à 15.000 g durante 20 minutos, a 4ºC. O sobrenadante obtido foi utilizado para
determinação da atividade de POX, FAL e quantificação de proteínas.

5.2.3.2 Determinação da atividade de Peroxidase (POX)
A atividade de POX foi determinada a partir de 200 µL do extrato proteico e 2,8 mL de
uma solução preparada a partir de: 250 µL de guaiacol e 306 µL de peróxido de hidrogênio em
100mL de tampão fosfato 0,01M (pH 6,0). O branco apresentou todos os componentes do meio
de reação, exceto o extrato enzimático, o qual foi substituído por água. A atividade enzimática
foi analisada em espectrofotômetro, observando-se a variação na absorbância em comprimento
de onda de 470 nm, a aproximadamente 25ºC e expressa em unidade de absorbância min -1 mg
de proteína-1 (KUHN; PASCHOLATI, 2010). A atividade foi medida durante três minutos em
intervalo de 15 segundos.

5.2.3.3 Determinação da atividade de fenilalanina-amônia liase (FAL)
A atividade da enzima FAL foi avaliada com 200 μL do extrato enzimático,1500 μL de
Tris 100 mM, 500 μL de Fenilalanina (substrato) e 800 μL de ADE. Os tubos de ensaio
contendo as reações foram mantidos em banho-maria à 40ºC por 60 minutos. Após o período
de incubação, a reação foi paralisada com a adição de 100 μL de ácido clorídrico a 5,0 M. No
ensaio foram realizadas duas reações de referência. A primeira constando apenas o substrato
(Branco 1) e a segunda contendo o extrato proteico (Branco 2). O Branco 1 foi preparado
adicionando-se 1500 μL de Tris HCl 100 mM (pH 8,8), 500 μL de Fenilalanina 30 mM e 1000
μL de ADE. O Branco 2 consistiu de 1500 μL de Tris 100 mM, 200 μL do extrato enzimático
e 1300 μL de ADE. A leitura foi realizada em cubeta de quartzo, por meio de variação na
absorbância em comprimento de onda de 290 nm, a 25ºC e expressa em unidade de absorbância
min -1 mg de proteína-1 (UMESHA, 2006).

5.2.3.4 Quantificação de proteínas
O teste de Bradford foi empregado para a quantificação do conteúdo total de proteínas
nas amostras (BRADFORD, 1976). Em 20 μL do sobrenadante adicionou-se 1 mL de reagente
concentrado de Bradford, e, após 15 minutos, procedeu-se a leitura de absorbância a 595 nm.
As leituras da absorbância foram realizadas no espectrofotômetro (GENESYS™ 10S
UV-Vis) e as reações para cada planta tratada foram realizadas em triplicatas para cada
repetição. O delineamento experimental utilizado foi o inteiramente casualizado em esquema
fatorial (4x4), sendo quatro tratamentos (ADE, Ecolife®, óleo essencial de hortelã-pimenta e

86

BABA) em quatro tempos (24, 48, 72 e 96 horas). As análises estatísticas foram realizadas com
os valores calculados de atividade enzimática. Os dados foram submetidos à análise de
variância, e quando F foi significativo, as médias foram comparadas pelo teste de Tukey ao
nível de 5% de probabilidade, através do programa estatístico SISVAR versão 5.6 (FERREIRA,
2010).

5.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.3.1 Incidência da doença
As mudas de mamoeiro tratadas com o produto Ecolife® e o óleo essencial de hortelãpimenta mostraram diminuição na incidência da podridão das raízes causada por P.
cucurbitacearum em 50%, quando comparada com a testemunha e com as plantas tratadas com
o óleo essencial de eucalipto; e uma diminuição acima de 55% em relação ao óleo essencial de
citronela (Figura 19). Tais resultados, condizem com os efeitos desses produtos no controle in
vitro, visto que, o Ecolife® e o óleo essencial de hortelã-pimenta apresentaram de maneira
semelhante, além da atividade fungistática, um efeito fungicida. Entretanto, o extrato aquoso
de alho, e o óleo essencial de eucalipto, apesar do sucesso no controle in vitro, não apresentou
um efeito com relação ao controle, pois, as plantas tratadas com esses produtos apresentaram
incidência de mais de 50% da doença.
Figura 18 – Efeito de óleos essenciais de hortelã-pimenta (Mentha piperita L.); citronela (Cymbopogon nardus
L.); eucalipto (Eucalyptus globulus L.); indutor Ecolife® e extrato aquoso de alho (Allium sativum L.), sobre a
incidência de Pythium cucurbitacearum em mudas de mamoeiro.

Incidência de plantas com sintomas
(%)

100

1

80

ab

b

b

b

60
40
20

a

a

Ecolife

Hortelã

0
Alho
Testemunha Eucalipto
Produtos alternativos

Citronela

Médias seguidas pela mesma letra nas colunas não diferem estatisticamente entre si pelo teste Tukey ao nível de
5% de probabilidade. As barras representam o erro padrão.
Fonte: Autora (2015).

87

Possivelmente, o sucesso da ação dos produtos alternativos no controle de doenças de
plantas depende de suas propriedades biológicas. Os óleos essenciais possuem propriedades,
cujo efeitos biológicos podem ser resultado de um sinergismo de todas as moléculas ou de
compostos majoritários presentes (BAKKALI et al. 2008). No caso do óleo essencial de hortelãpimenta, Singh; Shushni; Belkheir (2011) destacaram a atividade antibacteriana e antifúngica
do óleo associada ao mentol e a mentona, seus componentes majoritários. É provável que esses
elementos tenham sido responsáveis pelo controle da podridão das raízes do mamoeiro causada
por P. cucurbitacearum.
Óleos essenciais extraídos de diferentes espécies de plantas, têm mostrado sua
efetividade no controle de doenças em alguns patossistemas. Segundo Maia et al. (2014), a
mancha da folha causada pelo míldio da videira pode ser controlada pelo óleo essencial de
alecrim (Rosmarinus officinalis L.). Vitoratos et al. (2013), comprovaram a eficiência de óleo
essencial de orégano (Origanum vulgare L.) e limão (Citrus limon L.) no controle de Botrytis
cinerea em frutos de tomate (Solanum lycopersicum L.) e morango (Fragaria vesca L.).
Sarmento-Brum et al. (2013) observaram a eficiência dos óleos de capim-limão, citronela, ervacidreira (Melissa officinalis L.), hortelã-pimenta e nim (Azadirachta indica) na redução da
severidade da antracnose do sorgo.
De acordo com Cruz et al. (2011), o produto Ecolife®, apresenta, na sua constituição,
compostos biologicamente ativos, podendo exercer também ação sobre o patógeno. O produto
possui ainda em sua composição, bioflavonoides cítricos, ácido ascórbico e fitoalexinas cítricas
capazes de exercer efeito protetor e/ou curativo em alguns patossistemas.
A ineficácia do extrato de alho no controle da podridão das raízes do mamoeiro, nas
condições in vivo, pode estar relacionada com a volatilidade da alicina, substância
antimicrobiana produzida quando o alho é macerado, e também pela relação do patossistema
estudado, podendo haver degradação dos compostos pelas condições ambientais de luz,
temperatura, entre outros. Em trabalho realizado anteriormente, em condições in vitro, o extrato
de alho mostrou sucesso na inibição do crescimento micelial do patógeno, provavelmente, pelo
fato de estar em contato direto e confinados em placas de Petri.
Os resultados do presente estudo diferem dos encontrados por Nashwa; Elyousr (2012),
os quais observaram que extratos de A. sativum, na concentração de 5%, reduziu
significativamente a doença pinta-preta em tomateiro (Alternaria sp.) em condições de campo.
Alguns estudos têm apontado o sucesso do uso do extrato de alho em conjunto com
óleo vegetal em condições de campo. De acordo com Leite et al. (2012), o extrato bruto de
alho associado a óleo vegetal foi efetivo no controle da antracnose da videira em condições de

88

campo. Segundo Leite et al. (2011), o extrato de alho também associado ao óleo vegetal
apresentaram grande potencial de utilização no controle do oomiceto causador do míldio da
videira (Plasmopara viticola).

5.3.2 Atividade enzimática
A aplicação dos indutores Ecolife ® e BABA não proporcionou incrementos
significativos na atividade de peroxidase, no período analisado de 24 a 96 horas após a
inoculação com P. cucurbitacearum, quando comparado as plantas que foram tratadas
apenas com ADE. Entretanto, as plantas que foram tratadas com óleo essencial de hortelãpimenta apresentaram incremento da enzima após 72 horas da inoculação e se mantiveram
até 96 horas, sendo o incremento da enzima superior em até nove vezes, quando comparado
às plantas do tratamento testemunha (Figura 19).
Figura 19 - Atividade de peroxidase (POX) em folhas de mamoeiros induzidas com ácido LD β-amino–n–butírico
(BABA), Ecolife®, Óleo essencial de hortelã-pimenta (Mentha piperita L.), e testemunha (ADE), às 24, 48, 72 e
96 horas após a inoculação com Pythium cucurbitacearum.
14

aA

aA

POX (U.A. min -1 mg proteína -1) 1

12
10
abA

8

ADE
aA aA

bA

6

bA

4

aA

aB
aA

2

HORTELÃ

bA

aB

aA

ECOLIFE

bA

BABA

aA
bA

0

24

48
72
Tempo após a inoculação (horas)

96

1

Médias seguidas pelas letras minúsculas iguais entre produtos diferentes no mesmo tempo de inoculação não
diferem entre si, e letras maiúsculas iguais entre os mesmos produtos em tempos de inoculação diferentes não
diferem entre si pelo teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade. As barras representam o erro padrão.
Fonte: Autora (2015).

A atividade da POX têm sido frequentemente relacionadas à resposta de resistência em
diferentes patossistemas e em diversos estudos. Segundo Cavalcanti et al. (2006), a resistência

89

induzida foi evidenciada pelo aumento da atividade de POX em tomateiro contra a mancha
bacteriana (Xanthomonas vesicatoria); sendo o mesmo observado por Araújo; Menezes (2009),
em doenças foliares do tomateiro.
De acordo com Campos et al. (2004), maiores estímulos na atividade enzimática da
peroxidase foi observada em cultivares de feijão (Phaseolus vulgaris L.) com maior resistência
contra a antracnose (Colletotrichum lindemuthianum).
O aumento significativo da peroxidase nas plantas pulverizadas com óleo essencial de
hortelã-pimenta, cuja coleta das folhas ocorreu as 72 e 96 horas após a inoculação, pode ser um
indicativo de indução sistêmica desencadeada pela ação dos componentes presentes no óleo
essencial nesse período. Desse modo, é possível que tenha ocorrido uma volatilização mais
lenta do óleo.
Os óleos essenciais vêm mostrando respostas consideráveis na ativação de enzimas
relacionadas a defesa. Pereira et al. (2008), estudando produtos alternativos e indutor de
resistência no manejo da cercosporiose-do-cafeeiro (Cercospora coffeicola), observaram que o
óleo essencial de tomilho (Thymus vulgaris L.) aumentou a atividade de peroxidase. Segundo
Pereira et al. (2012), o óleo essencial de citronela proporcionou aumento na atividade de
peroxidase, ativando respostas de defesa do cafeeiro contra a ferrugem (Hemileia vastatrix) e
cercosporiose (C. coffeicola). O óleo essencial de capim-limão também proporcionou potencial
de indução de resistência em plantas de tomate contra Alternaria solani (ITAKO; TOLENTINO
JR; SCHWAN-ESTRADA, 2013).
Possivelmente, a menor incidência da podridão radicular causada por P.
cucurbitacearum nas mudas de mamoeiro observadas no experimento anterior, onde as plantas
foram tratadas, após a inoculação, com o óleo essencial de hortelã-pimenta, pode estar
relacionada tanto com a ação direta dos produtos sobre o patógeno, quanto pela ativação da
POX, enzima relacionada a defesa; o que não ocorreu com o indutor Ecolife®, o que indica um
resultado apenas da ação direta do produto sobre o patógeno.
Tavares et al., (2009) observaram incremento na atividade de peroxidase em plantas de
mamoeiro, constatando a indução de resistência à podridão radicular causada pelo oomiceto
Phytophthora palmivora com o uso de indutores bióticos e abióticos.
De acordo com Cavalcanti et al. (2007), as peroxidases estão envolvidas em diversos
processos fisiológicos das plantas, tais como a lignificação da parede celular, regulação e
crescimento, biossíntese de etileno e respostas a vários estresses.
Para a atividade de FAL, às 24 horas após a inoculação com o patógeno, houve um
aumento significativo da atividade da enzima nas plantas que foram tratadas apenas com ADE

90

e com o indutor Ecolife ®, sendo superior à atividade das plantas tratadas com óleo essencial de
hortelã-pimenta.
Entretanto, após 48 horas da inoculação, as plantas induzidas com os produtos não
apresentaram diferenças significativas na atividade da enzima, ocorrendo uma diminuição da
atividade nesse tempo para as plantas tratadas com ADE e Ecolife®, em relação as primeiras
24 horas.
Após 72 horas, as plantas que foram tratadas com Ecolife ® apresentaram maior
incremento da enzima em relação aos demais tratamentos. Contudo, 96 horas após a inoculação,
o indutor BABA proporcionou um aumento significativo na atividade da FAL em relação às
plantas tratadas com o mesmo produto às 24, 48 e 72 horas (Figura 20).

Figura 20 - Atividade de Fenilalanina-Amônia Liase (FAL) em folhas de mamoeiros induzidas com, ácido LD βamino–n–butírico (BABA), Ecolife®, óleo essencial de hortelã-pimenta (Mentha piperita L.), e testemunha (ADE),
às 24, 48, 72 e 96 horas após a inoculação com Pythium cucurbitacearum.
0,3

FAL (U.A. min -1 mg proteína -1)

aA
0,25

0,2

aA
aA
aAB

0,15

abA

aAB aA
aB

aA aAB
0,1

bA bB

ECOLIFE
HORTELÃ

abAB
aB

ADE

bB

aB

BABA

0,05

0
24

48

72

96

Tempo após a inoculação (horas)
1

Médias seguidas pelas letras minúsculas iguais entre produtos diferentes no mesmo tempo de inoculação não
diferem entre si, e letras maiúsculas iguais entre os mesmos produtos em tempos de inoculação diferentes não
diferem entre si pelo teste Tukey ao nível de 5% de probabilidade. As barras representam o erro padrão.
Fonte: Autora (2015).

Provavelmente, o aumento da atividade da FAL nas plantas testemunha, inoculadas
apenas com o patógeno e tratadas com ADE, 24 horas após a inoculação, pode estar relacionado
ao estimulo da presença do patógeno na planta, ou seja, a resposta de defesa da própria planta
contra a ação do patógeno. De acordo com Itako; Tolentino Jr; Schwan-Estrada (2013), as

91

enzimas relacionadas com a patogênese geralmente têm participação nos mecanismos de defesa
durante a infecção.
Entretanto, para as plantas cujas folhas foram pulverizadas com o indutor BABA, a
atividade da FAL teve seu aumento máximo 96 horas após a inoculação com o patógeno.
Mostrando o possível efeito do indutor nesse período, Baysal et al. (2005), observaram indução
da resistência em folhas de tomate induzidas por BABA contra o cancro bacteriano causado por
Clavibacter michiganensis, relatando o aumento da FAL. De acordo com Jakab et al. (2001), o
efeito protetor do BABA é devido a uma potencialização dos mecanismos de defesa natural
contra estresses bióticos e abióticos.
De acordo com Stangarlin et al. (2011), a FAL é uma enzima responsável pela conversão
de L-fenilalanina em ácido trans-cinâmico, que é importante para a produção de
fenilpropanoides, como a lignina, e flavonoides, como as fitoalexinas. Dessa maneira, o
aumento de FAL está frequentemente associado ao aumento da concentração dessas
substâncias, que são importantes no mecanismo de defesa das plantas ao ataque de patógenos.

92

5.4 CONCLUSÕES


O óleo essencial de hortelã-pimenta e o indutor Ecolife® são capazes de controlar a
podridão de raízes causado por P. cucurbitacearum, em mudas de mamoeiro;



O extrato aquoso de alho e o óleo essencial de eucalipto não apresentam efeito de
controle da podridão de raízes causado por P. cucurbitacearum, em mudas de
mamoeiro;



O óleo essencial de hortelã-pimenta proporciona aumento na atividade da POX,
contudo, o mesmo não ocorre com a atividade da FAL.

93

REFERÊNCIAS

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