Tese izael.pdf
Documento PDF (2.0MB)

Exibir conteúdo Baixar

                    UNIVERSIDADE FEDERAL DE ALAGOAS
CENTRO DE CIÈNCIAS AGRÁRIAS
PROGRAMA DE PÓS GRADUAÇÃO EM PROTEÇÃO DE PLANTAS

IZAEL OLIVEIRA SILVA

Etiologia da podridão radicular da mandioca de mesa (Manihot
esculenta Crantz) var. Rosinha no Estado de Alagoas e Influência
de Trichoderma spp. sobre o desenvolvimento de Fusarium
falciforme

Rio Largo-AL
2016

IZAEL OLIVEIRA SILVA

Etiologia da podridão radicular da mandioca de mesa (Manihot
esculenta Crantz) var. Rosinha no Estado de Alagoas e
Influência de Trichoderma spp. sobre o desenvolvimento de
Fusarium falciforme

Tese de doutorado apresentada ao Programa de PósGraduação em Proteção de Plantas do Centro de
Ciências Agrárias da Universidade Federal de
Alagoas como requisito para obtenção do grau de
Doutor em Proteção de Plantas.
Orientadora: Prof.ª Dr.ª Edna P. da Rocha Amorim

Rio Largo-AL
2016

Folha de Aprovação

IZAEL OLIVEIRA SILVA

Etiologia da podridão radicular da mandioca de mesa (Manihot
esculenta Crantz) var. Rosinha no Estado de Alagoas e
Influência de Trichoderma spp. sobre o desenvolvimento de
Fusarium falciforme

Tese submetida ao corpo docente do
Programa de Pós-Graduação em Proteção de
Plantas, do Centro de Ciências Agrárias da
Universidade Federal de Alagoas.
________________________________________________________________________
Profª Drª Edna Peixoto da Rocha Amorim,
Universidade Federal de Alagoas
(Orientadora)

Banca Examinadora:

__________________________________________________________________________
Prof.ª Dr.ª Juliana Paiva Carnaúba Ramos,
Instituto Federal de Alagoas
(Examinador Externo)

__________________________________________________________________________
Dra. Iraildes Pereira Assunção
Universidade Federal de Alagoas

(Examinador Interno)

__________________________________________________________________________

Dra Julio Alves Cardoso dos Santos
Universidade Federal de Alagoas

(Examinador interno)

Ao Pai de Misericórdia, que com toque sutil de amor, me fez “enxergar” a graça de
reencontrar o sentido de ser melhor.
À Ele que me sustentou e me guiou nos meus momentos mais escuros e cegos,
à Ele que me abriu os olhos da alma, quando a vida me fechou o da carne.
Bendito seja Deus para sempre em tudo que me acontece,
à Ele toda Honra, toda Glória agora e para sempre.
OFEREÇO

À minha família,
que em todos os momentos de minha vida foram presentes,
tanto na alegria quanto na tristeza sempre foram minha fortaleza.
HOMENAGEM

À professora e Mãe acadêmica EDNA PEIXOTO DA ROCHA AMORIM, por toda a
graciosidade de Mãe, compreensiva, incentivadora, protetora e afetuosa,
meu terno carinho, admiração e respeito.
EXEMPLO

A meu amigo-irmão NELSON AUGUSTO DO NASCIMENTO JÚNIOR,
que em todos os momentos me encorajou,me guiou com seu exemplo de pessoa,
de pai e profissional.
GRATIDÃO

A meu Irmão de todas as horas GRAZZIANO DUARTE SILVA SANTOS,
por tudo desprendimento e apoio nos momentos mais cruciais
de minha vida meu grande exemplo de amizade.
ADMIRAÇÃO

Aos meus pais José Raimundo e Mª Juligia Oliveira Silva,
Meus irmãos, Beclaute, Ibéria, Wcleuton e Maricléia
Aos meus sobrinhos Thomas, Adrian Guilherme, Sahvanna,
Miguel, Sophia e Ana Pietra. A todos os meus familiares,
DEDICO

Submeto-me a Teu querer, eu que um dia esqueci, meu principio meu fim,
fez-se visível quando já não podia ver, fez-se presente em meu deserto,
fostes Misericórdia diante de minha miséria,
me amou e se fez encontrar no momento exato em que me perdi,
agora resgatado por Ti, sou livre para permanecer a Teu lado,
meu primeiro Amor, meu Deus, meu Senhor.
(Izael Oliveira Silva)

AGRADECIMENTOS

A DEUS, pelo dom da vida e por ter me dado o maior presente que tenho até hoje,
minha família. A Universidade Federal de Alagoas, e ao Centro de Ciências Agrárias (CECA)
por me proporcionar a conclusão de mais uma etapa da minha longa jornada em busca dos
meus objetivos;
A CNPq-CAPES, pela concessão da bolsa de mestrado. Ao Laboratório de
Fitopatologia coordenado por Profª. Drª. Edna Peixoto da Rocha Amorim. Ao corpo docente
do Programa de Pós Graduação em Proteção de Plantas, pelos ensinamentos; Aos Profs. Drs,
Iraildes Pereira Assunção e Gaus Silvestre de Andrade, pela oportunidade, apoio e paciência;
A minha Orientadora Profª. Dra. Edna da Rocha Amorim, pelas instruções dadas, além
do aprendizado diário, o qual foi de suma importância para execução deste trabalho. A ela
minha Admiração e respeito além dos momentos de descontração e ensinamento, dos quais
sem sombra de dúvidas me fizeram ver que tudo pode ficar melhor em mãos talentosas;
Um agradecimento muito especial à Profª Dra Adriana Duarte, que sempre me ajudou
seja em incentivo, defesa e dispondo de seus estagiário Antonio e Laysa para me auxiliar nas
etapas dos experimentos no momento mais intenso de minha vida, meu sinceros
agradecimentos. A Profª Drª. Fátima Muniz, pela convivência harmoniosa pelos conselhos e
ensinamentos;
Aos meus pais, José Raimundo Silva, pelo exemplo de força e segurança e minha
amada mãe Maria Julígia Oliveira Silva, a qual “na alegria ou na tristeza sempre foi minha
fortaleza” por todo carinho, apoio e alegria transmitidas durante todos estes anos;
Aos Meus irmãos, Beclaute, Ibéria, Wcleuton, Maricléia, por sempre me apoiarem e
pela presença em todos os momentos sendo os meus exemplos de persistência e conquistas. As
minhas cunhadas, Gilmara e Leiziane, e cunhados Adriano e Odijas, por serem grandes e
verdadeiros irmãos;
Aos meus sobrinhos amados, Thomas, Adrian Guilherme, Sahvana, Miguel, Sophia e
Ana Pietra pelos abraços, sorrisos e amor demonstrado a cada dia. A meus avós paternos
Manoel e Claudemira “in memory” que foi presente em minha infância como mãe amorosa. A
meu avô José Ferreira “in memory” pelos momentos de alegria e descontração que tivemos;E
ao Vô Manuel “in memory” que apesar de não o ter conhecido carrego as históras de sua
pasciência e retidão que são exemplos para mim.
A minha guerreira e Amada avó Cleonice “in memory” a qual sem sobra de dúvidas foi
guerreira, amorosa e vitoriosa. A mulher mais forte que já pude conhecer, que sorria mesmo
tendo vários motivos para chorar, que num olhar distante, profundo, mas acima de tudo
tranquilo, transmitia a paz e o amor que nos fez ter certeza que podiamos ir mais além do que
imaginamos. A senhora minha avó o meu muito obrigado por ter me dado o meu maior e mais
precioso presente, a minha amada Mãe;
A meus tios e tias maternos pelo afeto, que de várias formas e maneiras foi
demonstrado. A tia Ní pela alegria irradiante, a Rosa pela dedicação e cuidado, a Zeta pelas
saudosas brincadeiras e orações e a Zezé pelo carinho que todas às vezes me é dado quando
nos vemos. Aos meus tios Jota, Duda, Ismar e Giselho “in memory” por participarem de todos
os momentos de descontração;
A meus tios paternos o meu obrigado, em especial a Jurimar e Mª das Dores José
Moreira “in memory” Lourival, Luiz José, Damião e Maria e Maria José os quais de forma
direita ou indireta participaram de minha vida;

A meu grande amigo e irmão Grazziano e Luana, por serem verdadeiros irmãos, sendo
companheiros, se dispondo de forma muito expressiva em minha vida, estando sempre perto
nos momentos mais importante de minha vida;
Às Dra. Juliana Carnauba e Kirley Michelly pela amizade de longa data e que até hoje
são grande orgulho para mim. E a Magdaly que com sua alegria sempre soube arrancar um
sorriso de meu rosto;
A todos os meus amigos na fé do TLC são Miguel em especial a Jayane, Janderson,
Claudemir, Rose, Vicente Jocicleide (Keu) e seu filho Neto, Thais, Felipe, Luan e por ultimo
mais tão importante quanto, Thamires aquela que hoje aquece meu coração. Meu muito
obrigado;
À Ana Izabel, que mesmo na distância se faz presente todos os dias em oração, uma das
pessoas que admiro e que sempre foi sentinela, uma verdadeira amiga, uma irmã. A você todo
meu carinho;
A família Justino, em especial a Sr. Antonio, Dona Maria José, Ana Deize e Tonny, que
durante maior parte deste curso foram companheiros e parceiros nas etapas iniciais deste
trabalho. Ao Sr. Manuel e Dona Santina que são para mim exemplo de retidão fé e oração. E a
Marta, Alexandre e Janiele pelos momentos de descontração e alegria. Amo vocês como
família. Obrigado por tudo, a vocês toda minha admiração, respeito e carinho.
Ao Dr. Eduardo S. P. Melo “in memory”, por ter sido um grande parceiro e amigo em
todos os momentos em que estava sobre tratamento, sendo exemplo de humildade, dedicação e
sapiência. Meu muito obrigado. A Dr. Denizio Dantas, por sua destreza, competência, além de
humildade e amizade em todo processo de minha recuperação. Minha Gratidão. A Dr. Alan
por acompanhar todo o processo, sendo um verdadeiro parceiro em todos os momentos
angustiantes do tratamento;
Aos funcionários da Secretaria do Programa de Pós Graduação em Proteção de
Plantas, Geraldo de Lima, Marcos Antônio Lopes e Michele Cristina, pela atenção e
convivência;
Aos amigos Nelson Augusto Nascimento Junior, Rui Silva, Maria Quitéria C. dos
Santos, Henrique, Daniella, Mércia, Jair Tenório, Clemens Fortes, Maria Lausane, Manoel
Elion, Alexandre Guimarães, pela amizade, cooperação e apoio;
Aos amigos que fazem parte do Laboratório de Fitopatologia, em especial, Nelson
Augusto Nascimento Junior, Dayse Rocha, David Vitor, Roasângela, Jardel, Cristiane, Erika,
pela amizade, conviência e apoio; A todos os colegas e amigos da pós graduação;
A Residência Universitária Alagoana (RUA) e a todos os meus amigos IRMÃOS, que
por lá passaram e a todos que de alguma maneira contribuíram para realização desse
trabalho.

RESUMO
A podridão radicular causada por diversos patógenos limita a produção da mandioca (Manihot
esculenta Crantz), cultura de elevado interesse para a região Nordeste do Brasil,
proporcionando grandes prejuízos. As dificuldades no manejo tem direcionado a busca por
alternativas, entre as quais, o biocontrole, vem apresentando resultados significativos. Os
objetivos deste trabalho foram determinar a etiologia dos fitopatógenos envolvidos com a
podridão radicular da mandioca, no estado de Alagoas, avaliar a capacidade de isolados de
Trichoderma spp. em inibir o desenvolvimento de Fusarium sp. e identificar molecularmente
os isolados de Trichoderma e Fusarium sp. Para tanto, experimentos foram conduzidos nos
Laboratórios de Fitopatologia e Fitopatologia Molecular do Centro de Ciências Agrárias da
Universidade Federal de Alagoas (CECA-UFAL). Inicialmente, solo da rizosfera e raízes
tuberosas de mandioca com sintomas de podridão foram coletados e submetidos a isolamento,
identificação morfológica e testes de patogenicidade. Os fungos isolados foram Fusarium sp.,
Neoscytalidium sp. e o oomiceto Phytophthora sp., todos patogênicos a mandioca. Em seguida,
realizou-se a seleção de isolados de Trichoderma pela técnica de pareamento. Foram obtidos 12
isolados de Trichoderma, ente os quais sete (T2; T3; T5; T6; T10; T13; T15) produziram
substancias bioativas que inibiram o desenvolvimento de Fusarium sp. Posteriormente, a
caracterização molecular de Fusarium sp. e de Trichoderma spp. foi realizada através do
sequenciamento da região ITS do DNA e análise filogenética, cujo estudo, construído usando o
método de ‘‘maximum Likelihood Tree’’ com base em 1000 réplicas de “bootstrap”, mostrou
100% de similaridade genética com a espécie Fusarium falciforme. Os isolados de
Trichoderma foram identificados como T. harzianum (T6), T. citrinoviride (T5) e T. orientale
(T15). Avaliou-se também o efeito do extrato bruto a 50°C, extrato térmico (100°C) e extrato
autoclavado (120°C/15 minutos) de Trichoderma spp. e a detecção de índice enzimático de F.
falciforme e de Trichoderma spp. Os extratos brutos de T. harzianum, T. citrinoviride e T.
orientale são eficientes em inibir o desenvolvimento de F. falciforme, sendo o extrato bruto, o
que proporcionou a maior porcentagem de redução de crescimento micelial (85%), seguido do
extrato a 100°C (59%) e 121°C (40%). Os isolados T2, T3 e T6 (T. harzianum), T5 (T.
citrinoviride) e T15 (T. orientale) e o isolado de F. falciforme produziram as enzimas amilase,
celulase, gelatinase, lípase, protease e quitinase. O presente estudo constitui o primeiros
registro de F. falciforme nessa cultura.
Palavras - Chave: Raiz tuberosa, Identificação molecular, Patologia.

ABSTRACT
Root rot caused by several pathogens limits the production of manioc (Manihot esculenta
Crantz), a crop of great interest to the Northeast region of Brazil, causing great losses. The
difficulties in the management have directed the search for alternatives, among which, the
biocontrol, has presented significant results. The objectives of this work were to determine the
etiology of phytopathogens involved with root rot of cassava, in the state of Alagoas, to
evaluate the ability of Trichoderma spp. In inhibiting the development of Fusarium sp. And to
identify molecularly the Trichoderma and Fusarium sp. For that, experiments were conducted
in the Phytopathology and Molecular Phytopathology Laboratories of the Agricultural Sciences
Center of the Federal University of Alagoas (CECA-UFAL). Initially, rhizosphere soil and
tuberous roots of cassava with symptoms of rot were collected and submitted to isolation,
morphological identification and pathogenicity tests. The isolated fungi were Fusarium sp.,
Neoscytalidium sp. And the Phytophthora sp., All pathogenic to cassava. Then, the selection of
Trichoderma isolates was performed by pairing technique. Twelve isolates of Trichoderma
were obtained, of which seven (T2, T3, T5, T6, T10, T13, T15) produced bioactive substances
that inhibited the development of Fusarium sp. Subsequently, the molecular characterization of
Fusarium sp. And Trichoderma spp. Was performed through the DNA ITS region sequencing
and phylogenetic analysis, whose study, constructed using the '' Maximum Likelihood Tree ''
method based on 1000 bootstrap replicates, showed 100% genetic similarity with the falciform
Fusarium species . Trichoderma isolates were identified as T. harzianum (T6), T. citrinoviride
(T5) and T. orientale (T15). The effect of the crude extract at 50 ° C, thermal extract (100 ° C)
and autoclaved extract (120 ° C / 15 minutes) of Trichoderma spp. And the detection of
enzymatic index of F. falciforme and Trichoderma spp. The crude extracts of T. harzianum, T.
citrinoviride and T. orientale are efficient in inhibiting the development of falciform F. The
crude extract yielded the highest percentage of mycelial growth reduction (85%), followed by
the extract At 100 ° C (59%) and 121 ° C (40%). The isolates T2, T3 and T6 (T. harzianum),
T5 (T. citrinoviride) and T15 (T. orientale) and the F. falciform isolate produced the enzymes
amylase, cellulase, gelatinase, lipase, protease and chitinase. The present study constitutes the
first record of F. falciformus in this culture.
Key words: Root tuber, Molecular identification, Pathology.

LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Aspecto das colônias e estruturas reprodutivas dos isolados de fitopatógenos
causadores de podridão em mandioca: Fusarium sp (A1-A6), Neoscytalidium sp (B1-B6) e
Phytophthora sp. (C1-C6). Colônia de Fusarium sp (A1); conídios (A2); célula conidiogênica
(A3-A6). Colônia de Neoscytalidium sp (B1); Conídios (B2-B6). Colônia de Phytophthora sp
(C1); Esporângio (C2); Clamidósporos (C3 E C4); Esporângios (C5) e Esporângios em
reprodução (C6)...........................................................................................................................50
Figura 2. Aspecto da colônia e estruturas reprodutivas do isolado T6 de Trichoderma
spp................................................................................................................................................51
Figura 3. Plantas e raízes de mandioca cv rosinha apresentando sintomas de podridão após
inoculação: sintomas de lesão no caule, clorose e murcha nas folhas (A1 e A2) e podridão seca
na raiz (A3 e A4), causadas por Fusarium sp.; murcha e seca das folhas (B1 e B2), lesão negra
no caule (B3) e podridão negra na raiz (B4), causadas por Neoscytalidium sp.; lesões no caule,
murcha e morte da planta (C1 e C2), crescimento cotonoso na raiz (C3) e podridão mole com
degradação
da
parede
(C4)
causadas
por
Phytophthora
sp..................................................................................................................................................52
Figura 4. Confronto entre os isolados de Trichoderma spp e Fusarium sp: isolado de Fusarium
sp sem confronto (T0); isolados de Trichoderma spp na posição superior de cada placa (T1T15).............................................................................................................................................54
Figura 5. Notas atribuídas aos isolados de Trichoderma spp. avaliadas após o
pareamento..................................................................................................................................55
Figura 6. Produção de metabólitos por isolados de Trichoderma spp confrontados com
Fusarium sp: isolado de Fusarium sp (T0); isolados de Trichoderma spp na posição superior de
cada
placa
(T2-T15)
.....................................................................................................................................................56
Figura 7. Porcentagem de inibição do crescimento micelial (PIC) de Fusarium sp. em cultivo
pareado com isolados de Trichoderma spp.................................................................................57
Figura 8.Árvore filogenética baseada na região ITS do DNA de Fusarium sp, construída
usando o método de ‘‘maximum Likelihood Tree’’. O isolado Fusarium redolens 6VVBY3 foi
utilizado como “outgroup”. A barra de escala representa mudança de 0,04 e valores de suporte
de

bootstrap

de

1000

repetições

são

apresentados

nos

ramos.

.....................................................................................................................................................60
Figura 9. Árvore filogenética baseada na região ITS do DNA de Trichoderma spp, construída
usando o método de ‘‘maximum Likelihood Tree’’. O isolado de Fusarium falciforme CBS
128812 foi utilizado como “outgroup”. A barra de escala representa mudança de 0,02 e valores
de

suporte

de

bootstrap

de

1000

repetições

são

apresentados

nos

ramos.

.....................................................................................................................................................63

Figura
10.
Extratos
centrifugados
dos
isolados
de
Trichoderma
spp................................................................................................................................................89
Figura 11. Efeito dos extratos de Trichoderma spp. sobre a porcentagem de inibição do
crescimento micelial de Fusarium sp., aos 3 e 6 dias de incubação: T2; T3; T5; T6 e T15
(Trichoderma),T0 (Testemunha).................................................................................................95
Figura 12. Efeito dos extratos de Trichoderma spp., sobre a porcentagem de inibição do
crescimento micelial de Fusarium sp.: A) atividade de biocontrole dos extrato dos isolados, B)
efeito da concentração dos extratos e C) Efeito do tempo sobre a PIC.......................................97
Figura 13. Efeito dos extratos de Trichoderma spp. sobre a porcentagem de inibição do
crescimento micelial de Fusarium sp.: Atividade de biocontrole dos extratos (A) e efeito do
tempo sobre a PIC (B).................................................................................................................99
Figura 14. Índice enzimático dos isolados de Trichoderma spp. e Fusarium falciforme.Escala
de Furlanato (1989)...................................................................................................................102
Figura 15. Reação enzimática de Fusarium falciforme e Trichoderma spp nos meios
específicos para secreção de enzimas........................................................................................107
Figura 16. Indice enzimático dos isolados de Trichoderma spp. e Fusarium falciforme....... 108
Figura 17. Potencial enzimático (P.E.) dos isolados de Trichoderma spp. e Fusarium
falciforme...................................................................................................................................111

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Escala de Bell et al. (1982) ...................................................................................... 46
Tabela 2. Descrição do primer utilizado para identificação dos gêneros fúngicos................. 47
Tabela 3. Média dos Índices de Atividade enzimática dos isolados de Trichoderma spp e
Fusarium falciforme..................................................................................................................102

SUMARIO
RESUMO ................................................................................................................................ vii
ABSTRACT ........................................................................................................................... viii
1.INTRODUÇÃO ................................................................................................................... 16
2. REVISAO DE LITERATURA ......................................................................................... 18
2.1. A CULTURA DA MANDIOCA .......................................................................... ...........18
2.2. PROBLEMAS FITOSSANITÁRIOS NA CULTURA DA MANDIOCA .................. 19
2.3. O PATÓGENO Fusarium sp .......................................................................................... 21
2.4. CONTROLE DA DOENÇA ........................................................................................... 23
2.5. BIOCONTROLE DE FITOPATÓGENOS .................................................................. 24
2.6. O FUNGO Trichoderma sp ............................................................................................. 26
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................................. 30
3. ETIOLOGIA DA PODRIDÃO RADICULAR DA MANDIOCA NO ESTADO DE
ALAGOAS E EFEITO DE Trichoderma spp. SOBRE O DESENVOLVIMENTO DE
Fusarium falciforme................................................................................................................ 39
RESUMO ................................................................................................................................ 39
ABSTRACT ............................................................................................................................ 40
3.1. INTRODUÇÃO ............................................................................................................... 41
3.2. MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................................ 43
3.2.1. . LOCAL DE EXECUÇÃO. ........................................................................................ 43
3.2.2. COLETA DE SOLO E OBTENÇÃO DOS ISOLADOS .......................................... 43
3.2.3. TESTE DE PATOGENICIDADE E REISOLAMENTO ......................................... 44
3.2.4. AVALIAÇÃO DO POTENCIAL DE BIOCONTROLE DE ISOLADOS DE
Trichoderma spp SOBRE O DESENVOLVIMENTO DE Fusarium sp.............................45
3.2.5.CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DOS ISOLADOS.........................................46
3.2.5.1. Extração do DNA de Fusarium sp. e dos isolados de Trichoderma spp.................46

3.2.5.2. Amplificação do DNA e sequenciamento dos produtos de PCR.............................47
3.2.5.3. Sequenciamento e Análises filogenéticas..................................................48
3.3. RESULTADOS E DISCUSSÕES .................................................................................. 49
3.3.1. IDENTIFICAÇÃO DOS FITOPATOGENOS .......................................................... 49
3.3.2. IDENTIFICAÇÃO DOS BIOCONTROLADORES..................................................50
3.3.3- PATOGENICIDADE DOS ISOLADOS......................................................................52
3.3.4. AVALIAÇÃO DA AÇÃO DOS ISOLADOS DE Trichoderma sp. SOBRE O
CRESCIMENTO MICELIAL DE Fusarium sp....................................................................53
3.3.5. CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DOS ISOLADOS ISOLADOS...................59
3.3.5.1 Amplificação do DNA, purificação e sequenciamento dos produtos da
PCR.............................................................................................................................................59
CONCLUSÕES..........................................................................................................................65
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS....................................................................................66

4. EFEITO DE Trichoderma spp. SOBRE O DESENVOLVIMENTO DE
Fusarium falciforme e ATIVIDADE ENZIMÁTICA DE Trichoderma spp E
DE Fusarium falciforme...............................................................................

83

RESUMO ................................................................................................................................ 83
ABSTRATIC........................................................................................................................... 84
4.1. INTRODUÇÃO............................................................................................................

85

4.2. MATERIAL E MÉTODOS...............................................................................................87
4.2.1. . LOCAL DE EXECUÇÃO............................................................................................87
4.2.2. EFEITO DO EXTRATO DE Trichoderma spp. SOBRE O DESENVOLVIMENTO
DE Fusarium falciforme....................................................................................................

87

4.2.3. ATIVIDADE ENZIMÁTICA DE ISOLADOS DE Tichoderma spp. E EFEITO NO
DESENVOLVIMENTO DE Fusarium falciforme.................................................................89
4.2.3.1.

Teste

enzimático

para

AMILASE

(HANKING

e

ANAGNOSTAKIS,

1975)............................................................................................................................................89

4.2.3.2. Teste enzimático para CELULASE (HANKING e ANAGNOSTAKIS, 1975).......90
4.2.3.3. Teste enzimático para GELATINASE (HANKING e ANAGNOSTAKIS, 1975)..91
4.2.3.4. Teste enzimático para LIPASE (‘Hankin & Anagnostakis (1975)......................... 91
4.2.3.5. Teste enzimático para PROTEASE (Lacaz et al., 1991)...........................................92
4.2.3.6. Teste enzimático para QUITINASE ( Renwech et al., 1991) com modificação......92
4.2.4. DETERMINAÇÃO ENZIMÁTICA..............................................................................92
4.2.5 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL E ANALISE ESTATISTICA.......................92
4.3. RESULTADOS E DISCUSSÕES.....................................................................................93
4.3.1. EFEITO DO

EXTRATO

BRUTO

DE

Trichoderma spp.

SOBRE

O

DESENVOLVIMENTO DE Fusarium falciforme.................................................................93
4.3.2 EFEITO DO EXTRATO DE Trichoderma spp TRATADO TERMICAMENTE
SOBRE O DESENVOLVIMENTO DE Fusarium falciforme...............................................97
4.3.3. ATIVIDADE ENZIMÁTICA DOS ISOLADOS DE Trichoderma spp. E Fusarium
falciforme....................................................................................................................................99
CONCLUSÕES.......................................................................................................................112
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

............................................................................113

1.

INTRODUÇÃO
A mandioca (Manihot esculenta, Crantz) têm grande expressão econômica e social

no Brasil e no mundo pelo seu importante valor na alimentação humana, animal e na
industrialização, garantindo a sobrevivência de significativa parcela da população de baixa
renda, como fonte alimentícia e como geração de renda para a agricultura familiar
(NOTARO et al. 2013).
A mandioca e seus derivados é dos alimentos mais consumidos no mundo e ocupa a
sexta colocação de maior produção e expressão do planeta, estando atrás apenas das culturas
da soja, trigo, arroz, milho e batata (FAO, 2012). O Brasil é o quarto produtor mundial, com
uma safra estimada para 2016 de 25 milhões de toneladas (IBGE, 2015).
De grande versatilidade, a cultura é totalmente aproveitada, não só a parte aérea
(folhas e hastes) como também a raiz. As folhas têm seu aproveitamento na alimentação
humana (suplemento) e animal (triturada). As hastes, na alimentação animal, sob a forma de
silagens e fenos e ainda in natura. A raiz, na alimentação humana, animal e ainda pelas
indústrias, principalmente de farinha, de féculas, plásticos biodegradáveis, produtos têxteis e
de biocombustível (CONAB, 2013).
A cultura da mandioca enfrenta muitos desafios, entre os quais, destaca-se os
problemas fitossanitários (NASCIMENTO JÚNIOR, 2015). Diversas doenças já foram
relatadas na cultura, dentre elas, as podridões radiculares, cujos agentes podem ser
Lasiodiplodia sp., Fusarium sp., Neoscytalidium lignicola, Phytophthora drechsleri Tucker,
Pythium sp. e Rosellinia sp. Entretanto, registros sobre os principais fitopatógenos
envolvidos na podridão radicular nos estados produtores ainda são incipientes e são de suma
importância para servir como ferramenta na tomada de decisão sobre qual a melhor
estratégia de manejo a ser utilizada (MASSOLA JR; BEDENDO, 2005; MUNIZ et al.,
2006; FUKUDA; OTSUBO, 2015; NOTARO et al., 2013; SILVA, 2013).
Os

mais

importantes

agentes

causadores

da

podridão

radicular

são

os

microrganismos, P. drechsleri e F. solani, não somente pela abrangência geográfica, mas
principalmente pelas severas perdas na produção. Alguns estudos mostram que a ocorrência
de Fusarium é mais acentuada em plantios de mandioca em solos ácidos e adensados. Os
sintomas podem ocorrer em qualquer fase do desenvolvimento da planta e raramente causam
danos diretos nas raízes.

O ataque ocorre no ponto da haste junto ao solo, causando infecções e muitas vezes
obstruindo totalmente os tecidos vasculares, impedindo a livre circulação da seiva e,
conseqüentemente, provocando podridão indireta das raízes. Ao contrário de Phytophthora,
cujos o sintomas provocados nas raízes são coloração marrom e podridão mole que exsudam
um líquido com mau cheiro, as podridões de Fusarium sp são caracterizados por uma

podridão de consistência seca e sem o aparente distúrbio dos tecidos (MOURA; SILVA,
1997; POLTRONIERI et al, 2001; SILVA; TEIXEIRAS, 2012).

As medidas de controle da podridão radicular envolvem a integração do uso de
variedades tolerantes, associado a práticas culturais como rotação de culturas, manejo físico
e químico do solo, sistemas de cultivo e outras. Nascimento Júnior (2015), destaca que é de
fundamental importância o conhecimento das condições edafo-climáticas da região do
cultivo e o uso de técnicas apropriadas que possam ser adotadas pelo agricultor, para que
possam ter um retorno econômico dentro de um sistema agrícola sustentável.
O controle alternativo de fitopatógenos com antagonistas, principalmente com
espécies de Trichoderma, já vem sendo estudado, devido ao interesse mundial de utilizar
produtos menos agressivos ao ambiente (SOUSA et al., 2012; SILVA et al., 2014). Para
Robbs (1992) e Barbosa; Meza (2009) a competição por alimentos e a antibiose, são os
mecanismos mais frequentemente utilizados por algumas espécies de Trichoderma, sendo
por isso considerado um excelente agente de biocontrole.
Diante do exposto, o objetivo do presente trabalho foi identificar os principais
agentes causais da podridão radicular da mandioca de mesa var. Rosinha, no estado de
Alagoas e avaliar a capacidade de Trichoderma spp em controlar a podridão radicular,
causada

por

Fusarium

sp.

2. REVISAO DE LITERATURA
2.1. A CULTURA DA MANDIOCA
A mandioca, uma cultura de grande interesse para o Nordeste brasileiro,
notadamente para o Estado de Alagoas, é uma planta perene, arbustiva, pertencente à
família das Euforbiáceas, rica em fécula, utilizada na alimentação humana e animal ou
como matéria prima para diversas indústrias (FRAIRE FILHO; BAHIA, 2015).
Nascimento Júnior (2015), enfatiza as vantagens desta cultura, devido a sua rusticidade,
baixo custo, adaptação em relação ao clima e solo e suas características nutricionais que
estão relacionadas à grande acumulo de amido em suas raízes, bem como de proteínas e
aminoácidos nas folhas.
É uma planta originária das regiões tropicais da América do sul, mas que teve como
lugares da sua domesticação o Sudeste da Ásia, a África e a América Tropical (NOTARO
et. al., 2013; SILVA, 2013; FRAIRE FILHO; BAHIA, 2015).
Em 2013, foram produzidas 281.718.000 toneladas de mandioca em todo o mundo,
sendo o Brasil o quarto produtor mundial com 23.977.757 toneladas, ficando atrás da
Nigéria, maior produtor, Indonésia e Tailândia. As regiões Norte e Nordeste do Brasil
possuem os maiores volumes de produção e a maior área cultivada, sendo as regiões Sul,
Sudeste e Centro-Oeste, as de maiores rendimentos agrícolas. O Estado do Pará é o maior
produtor nacional de raiz de mandioca, seguido de Paraná, Maranhão e Bahia (IBGE,
2015).
No Estado de Alagoas, as regiões que se destacam como produtoras de mandioca
são o agreste, com 70% da produção total do estado (Arapiraca, São Sebastião e Campo
Alegre), a zona da mata e o litoral norte, sendo a primeira região, a que detém a maior
quantidade de produtores, responsável por 13,36 t.ha-¹ e produção de 240.448 toneladas,
ocupando a segunda colocação em produtividade se comparados aos outros estados do
nordeste (CONAB 2013).
Notaro (2012) enfatizaram que essa cultura ainda é de agricultura familiar e se
desenvolve de forma rudimentar, sendo que o principal meio de propagação é vegetativa e
ainda cultiva-se variedades de baixa qualidade genética. A sua utilidade esta associada ao
teor de ácido cianídrico (HCN) presente nas folhas e raízes, que a classifica como mansa
ou doce (<180mg kg-¹ de HCN), também conhecidas como macaxeira, utilizada para o
consumo in natura; intermediárias (180-300mg kg-¹) e amarga ou brava (>300mg kg-¹)

essas duas últimas são utilizadas para ração animal, produção de fécula, farinha e
biocombustível (OLIVEIRA et al., 2012).

A maior utilidade da mandioca está na indústria alimentícia, principalmente na
produção de fécula destinada para o mercado de amido modificado, que além de atender a
culinária regional em pães, tapiocas, beijus, bolinho de goma e pé-de-moleque; é um dos
produtos da mandioca que mais emprega mão-de-obra e agrega um elevado valor no
produto processado, segundo Nascimento Júnior (2015). Quanto à produção de
biocombustíveis, a mandioca vem se mostrando uma boa alternativa na fabricação de
etanol, pois apresentou um menor custo energético na produção de etanol comparado a
cana de açúcar e o milho, de acordo com Salla et. al., (2010).
Segundo Alves (2006), o ciclo da mandioca pode variar de 6 a 24 meses de cultivo,
mas comercialmente é 12 a 18 meses para o beneficiamento de farinha e fécula e entre 8 a
10 meses para as de mesa, Dentre as variedades plantadas em Alagoas, destaca-se a
Rosinha, cujo ciclo varia entre 9 a 10 meses em sequeiro, podendo ser antecipado para 7 a
8 meses em condições de sistema irrigado. Essa variedade pode atingir três metros de
altura, mantém o stand de plantas ao final do cultivo com boa produção de ramas e
produtividade em 21 t ha-¹ (DINIZ et al, 2009).
Nascimento Júnior (2015), relata em seu trabalho que mesmo com a rusticidade da
cultura é necessário está atento às condições adafo-climáticas, afirmando que a mandioca
produz bem em solos férteis, com pH entre 5,5 a 7,0 com classe textural arenosa ou média
e uma boa drenagem natural. A condição climática ideal está na faixa de temperatura entre
20°C e 27°C, podendo se estabelecer em ambientes com temperaturas entre 16°C e 38°C;
com precipitação entre 1000 a 1500 mm ano-¹, em regiões semi-áridas entre 500 e 700 mm
ano-¹; altitudes de 600 a 800 metros acima do nível do mar e período de luz de 12 horas
dia-¹ (SILVA; ANDRADE, 2011; SILVA, 2013).

2.2. DOENÇAS NA CULTURA DA MANDIOCA
Vários fatores podem limitar a produção da mandioca, tais como, a ocorrência de
insetos-praga e fitopatógenos causadores de doenças, prejudicando a qualidade e a
produção de mandioca no Brasil e no mundo. De acordo com Nascimento Júnior (2015), a
mandioca possui baixa resistência a doenças o que acarreta severas perdas econômicas na
produção.
Dentre as doenças de importância destacam-se as causadoras de manchas foliares
como mancha parda (Cercosporidium henningsii) mancha branca (Phaeoramularia

manihotis), queima das folhas (Cercospora vicosae), mancha preta (C. manihobaea) e
antracnose

(Colletotrichum

gloeosporioides

f.

sp.

manihotis)

que

limitam

os

fotoassimilados (SILVA; ANDRADE, 2011; MORAIS et al., 2013; OLIVEIRA et al.,
2013). E as podridões radiculares, causadas por fungos e oomicetos, tais como Diplodia
sp., Fusarium sp., Neoscytalidium sp., Rosellinia sp., Phytophthora sp. e Pythium sp.
(FUKUDA; OTSUBO, 2015; NOTARO et al., 2013; SILVA 2013; OLIVEIRA et al.,
2013).
Notaro et al., (2013) e Silva (2013) alertam que a podridão radicular da mandioca é
uma doença de alto impacto econômico e social, nos Estados do Maranhão, Pará, Alagoas
e Pernambuco, pois está provocando uma queda progressiva na produtividade, além de
inutilizar as áreas para plantio ao longo dos ciclos da cultura. Segundo Nascimento Júnior
(2015), as podridões são responsáveis por grandes perdas na produção de mandioca no
Nordeste, sendo o Omyceto Phytophthora sp e o fungo Fusarium sp., os patógenos que
limitam a cultura entre 30 e 70%. O autor afirma ainda que em condições favoráveis a
doença pode provocar 100% de perda.
A podridão causada por Fusarium sp. ocorre em plantas jovens e adultas, com
sintomas de murcha repentina e severo desfolhamento, que pode ser potencializado em
áreas de solo argiloso e mal drenados (SILVA; TEXEIRA, 2012). Fato este já relatado por
Gomes; Leal (2003), que ao trabalharem com mandioca nos Estados de Sergipe, Bahia e
Alagoas, afirmaram que a podridão das raízes é a doença mais limitante da cultura na
região Nordeste, principalmente quando é implantada em áreas formadas por solo
compactado.
Os sintomas da podridão radicular são bastante distintos em função do agente
causal. Os autores relatam que normalmente, Phytophthora sp. ataca a cultura na fase
adulta, causando podridão “mole” nas raízes, com odor muito forte, semelhantes ao de
matéria orgânica em decomposição; coloração acinzentada. O aparecimento de sintomas
visíveis é mais frequente em raízes maduras; entretanto, existem casos de manifestação de
sintomas na base das hastes jovens ou em plantas recém-germinadas, causando murcha e
morte total. Já no caso da podridão causada por Fusarium sp., o problema pode ser bem
mais acentuado, podendo apresentar sintomas em qualquer fase do desenvolvimento da
planta e raramente causam danos diretos na raiz. (GOMES; LEAL, 2003; SILVA;
TEXEIRA, 2012; NASCIMENTO JÚNIOR, 2015).

2.3. O PATÓGENO Fusarium sp.
O gênero Fusarium foi descrito em 1809, por Link. As espécies desse gênero
pertencem ao reino Fungi, filo Ascomycota, classes Eauscomycetes e Pyrenomycetes,
ordem Hypocreales, apresentando 65 espécies, 55 variedades e 22 formas, conforme
Wollenweber; Reinking (1935)1 citado por Ventura (1999). Trata-se de um dos mais
importantes fitopatógenos do mundo, com ampla distribuição geográfica, distribuídos no
solo e em associação com plantas. Tendo espécies cosmopolitas e outras com ocorrência
restrita a determinados ambientes (VENTURA, 1999).

A maioria das espécies são

sapróbios, mas algumas espécies produzem micotoxinas que podem afetar a saúde humana
e animal (URBEN et al. 2009). Seifert, 2006; Querales (2010) relatam que o gênero
Fusarium é um grupo complexo crescente em número de espécies e geram controvérsia
taxonômicas para fitopatologistas.
Milanesi, (2009), comenta que o Fusarium sp. pode ocorrer especialmente em locais
de climas tropicais e subtropicais, e tem uma grande capacidade de sobreviver por longos
períodos no solo fora de seus hospedeiros, através da formação de estruturas de resistências
chamadas clamidósporos.
Três grupos dentro do gênero são os exemplos mais específicos dessas mudanças,
nomeados como o complexo Gibberella fujikuroi (Sawada) Wollenw (com o nome
genérico referindo-se aos teleomorfo), o complexo Fusarium solani (Mart.) Sacc. e o
complexo F. graminearum. O gênero é caracterizado pelo seu crescimento rápido, colônias
com coloração pálida ou colorida (violeta à púrpura escuro ao laranja), com micélio aéreo e
difuso (MARTINS, 2005).
____________________
1

WOLLENWEBER, H. W.; REINKING, O. A.. Die fusarien: ihre beschreibung,

schadwirkung und bekämpfung. Berlin: P. Parey, 1935.

Puhalla (1981); Martins (2005); Agrios (2005), relatam que a identificação de
espécies de Fusarium sp. era baseada na morfologia dos macro e microconídios,
conidióforos, clamidosporos e na disposição dos conídios no conidióforo. Os
microconídios são unicelulares e uninucleados; os macroconídios mais comuns são
multicelulares, mas cada célula tem somente um núcleo. Todos os núcleos de um

macroconídio, contudo, são descendentes mitóticos de um mesmo núcleo progenitor e
são, portanto geneticamente idênticos. Os estágios sexuais de Fusarium são ascomicetos;
o esporo sexual é o ascósporo. Os que alocados no gênero Nectria têm ascósporos
bicelulares. Cada célula do ascósporo bicelular é uninucleada e ambos núcleos são
geneticamente idênticos. Outros, como é o caso em Gibberella, formam ascósporos
multicelulares.
Outro fato que é mencionado por Martins (2005), é que as características
morfológicas sofrerem influência do ambiente e também nutricionais. Especialistas no
gênero utilizam meios de cultura e condições padronizadas para identificação. Devido à
esta plasticidade e variações de características fenotípicas encontradas neste fungo, a
taxonomia baseada somente em conceitos morfológicos não é confiável.(Martins, 2005;
Urbens et al., 2009; Querales, 2010).
A identificação da espécie de Fusarium é um dos primeiros passos para seu estudo.
Tradicionalmente tem sido realizado com base na morfologia, desde a publicação do
tratado do gênero “Die Fusarien”, em 1935 por Wollenweber; Reinking 1. Outros
sistemas foram propostos, mas não resolveram o problema da identificação das espécies.
As ferramentas para a identificação foram incrementadas e incluem a utilização de
microscopia ótica e eletrônica, meios seletivos e diferenciais, comparações enzimáticas,
metabólitos secundários, bem como, o uso de tecnologias imunológicas e moleculares
(LEAL- BERTIOLI, 1998; MARTINS 2005).
O`Donnell et al., (2000); Summerell et al., (2003); Ottoni, (2008); comentam que
com o advento das ferramentas moleculares a identificação de Fusarium passa a envolver
três conceitos de espécie: o da espécie morfológica, baseada na similaridade dos
caracteres morfológicos observáveis, denominados de marcadores morfológicos; o da
espécie biológica, baseado na compatibilidade sexual entre membros da mesma espécie; e
o conceito de espécie filogenética, baseado na análise de seqüências gênicas. Querales
(2010) menciona em seu trabalho que a adoção destes modelos de classificação afeta a
taxonomia do gênero já que por décadas foi baseada simplesmente em caracteres
morfológicos e também cria controvérsias, pois muitos fitopatologistas acreditam que tais
modelos só acrescentam dificuldades para uma identificação prática na diagnose de
agentes causais de doenças em plantas e que, portanto, tais modelos estão mais adaptados
para os estudos realizados por micologistas. Não obstante, estas mudanças são

pertinentes, dado que dentro deste gênero existem espécies muito próximas, fato que
pode levar a uma diagnose errada com importantes conseqüências práticas.
De acordo com Notaro et al. (2013), Fusarium solani Math (Sacc) é a espécie que
prevalente causa podridão radicular na mandioca cv. branquinha no Estado de
Pernambuco. Esta espécie produz, em meio de cultura, micélio aéreo, com coloração que
varia do branco ao creme, tornando-se marrom-azulado quando esporodóquios estão
presentes. Produz três tipos de esporos assexuados: os macroconídios em forma de foice,
medindo cerca de 15-35 x 4-7 µm com 3-5 septos; os microconídios, que possuem ou não
septo, medem cerca de 5-10 x 1-3 µm e os clamidósporos, que são hialinos, globosos,
lisos a áspero, medindo de 6-10 µm.
O estado sexual do fungo é Nectria haematococca (Ascomycete). Este fungo
sobrevive em restos culturais, solo, tubérculos e sementes infectadas, podendo persistir
no solo durante vários anos. As condições ideais para o seu estabelecimento são
temperatura de 15 a 25 °C, umidade de 50 a 75%, ocorrência de ferimentos, plantios em
solos contaminados e armazenamento inadequado. Ferimentos no sistema radicular,
principalmente os ocasionados por nematoides, facilitam a penetração do fungo nas raízes
dos hospedeiros.

2.4. CONTROLE DA DOENÇA
Por ser um patógeno veiculado pelo solo, sua eliminação, após a instalação na área
de plantio se torna uma tarefa muito difícil e medidas de controle químico praticamente
inexistem, exceto aquelas preventivas, como o uso de tratamento de sementes ou outros
materiais de propagação (LAZAROTTO et al., 2012). O Controle cultural, baseado na
prevenção de ferimentos durante a colheita e o armazenamento, o uso de sementes sadias
e substrato livre do patógeno, utilizado uma única vez, a aplicação equilibrada dos
nutrientes, o controle da irrigação, bem como a utilização de variedades resistentes e o
tratamento com fungicida das estacas sementes (maniva) e do substrato utilizado para o
semeio quando infectado, podem minimizar as perdas de produção.
Como medida de controle o que mais se mostrou eficiente baseado nas pesquisas
realizadas pela Embrapa Mandioca e Fruticultura e Empresa de Desenvolvimento
Agropecuária (EMAGRO), foi o uso de variedade tolerante, associado à rotação de
culturas e sistemas de plantio, que reduziram a podridão em cerca de 80%. As variedades

consideradas tolerantes até então conhecidas são: Osso Duro, Cedinha, Bibiana, clone
148/02, Aramaris e Kiriris, para o Nordeste. (GOMES; LEAL, 2003; BETTIOL, 2009;
LOBO JÚNIOR et al., 2009; LAZAROTTO et al., 2012)
Para o controle de Fusarium sp., o produto químico difenolconazol e thiram, no
tratamento de solo e, no tratamento de sementes, são os mais recomendados pela
eficiência apresentada. No entanto, o controle químico se tornou constante e com o uso
indiscriminado advieram problemas ecológicos, pois estes provocam alterações no
ambiente como: seleção de patógenos resistentes, ocorrência de surtos de doenças
consideradas como secundárias, diminuição de microrganismos benéficos, além de causar
efeitos deletérios (nocivos) ao homem, aos animais e ao ambiente, através do acúmulo de
resíduos no solo, na água e nos alimentos (BIZI, 2015).
De uma maneira geral, os custos elevados da prática do controle químico,
associado ao surgimento de resistência aos produtos comumente empregados, bem como
a proibição do uso de outros, como o brometo de metila, torna essencial o
desenvolvimento de técnicas alternativas de controle (BETTIOL, 2009; LOBO JÚNIOR
et al., 2009; LAZAROTTO et al., 2012). No chamado controle alternativo inserem-se o
controle biológico, a indução de resistência em plantas (MORAES, 1992) e o uso de
extratos naturais com propriedades antimicrobianas e ou indutoras de resistência
(STANGARLIN et al., 2008).

2.5. BIOCONTROLE DE FITOPATÓGENOS
A tentativa de reduzir a atividade deletéria de um patógeno ou do inoculo tem sido
uma constante na agricultura, e a substituição de agroquímicos por produtos naturais com
atividade de supressão ou de controle tem sido uma das alternativas viáveis, pois o
resíduo deixado é mais rapidamente assimilado e decomposto pelo ambiente devido a sua
baixa persistência (SOUZA, 2013; BIZI, 2015).
Ethur, (2006) e Dianese, (2007); relatam a importância das pesquisas na área de
controle biológico, tais como a introdução de organismos antagônicos em ambientes em
que o patógeno esteja causando danos como forma de otimizar controle. Cancela (2015),
afirma que a dinâmica da ação do controle biológico ocorre de forma natural e consiste na
regulação do número de plantas e animais por inimigos naturais. O controle biológico é o
componente fundamental do equilíbrio da natureza e como o controle químico apresenta

vantagens e desvantagens. Entre as vantagens está o fato de ser uma medida atóxica, não
provocar desequilíbrio, não possuir contraindicações, propiciar um controle mais extenso
e é eficiente quando não existe maneira de se utilizar o controle químico. Em
compensação requer mais tecnologia, possui um efeito mais lento, não é de tão fácil
aquisição e nem sempre pode ser aplicado em qualquer época do ano.
Manter o equilíbrio no Agroecossitema é uma pratica do controle biológico de
modo que o hospedeiro, na presença do patógeno, não sofra danos significativos, em
função da ação controladora dos organismos não patogênicos do sistema. Os autores
relatam ainda que doença é mais que uma íntima interação do patógeno com o
hospedeiro, influenciada pelo ambiente e sim o resultado de uma interação entre
hospedeiro, patógeno e uma variedade de não-patógenos que também repousam no sítio
de infecção e que apresentam potencial para limitar ou aumentar a atividade do patógeno,
ou a resistência do hospedeiro. Portanto, patógeno, hospedeiro e antagonistas, interagindo
num sistema biológico, são os fatores e componentes do controle biológico (BIZI, 2015;
CANCELA (2015).
Um fator limitante para o uso de produtos biológico é a disponibilidade no
mercado para esta modalidade de controle. Outro problema é o fato de que a grande
maioria dos produtos naturais não estão devidamente registrados para uso em escala
comercial (SILVA et al., 2008).
A presença do fitopatógeno interfere na homeostase da planta, mas também podem
atuar acionando mecanismos de defesa da planta e/ou ativando genes que conferem
resistência da planta hospedeira (AGRIOS, 2005). Michereff et al., (1993), afirmam que
o patógeno possui atividades determinantes que envolvem crescimento, infectividade,
agressividade, virulência e outras atribuições do patógeno ou processos, que determinam
a infecção, desenvolvimento dos sintomas e reprodução. A interação entre antagonista,
hospedeiro e patógeno não ocorre de maneira particular, mas mutuamente.
Diversos autores relatam as interações e sua interferência na vida do fitopatógeno por
mecanismos de ação como competição por espaço e nutrientes a antibiose,
micoparasitismo ou hiperparasitismo, predação, indução de resistência, aumentando
assim vantagem competitiva no ambiente. Estes mecanismos variam de espécie para
espécie e, também, de linhagem para linhagem dentro da mesma espécie, de acordo com
a interação hospedeiro-parasita. (CARVALHO, 2006; BETTIOL; MORANDI, 2009;

BRITO et al., 2010; ZUCCHI, 2010; DIAS, 2011; MACHADO et al., 2012; BIZI, 2015;
CANCELA, 2015; FIPKE, et al., 2015).
Dentre os fungos que apresentam elevado potencial para serem utilizados como
agentes de biocontrole, o gênero Trichoderma Pers. é um dos mais pesquisados e
estudados (MENEZES et al., 2010). As espécies mais conhecidas de Trichoderma são: T.
hamatum (Bonord.) Bainier, T. viride Pers, T. aureoviride Rifai, T. harzianum Rifai, T.
koningii Oudem, T. pseudokoningii Rifai e T. longibrachiatum Rifai (BETTIOL; GHINI,
2005 ).
Ezziyyani et al., (2007) relatam que a freqüência de Trichoderma spp., é muito
importante por ser um biocontrole de fitopatógenos como Phytophthora, Fusarium e
Neoscytalidium. Remuska & Pria (2007) avaliando a efeito antagônico de Trichoderma
spp., no controle do crescimento micelial de fungos fitopatogênicos observou que este
exerceu efeito antagonista sobre alguns fitopatógenos radiculares, tais como Sclerotium
rolfsii, Pythium aphanidermatum e Fusarium solani, sendo este último gênero descrito
como um dos principais fitopatógenos associados à podridão radicular da mandioca no
estado de Pernambuco.
Hoffmann et. al., (2015) relatam que tiveram 80% de controle de Fusarium sp
utilizando isolados de Trichoderma spp.

Da Silva et. al., (2011); Pereira (2013)

comprovam em seus trabalhos um grande potencial de inibição de crescimento micelial
de F. solani por espécies de Trichoderma spp. Souza et. al., (2015) também relatam que
Fusarium sp., e Bipolaris sp., tiveram seu crescimento fortemente inibido pelos isolados
de Trichoderma spp. Outros trabalhos realizados por Bomfim et al., (2010); Dias (2011);
Lazarotto et al., (2012); Santos et al., (2012); Marques et al., (2014), obtiveram
resultados promissores apresentando de bom a ótimo desempenho, no que diz respeito a
inibição do crescimento micelial de fitopatógenos por eles testados.

2.6. O FUNGO Trichoderma sp

O gênero Trichoderma, esta classificado como pertencente ao Reino Fungi, filo
Ascomycota, classes Eauscomycetes e Pyrenomycetes, ordem Hypocreales, família
Hypocreaceae, gênero Hypocrea (teleomorfo). Este fungo apresenta grande potencial
antagônico e frequentemente é associado a solos supressivos a fitopatógenos (MELO,

1991). De acordo com Harman et al. (2004); Harman (2005), seu uso pode oferecer
outras vantagens: decomposição de matéria orgânica, competição com uma microflora
deletéria através da colonização da rizosfera, produção de antibiose e indução de
resistência
Espécies de Trichoderma já foram documentadas para o controle de vários
patógenos, tais como Rhizoctonia solani Kühn, Sclerotium rolfsii Sacc., Sclerotina
sclerotiorum (Lib.) de Bary, Fusarium spp. e Pythium spp. (MELO; AZEVEDO 1998).
Diferentes espécies de Trichoderma, incluindo T. harzianum Hifai, apresentaram uma
elevada taxa de parasitismos e atividade antagônica para os fitopatógenos, tais como S.
rolfsii, S. minor e S. sclerotiorum, R. solani e Pyricularia grisea Sacc. (ROLLAN et
al.,1999; RONDÓN et al., 2007).
De acordo com Dos Santos (2010), o isolado de T. harzianum apresentaram
antagonismo in vitro sobre o fungo S. rolfsii; sendo capaz de hiperparasitar as hifas do
patógeno e competir por espaço e nutriente. Silva et al (2013), trabalhando com isolados
de Trichodema spp como agente de controle biológico de S. lignicola, observaram que
inicialmente o isolado de Neoscytalidium sp mostrou-se bastante competitivo ao ser
confrontado com Trichoderma spp, porém ao se encontrarem na placa de Petri, o
Trichoderma spp sobrepôs a colônia do patógeno. O material observado da região
sobreposta pelo antagonista indicou que ali houve uma ação enzimática degradativa da
hifa do patógeno, visto que se destinguia com precisão apenas esporos e hifas do
antagonista.
Para Robbs (1992) e Barbosa; Meza (2009) a competição por alimentos e a
antibiose, são os mecanismos mais frequentemente utilizados por agentes de biocontrole,
uma vez que os organismos mais eficientes em usar os recursos disponíveis se
multiplicam e colonizam rapidamente a rizosfera, garantindo a sua sobrevivência. De
acordo com Ethur (2006), a competição é uma das principais características de isolados
de Trichoderma sp., usados como agentes de biocontrole e que a sua velocidade de
crescimento, busca por alimento e espaço são as características que o promoveram a
condição de um excelente agente de biocontrole.
A secreção de substâncias orgânicas antibióticas (antibiose), produzidas por
microrganismos, que mesmo em baixa concentração interfiram nas atividades
metabólicas, na redução ou paralisação do crescimento e esporulação, redução na

germinação de esporos, além de distorções na hifa e endólise, quer seja especifica, quer
seja de amplo aspecto de ação, são importantes artifícios para eficiência de organismos
antagonistas (LOBO JUNIOR; ABREU, 2000; BOMFIM, 2007; SOUZA, 2013).
Segundo Claydon et al., (1987), antibióticos são produtos do metabolismo secundário de
seus produtores, e podem ser mais importantes na inibição de outros organismos do que a
competição por nutrientes.
A antibiose também foi relatada por diversos pesquisadores como um dos
mecanismos de ação de espécies de Trichoderma (BETTIOL, 1991; DIAS, 2011;
CARVALHO FILHO, 2013). A gliotoxina, viridina e trichodermina, são algumas das
substâncias produzidas por espécies de Trichoderma capazes de inibir o desenvolvimento
de outros fungos (Amorim et al. 2011). Ethur (2006) relatou que a gliotoxina foi
responsável pela inibição da germinação de esporângios e do crescimento micelial de
Pythium ultimum.
Segundo Bomfim et al., (2010) e Souza (2013), o biocontrolador será bem
sucedido se for capaz de degradar a parede celular (composta por carboidratos, tais como
quitina), além de proteínas e lipídios em quantidades significativas do fitopatógeno ou
interromper os processos relacionados a sua síntese. Portanto, a produção de enzimas que
hidrolisem os componentes da parede celular dos fitopatógenos, particularmente
quitinases e glucanases, é uma característica comum em muitos agentes de biocontrole.
Algumas espécies de Trichoderma são conhecidas pela sua alta capacidade em produzir
enzimas que degradam celulose e quitina (MELO, 1991; HARMAN et al., 2004).
O micoparasitismo, situação em que o microrganismo antagonista vive sobre ou
dentro do fungo antagonizado, alimentando-se e desenvolvendo-se às expensas deste, é
outro mecanismo de ação que um bom agente de controle biológico deve possuir. O
micoparasitismo envolve antibiose e canibalismo provocados pela ação de enzimas
hidrolíticas, como quitinases, glucanases, proteases e lipases, que provocam a morte de
um deles que, assim, servem de alimento para o sobrevivente (LOBO JUNIOR; ABREU,
2000; HARMAN, 2000; BOMFIM, 2007; BARRA et. al., 2008; ZUCCHI, 2010).
Quitinases e β-1,3-glucanases estão diretamente envolvidas nas interações de
micoparasitismo entre espécies de Trichoderma e seus hospedeiros, devido a maioria dos
fungos fitopatogênicos possuírem em sua parede celular quitina, organizada em camadas
regularmente ordenadas e β-1,3-glucanas arranjadas como um enchimento de maneira

amorfa. A quitinase age de forma aleatória e degradam a parede celular de fungos,
liberando oligômeros que induzem as exoquitinases, começando assim o ataque
micoparasítico, hidrolisando os oligossacarideos da parede celular do fitopatógeno.
(MARCELLO, 2008; GIESE et. al, 2003; BAUERMEISTER et. al, 2010).
Melo (1996) relata que a atividade micoparasitica necrotrófica tem grande
eficiência em inúmeros fungos fitopatogênicos, principalmente aqueles com estruturas de
resistência consideradas difíceis de serem atacadas por microrganismos, como esporos,
escleródios, clamidósporos e microescleródios. Melo; Azevedo (1998) afirma que
Trichoderma sp possui característica micoparasita, pois pode detectar e localizar hifas de
fungos suscetíveis, crescendo em sua direção presumivelmente em resposta a estímulos
químicos, produzidos pela hifa hospedeira, formando estruturas semelhantes a apressórios
e enrolando-se em toda a sua extensão para, então, penetrar e digerir a hifa.
O gênero Trichoderma é considerado um bom agente de controle microbiano, pois
apresenta além habilidades descritas acima, características essenciais, como ausência de
impacto negativo ao meio ambiente, presença de estruturas de reprodução de fácil
propagação, principalmente em substratos naturais (Spiegel; Chet, 1998), capacidade de
sobreviver em ambientes desfavoráveis, além de conter populações de patógenos em
condições de solo diferentes (VINALE et al., 2008).

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
AGRIOS, G.N. Plant pathology. Amsterdam : Elsevier Academic Press. 5.ed, 2005.
922p.
ALVES, A., A., C.. Fisiologia da mandioca. In: Aspectos socioeconômicos e agronômicos
da mandioca. EMBRAPA Mandioca e Fruticultura Tropical, Cruz das Almas, 2006., 817p.

AMORIM, L.; REZENDE, J. A. M.; BERGAMIN FILHO, A. Manual de
Fitopatologia. Piracicaba: Agronômica Ceres. v. 1,4. Ed, p. 383 -387, 2011.
BARBOSA, R.J.F.; MEZA, C.L.S. Antagonismo in vitro de Trichoderma harzianum
rifai sobre Fusarium oxysporum schlecht f. sp passiflorae en maracuyá (Passiflora
edulis sims var. flavicarpa) del municipio zona bananera colombiana. Rev. Fac. Nal. Agr.
Medellín, v.62, n.1, p.4743-4748, 2009.
BARRA, V. R.; ROMEIRO, R.S.; FERRAZ, H.G.M.; MACAGNAN, D.; SILVA, H. S.
A.; MOURA, A. B.; HALFELD-VIEIRA, B. A; MENDONÇA, H. L.; VIEIRA JÚNIOR,
J. R. Potencialidade antagonística em alguns procariotas agentes de biocontrole de
enfermidades de plantas. Summa Phytopathologica, v.34, n.2, p.121-126, 2008.
BAUERMEISTER, A.; REZENDE, M. I.; GIESE, E. C.; DEKKER, R. F. H.;
BARBOSA, A. M. 1,3-Glucanases Fúngicas: produção e aplicações biotecnológicas.
LONDRINA SP. Semina: Ciências Exatas e Tecnológicas, , v. 31, n. 2, p. 75-86, jul./dez.
2010.
BETTIOL, W. Controle biologico de doencas do filoplano. In: BETTIOL, W., org.
Controle biologico de doencas de plantas. Jaguariuna: EMBRAPA-CNPDA, 1991.
p.33-52 (EMBRAPA-CNPDA. Documentos, 15).
BETTIOL, W.: MORANDI, M.A.B. Controle Biológico de Doenças de Plantas no
Brasil. In: BETTIOL, W.: MORANDI, M.A.B. (Org). Biocontrole de Doenças de
Plantas: uso e perspectivas. Jaguariúna – SP: Embrapa Meio Ambiente, p. 7-14, 2009.

BETTIOL, W.; GHINI, R. Solos Supressivos. In: MICHEREFF,S. J.; ANDRADE, D. E.
G. T.; MENEZES, M. (Eds.) Ecologia e Manejo de patógenos radiculares em solos
tropicais. Recife:UFRPE, Imprensa Universitária, 2005. cap.6, p. 125-143.
BIZI, R. M., Utilização de fungos no Controle Biológico de Doenças. <
http://www.floresta.ufpr.br/alias/lpf/public_html/contbio03.html.>
Acesso
em
16/11/2015.
BOMFIM, M. P., Antagonismo in vitro e in vivo de Trichoderma spp. a Rhizopus
stolonifer em maracujazeiro amarelo. Vitória da Conquista BA, 2007. 74f.:
Dissertação de Mestrado. Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia. 2007
BOMFIM, M. P., SÃO JOSÉ, A. R., REBOUÇAS, T. N. H., ALMEIDA, S. S. D.,
SOUZA, I. V. B., & DIAS, N. O . Avaliação antagônica in vitro e in vivo de
Trichoderma spp. a Rhizopusstolonifer em maracujazeiro amarelo. Summa
Phytopathologyca, v.36, n.1, p. 61-67, 2010.
BRITO, F. S.; MILLER, P. R. M., STADNIK, M. Presença de Trichoderma spp em
composto e suas características para o controle de fitopatógenos. Rev. Bras. de
Agroecologia, Porto Alegre , p. 43-53. 2010.
CANCELA, K. C., Controle Biológico Florestal Conceitos, Terminologia, Descrição
e
Caracterização
de
Agente.
Proteção
florestal
Disponível
em
<http://www.floresta.ufpr.br/alias/lpf/public_html/contbio01.html>
Acesso
em
16/11/2015.
CARVALHO FILHO, M. R., Relações filogenéticas, identificação e potencial de uso
de isolados de Trichoderma no controle do mofo branco e como promotores de
crescimento do feijoeiro. Brasília-DF, 2013. 123f. Tese de Doutorado. Programa de
Pós-graduação em Fitopatologia, Universidade de Brasília. Brasília. 2013.
CARVALHO, A. C., Bioprospecção de isolados de Trichoderma stromaticum para o
controle biológico da Vassoura-de-Bruxa do Cacaueiro. 2006. 82f. Dissertação de
Mestrado. Universidade Estadual de Santa Cruz. 2006.
CLAYDON, N.; ALLAN, M.; ITANSON, J.R.; AVENT, A. G. Antifungal alkyl
pyrones of Trichoderma harzianum. Transactions of the British Mycological Society,
v.88, p.503-513, 1987.COMPANHIA NACIONAL DE ABASTECIMENTO.
Perspectivas para a agropecuária. Conab, Brasília , v.1, 2013., 154p.
DA SILVA, D. C. V., TIAGO, P. V., & DE SOUZA-MOTTA, C. M. . Isolamento e
seleção de fungos filamentosos do solo de sistemas agroflorestais do Município de

Bom Jardim (PE) com base na capacidade de produção de enzimas hidrolíticas1.
Revista Brasil. Bot, 34(4), 607-610. 2011
DIANESE, A. de C. Variabilidade e controle de Phytophthora palmivora (Podridãodo-pé) e controle da varíola (Aperisporium caricae) do mamoeiro (Carica papaya).
2007. 109f. Tese Doutorado – Universidade de Brasília, Brasília. 2007

DIAS, P. P., Controle biológico de fitopatógenos de solo por meio de isolados de
fungos do gênero Trichoderma e sua contribuição no crescimento de plantas. 2011.
101 f. Tese Doutorado. Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro. Seropédica - Rio
de Janeiro. 2011
DINIZ, M. de S.. Efeito da manipueira na adubação da mandioca. Revista Raízes e
Amidos Tropicais, v. 5, 2009.
DOS SANTOS, J. et al. Atividade hiperparasíticade Trichoderma spp. sobre
escleródios de Sclerotinia sclerotiorum em solo. In: SEMINÁRIO DE INICIAÇÃO
CIENTÍFICA E
TECNOLÓGICA,7,2010.Anais...EPAMIG,2010.Online.Disponívelem:http://www.epam
ig.br/index.php?option=com_docman&task=cat_view&gid=121&dir=DESC&order=date
&limit=10&limitstart=10.Acesso em Dezembro 2015
ETHUR, L.Z. Dinâmica populacional e ação de Trichoderma no controle de
fusariose em mudas de tomateiro e pepino. 2006. 154p. Tese (Doutorado em
Fitopatologia) - Universidade Federal de Santa Maria, Santa Maria-RS. 2006.
EZZIYYANI, M.; REQUENA, M. E.; EGEA-GILABERT, C.; CANDELA, M. E.
Biological Control of Phytophthora Root Rot of Pepper Using Trichoderma harzianum
and Streptomyces rochei in Combination. Journal of Phytopathology , [S.I], v.155, n.6, p.
342-349, 2007
FAO.
Faostatidtics
Database.
Disponivel
<https://www.fao.org.br/FAO_Brf2mpu3a.asp> Acesso em Dezembro de 2015.

em

FIPKE, G. M; PAZINI, J.B.; ETHU,L. Z. Antagonismo de isolados de Trichoderma
spp. ao Sclerotinia sclerotiorum em diferentes temperaturas. Magistra, Cruz das
Almas BA, V. 27, N.1, p. 23 – 32, Jan./Mar. 2015
FUKUDA C.; OTSUBO A.A. Cultivo da mandioca na região centro sul do Brasil.
Embrapa
Mandioca
e
Fruticultura.

HTTP://sistemasdeproducao.cnptia.embrapa.br/FontesHTML/Mandioca/mandioca_centr
osul/doenc s.htm . Acessado em 16 de julho de 2015.
FRAIFE FILHO G. A., BAHIA J. J. S., Mandioca. Ceplac-Cepec-BA.
http://www.ceplac.gov.br/radar/mandioca.htm . Acessado Dezembro de 2015.
GIESE, E. C.; BARBOSA, A. M.; SILVA M.L.C. Glucanases Fúngica: Produção e
aplicações das -1,3 e -1,6 glucanases. Revista Biotecnologia Ciência e
Desenvolvimento, Brasília-DF, nº 30 , P.97-104.. jan/jun 2003.
GOMES, J. C.; LEAL, E. C., Cultivo da Mandioca para a Região dos Tabuleiros
Costeiros. In.: Podridão Radicular. Embrapa Mandioca e Fruticultura. Sistemas de
Produção,
11.
ISSN
1678-8796
Versão
eletrônica/Jan/2003.
https://sistemasdeproducao.cnptia.embrapa.br/FontesHTML/Mandioca/mandioca_tabcost
eiros/doencas.htm . Acesso 13/12/2015.
HOFFMANN, C. A. et al.. Potencial de antagonismo de isolados de Trichoderma sp.
contra o isolados de Fusarium sp., in vitro. Revista Verde de Agroecologia e
Desenvolvimento Sustentável, v. 10, n. 1, p. 236-242, 2015.
HARMAN, G. E. The Nature and Application of Biocontrol Microbes II:
Trichoderma spp. Overview of Mechanisms and Uses of Trichoderma spp.
Phytopathology, St Paul, v. 96, p. 190-194. 2005
HARMAN, G. E. Myth and dogmas of biocontrol changes in perceptions derived
from research on Trichoderma harzianum T-22. Plant Disease, St. Paul, v. 84, p.377393, 2000.
HARMAN, G.E. HOWELL, C. R., VITERBO, A., CHET, I., & LORITO, M.
Trichoderma species-opportunistic, avirulent plant symbionts. Nature Reviews
Microbiology. V.2, p. 43-56. 2004.
IBGE - Instituto Brasileiro de Geografia e estatística. PAS - Pesquisa Anual de
Serviços, 2015.
[online] Disponível
na internet
via WWW URL:
http://www.ibge.gov.br/home/. Arquivo consultado Dezembro de 2015.
LAZAROTTO, M.; BOVOLINI, M. P.; MACIEL, C. G.; MUNIZ, M. F. B. Seleção in
vitro de Isolados de Trichoderma spp. com Potencial de Antagonismo a Isolados
Patogênicos de Fusarium spp. In: XVI Simpósio De Ensino, Pesquisa E Extensão,
Unifra, v. 3, 2012.
LEAL- BERTIOLI, S. C. DE M. O enfoque molecular na sistemática de fungos.
Revisão Anual de Patologia de Plantas. V.6. p. 197-230, 1998

LOBO JÚNIOR, M. e ABREU, M.S. Inibição do crescimento micelial de Sclerotinia
sclerotiorum por metabólitos voláteis produzidos por alguns antagonistas em
diferentes temperaturas e pH’s. Ciência Agrotécnica, Lavras, v.24, p.521-526, 2000.
LOBO JUNIOR, M.; BRANDÃO, R. S.; CORRÊA, C. A.; GÖRGEN, C. A.; CIVARDI,
E. A.; OLIVEIRA, P. de. Uso de braquiárias para o manejo de doenças causadas por
patógenos habitantes do solo.Santo Antônio de Goiás: Embrapa Arroz e Feijão,
2009. 8 p. (Embrapa Arroz e Feijão. Comunicado técnico, 183).
MACHADO, D. F. M.; PARZIANELLO, F. R.; SILVA, A. C.F. e ANTONIOLLI, Z. I.
Trichoderma no Brasil: o fungo e o bioagente. Revista de Ciências Agrárias, v.35, n.1,
p. 274-288, 2012.
MARCELLO, C. M. Avaliação da expressão e caracterização de uma exo-b-1,3glucanase envolvida no mecanismo de micoparasitismo de Trichoderma asperellum.
Brasília-DF, 2008. 89f. Tese de Doutorado. Laboratório de Enzimologia Departamento
de Biologia Celular do Instituto de Biologia da Universidade de Brasília – UnB. Brasília
– DF. 2008.
MARQUES, H. I. P.; SILVA, M. B.; MARQUES, M. D. P.; RODRIGUES, R. C.;
RIBEIRO, P. R. C. C. Inibição do crescimento micelial de Trichoderma harzianum
por fertilizantes líquidos. Enciclopédia Biosfera, v. 10, n. 18, p. 2040, 2014.
MARTINS, M. K.. Variabilidade genética de isolados de Fusarium spp. e estudo da
interação com a planta hospedeira. 2005. 110f. Diss. Tese (Doutorado em
Agronomia)-Escola Superior de Agricultura" Luiz de Queiroz", Universidade de São
Paulo, SP.[Links], 2005
MASSOLA JR, N.S.; BEDENDO, I. P.. Doenças da mandioca. In: KIMATI, H. et al.
Manual de fitopatologia: Doenças das plantas cultivadas;. 4ª Ed.vol. 2, p. 340-341 – São
Paulo: Agronômica Ceres, 2005
MELO, I. S. Potencialidades da utilização de Trichoderma spp. no controle biológico
de doenças de plantas. In: BETTIOL, W. (Ed.). Controle biológico de doenças de
plantas. Jaguariúna: CNPDA/EMBRAPA, 1991. p. 135-156.
MELO, I. S.; AZEVEDO, J. L. Ecologia Microbiana. Jaguariúna: Embrapa DNPMA, p.
393-419, 1998.
MELO, I.S. Trichoderma e Gliocladium como bioprotetores de plantas. Revis. Anu.
Patol. Plantas v. 4, p. 261-295. 1996.

MENEZES, J. P., LUPATINI, M., ANTONIOLLI, Z. I., BLUME, E., JUNGES, E., &
MANZONI, C. G. Variabilidade genética na região its do rDNA de isolados de
trichoderma spp.(Biocontrolador) e Fusarium oxysporum f. sp. Chrysanthemi. Ciência e
Agrotecnologia, 34(1), 132-139.2010
MICHEREFF, S.J.; MENEZES, M.; MARIANO, R.L.R. Potencial de Trichoderma
para o controle da antracnose do sorgo. Fitopatologia Brasileira, Brasília, v. 18, p.
392-398, 1993.
MILANESI, P.M. Caracterização, toxicidade e patogenicidade de Fusarium spp. em
genótipos de soja em sistema plantio direto. 2009. 91 p. Dissertação (Mestrado em
Agronomia) - Universidade Federal de Santa Maria, Santa Maria, 2009.
MORAES, W. B. C. Controle alternativo de fitopatógenos. Pesquisa Agropecuária
Brasileira, v. 27, n. 13, p. 175-190, 1992.
MORAIS, M. dos S.; NASCIMENTO, L. C do; MOREIRA, K. A.; SILVA, M. da;
CAVALCANTI, N. T. D. O. Levantamento e avaliação da incidência das doenças da
mandioca no estado da Paraíba. Summa Phytopathologica, v. 39, n. 3, p. 204. 2013.
MOURA, G. de M.; SILVA, M. D. O. da. Avaliação de resistência de cultivares de
mandioca à podridão de raízes. Embrapa-CPAF/AC. Comunicado Técnico, 4p. Rio
Branco 1997.

MUNIZ J. N, RUFFINO-NETTO A, YAMAMURA M, VILLA TCS, ARCENCIO R.
Aspectos epidemiológicos da coinfecção tuberculose e vírus da imunodeficiência
humana em Ribeirão Preto (SP), de 1998 a 2003. J. Bras. Pneumol., 32(6):529-34,
2006
NASCIMENTO JÚNIOR, N. A. Efeito da casca de mandioca no controle da
podridão radicular causada por Phytophthora sp. em mandioca de mesa (Manihot
esculenta Crantz) var. Rosinha em ambiente irrigado. Rio Largo-AL,2015.82f. Tese
de Doutorado. (Programa de Pós-Graduação em Proteção de Plantas da Universidade
Federal de Alagoas. Alagoas. 2015.
NOTARO, K. A. MEDEIROS, E. V., SILVA, C. A. D., & Barros, J. A. Prospecção de
fitopatógenos associados á podridão radicular da mandioca em Pernambuco, Brasil.
Biosci. J., Uberlândia, v. 29, n. 5, p. 1832-1839, 2013.
NOTARO, K. A. Prospecção de fitopatógenos e caracterização de solos arenosos
envolvidos na supressividade ou conducividade da podridão radicular da mandioca,
causada por Neoscytalidium lignicola/ Krystal de Alcantara Notaro. Garanhuns-PE,
2012. 111f. Dissertação (PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PRODUÇÃO

AGRÍCOLA). Universidade Federal Rural de Pernambuco – Unidade Acadêmica de
Garanhuns, 2012.
O`DONNELL, K.; NIRENBERG, H.I.; AOKI, T.; CIGELNIK, E. A multigene
phylogeny of the Gibberella fujikoroi species complex: detection of additional
phylogenetically distinct species.Mycoscience, Tokyo, v. 41, p. 61-78, 2000.

OLIVEIRA, L. G. SILVA, A.C.S; SILVA, R. L. ,LIMA, D. W. S & LIMA, G; COSTA.
Atividade proteolítica de fungos de solo fitopatogênicos ao Feijão-Caupi [Vigna
unguiculata (L.) Walp.] In: III CONAC Congresso Nacional de Feijão-Caupi.
Pernambuco. Resumo expandido. 4p. 22-24 de abril Recife Pernambuco 2013.
OLIVEIRA, N. T; J. M. A., UCHÔA, S. C. P., RODRIGUES, G. S., MELVILLE, C. C.,
& de ALBUQUERQUE, J. D. A. A.. Caracterização e identificação de clones de
mandioca produzidas em Roraima para o consumo in natura. Revista Agro@mbiente
On-line, v. 5, n. 3, p. 188-193, 2012.
OTTONI, R.J. Analise da incidência de Fusarium spp. toxigenicos e de níveis de
fumonisinas em grãos ardidos de milho hibrido. 2008. 54 p. Dissertação (Mestrado em
Microbiologia Agrícola) - Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”,
Universidade de São Paulo, Piracicaba, 2008.
PEREIRA, C O.F. Estudo da patogenicidade e controle biológico de Fusarium sp.
Com Trichoderma sp. 2013.74f. Dissertação. Universidade de Caxias do Sul. 2013.
PUHALLA, J.E. Genetic considerations of the genus Fusarium. In: Nelson, P.E.;
Toussoun, T.A.; Cook, R.J. (Ed) Fusarium: diseases, biology, and taxonomy.
Pennsylvania: Pennsylvania State University, v.27, p.291-305, 1981.
QUERALES, P. J.. Caracterização morfológica e genética de Fusarium spp. isolados
de sementes e associados à podridão do colmo de milho (Zea mays L.). Diss. Escola
Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz, 2010.
REMUSKA, A.C.; DELLA PRIA, M. Efeito de Bacillus truringiensis e Trichoderma sp.
no crescimento de fungos fitopatogênicos. Publication UEPG: Ciências Exatas e da
Terra, Agrárias e Engenharia, Ponta Grossa, v.13, n.3, p.31-36, 2007.
ROBBS, F. C. Controle Biológico de doenças em plantas. In: NETO, A. M. A.;
BARAN, C. L. (ed.). Manual de Controle Biológico. Rio de Janeiro: Lidador. 1992. p.4651.

ROLLAN M, MONACO C, NICO A. Efecto de la tempratura sobre la interaccion
invitr o entre especies de Tricihoderma y Sclerotinia sclerotiorum, S. minor y
Sclerotium rolfsii. Invest. Agr.: Prod. Prot. Veg. 14:1-16. 1999.
RONDÓN T.R, GUTIÉRREZ GR, ZAYAS A.D.P, PÉREZ LA, CUTIÑO Y.L.
Efectividad in vitro de Trichoderma harzianum Rifai para el biocontrol de
Rhizoctonia solani Kühn y Pyricularia Grisea sacc. aislados en el cultivo del arroz
(Oryza sativa l.). Fitosanidad 11: 29-34.2007.
SALLA, D. A., CABELLO, C. Análise energética de sistemas de produção de etanol
de mandioca, cana-de-açúcar e milho. Revista Energia na Agricultura. Botucatu, vol.
25, n.2, p.32-53., 2010.
SANTOS, C. C., OLIVEIRA, F. A. de; SANTOS, M. S. dos; TALAMINI, V.;
FERREIRA, J. M. S.; SANTOS, F. J. dos., Influência de Trichoderma spp. sobre o
crescimento micelial de Thielaviopsis paradoxa. Scientia Plena 8, 047309
www.scientiaplena.org.br . 2012
SEIFERT, K.A. Enhancing the relevance of fungal taxonomy to plant pathology:
phylogenetics, molecular diagnostics, and long-term memory1. Symposium contribution.
Canadian Journal of Plant Pathology, Otawa, v. 28, p. S280-S287, 2006.
SILVA, A. N.; AZEVEDO, G. B.; ROCHA-SOBRINHO, G. G.; NOVAES, Q. S.;
Efeito de produtos químicos e de Trichoderma spp. no controle de Fusarium solani
do maracujazeiro. Interciencia, v. 6, p. 398-403, 2014.
SILVA, C. A. D., DE MEDEIROS, E. V., BEZERRA, C. B., DE MORAIS; SILVA, W.,
DE BARROS, J. A., & DOS SANTOS, U. J. Interferência da incorporação de matéria
orgânica no solo no controle da podridão negra da mandioca, causada por
Scytalidium lignicola. Biosci. J., Uberlândia, v. 29, n. 6 , p. 1823-1831, Nov./Dec. 2013.
SILVA, C. A. D., Prospecção em fitopatógenicos e avaliação de fontes de matéria
orgânica sobre a supressividade da podridão radicular da mandioca. Garanhuns- PE,
2013. 77 f. Dissertação (Mestrado em Produção Agrícola). Universidade Federal Rural
de Pernambuco – Unidade Acadêmica de Garanhuns, 2013.
SILVA, H. S. A.; ANDRADE, E. C. Impacto potencial das mudanças climáticas sobre as
doenças da mandioca no Brasil. In: Impactos das mudanças climáticas sobre doenças
de importantes culturas no Brasil. Jaguariúna: Embrapa Meio Ambiente, p. 263-272,
2011.
SILVA, J. L.; TEIXEIRA, R. N. V. Esporulação e crescimento micelial de Fusarium
solani em diferentes meios de cultura e regimes de luminosidade. Revista

Agrombiente
On-line,v.6,n.1,p.47-52,
2012.
<http://revista.ufrr.br/index.php/agroambiente/article/view/604>

Disponível

em:

SILVA, K. S.; REBOUÇAS, T. N. H.; BOMFIM, M. P.; SILVA, D. S.; SÃO JOSÉ, A.
R.; BENETT, C. G. S. Atividade antagônica in vitro de isolados de Trichoderma spp.
ao fungo Phytophthora citrophthora. Londrina. Semina: Ciências Agrárias, v. 29, n. 4,
p. 749-754, out./dez. 2008.
SILVA, M.B.; NICOLI, A. COSTA, A.S.V.; BRASILEIRO, B.G.; JAMAL, C.M.,
SILVA, C. A.; PAULA JÚNIOR, T. J.; TEIXEIRA, H. Ação antimicrobiana de
extratos de plantas medicinais sobre espécies fitopatogênicas de fungos do gênero
Colletotrichum. Revista Brasileira de Plantas Medicinais , Botucatu, v.10, n.3, p.57-60,
2008.
SOUSA, R.M.S.; SERRA, I.M.R.S.; MELO, T.A. Effect of essential oils as an
alternative in the control of Colletotrichum gloesporioides in pepper.Summa
Phytopathologica , v.38, n.1, p.42-47, 2012.
SOUZA, J. R., Potencialidade de fungicida e agente biológico no controle de
requeima do tomateiro. 2013. 63f. Dissertação. Universidade Estadual do Sudoeste da
Bahia, Vitória da Conquista. Bahia – BR. 2013.
SOUZA, K. de A.;VAZ, M. C. A.; ALVES, G. C. S.; PAZ -LIMA, M. L.. Confronto in
vitro de isolados de Trichoderma spp. com fungos filamentosos. 2p. IV Congresso
Estadual de Iniciação Científica do IF Goiano 21 a 24 de setembro de 2015.
SPIEGEL, Y.; CHET, I. Evolution of Trichoderma spp. as a biocontrol agent against
soilborne fungi and plant parasitic nematodes in Israel. Integrated Pest Management
Review, v. 03, p. 167-175, 1998.
STANGARLIN, J.R. et al. Controle de doenças de plantas por extratos de origem
vegetal. Revisão Anual de Patologia de Plantas, v.16, p.265-304, 2008.
TOCAFUNDO, F., Avaliação de isolados de Trichoderma spp. no controle de
Phytophthora palmivora em mamoeiro. 2008.66f, Dissertação Universidade Estadual de
Santa Cruz. Ilhéus– Bahia. 2008.
URBEN, A.F., et al., Curso taxonomia de Fusarium. Embrapa recursos genéticos e
biotecnologia. Brasilia-DF: Embrapa informação tecnólogica, 2009.
VENTURA, J. A. Taxonomia de Fusarium e seus segregados: I- história, meios e
procedimentos de cultivo. Revisão Anual de Patologia de Plantas , Passo Fundo, v. 7, p.
271-298, 1999.

VINALE F, SIVASITHAMPARAM, K., GHISALBERTI, E. L., MARRA, R., WOO, S.
L., & LORITO, M.. Trichoderma–plant–pathogen interactions. Soil Biology and
Biochemistry, v. 40, p.1-10.2008.
ZUCCHI, F. O. Trichoderma sp. em áreas agrícolas visando o controle de doenças
fúngicas de raízes de plantas cultivadas. Campinas SP. JV Biotecnologia. 15p. 2010.

3.ETIOLOGIA DA PODRIDÃO RADICULAR DA MANDIOCA NO ESTADO DE
ALAGOAS E AVALIAÇÃO DO EFEITO DE ISOLADOS DE Trichoderma spp.
SOBRE O DESENVOLVIMENTO DE Fusarium falciforme.

RESUMO
A podridão radicular é a doença mais limitante da produção de mandioca nas Regiões Norte e
Nordeste do Brasil, com perdas que chegam a aproximadamente 70%. Este trabalho teve
como objetivos identificar os agentes causais da podridão radicular da mandioca cv Rosinha
no Estado de Alagoas, proceder a caracterização morfológica e molecular de Fusarium sp. e
de seu biocontolador (Trichoderma spp.). Para tanto foram conduzidos três experimentos No
primeiro experimento, estudou-se as espécie de patógenos, causadores da podridão radicular
da mandioca, através do isolamento, caracterização morfológica e confirmação da
patogenicidade. Posteriormente, em um segundo experimento avaliou-se a capacidade de
inibição dos isolados de Trichoderma spp., obtidos da rizosfera da mandioca e da coleção de
microrganismos da Embrapa Meio Ambiente-SP, sobre o desenvolvimento de Fusarium sp.
No terceiro experimento, procedeu-se a caracterização molecular de Fusarium sp. e de
Trichoderma spp. Inicialmente, solo da rizosfera e raízes tuberosas de mandioca,
apresentando sintomas de podridão foram coletados e submetidos a isolamento. Em seguida,
realizou-se a seleção de isolados de Trichoderma pela técnica de confrontamento e produção
de metabólitos. Posteriormente, a caracterização molecular de Fusarium sp. e de Trichoderma
spp. foi realizada através do sequenciamento da região ITS e análise filogenética. Os fungos
isolados foram Fusarium sp., Neoscytalidium sp. e o oomiceto Phytophthora sp., todos
patogênicos às raízes e plantas de mandioca. Foram obtidos 12 isolados de Trichoderma,
entRe os quais, sete (T2; T3; T5; T6; T10; T13; T15) produziram substâncias bioativas que
inibiram o desenvolvimento de Fusarium sp. O estudo filogenético baseado na região ITS do
DNA construído usando o método de ‘‘maximum Likelihood Tree’’ com base em 1000
réplicas de “bootstrap”, mostrou 100% de similaridade genética com a espécie Fusarium
falciforme. Os isolados de Trichoderma foram identificados como T. harzianum (T6), T.
citrinoviride (T5) e T. orientale (T15).
Palavras-Chave: Manihots sp., Controle biológico, Fungo.

ETIOLOGY OF CASSAVA BROWN STREAK IN THE STATE OF ALAGOAS AND
Trichoderma spp EVALUATION OF THE EFFECT OF ISOLATES OF Trichoderma
spp ON THE DEVELOPMENT OF Fusarium falciforme.

ABSTRACT

Root rot is the most limiting disease of cassava production in the North and Northeast regions
of Brazil, with losses reaching approximately 70%. The objective of this work was to identify
the causal agents of root rot of cassava cv Rosinha in the State of Alagoas, to perform the
morphological and molecular characterization of Fusarium sp. And its biocontainer
(Trichoderma spp.). For this purpose, three experiments were carried out. In the first
experiment, the pathogen species responsible for root rot of cassava were studied through
isolation, morphological characterization and confirmation of pathogenicity. Later, in a
second experiment, the inhibition capacity of the Trichoderma spp. Isolates obtained from the
manioc rhizosphere and the collection of microorganisms of Embrapa Meio Ambiente-SP on
the development of Fusarium sp. In the third experiment, the molecular characterization of
Fusarium sp. And Trichoderma spp. Initially, soil of rhizosphere and tuberous roots of
manioc, presenting symptoms of rot were collected and submitted to isolation. Then, the
selection of Trichoderma isolates was performed by the technique of comparison and
production of metabolites. Subsequently, the molecular characterization of Fusarium sp. And
Trichoderma spp. Was performed through the ITS region sequencing and phylogenetic
analysis. The isolated fungi were Fusarium sp., Neoscytalidium sp. And Phytophthora sp., All
pathogenic to roots and cassava plants. Twelve isolates of Trichoderma were obtained, and
seven (T2, T3, T5, T6, T10, T13, T15) produced bioactive substances that inhibited the
development of Fusarium sp. The phylogenetic study based on the ITS region of the DNA
constructed using the '' Maximum Likelihood Tree '' method based on 1000 bootstrap
replicates, showed 100% genetic similarity with the falciform Fusarium species. Trichoderma
isolates were identified as T. harzianum (T6), T. citrinoviride (T5) and T. orientale (T15).
Key words: Manihots sp., Biological control, Fungus.

3.1. INTRODUÇÃO
A mandioca (Manihot esculenta Crantz) é muito importante para o Nordeste brasileiro,
notadamente para o Estado de Alagoas. Seu principal uso é na alimentação humana e animal,
como matéria prima para indústria de biocombustível, plásticos biodegradáveis,
processamento de carnes, na produção de massas, produtos têxteis e amidos modificados
(CONAB, 2013; OLIVEIRA et al., 2012; FRAIFE FILHO & BAHIA, 2015).
Por exercer um impacto social bastante significativo, que vai da mão de obra, plantio,
beneficiamento e principalmente pelo seu teor nutricional, a mandioca e seus derivados é dos
alimentos mais consumidos no mundo. Essa cultura ocupa a sexta posição em área plantada.
Entretanto, enfrenta muitos desafios, principalmente no emprego de técnicas que possibilitem
aumentar a produção de raízes, processamento, comercialização e problemas fitossanitários
(NOTARO et al., 2013; SILVA, 2013).
Os prejuízos causados pela podridão radicular são fatores limitantes nas regiões Norte
e Nordeste do pais (NASCIMENTO JÚNIOR, 2015). Entretanto, registros sobre os principais
fitopatógenos envolvidos na podridão radicular são incipientes, apesar da importância para
servir como ferramenta para tomada de decisão sobre qual a melhor estratégia de manejo a ser
utilizada.
Uma das maneiras de conter os prejuízos causados por essa doença é o uso de
agroquímicos que quando usados de forma irresponsável causam grande prejuízo ao ambiente
devido ao resíduo toxico. Uma forma de conseguir que se tenha uma redução no uso desses
agrotóxicos é a utilização de agentes de controle biológico, sendo o fungo Trichoderma sp.
um dos mais promissores (BIZI, 2015; CANCELA, 2015; FIPKE, et al.,2015).
Vários são os mecanismos utilizados por Trichoderma spp. no controle de
fitopatógenos, sendo hiperparasitismo, antibiose e competição os mais conhecidos. Zucchi
(2010) relata que a atividade micoparasitica necrotrófica tem grande eficiência em inúmeros
fungos fitopatogênicos, principalmente aqueles com estruturas de resistência consideradas
difíceis de serem atacadas por microrganismos, como esporos, escleródios, clamidósporos e
microescleródios. Outro mecanismo importante dos biocontroladores é a produção de
substâncias bioativas voláteis ou não voláteis que são capazes de impedir o desenvolvimento
de outros organismos de espécies diferentes (DIAS, 2011; CARVALHO FILHO, 2013;
MATOS et al., 2014).

Devido à importância da cultura da mandioca e os problemas fitossanitários existentes,
pesquisas voltadas à identificação dos agentes etiológicos de doenças e seu controle são cada
vez mais necessárias. Por estes motivos, este trabalho teve como objetivos identificar os
agentes responsáveis pela podridão radicular da mandioca e avaliar a capacidade de isolados
de Trichoderma spp. em inibir o desenvolvimento de Fusarium sp.

3.2. MATERIAL E MÉTODOS
3.2.1. . LOCAL DE EXECUÇÃO.

Os trabalhos foram conduzidos no laboratório de Fitopatologia e de Fitopatologia
molecular, da Unidade Acadêmica Centro de Ciências Agrárias (CECA), da Universidade
Federal de Alagoas (UFAL)- Campus Delza Gitaí, em Rio Largo, Estado de Alagoas.

3.2.2. COLETA DE SOLO E OBTENÇÃO DOS ISOLADOS
As coletas de solo e raízes foram realizadas em áreas produtoras de mandioca cv
rosinha, nos municípios de Campo Alegre, São Sebastião, Arapiraca e Penedo no Estado de
Alagoas, que apresentavam problemas de podridão radicular. As amostras constaram de pelo
menos 5 sub-amostras coletadas (entre espaços de 3 até 10m e 5-15cm de profundidade),
homogeneizadas e não peneiradas, resultando numa amostra final de 100-150g. As amostras
foram acondicionadas em recipientes plásticos e mantidas em caixa de isopor durante as
viagens.
Para o isolamento dos microrganismos utilizou-se a técnica de diluição seriada,
conforme metodologia de Tuite (1969): 25g de cada amostra de solo foram homogeneizadas
manualmente e transferidas para Erlenmeyeres contendo 225mL de água destilada esterilizada
(ADE) com 5 gotas de Tween 10, para facilitar o desprendimento das estruturas dos isolados
das partículas de solo; e isolamento indireto das raízes que apresentaram sintomas da doença
(ALFENAS et al., 2007).
Para o isolamento dos patógenos, o material foi mantido sob agitação por 5 minutos,
posteriormente, 10 mL da suspensão foi transferida para 90 mL de ADE (água destilada
esterilizada) e agitada brevemente. A operação foi repetida até a diluição 10-8. Em seguida 1,0
mL dessa suspensão foi transferida para placas de Petri contendo meio de cultura BDA
(Batata – 200 g, Dextrose – 20 g, Ágar – 18 g e água destilada – 1000 mL).
Para o isolamento de Trichoderma sp., as suspensões das amostras de solo foi mantida
sob agitação constante por 30 minutos, seguida das diluições em ADE e transferência de
1,0mL das suspensões, 10-3 e 10-4 para os meios de cultura BDA e EM- Extrato de Malte
(malte 20 g, ágar 20 g e água 1000 mL).

As placas foram mantidas em condições ambiente (28±2°C), em regime de alternância
luminosa e escuro para isolamento dos patógenos e biocontroladores, respectivamente. Após
sete dias, verificou-se o crescimento das colônias. Posteriormente, os isolados dos patógenos e
de Trichoderma foram transferidos e preservados em BDA em temperatura ambiente.
Os isolados obtidos foram repicados para placas de Petri contendo meio BDA. Após
sete dias, foram feitas observações em lâminas para identificar as estruturas dos isolados. As
medições das estruturas propagativas foram realizadas através de imagens capturadas por
câmera digital (Olympus IX2-SLP) acoplada ao microscópio óptico com aumento de 400x,
projetada em monitor de computador, através do software Cellsenses Standard (SAMSUNG
SDC-415®). Foram efetuadas 50 medições de cada tipo de estrutura produzida.

3.2.3. TESTE DE PATOGENICIDADE E REISOLAMENTO

O teste de patogenicidade foi realizado, conforme Nascimento Júnior (2015), em
raízes e em plantas de mandioca da cultivar rosinha, pois a região onde foram coletados o solo
com problema de podridão era desta variedade. As raízes foram lavadas com água e sabão
líquido e depois desinfetadas com álcool a 70%, durante 5 minutos, hipoclorito de sódio 2,5%
durante 3 minutos, e lavadas com ADE, duas vezes por 2 minutos. Após o procedimento de
desinfestação, as raízes foram secas e postas em bandejas plásticas. A inoculação de cada
isolado foi realizada em raízes de mandioca com ferimento, usando perfurador de
aproximadamente 6,0 mm de diâmetro, retirando um disco do tecido vegetal e colocando
outro de meio de cultura BDA contendo micélio dos microrganismos isolados. Para a
testemunha, o mesmo procedimento foi realizado, sendo que o disco de BDA não continha
propágulo dos patógenos.
As raízes inoculadas foram mantidas em câmara úmida, preparadas com sacos
plásticos transparentes e um chumaço de algodão hidrófilo umedecido com ADE, durante
48h. Após este período, as raízes de mandioca foram avaliadas observando se apresentavam
sintomas da doença, característicos de cada patógeno.
Para o teste de patogenicidade em plantas, manivas de mandioca cv. rosinha foram
semeadas em copos plásticos de 500mL contendo solo autoclavado. As manivas foram
previamente desinfestadas com álcool a 70%, durante 5 minutos, hipoclorito de sódio 3%, por
2 minutos, e lavadas com ADE duas vezes por 1 minuto.

Trinta dias após o plantio, as plantas foram inoculadas com três discos de BDA
contendo micélio dos fitopatógenos sobre ferimentos previamente feitos na altura do caule das
plantas. Foram mantidos em câmera úmida durante 72h.
As plantas que apresentaram sintomas típicos da doença foram utilizadas para o
reisolamento do patógeno em placas de Petri contendo meio BDA, sob condições ambientais
a fim de confirmar a identidade do patógeno.

3.2.4. AVALIAÇÃO DO POTENCIAL DE BIOCONTROLE DE ISOLADOS DE
Trichoderma spp SOBRE O DESENVOLVIMENTO DE Fusarium sp.

Para avaliar o potencial de biocontrole dos isolados de Trichoderma contra Fusarium
sp., foram utilizados doze isolados de Trichoderma spp., obtidos dos pontos de coleta e três
isolados disponibilizados pelo laboratório de Fitopatologia da Universidade Federal de
Alagoas.
Utilizou-se o método do pareamento, que consistiu em confrontar discos (5mm de
diâmetro) de meio de cultura contendo estrutura do patógeno e o antagonista em uma única
placa de Petri contendo meio BDA, equidistantes entre si. Como testemunha, usou-se o
patógeno cultivado isoladamente. As placas foram mantidas por sete dias em temperatura
ambiente (28±2ºC) e fotoperíodo de 12h.
O grau de antagonismo foi avaliado utilizando da escala de notas descrita por Bell et
al. (1982), que atribuí notas de 1 a 5, a depender do micelial dos isolados de Trichoderma
sobre o crescimento micelial do fitopatógeno (Tabela 1) e também por meio do diâmetro
ortogonal das colônias com auxílio de um paquímetro WESTERN®Pro Digital Caliper. Para
o cálculo da porcentagem de inibição do crescimento micelial (PIC) foi aplicada a fórmula
proposta por Abbott (1925)1, citado por Nascimento Júnior (2015), (Eq 1), sendo que o
período de avaliação foi quando o patógeno atingiu o diâmetro da placa na testemunha.
___________________
3

ABBOTT, W. S. A method of computing the effectiveness of an insecticide. Journal of Economic
Entomology, Lanhan, v. 18, p. 265-267, 1925.

O delineamento experimental utilizado foi inteiramente casualizado, com 15
tratamentos e 4 repetições. Os dados foram submetidos à análise de variância e teste de Tukey
de significância a 5%.

Tabela 1. Escala de Bell et al. (1982)
Nota (1) - Trichoderma completamente crescido sobre o patógeno preenchendo toda placa;
Nota (2) - Trichoderma com crescimento de pelo menos 2/3 da superfície do meio;
Nota (3) - Trichoderma e patógeno ocupando cerca de 1/2 da superfície do meio cada um, não
havendo nenhum domínio de um sobre o outro;
Nota (4) - Patógeno colonizando pelo menos 2/3 da superfície do meio e aparentemente sendo
impedido de crescer devido ao Trichoderma;
Nota (5) - Patógeno crescido sobre o Trichoderma preenchendo a superfície do meio.

Em que: PIC- percentagem de inibição do crescimento micelial (%); T- testemunha em milímetro
(mm) e t- tratamento avaliado em milimetro (mm).

3.2.5 CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DOS ISOLADOS
3.2.5.1. Extração do DNA de Fusarium sp. e dos isolados de Trichoderma spp.
Discos de micélio de isolados de Fusarium sp. e de Trichoderma spp. foram
transferidos para Erlenmeyers com 30 mL de meio líquido sacarose-extrato de leveduraasparagina (ALFENAS et al.,1991). Após cinco dias, os micélios foram retirados e os
excessos do meio lavados com água destilada esterilizada. Para extração, 200mg do micélio
de cada isolado foram transferidos para almofariz e refrigerados a – 80º C por cinco minutos.
Em seguida, os micélios foram macerados na presença do tampão de extração, conforme o
protocolo de extração CTAB (cationic hexadecyl trimethyl ammonium bromide), segundo
DOYLE; DOYLE (1987).
Os micélios triturados foram transferidos para dois tubos de micro-centrífuga com
capacidade de 1,5 mL. Em seguida, adicionou-se 1 mL de tampão de extração (CTAB 4%,
NaCl 1,4M, EDTA 20 mM, Tris-HCl 100 mM, PVP 1%), 4 µL de β-mercaptoetanol, e depois,

os tubos foram mantidos em banho-maria a 65°C por 30 minutos. Posteriormente, as amostras
foram centrifugadas a 12.000 rpm por 15 minutos. O sobrenadante foi transferido para um
novo tubo, onde foi adicionado 600 µL de CIA (clorofórmio: álcool isoamílico 24:1). Após
centrifugação, a fase aquosa foi transferida para um novo tubo, acrescentando –se 400 µL de
etanol absoluto.
O DNA precipitado foi lavado com etanol 70% e seco em temperatura ambiente e, em
seguida, ressuspendido com 40 µL de TE (Tris-EDTA; Tris-HCl 10 mM, EDTA 1mM) +
RNAse (10µg/mL). A qualidade do DNA foi estimada visualmente em gel de agarose 0,8%.
O material foi armazenado sob a temperatura de -20°C.
3.2.5.2. Amplificação do DNA e sequenciamento dos produtos de PCR

Os isolados obtidos foram amplificados com o gene que codifica para a região ITSrDNA (Tabela 2).
Tabela 2. Descrição do primer utilizado para identificação dos gêneros fúngicos.
Gene

Primer Sequencia (5’-3’)
ITS1

Referências

TCCGTAGGTGAACCTGCGG

ITS

White et al., 1990
ITS4

TCCTCCGCTTATTGATATGC

As reações de PCR foram preparadas com tampão 10X, MgCl2 50 mM, DNTP’s 10
mM, 10 μM de cada oligonucleotídeo, 1U de Taq DNA Polimerase e 1μL de DNA diluído
(1:20). O volume final das reações foi ajustado para 60μL com água Milli-Q autoclavada. As
reações de PCR ocorreram em termociclador Applied Biosystems (2720 Thermal Cycler) nas
seguintes condições para a região ITS: desnaturação inicial de 95°C por 2 min e 38 ciclos de
95°C por 1 min, 55°C por 30 s, 72°C por 45 s e um ciclo final de 10 min por 72°C. Em
seguida, o produto de PCR foi enviado, para purificação e sequenciamento com os mesmos
primers utilizados na amplificação, para Macrogen Inc. (Seoul, Coréia do Sul).
3.2.5.3. Sequenciamento e Análises filogenéticas
O sequenciamento foi realizado pela Macrogen Inc. (Seul, Coréia do Sul)
diretamente dos produtos de PCR purificados e posteriormente, comparadas com outras

sequências depositadas no Genbank (www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank), utilizando o programa
BlastN (Nucleotide Basic Local Alignment Search Tool), para a identificação preliminar da
espécie do fungo com maior porcentagem de identidade. Também foram comparadas com
sequências no banco de dados Q-Bank Fungi (http://www.q-bank.eu/fungi/) para determinar
os gêneros fúngicos com os quais compartilharam maior identidade de sequência.
Alinhamentos múltiplos de sequências nucleotídicas foram preparados utilizando-se o
algoritmo MUSCLE (EDGAR, 2004) e ajustados manualmente no pacote MEGA6
(TAMURA et al., 2013). Inferência Bayesiana foi realizada no web portal CIPRES (MILLER
et al., 2010) usando MrBayes v. 3.2.3 (RONQUIST et al., 2012). O melhor modelo de
substituição de nucleotídeos foi determinado usando MrModeltest 2.3 (POSADA;
BUCKLEY, 2004) de acordo com o Akaike Information Criterion (AIC). Análises foram
rodadas para cada conjunto de dados por 10 milhões de gerações usando quatro cadeias e
amostrando a cada 1.000 gerações, para um total de 10.000 árvores. As primeiras 2.500
árvores foram descartadas como uma fase de burn-in. Probabilidades posteriores
(RANNALA; YANG, 1996) foram determinadas a partir de uma árvore consenso majorityrule gerada com as 7.500 árvores remanescentes. As árvores foram visualizadas e editadas nos
programas

FigTree

(https://inkscape.org/pt/).

v.

1.4

(ztree.bio.ed.ac.uk/software/figtree)

e

Inkscape

3.3. RESULTADOS E DISCUSSÕES

3.3.1. IDENTIFICAÇÃO DOS FITOPATOGENOS

Após a diluição em série, foram identificados três fitopatógenos em nível de gênero
como agentes causais da podridão radicular da mandioca,
O primeiro isolado apresentou micélio aéreo filamentoso, denso e cotonoso, formado
de hifas ramificadas, septadas, variando de branco ao creme, tornando-se levemente
avermelhado. Seu crescimento, em placas de 90mm com meio BDA, levou cerca de sete dias.
Em lâminas feitas para observação das estruturas foram obervados macroconídios com 3-7
septos e tamanho variando de 27-60 µm x 3-5 µm e microconídios com e sem septos,
medindo 8-16 µm

x 2-4 µm, de forma cilíndrica a oval. Com auxílio da literatura

especializada e observação das estruturas, foi concluído que se tratava do gênero Fusarium,
pertencente ao complexo F. solani (Mart.) Sacc. (Figura 1 A).
O outro isolado encontrado apresentava micélio inicialmente claro e depois chegando
até a cor negra. Seu crescimento em meio BDA, em placas de 90mm, levou em média quatro
dias. Os conídios mostraram-se escuros, cilíndricos, esféricos ou sub-esféricos, lisos, em
cadeia, e a grande maioria sem septo, medindo 4,0-8,5 x 3,5-7,0µm de comprimento e
largura, respectivamente. De acordo com as características morfológicas observadas o agente
causal foi identificado como Neocytalidium lignicola Pesante, conforme descrição de Ellis
(1971 Dematiaceous Hyphomycetes. CMI). Discrição semelhante foi encontrada nos
trabalhos de Serra et al. (2009), Machado et al. (2014) e Hohenfeld, 2016. (Figura 1 B).
O terceiro fitopatógeno apresentou crescimento micelial de aspecto felpudo e
coloração esbranquiçada com hifas cenocíticas e hialinas. As observações microscópicas
revelaram a presença de esporângios com formatos piriformes e elipsoides, não papilados,
com dimensões de 33,8-46,46 µm x 21,6-29,6 µm. Os clamidósporos foram raros e
apresentaram-se globosos e terminais. Segundo Cother, Griffin (1974), estes propágulos são
registrados apenas em alguns isolados de P. drechsleri. Outra característica marcante foi à
formação de um halo no meio de cultura, visualizado por uma circunferência bem definida ao
redor do micélio. De acordo com as características morfológicas observadas e comparadas
com a literatura especializada foi concluído que se tratava de Phytophthora sp. (Figura 1 C).

Todos esses fitopatógenos isolados e identificados são relatados como causadores
podridão de raiz em diversas culturas inclusive na mandioca.

Figura 1. Aspecto das colônias e estruturas reprodutivas dos isolados de fitopatógenos
causadores de podridão em mandioca: Fusarium sp. (A1-A6), Neoscytalidium sp. (B1-B6) e
Phytophthora sp. (C1-C6). Colônia de Fusarium sp. (A1); conídios (A2); célula
conidiogênica (A3-A6). Colônia de Neoscytalidium sp. (B1); Conídios (B2-B6). Colônia de
Phytophthora sp (C1); Esporângio (C2); Clamidósporos (C3 E C4); Esporângios (C5) e
Esporângios em reprodução (C6).

Fonte: SILVA e NASCIMENTO JÚNIOR; (2016).

3.3.2. IDENTIFICAÇÃO DOS BIOCONTROLADORES
Foram obtidos doze isolados de Trichoderma spp. que apresentaram crescimento
micelial esbranquiçado que originou rapidamente conidióforos hialinos, agregados e muito
ramificados, não verticiliados, fiálides simples ou em grupos. Conídios unicelulares, ovoides,
com paredes lisas ou ásperas produzidos em pequenos clusters terminais, de coloração verde
ou hialinos se espalhando rapidamente sobre a superfície da colônia, medindo 3,8-4,0 x 3,13,7 µm, características de espécies de Trichoderma (Figura 2).

Figura 2- Aspecto da colônia e estruturas reprodutivas do isolado T6 de Trichoderma spp.

Fonte: SILVA; AMORIM (2016)

3.3.3- PATOGENICIDADE DOS ISOLADOS
Nos testes realizados em raízes, após 5 dias da inoculação foram observados sintomas
iniciais de podridão, que variaram de consistência de acordo com o isolado: algumas
apresentavam aspecto seco e crescimento cotonoso de coloração esbranquiçada, outras
apresentavam tecidos desintegrados e consequente podridão mole, com odores muito fortes,
semelhantes ao de matéria orgânica em decomposição e mostraram uma coloração
acinzentada e em outras a podridão tinha a coloração negra (Figura 3).
Foram realizados reisolamentos em meio BDA e os materiais apresentaram as mesmas
características, confirmando, desta forma, que os microrganismos causadores das podridões
radiculares em mandioca cv rosinha foram Fusarium sp. (podridão seca), Phytophthora sp.
(podridão mole) e N. lignicola (podridão negra) que foi com bases no sequenciamento de
regiões genômicas foi reclassificado para Neoscytalidium hyalinum. (MACHADO et al. 2014
e HOHENFELD, 2016)
Os isolados também mostraram-se patogênicos às plantas em desenvolvimento. Após
10 dias, as plantas que receberam ferimento no caule e foram inoculadas com um disco
contendo micélio, apresentaram lesões características de podridão na região do colo,
conforme pode ser observado na Figura 3.
De acordo com Alves e Silva (2003), os mais importantes agentes causadores da
podridão radicular em mandioca são Phytophthora sp. e Fusarium sp., causando podridões

moles e secas nas raízes, respectivamente.
O fungo N. hyalinum tem sido descrito também como um importante patógeno na
cultura da mandioca causando a podridão negra em raízes e caule. A presença deste patógeno
no Brasil foi verificada pela primeira vez no estado de Pernambuco e, em seguida, nos estados
do Pará, de Alagoas e do Maranhão (LARANJEIRA et al., 1994; POLTRONIERI et al.,
2002; MUNIZ et al., 2006; SERRA et al, 2009; MACHADO et al. 2014 e HOHENFELD,
2016).

Figura 3. Plantas e raízes de mandioca cv rosinha apresentando sintomas de podridão após
inoculação: sintomas de lesão no caule, clorose e murcha nas folhas (A1 e A2) e podridão
seca na raiz (A3 e A4), causadas por Fusarium sp.; murcha e seca das folhas (B1 e B2),
podridão negra no caule e na raiz (B3 e B4), causadas por Neoscytalidium sp.; lesões no
caule, murcha e morte da planta (C1 e C2), crescimento cotonoso na raiz (C3) e podridão
mole com degradação da parede (C4) causadas por Phytophthora sp.

Fonte: SILVA; NASCIMENTO JÚNIOR (2016)

3.3.4. AVALIAÇÃO DA AÇÃO DOS ISOLADOS de Trichoderma sp. SOBRE O
CRESCIMENTO MICELIAL DE Fusarium sp.

A partir dos resultados obtidos pela escala adotada, verificou-se que aos sete dias, os
15 isolados de Trichoderma spp. já provocaram algum grau de inibição no crescimento
micelial do fitopatógeno (Figura 4). Após 14 dias foi verificado que os isolados (T1; T2; T3;
T5; T6; T9 e T15) obtiveram alta atividade de biocontrole (notas 1) e os isolados (T4; T8;
T10; T12 e T14) apresentaram bom desempeno (notas 2). Já os isolados T7 e T13 foram os
que obtiveram menor desempenho em sua atividade de biocontrole, ou seja, menor nota entre
todos (Figura 5).
Figura 4. Confronto entre os isolados de Trichoderma spp. e Fusarium sp.: testemunha (T0);
isolados de Trichoderma spp. na posição superior de cada placa (T1-T15).

Fonte: SILVA e NASCIMENTO JÚNIOR (2016)
Figura 5. Notas atribuídas aos isolados de Trichoderma spp. avaliadas após o pareamento.

*Colunas com a mesma letra não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5%.

Vários pesquisadores corroboram com os resultados observados neste trabalho.
Estudos semelhantes realizados por Hoffmann et al., (2015) concluíram que dos 15 isolados
por ele testados no controle de Fusarium sp., mais de 80% dos isolados inibiram
completamente o crescimento micelial do fitopatógeno. Os resultados obtidos por Da Silva et.
al., (2011); Pereira (2013) indicaram um grande potencial de inibição de crescimento micelial
de F. solani por espécies de Trichoderma spp. Souza et al. (2015), também relatam que
Fusarium sp. e Bipolaris sp., tiveram seu crescimento fortemente inibido pelos isolados de
Trichoderma spp. Outros trabalhos realizados por Bomfim et al., (2010); Dias (2011);
Lazarotto et al., (2012); Santos et al., (2012); Marques et al., (2014), obtiveram resultados
promissores apresentando de bom a ótimo desempenho, no que diz respeito a inibição do
crescimento micelial de fitopatógenos por eles testados.
No teste de confronto, os isolados que foram classificados como excelentes (T1; T2;
T3; T5; T6; T9 e T15) e bons (T4; T8; 10; T11; T12 e T14) no potencial de biocontrole,
detinham a maior velocidade de crescimento e colonizaram placas com meio BDA entre três a
quatro dias de incubação, tendo um crescimento de aproximadamente 30mm e 22,5mm/dia,
respectivamente. Os isolados classificados como moderados (T7 e T13) colonizaram as placas
em cinco dias e foram os que tiveram menor velocidade de crescimento 18,2mm/dia. Dentre
todos os isolados o T15 foi o que colonizou a placa de Petri com meio de cultura BDA em

apenas dois dias, tendo uma velocidade de 44,7mm/dia, além de modificar a cor do meio,
esporular no terceiro dia. De acordo com Michereff et al . (1993), a velocidade de
crescimento apresentada por Trichoderma spp., tem motivado a utilização deste
microrganismo como agente de biocontrole.
As relações desarmônicas, ocorridas entre os isolados de Trichoderma spp. e o
patógeno, foram observadas desde a velocidade de crescimento, comprovando a sua alta
capacidade de assimilação de nutrientes, e no momento do confronto entre o micélio do
biocontrolador e patógeno, pois era possível visualizar desde halos de inibição (antibiose) a
mudança na coloração na linha de contato entre eles, isso devido a ação de hiperparasitismo
ou micoparasitismo.
Outra peculiaridade observada nos isolados de Trichoderma spp., utilizados neste
trabalho foi que além de apresentarem as características de um bom competidor, alguns
isolados modificaram a cor do meio de cultura, sugerindo assim que eles produziam
metabolitos (Figura 6). Dentre os isolados que alteraram a coloração do meio, destacam-se os
isolados T2; T3; T10 e T13 que só manifestavam essa característica quando entraram em
contato direto com o fitopatógeno. A cor do meio variou entre tons de vermelho, amarelo e
cinza como constam na Figura 6.
O confronto possivelmente acionou as defesas do fitopatógeno que como resposta
liberou substâncias bioativas na tentativa de conter ação hiperparasitica do antagonista. Em
contrapartida também esta reação estimulou o biocontrolador a ativar seus bioativos de
defesa. Os isolados de Trichoderma spp. estudados apresentaram características de
competição, hiperparasitismo (estrangulamento e degradação de hifas) e antibiose (liberação
de enzimas que hidrolisam a estrutura dos tecidos do fitopatógeno). Estes aparato físico e
químico, normalmente faz extravasar o conteúdo celular que possivelmente pode ter alterado
o pH, condicionando assim a mudança da cor do meio e/ou produção de metabolitos.

Figura 6. Produção de metabólitos por isolados de Trichoderma spp. confrontados com
Fusarium sp.: isolado de Fusarium sp (T0); isolados de Trichoderma spp. na posição superior
de cada placa (T2-T15).

Fonte: SILVA e NASCIMENTO JÚNIOR (2016).

Firn; Jones (2003) comprovaram em suas pesquisas, que a produção de metabólitos
secundários está relacionada à coloração obtida pelo desenvolvimento do fungo no meio.
Demain (2000) afirma que a maioria das pesquisas de novos compostos antibióticos
consistem em modificações químicas de antibióticos naturais, ou seja, pela via semi-sintética
ocorridas e observadas nos biocontroladores e a cor é um dos sinais desta produção. Santin,
(2008) e Zucchi (2010) comentam que Trichoderma spp., possuem característica de
micoparasita capazes de detectar e localizar hifas de fungos suscetíveis, crescendo em sua
direção presumivelmente em resposta a estímulos químicos produzidos pela hifa hospedeira,
formando estruturas semelhantes a apressórios e enrolando-se em toda a sua extensão para,
então, penetrar e digerir a hifa. Algo semelhante é relatado por Silva et al., (2013) que
comentam, que as ações de biocontrole usadas por este microrganismo só ocorreram quando
Trichoderma spp., entrou em contato direto com o fitopatógeno crescendo sobre ele.
Nascimento et al., (2014) verificaram algo semelhante em seu trabalho com
prospecção de fungos da caatinga produtores de antibióticos, quando detectou que meio pobre
em nutrientes (aveia) estimula a esporulação e mudança da cor do meio, deste modo, há

produção de metabolitos secundários como forma de sobrevência. Os isolados que liberavam
metabolitos, testados pelos autores obtiveram eficiência de controle de 86,36% e
apresentaram atividade contra Escherichia coli e Staphylococcus aureus. Os autores
comentam ainda que estes metabolitos são sintetizados por meio de uma série de reações
bioquímicas que ocorrem nas células, onde o resultado é a síntese de um produto que favoreça
a sobrevivência e induz o fungo a produzir substâncias de defesa para vencer a concorrência
na obtenção de alimento.
Quanto à capacidade de inibição de crescimento micelial de Fusarium sp., promovida
por isolados de Trichoderma spp., pôde-se, observar que os isolados que proporcionaram
maior percentual de inibição foram T4 e T6, seguido do T15 com mais de 70%. No entanto
não diferiram de T1, T2, T3, T5, T8, T9, e T11. O segundo melhor resultado foi obtido por
T10 com aproximadamente 60% mas não diferiram de T1, T2, T3, T5, T8, T9, T11 E T15. Os
isolados T12 e T13 proporcionaram terceiro melhor percentual de inibição com
aproximadamente 58% e não deferiram de T1, T2, T3, T5, T8, T9, T10, T11 E T14. O menor
percentual de inibição foi proporcionado pelo isolado T7 com pouco mais de 45%, porém não
diferindo estatisticamente do isolado T14 (Figura 7).

Figura 7. Porcentagem de inibição do crescimento micelial (PIC) de Fusarium sp. em cultivo
pareado com isolados de Trichoderma spp.

* Colunas com a mesma letra não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5%.

Os resultados obtidos neste trabalho comprovaram a capacidade de biocontrole de
todos os isolados de Trichoderma spp., em inibir o crescimento micelial de Fusarium sp. A
taxa de inibição variou de 47,5% (isolado T7), que teve menor desempenho a 72,8% (isolado
T4) que teve o melhor desempenho.
Observa-se que os isolados T7 e T14, que obtiveram as menores notas (3) na escala de
Bell (1982), obtiveram um percentual de inibição de 47,5% e 58,9% respectivamente. Os
isolados T4, T8, T10, T12, e T14, que tiveram uma boa nota (2), os percentuais de inibição
foram 72,8%, 65%, 60%, 59,4%, e 58,9%. Já os isolados T1, T2, T3, T4, T5, T6, T9, T11 e
T15 com excelente nota (1), inibiram 64,4%, 68,1%, 69,4%,72,8%, 68,3%, 72,5%, 66,7%,
66,1% e 71,4%. Notou-se que todos os isolados de Trichoderma spp., testados foram capazes
de causar inibição do fitopatógeno com eficiência que variaram de 47,5% a 72,8%. Apenas o
isolado T7 teve eficiência inferior a 50%. Portanto 93,34% dos isolados de Trichoderma spp.
testados inibiram a crescimento micelial de Fusarium sp.
Notou-se ainda, que o isolado que teve maior taxa de inibição não teve a melhor nota
na escala de Bell (1982), isso possivelmente ocorreu devido a alguns isolados de Trichoderma
spp., liberarem substâncias voláteis e não voláteis que são capazes de inibir o crescimento do
fitopatógenos. Dos Santos (2008); Aguiar et al.,(2013) e Maciel et al., (2014) justificam este
fato ao relatarem em seus trabalhos, a eficiência de inibição do crescimento micelial de F.
oxysporum quando exposto a metabólitos voláteis e não voláteis produzidos pelos isolados de
Trichoderma spp.
Resultados obtidos por Kwon Chung e Bennett, (1992), corroboram com os dados
deste trabalho, pois dentre os isolados que apresentaram notas excelentes e boas na escala de
Bell (1982), tiveram maior percentual de inibição (PIC), produção de metabolitos e mudança
da cor do meio entrando em contato com o patógeno ou em seu desenvolvimento no meio
(Figura 7). Os isolados T5; T6 e T15 alteravam todo o meio de cultura, demonstrando assim
sua capacidade de produção de metabolitos ou mudança de pH do meio como possível
condição básica para sua colonização (Figura 6).
Outra explicação pode ser dada em relação ao tipo de característica observável: a PIC
está relacionada com percentual de crescimento do fitopatógeno confrontado com o
biocontrolador. Então, o isolado de Trichoderma spp., que obteve maior crescimento micelial
na placa, obteve a maior PIC. Na escala de Bell et al. (1982) a relação está mais voltada ao
tipo de interação existente entre biocontrolador versos fitopatógeno, ou seja, se fitopatógeno

ocupar maior diâmetro de crescimento na placa, e mesmo assim o biocontrolador conseguisse
crescer e esporular sobre o fitopatógeno, o isolado teria a melhor nota na escala, mesmo tendo
uma PIC menor. Silva (2013) relata em seu trabalho que Neoscytalidium sp., foi bastante
competitivo ao ser confrontado com Trichoderma sp., porém no momento em que as hifas se
tocarem na placa de petri, o isolado de Trichoderma spp., sobrepôs a colônia do patógeno.
Seguindo a mesma linha de raciocínio, a nota na escala de Bell (1982) para o isolado de
Trichoderma spp., seria excelente (1), mas o diâmetro de crescimento do fitopatógeno na
placa seria maior, por tanto a PIC seria menor. Resultados semelhantes foram encontrados nos
trabalhos de Lazarotto et al. (2012) e Santos et al, (2012) trabalhando com isolados de
Trichoderma spp, Fusarium sp e F. solani, também encontra resultados semelhantes
utilizando T. paradoxa.

3.3.5 Caracterização molecular dos isolados
3.3.5.1 Amplificação do DNA, purificação e sequenciamento dos produtos da PCR
O produto da amplificação da PCR com os primers ITS1 e ITS4 resultou num
fragmento de aproximadamente 550 pares de bases (pb). A análise filogenética baseada nas
sequências gênicas da região ITS do DNA do isolado, usando o método de ‘‘maximum
Likelihood Tree’’ com base em 1000 réplicas de “bootstrap”, revelou com 100% de
confiabilidade que o isolado pertence ao genero Fusarium e 99% similar com a sequência de
Fusarium falciforme depositada no GenBank (CBS128812) (Figura 8).
Os resultados são aceitáveis para conclusão em nível de espécie, pois, o valor de
similaridade encontrado foi 99%. MENEZES et al.,(2010); concluíram em seu trabalho que o
sequenciamento da região ITS foi um eficiente método para identificação e separação de
isolados de Fusarium spp., e também de Trichoderma spp.

Figura 8 – Árvore filogenética baseada na região ITS do DNA de Fusarium sp, construída
usando o método de ‘‘maximum Likelihood Tree’’. O isolado Fusarium redolens 6VVBY3
foi utilizado como “outgroup”. A barra de escala representa mudança de 0,04 e valores de
suporte de bootstrap de 1000 repetições são apresentados nos ramos.

Portanto podemos afirmar que a partir da região genômica estudada e árvore
filogenética formada o isolado de FUS se trata de F. falciforme e não de F. solani como
esperado. Sendo assim o primeiro relato desta espécie causando podridão em raiz de
mandioca.
Vários autores descrevem Fusarium solani, como agente causal da doença e relatam
também que isolados F. verticillioides e F. oxysporum causam a podridão da raiz da
mandioca, mas nenhum dos autores pesquisados neste trabalho mencionam a ocorrência
espécie F. falciforme como agente causal da podridão em mandioca. FUKUDA, 1991;
MASOLA; BEDENDO, (2005); BANDYOPADHYAY et al., (2006); HOHENFELD, (2016).
Uma explicação lógica se deve ao fato que o conceituar espécie, se baseando em
caracteres morfológicos, patogenicidade de hospedeiro e formae speciales, pode não refletir a
real diversidade de espécies e populações, podendo assim omitir a variabilidade genética e as

verdadeiras relações filogenéticas, espécies biológicas, variedade de hospedeiro e distribuição
geográfica desses patógenos (O’DONNELL; GRAY, 1995; BAAYEN et al., 2000;
O’DONNELL, 2000).
O’Donnell, (2000); O’Donnell et al., (2008) e Nalim et al.(2011) evidenciaram,
através da análise da filogenia molecular, que F. solani engloba várias espécies filogenéticas
distintas. Dessa forma, atualmente, refere-se na literatura a esse grupo de fungos como
Fusarium

solani

species

complex-

FSSC.

Espécies

deste

complexo

apresentam

comportamento reprodutivo com populações homotálicas e heterotálicas. Cardoso (2015) ao
fazer caracterização filogenética, descobre outros isolados de Fusarium que causavam
podridão do colo do maracujazeiro.
Vaz, (2013) ressalta que muitas espécies do complexo Fusarium solani ocorrem de
forma saprofítica e em seu trabalho com pimenta-do-reino, mais da metade dos isolados
obtidos com sintomas de fusariose não pertenciam ao agente etiológico da doença,
evidenciando assim claramente que apenas a identificação morfológica é ineficiente para
diagnosticar a doença, pois estirpes patogênicas e não patogênicas podem surgir na natureza
provavelmente devido ao fluxo genético existente entre eles.
CHEHRI et al. (2015), relatam que membros do complexo de espécies Fusarium
solani foram encontrados não só causado infecções em plantas, mas também em animais e
humanos. No entanto, o status taxonômico deste complexo ainda é muito confuso e muitas
novas espécies, bem como linhagens só foram esclarecidas recentemente. Os mesmos autores
utilizaram regiões genômicas espaçadoras internas transcritas (ITS) e sequências de fator de
alongamento de tradução parcial (TEF-1α) e concluíram que isolados descritos
morfologicamente como isolados de Fusarium solani na verdade se tratava de Fusarium
keratoplasticum e de Fusarium falciforme e se agruparam no mesmo clado com 95% de
similaridade. A filogenia molecular com base nestas regiões confirmaram que todas as
estirpes formaram um grupo monofilético. NALIM, et al. (2011) encontraram resultados
semelhantes ao trabalhar com peritécio de Nectria sp., isolados de solo de regiões tropicais, e
acrescentaram novas espécies de Fusarium no complexo solani.
HYDE, (2014) verificou também que dentro do complexo F. solani foram encontradas
além dos citados acima F.ambrosium. F. phaseoli, F. virguliforme, F.dimerum, Fusarium spp.
utilizando os primers de ITS (ITS1 e ITS5) e RPB (RPB1 e RPB2). O’DONNELL et al.

(2010) ao estudar regiões genômicas descobriram um elevado número de loci e que o
complexo solani FSSC é composto por, pelo menos, 40 espécies filogeneticamente distintas,
que antes eram desconhecidas por causa da semelhança morfológica. O'Donnell et al., (2013)
comentam que esta ultima região é bastante informativa e concatenada com a ITS aumentam a
confiabilidade na determinção das especie de Fusarium spp. no complexo solani.
Quanto aos isolados de Trichoderma spp., os isolados T2 e T3 foram fornecidos pela
Embrapa Meio Ambiente- Jaguariúna-SP e identificados como Trichoderma harzianum, já os
isolados T5, T6 e T15 que apresentaram melhor nota na escala de Bell et al., (1982) possível
produção de metabolitos secundários, bem como os que tiveram melhor taxa de inibição de
Fusarium sp., foram submetidos a extração de DNA e sequenciamento para posterior
identificação molecular e a analise filogenética.
A árvore filogenética gerada a partir das sequências dos genes ITS1 e ITS5 do rDNA,
apresentou dois grandes Clados com suporte de 100%. Estes clados foram classificados como
A, que apresentou o maior número de ramos e também agrupou os isolados T5 e T6 e B, onde
ficou agrupado o isolado T15 (Figura 9).
Observando a árvore podemos verificar que T6 agrupou-se no clado A e apresentou
99% de suporte onde estão sequências de Trichoderma harzianum e Hypocrea lixii sua forma
teleomorfica (sexuada) com 95% de similaridade, confirmando então que o isolado em
questão seja Trichoderma harzianum.
O isolado T5 também apresentou suporte de 99%, igual ao de isolado T6, agora
identificado como T. harzianum e sua similiaridade se deu com isolado de Trichoderma
citrinoviride com suporte de 94%, afirmando assim que o isolado seja da mesma espécie.
Mais recentemente as formas teleomórficas Hypocrea lixii, H. atroviridis, T. harzianum e T.
atroviride , foram descobertas e comprovadas através da análise do DNA (CHAVERRI et. al.,
2003; DODD et al., 2003).

Figura 9 – Árvore filogenética baseada na região ITS do DNA de Trichoderma spp.,
construída usando o método de ‘‘maximum Likelihood Tree’’. O isolado de Fusarium
falsiforme CBS 128812 foi utilizado como “outgroup”. A barra de escala representa mudança
de 0,02 e valores de suporte de bootstrap de 1000 repetições são apresentados nos ramos.

O isolado T15 se agrupou no clado B, onde apresentou suporte de origem de 100%,
mas sua similaridade no ramo em que o isolado foi agrupado foi mais baixa. No entanto, o
mesmo apresentou similaridade de 95% com Trichoderma orientale. Devido a sua
similaridade podemos sugerir a espécie deste isolado como a mesma espécie que ele foi
agrupado na árvore filogenética.
Trabalho semelhante foi realizado por Carvalho Filho (2013), que ao analisar a
mesma região genômica, relata que a região ITS é suficiente para identificar isolados de
Trichoderma spp., comparando sequências depositadas no NCBI GeneBank. CORABIADELL (2005), estudando a filogenia usando a mesma região, também corrobora com
resultados encontrados neste trabalho, ao identificar os isolados de Trichoderma spp usando a
região transcrita. REYES-FIGUEROA (2016), também conseguiu identificar em nível de

espécie seus isolados de Trichoderma spp, apenas com esta região e com suporte em árvore
com escore mais baixos que os encontrados neste trabalho. MENEZES et al.,(2010)
concluíram que o sequenciamento da região ITS foi um eficiente método para identificação e
separação de isolados de Trichoderma spp. LIMA- LUZ, (2012) corrobora com os autores
acima citados ao concluir a eficiência na identificação de isolados de Trichoderma spp.
oriundos de solos agrícolas do Norte do Maranhão.
Samuels (2004), em seu estudo não identificou alguns isolados a nível de espécie,
devido ao fato desta região ser muito conservada. Por este motivo os isolados que não foram
identificados tiveram outra região genômica sequenciada (EF1 – Translation elongation) e
concatenadas com a região transcrita para identificar a espécie destes isolados. Jaklitsch
(2015), relata que a região RPB1 e RPB2 também são regiões que apresentam elevado
número de loci e que dá também um grande suporte pra identificação molecular de isolados
de Trichoderm spp. e de sua forma Teleomorfica.
Sanchez e Rebolledo (2010), comentam que as pesquisas voltadas a biologia
molecular com Trichoderma ainda são muito escassas e que apartir do estudo realizado por
ele com a região ITS foram descritas quatro novas especies.
As árvores filogenéticas geradas mostraram que os isolados foram identificados
corretamente, uma vez que, os grupos resultaram em ramos contendo indivíduos pertencentes
a suas respectivas seções e espécie, com seu alto grau de similaridade e suporte nos clados e
nos ramos.
3.4. CONCLUSÕES
Os fungos Fusarium falciforme, Neoscytalidium sp. e o oomiceto Phytophthora sp. são
agentes causais da podridão radicular da mandioca cv Rosinha no estado de Alagoas.
As espécies de Trichoderma capazes de controlar F. falciforme são T. harzianum (T2,
T3 e T6), T. citrinoviride (T5) e T. orientale (T15)
Todos os isolados de Trichoderma spp. testados foram capazes de inibir o crescimento
micelial do F. falciforme.
Os isolados de Trichoderma sp., T2; T3; T5; T6; T10; T13; T15 produzem substâncias
bioativas capazes de alterar a cor do meio e favorecer a atividade de biocontrole sobre

Fusarium falciforme, sendo que os isolados testados T2; T3 apresentam reação mais rápida de
biocontrole, seguidos dos isolados T6; T5 e T15 respectivamente

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ALFENAS, A. C.; FERREIRA, F. A.; MAFIA, R.G.; GONÇALVES, R. C. Isolamento
de fungos fitopatogênicos. In: ALFENAS, A. C.; MAFIA, R. G.; M (Ed.). Métodos em
Fitopatologia. Viçosa, MG: UFV, p. 53-90. 2007.

ALVES, A. A. C.; SILVA, A. F. Cultivo da mandioca para a região semi-árida. Cruz
das Almas: EMBRAPA-CNPMF, 2003.

AGUIAR, A. R.; AGUIAR, D.; TEDESCO, S. B., & SILVA, A. C. F. Antagonismo a
fungos associados às sementes de Paspalum notatum flügge por Trichoderma.
Enciclopédia biosfera, Centro Científico Conhecer - Goiânia, v.9, n.17; p. 198. 2013.

AMORIM, L.; REZENDE, J. A. M.; BERGAMIN FILHO, A. Manual de
Fitopatologia. Piracicaba: Agronômica Ceres. v. 1,4. Ed, p. 383 -387, 2011.

BANDYOPADHYAY, R. et al. Fusarium species from the cassava root rot complex in
West Africa. Phytopathology, v.96, p.673-676, 2006

BARATTO, C. M. et al. Seleção de microrganismos produtores de enzimas hidrolíticas
isolados da região do meio oeste de Santa Catarina, Brasil. Evidência-Ciência e
Biotecnologia, Joaçaba v. 11 n. 2, p. 15-28, julho/dezembro 2011.

BARRA, V. R. et al.. Potencialidade antagonística em alguns procariotas agentes de
biocontrole de enfermidades de plantas. Summa Phytopathologica, v.34, n.2, p.121126, 2008.

BASSO, T. P.; GALLO, C. R.; BASSO, L. C. Atividade celulolítica de fungos isolados
de bagaço de cana-de-açúcar e madeira em decomposição. Pesquisa Agropecuária
Brasileira, v. 45, n. 11, p. 1282-1289, 2011

BAUERMEISTER, A. et al. 1,3-Glucanases Fúngicas: produção e aplicações
biotecnológicas. LONDRINA SP. Semina: Ciências Exatas e Tecnológicas, v. 31, n. 2,
p. 75-86. 2010.

BELL, D.K. et al. In vitro antagonism of Trichoderma species against six fungal plant
pathogens. Phytopathology, v.72, p.379-382, 1982.

BISPO, A. S. R. Bioprospecção de actinomicetos isolados de solos noestado da Bahia e
seu potencial na produção de enzimas lingocelulolíticas. 2010. 104f. Dissertação
(Mestrado em Microbiologia Agrícola) – Universidade Federal do Recôncavo da Bahia,
Cruz das Almas-BA. 2010.

BIZI, R. M., Utilização de fungos no Controle Biológico de Doenças. <
http://www.floresta.ufpr.br/alias/lpf/public_html/contbio03.html.>

Acesso

em

16/11/2015.

BOMFIM, M. P., Antagonismo in vitro e in vivo de Trichoderma spp. a Rhizopus
stolonifer em maracujazeiro amarelo. Vitória da Conquista BA, 2007. 74f.:
Dissertação (Mestrado em Agronomia do Programa de Pós Graduação da Universidade
Estadual do Sudoeste da Bahia). Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia, Unidade

Acadêmica Vitória da Conquista BA. 2007.

BOMFIM, M. P., SÃO JOSÉ, A. R., REBOUÇAS, T. N. H., ALMEIDA, S. S. D.,
BORTOLAZZO, N. G.. Isolamento e seleção de fungos celulolíticos para hidrólise
enzimática do bagaço de cana-de-açúcar. 2011. 77f. Dissertação de mestrado. Escola
Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz. 2011.

BRAGA, R. M. et al. Avaliação da Produção de Celulase por Cepas de Fusarium.
XVII Simpósio Nacional de Bioprocessos. 6p. Natal-RN de 02 a05 de agosto de 2009.

BRITO, F. S.; MILLER, P. R. M., STADNIK, M. Presença de Trichoderma spp em
composto e suas características para o controle de fitopatógenos. Porto Alegre ISSN:
1980-9735. Rev. Bras. de Agroecologia, , p. 43-53. 2010.

BUENO, C. J. et al. Produção de enzimas extracelulares por Fusarium solani de
maracujazeiro amarelo. Tropical Plant Pathology, 343-346.2009.

CANCELA, K. C., Controle Biológico Florestal Conceitos, Terminologia, Descrição
e

Caracterização

de

Agente.

Proteção

florestal

Disponível

em

<http://www.floresta.ufpr.br/alias/lpf/public_html/contbio01.html>

Acesso

em

16/11/2015.

CARDOSO, A.M.S.. "Caracterização filogenética, biológica e patogênica de
espécies do complexo Fusarium solani-FSSC associadas à podridão do colo do
maracujazeiro." 2015. 72f. Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de Lavras
UFLA. Lavras Minas Gerais. 2015.

CARVALHO FILHO, M. R. D. Identificação e relações filogenéticas, potencial de
uso de isolados de Trichoderma no controle do mofo branco e como promotores de
crescimento do feijoeiro. 2013. 123f. Tese de doutorado do programa de PósGraduação em Fitopatologia, do Departamento de Fitopatologia da Universidade de
Brasília. BRASÍLIA DISTRITO FEDERAL –BRASIL. 2013

CARVALHO, A. C., Bioprospecção de isolados de Trichoderma stromaticum para o
controle biológico da Vassoura-de-Bruxa do Cacaueiro. 2006. 82f. Dissertação.
Universidade Estadual de Santa Cruz. 2006.

CHAVERRI, P. et al. Hypocrea/Trichoderma: species with conidiophore elongations
and green conidia. Mycologia, v.95, n.6, p.1100-40, 2003

CHEHRI, K., SALLEH, B., and ZAKARIA, L. "Morphological and phylogenetic
analysis of Fusarium solani species complex in Malaysia." Microbial ecology 69.3
(2015): 457-471. 2015

CONAB - COMPANHIA NACIONAL DE ABASTECIMENTO. Perspectivas para a
agropecuária. Conab, Brasília, v.1, 154p. 2013.

CORABI-ADELL, C.. Biodiversidade do gênero Trichoderma (Hypocreales-Fungi)
mediante técnicas moleculares e análise ecofisiográfica. 2005.220f Tese apresentada
ao Instituto de Biociências da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”,
Campus de Rio Claro, Ciências Biológicas, Área de Concentração: Biologia Celular e
Molecular .Rio Claro Estado de São Paulo – Brasil. 2005.

COTHER, E.J. & GRIFFIN, D.M. Chlamydospore germination in Phytophthora
drechsleri. Transactions British Mycological Society, v.61, p.273-279, 1974.

DA MATA, J. F. et al. Emprego de extratos orgânicos e aquoso obtidos a partir de
isolados de Trichoderma spp. no controle de fitopatógenos. BIOFAR (Revista de
biologia e farmácia), v.2,n.2 , p.12-23, 2008.

DA SILVA, D. C. V., TIAGO, P. V., e DE SOUZA-MOTTA, C. M. . Isolamento e
seleção de fungos filamentosos do solo de sistemas agroflorestais do Município de Bom
Jardim (PE) com base na capacidade de produção de enzimas hidrolíticas1. Revista
Brasil. Bot, 34(4), 607-610. 2011.

DE BRITO, J. P. C.; LOPES, F. A. C.; ULHOA, C. J. Avaliação da atividade de αManosidase, α-arabinofuranosidase e lipase secretada por isolados de Trichoderma
spp.em presença de parede celular de Fusarium solani, Fusarium oxysporum,
Rhizoctonia solani e Sclerotinia sclerotiorum. Instituto de Ciências Biológicas,
Universidade

Federal

de

Goiás,

Brasil.

http://www.sbpcnet.org.br/livro/63ra/conpeex/pivic/trabalhos/JOAO_PAU.PDFisponíve
l em . Visitado em 04 de fevereiro de 2016.

DEMAIN, A. L. Microbial biotechnology. Trends in biotechnology, v. 18, n. 1, p. 2631, 2000.

DIAS, P. P., Controle biológico de fitopatógenos de solo por meio de isolados de
fungos do gênero Trichoderma e sua contribuição no crescimento de plantas. 2011.
101 f. Tese Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro. Seropédica - Rio de Janeiro.

2011.

DODD, S.L., LIECKFELDT, E., SAMUELS, G.J. Hypocrea atroviridis sp. nov., the
teleomorph of Trichoderma atroviride. Mycologia, v.95, n.1, p.27-40, 2003.
FUKUDA, C. Podridão das Raízes da Mandioca. Cruz das Almas: Embrapa
Mandioca e Fruticultura, Mandioca em Foco, 1991.

DOS SANTOS, H.A. Trichoderma spp. como promotores de crescimento em
plantas e como antagonistas a Fusarium oxysporum. 2008. Tese de Doutorado. Tese
de, Universidade de Brasília. 2008.

ELIAS, A.; FERREIRA, A.B.M.; BUENO, C.J. Produção in vitro de enzimas
extracelulares por fungos e sua relação com os sintomas descritos em planta hospedeira.
Summa Phytopathologica,v.41, n.4, p315-317, 2015.

FACCHIN, S. Isolamento de microrganismos e seleção de enzimas microbianas
com aplicações biotecnológicas no tratamento de esgotos tratamento de esgotos.
2013. 87f. Tese (Pós-Graduação em Genética do Departamento de Biologia Geral do
Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais). PhD Thesis.
Universidade Federal de Minas Gerais. 2013.

FAHEINA JUNIOR, G.S. Produção de celulases por fermentação submersa
utilizando microorganismos prospectados em coleções de culturas nacionais. 2012.
75f. Dissertação (Mestrado) –Universidade Federal do Ceará, Centro de Tecnologia,
Departamento de Engenharia Química, Programa de Pós-Graduação em Engenharia
Química, Fortaleza, 2012.

FELDMAN, K.A.; LOVETT, J.S.; TSAO, G.T. Isolation of the cellulose enzymes from
the termophilic fungus Thermoascus aurantiacus and regulation of enzyme production.
Enzyme and Microbial Technology, New York, v.10, p. 262-272, 1988.

FERNANDES, A. P. Avaliação do potencial enzimático de fungos filamentosos
isolados de diferentes fontes. Dissertação de mestrado em Ciências do Alimento. 2009.
58f . Universidade Federal de Lavras- UFLA, 2009.

FIPKE, G. M; PAZINI, J.B.; ETHU,L. Z. Antagonismo de isolados de Trichoderma
spp. ao Sclerotinia sclerotiorum em diferentes temperaturas. Magistra, Cruz das Almas
BA, V. 27, N.1, p. 23 – 32, Jan./Mar. 2015.

FIRN, D. & JONES, C. G. Natural products–a simple model to explain chemical
diversity. Natural product reports, v. 20, n. 4, p. 382-391, 2003.

FLORENCIO, C., COURI, S., FARINAS, C. S. Correlation between agar plate
screening and solid-state fermentation for the prediction of cellulase production by
Trichoderma strains. Enzyme Research, p.1-7, 2012.

FRAIFE

FILHO

G.

A.,

BAHIA

J.

J.

S.,

Mandioca.

Ceplac-Cepec-BA.

http://www.ceplac.gov.br/radar/mandioca.htm . Acessado em 26 de novembro de 2015.

FRANTZ, S. C.; CARREIRO, S. C.; SILVA, J. B. A. Produção de enzimas
hidrolíticas por fungos isolados de folhas em decomposição. 10° seminário de
Iniciação cientifica da UFT. Câmpus de Palmas. 5p. 25 a 28 de novembro de 2014.

FUNGARO, M. H. P, MACCHERONI Jr, W. Melhoramento genético para produção
de enzimas aplicadas a Indústria de Alimentos. In: MELO, I. S, VALADARES
INGLIS, M. C., NASS, L. L., VALOIS, A. C. C., ed. Recursos Genéticos e
Melhoramento-Microrganismo . Jaguariúna, São Paulo, Brasil: Embrapa Meio
Ambiente, p. 426-453, 2002.

FURLANETO, M.C. Recombinação genética e produção de celulases em
Trichoderma Pseudo Koningii Var . 1989. 152 p. Dissertação (Mestrado) - Escola
Superior de Agricultura“Luiz de Queiroz”, Universidade de São Paulo, Piracicaba,
1989.

GALLIANO, H.; GAS, G.; DURANT, H. Lignocellulose biodegradation and ligninase
excretion by mutant strains of Phanerochaete chrysosporium hyperproducing cellulases.
Biotechnology Letters, Dordrecht, v. 10, p. 655-660, 1988.

GIESE, E. C.; BARBOSA, A. M.; SILVA M.L.C. Glucanases Fúngica: Produção e
aplicações das B -1,3 e -1,6 glucanases. Revista Biotecnologia Ciência e
Desenvolvimento Brasília-DF - ISSN 1414-6347. Edição nº 30 , P.97-104.. jan/jun
2003.

GOMES, J. C.; LEAL, E. C., Cultivo da Mandioca para a Região dos Tabuleiros
Costeiros. In.: Podridão Radicular. Embrapa Mandioca e Fruticultura. Sistemas de
Produção,

11.

ISSN

1678-8796

eletrônica/Jan/2003.https://sistemasdeproducao.cnptia.embrapa.br/FontesHTML/
Mandioca/mandioca_tabcosteiros/doencas.htm . Acesso 13/12/2015.

Versão

GUIMARÃES, S. S. C.. Fusarium solani associado à soja no Brasil : morfologia,
filogenia molecular e patogenicidade. 2010. 65f. Tese (doutorado) – Universidade
Federal de Lavras, 2010

GUIMARÃES, G. R. Controle de Cladosporium herbarum e promoção de
crescimento do feijoeiro pelo emprego de Trichoderma harzianum. 2014. 54f.
Dissertação (Mestrado) Universidade Estadual de Goiás –Unidade Universitária de
Ipameri, 2014.

HARMAN, G. E. Myth and dogmas of biocontrol changes in perceptions derived from
research on Trichoderma harzianum T-22. Plant Disease, St. Paul, v. 84, p.377-393,
2000.

HOFFMANN, C. A. et al.. Potencial de antagonismo de isolados de Trichoderma sp.
contra o isolados de Fusarium sp., in vitro. Revista Verde de Agroecologia e
Desenvolvimento Sustentável, v. 10, n. 1, p. 236-242, 2015.

HOHENFELD, C. S.. Podridão radicular da mandioca: metodologias de inoculação
e seleção de fontes de resistência. 2016.. 86f. Dissertação (Recursos Genéticos
Vegetais) Universidade Federal do Recôncavo da Bahia. Cruz das Almas, BA.2016.

HYDE, K. D et al.One stop shop: backbones trees for important phytopathogenic
genera: I Fungal Diversity, 67(1), 21-125. 2014.

ISAIAS, C.O. et al. Ação antagônica e de metabólitos bioativos de Trichoderma spp.
contra

os

patógenos

Sclerotium

rolfsii

Phytopathologica v.40, n.1, p.34-41, 2014.

e

Verticillium

dahliae.

Summa

JAKLITSCH, W. M.; VOGLMAYR, H. Biodiversity of Trichoderma (Hypocreaceae)
in Southern Europe and Macaronesia. Studies in mycology, 80: 1-87. 2015.

JAYAPRAKASHVEL, M. et al.. Hydrogen cyanide mediated biocontrol potential of
Pseudomonas sp. AMET1055 isolated from the rhizosphere of coastal sand dune
vegetation. Adv. Biotech.9(10): 39-42. 2010.

JAMAL, C. M. et al. O uso de extratos vegetais no controle alternativo da podridão
pós- colheita da banana. In: SIMPÓSIO NACIONAL DO CERRADO, IX ,
2008,ParlaMundi. Anais. Brasília, DF: EMBRAPA Cerrados, p. 1-9. 2008.

KUPPER, K.C.; GIMENES-FERNANDES, N.; GOES, A. Controle biológico de
Colletotrichum acutatum , agente causal da queda prematura dos frutos cítricos.
Fitopatologia Brasileira, Viçosa, v. 28, n. 3, p. 251-257, 2003.

KWON-CHUNG, K.J.; BENNETT, J.E. - Medical mycology. Philadelphia, Lea &
Febiger, 866p. ill. 1992.

LARANJEIRA, D. et al. Ocorrência da podridão negra da maniva e raiz da mandioca
(Manihot esculenta) causada por Scytalidium lignicola no estado de Pernambuco,
Brasil. Fitopatologia brasileira, Brasília, v. 19, n. 3, p. 466-469, 1994.

LAZAROTTO, M. et al. Seleção in vitro de Isolados de Trichoderma spp. com
Potencial de Antagonismo a Isolados Patogênicos de Fusarium spp. In: XVI
Simpósio De Ensino, Pesquisa E Extensão, Unifra, v. 3, 2012.

LIMA- LUZ, R., Identificação e aspectos de biocontrole de isolados de Trichoderma

spp. oriundos de solos agrícolas do Norte do Maranhão. 2012. 126f. Dissertação
(Apresentada ao Programa de Pós -Graduação em Biologia Parasitária). Universidade
Ceuma pró-reitoria de Pós-Graduação, Pesquisa e extensão, mestrado em biologia
parasitária - CEUMA. São Luiz do Maranhão. 2012.

LOBO JUNIOR, M.; ABREU, M.S. Inibição do crescimento micelial de Sclerotinia
sclerotiorum por metabólitos voláteis produzidos por alguns antagonistas em diferentes
temperaturas e pH’s. Ciência Agrotécnica, Lavras, v.24, p.521-526, 2000.

LOPES , F.A.C. et al. Biochemical and metabolic profiles of Trichoderma strains
isolated from common bean crops in the Brazilian cerrado, and potential antagonism
against Sclerotinia sclerotiorum. Fungal Biology, v.116, p.815 -824, 2012.

LUZ, J. S.; SILVEIRA, E. B.; CAVALCANTE, U. M. T. Atividade enzimática de
fungos endofíticos e efeito na promoção do crescimento de mudas de maracujazeiroamarelo. Revista Caatinga, v. 19, n. 2, 2006.

MACHADO, A. R. et al.. New occurrences of Botryosphaeriaceae causing black root
rot of cassava in Brazil. Tropical Plant Pathology, v.39, p.464-470, 2014.

MACIEL, C. G. et al. Antagonismo de Trichoderma spp. e Bacillus subtilis (UFV3918)
A Fusarium sambucinum em Pinus elliottii ENGELM. Revista Árvore, Viçosa-MG,
v.38, n.3, p.505-512, 2014.

MARCELLO, C. M. Avaliação da expressão e caracterização de uma exo-b-1,3glucanase envolvida no mecanismo de micoparasitismo de Trichoderma asperellum.
Brasília-DF, 2008. 89f. Tese de Doutorado. Laboratório de Enzimologia Departamento

de Biologia Celular do Instituto de Biologia da Universidade de Brasília – UnB. Brasília
– DF. 2008.

MARQUES, H. I. P. et al. Inibição do crescimento micelial de Trichoderma harzianum
por fertilizantes líquidos. Enciclopédia Biosfera, v. 10, n. 18, p. 2040, 2014.

MASOLA JUNIOR, N.S. BEDENDO, I.P. Doenças de mandioca. In: KIMAT, H;
AMORIN, L; REZENDE, J.A.M; BERGAMIN FILHO, A; CAMARGO, L.E.A (Eds.).
Manual de Fitopatologia. Doenças de plantas cultivadas. Agronômica Ceres, v.2, p
399-455, 2005.

MATOS, F. B. D. Isolamento e caracterização de fungos isolados de ambiente
marinho. 2012). 63f.

Dissertação de mestrado (Programa de Pós-graduação em

Microbiologia Agrícola e do Ambiente Universidade Federal do Rio Grande do Sul Instituto de Ciências Básicas da Saúde) 2012.

MATOS, K. DA S. et al. Estudo in vitro da potencialidade de Trichoderma spp., no
biocontrole de Fusarium guttiforme. ENCICLOPÉDIA BIOSFERA Centro Científico
Conhecer - Goiânia, v.10, n.19; p. 2014-2234. 2014.

MENEZES, J. P. et al. Variabilidade genética na região ITS do rDNA de isolados de
Trichoderma spp.(Biocontrolador) e Fusarium oxysporum f. sp. Chrysanthemi. Ciência
e Agrotecnologia, 34(1), 132-139. 2010.

MICHEREFF, S.J.; MENEZES, M.; MARIANO, R.L.R. Potencial de Trichoderma
para o controle da antracnose do sorgo. Fitopatologia Brasileira, Brasília, v. 18, p.
392-398, 1993.

MUNIZ, M. F. S. et al.Caracterização de isolados de Phytophthora drechsleri, agente
causal da podridão mole de raízes de mandioca.Fitopatologia Brasileira, Brasília, v.
31, p. 195-198, 2006.

NALIM F.A. et al. New species from the Fusarium solani species complex derived
from perithecia and soil in the Old World tropics. Mycologia 103:1302–1330.2011.

NASCIMENTO JÚNIOR, N. A. Efeito da casca de mandioca no controle da
podridão radicular causada por Phytophthora sp. em mandioca de mesa (Manihot
esculenta Crantz) var. Rosinha em ambiente irrigado. Rio Largo-AL,2015.82f. Tese
de Doutorado. (Programa de Pós-Graduação em Proteção de Plantas da Universidade
Federal de Alagoas.Alagoas. 2015.

NASCIMENTO, R. F. Q. B. L. P. et al.Prospecção de fungos da caatinga produtores de
antibióticos. Revista Saúde & Ciência Online, v. 3, n. 3, p. 76-85, 2014.

NOTARO, K. A.et al. Prospecção de fitopatógenos associados á podridão radicular da
mandioca em Pernambuco, Brasil. Biosci. J., Uberlândia, v. 29, n. 5, p. 1832-1839,
2013.

NOTARO, K. A. Prospecção de fitopatógenos e caracterização de solos arenosos
envolvidos na supressividade ou conducividade da podridão radicular da
mandioca, causada por Scytalidium lignicola/ Krystal de Alcantara Notaro.
Garanhuns-PE, 2012. 111f. Dissertação (PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM
PRODUÇÃO AGRÍCOLA). Universidade Federal Rural de Pernambuco – Unidade
Acadêmica de Garanhuns, 2012.

NUNES, G. F. O et al. Atividade enzimática de isolados de rizóbio obtidos de
nódulos de leguminosas forrageiras. 4p. 34º Congresso Brasileiro de Ciencias do
solo.. Florianopolis-SC julho/agosto de 2013.

O`DONNELL, K. Molecular phylogeny of the Nectria haematococca-Fusarium solani
species complex. Mycologia,[S.l.], v. 92, n. 5, p. 919-938, Mar. 2000.
O’DONNELL, K. et al. Molecular phylogenetic diversity, multilocus haplotype
nomenclature, and in vitro antifungal resistance within the Fusarium solani species
complex. Journal Clinical Microbiology,[S.l.], v. 46, n. 8, p. 2477-2490, Aug.2008.
O`DONNELL, K. et al. Soybean Sudden Death Syndrome Species Diversity Within
North and South America Revealed by Multilocus Genotyping. Phytopathology, [S.l.],
v. 100, n. 1, p. 58-71, Jan. 2010.
O’DONNELL K. et al. RPB1 and RPB2 phylogeny supports an early Cretaceous origin
and a strongly supported clade comprising all agriculturally and medically important
fusaria. Fungal Genet Biol 52:20–31. 2013.

OLIVEIRA, A. N. et al. Enzimas hidrolíticas extracelulares de isolados de rizóbia
nativos da Amazônia central, Amazonas, Brasil. Ciênc. Tecnol. Aliment. 26: 853-860.
2006.

OLIVEIRA, L. G. et al. Atividade proteolítica de fungos de solo fitopatogênicos ao
Feijão-Caupi [Vigna unguiculata (L.) Walp.] In: III CONAC Congresso Nacional de
Feijão-Caupi. Pernambuco. 4p. Resumo expandido. Recife Pernambuco. 22-24 de abril
de 2013.

OLIVEIRA, N. T. de et al. Caracterização e identificação de clones de mandioca
produzidas em Roraima para o consumo in natura. Revista Agro@mbiente On-line, v.
5, n. 3, p. 188-193, 2012.

ORLANDELLI, R. C. et al. Enzimas de interesse industrial: produção por fungos e
aplicações.Revista saúde e biologia, v.7,n.3, p.97 -109, 2012

PÁDUA, R. R. et al. Avaliação e caracterização de potenciais antagonistas de
Sclerotium rolfsii pertencentes ao gênero Trichoderma . Boletim de pesquisa e
desenvolvimento/Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia . Brasília, DF, ISSN
1676 - 1340; Boletim 165, 23 p. Dez. 2007.

PEREIRA, C O.F. Estudo da patogenicidade e controle biológico de Fusarium sp.
Com Trichoderma sp. 2013.74f. Dissertação. Universidade de Caxias do Sul. 2013.

PEREIRA, F. F. O. Produção, purificação e caracterização da atividade proteolítica
produzida por Trichoderma harzianum. 2011 72f. Dissertação (mestrado) –
Universidade Católica de Brasília, 2011.

PEREIRA, V. M. Avaliação do potencial enzimático de fungos filamentosos e
otimização da produção de celulases por Aspergillus sulphureus (Fresen) Wehmer,
2012. 111 f. : Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de Lavras, 2012.

POLTRONIERI, L. S. et al. Incidência de Fusarium solani em mandioca no estado do
Pará. Fitopatologia Brasileira, Brasília, v. 27, n. 5,p. 544, 2002.

RAMOS, E.H.S. Avaliação da produção de celulases por fungos filamentosos

utilizando bagaço de cana como substrato. 2012. 59f. Dissertação (Mestrado)–
Universidade Federal de Pernambuco. Centro de Ciências Biológicas, Bioquímica e
Fisiologia, 2012

REYES-FIGUEROA, O. et al. Trichoderma species from the cacao agroecosystem with
biocontrol potential of Moniliophthora roreri. Revista Chapingo. Serie Ciencias
Forestales y del Ambiente, 22(2), 149-163. 2016.

ROVEDA, M.; HEMKEMEIER, M.; COLLA, L. M.. Avaliação da produção de lipases
por diferentes cepas de microrganismos isolados em efluentes de laticínios por
fermentação submersa. Ciência e Tecnologia de Alimentos, v. 30, n. 1, p. 126-131,
2010.

RUEGGER, M.J.S.; TAUK-TORNISIELO, S.M. Atividade da celulase de fungos
isolados dosolo da Estação Ecológica de Juréia-Itatins. São Paulo, Brasil. Revista
Brasileira de Botânica, São Paulo, v. 27, p. 205-211, 2004.

SACCO, L. P. Isolamento de bactérias produtoras de enzimas de interesse em
processos biotecnológicos. , 2013.47f.Dissertação (mestrado) Universidade Estadual
Paulista, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, Jaboticabal-SP 2013.

SAMUELS, G.J., CHAVERRI, P., FARR, D.F., MCCRAY, E.B. (n.d.) Trichoderma
Online, Systematic Botany & Mycology Laboratory, ARS, USDA. (http://nt.arsgrin.gov), 2004.
SUMMERBELL, R. C.; SCHROERS H.J. Analysis of phylogenetic relationship of
Cylindrocarpon lichenicola and Acremonium falciformeto the Fusarium solani species

complex and a review of similarities in the spectrumof opportunistic infections caused
by these fungi. Journal Clincal Microbiology, Utrecht, v. 40, n. 8, p. 2866–2875, Aug.
2002.
SÁNCHEZ, V. Y; REBOLLEDO, O. Especies de Trichoderma en suelos cultiva-dos
con Agave tequilana en la región de Los Altos Sur, Jalisco y valoración desu capacidad
antagónica contra Thielaviopsis paradoxa. Revista Mexicana de Micología, 32, 11–18.
2010.

SANTIN, R. C..M., Potencial do uso dos fungos Trichoderma spp. e Paecilomyces
lilacinus no biocontrole de Meloidogyne incognita em Phaseolus vulgaris. 2008. 91p.
Tese (Doutorado Fitotecnia, Área de Concentração Fitossanidade). Porto Alegre, Rio
Grande do Sul. 2008.

SANTOS, C. C. et al. Influência de Trichoderma spp. sobre o crescimento micelial de
Thielaviopsis paradoxa. Scientia Plena 8, 047309 www.scientiaplena.org.br . 2012.

SANTOS, P. L. D. et al. Utilização de extratos vegetais em proteção de plantas.
Enciclopédia Biosfera, 2562-2576. 2013.

SAZCI, A.; RADFORD, A.; ERENLER, K. Detection of cellulolytic fungi by using
Congo red as an indicator: a comparative study with the dinitrosalicyclic acid reagent
method. Journal Applied Bacteriol. v. 61, p. 559–562, 1986.

SERRA, I. M. R. S. et al. Scytalidium lignicola em mandioca: ocorrência no Estado do
Maranhão e reação de cultivares ao patógeno. Summa Phytopathologica, Botucatu, v.
35, n. 4, p. 327-328, 2009.

SILVA, A. N. et al. Efeito de produtos químicos e de Trichoderma spp. no controle de
Fusarium solani do maracujazeiro. Interciencia, v. 6, p. 398-403, 2014.

SILVA, C. A. D. et al.. Interferência da incorporação de matéria orgânica no solo no
controle da podridão negra da mandioca, causada por Scytalidium lignicola. Biosci. J.,
Uberlândia, v. 29, n. 6 , p. 1823-1831, Nov./Dec. 2013.

SILVA, C. A. D., Prospecção em fitopatógenicos e avaliação de fontes de matéria
orgânica sobre a supressividade da podridão radicular da mandioca. GaranhunsPE, 2013. 77 f. Dissertação (Mestrado em Produção Agrícola). Universidade Federal
Rural de Pernambuco – Unidade Acadêmica de Garanhuns, 2013.

SILVA, K. S. et al. Atividade antagônica in vitro de isolados de Trichoderma spp. ao
fungo Phytophthora citrophthora. Semina, Londrina, v. 29, n. 4, p. 749-754, out./dez.
2008.

SILVA, M.B. et al.. Ação antimicrobiana de extratos de plantas medicinais sobre
espécies fitopatogênicas de fungos do gênero Colletotrichum. Revista Brasileira de
Plantas Medicinais, Botucatu, v.10, n.3, p.57-60, 2008.

SILVA, R. A. et al.. Ação do extrato metanólico da Moringa oleifera sobre o
crescimento micelial de fitopatógenos, IV, 2009, Belém. Anais... Belém, PA:. p. 1- 4.
2009.

SILVA, V. M.; MARTINS, C. M.; SILVEIRA, S. C. Atividade celulolítica de
actinobactérias de região semiárida do Ceará. Enciclopédia Biosfera, v. 11, p. 2026-

2036, 2015.

SINGHANIA, R.R. et al.. Advancement and comparative profiles in the production
technologies using solid-state and submerged fermentation for microbial cellulases.
Enzyme and Microbial Technology, v.46, p.541-549, 2010.

SOUZA P. E.A. et al.. Promoção do crescimento do feijoeiro e controle da antracnose
por Trichoderma spp. Pesq. Agropec. Bras., Brasília, v. 47, n. 11, p. 1589-1595, 2012.

SOUZA, H.Q.de.; OLIVEIRA, L.A. de.; ANDRADE,J.S. Seleção de Basidiomycetes
da Amazonia para produção de enzimas de interesse biotecnológico. Ciência e
Tecnologia de Alimentos, Campinas, 2011.

SOUZA, J. R., Potencialidade de fungicida e agente biológico no controle de
requeima do tomateiro. 2013. 63f. Dissertação. Universidade Estadual do Sudoeste da
Bahia, Vitória da Conquista. Bahia – BR. 2013.

SOUZA, K. de A.;VAZ, M. C. A.; ALVES, G. C. S.; PAZ -LIMA, M. L.. Confronto in
vitro de isolados de Trichoderma spp. com fungos filamentosos. 2p. IV Congresso
Estadual de Iniciação Científica do IF Goiano 21 a 24 de setembro de 2015.

STAMFORD, T. L.M.; ARAÚJO, J. M.; STAMFORD, N. P. Atividade enzimática de
microrganismos isolados do jacatupé (Pachyrhizus erosus L. Urban). Ciência e
Tecnologia de Alimentos, v. 18, n. 4, p. 382-385, 1998.

TUITE, J. Plant phathological methods. Mineapolis: Burgess,1969. 239p.

VAZ, M. S. S.Caracterização do gene lip2 de Trichoderma harzianum. 2010. 81 f.

Dissertação (Mestrado)-Escola Superior Agrária de Bragança, Bragança, 2010.

VAZ, A.B. Caracterização biológica e filogenética do agente etiológico da fusariose
da pimenta-do-reino no Brasil. 2013. 62f. Tese (doutorado) –Universidade Federal de
Lavras. Lavras, Minas Gerais. 2013

VENTUROSO, L.R.; BACCHI, L.M.A.; GAVASSONI, W.L. Atividade antifúngica de
extratos

vegetais

sobre

o

desenvolvimento

de

fitopatógenos.

Summa

Phytopathologica, v.37, n.1, p.18-23, 2011.

VIZZOTTO, M.; KROLOW, A. C.; WEBER, G. E.B. Metabólitos secundários
encontrados em plantas e sua importância. Documento : Embrapa Clima Temperado,
Pelotas, n.316, p.7-15. 2010.

WENZEL, J. B. et al.. Atividade enzimática e antimicrobiana de fungos endofíticos
isolados de soja. Biológicas & Saúde, v. 3, n. 9, 2013.

ZAMPIERI, D.; RIBEIRO, R. T. D. S. Avaliação qualitativa da secreção de enzimas
hidrolíticas por fungos endofíticos isolados do cacaueiro (theobroma cacao L.) E o
controle biológico de crinipellis perniciosa. Salão de iniciação Científica (17.: 2005:
Porto Alegre, RS). Livro de resumos. Porto Alegre: UFRGS, 2005.

ZUCCHI, F. O Trichoderma sp. em áreas agrícolas visando o controle de doenças
fúngicas de raízes de plantas cultivadas. Campinas SP. JV Biotecnologia. 15p. 2010.

4.EFEITO DE Trichoderma spp. SOBRE O CRESCIMENTO DE
Fusarium falciforme e ATIVIDADE ENZIMÁTICA DE Trichoderma
spp.
RESUMO
A antibiose, a produção de substâncias bioativas e a excreção de enzimas capazes de
impedir o desenvolvimento ou resultar na completa lise e dissolução da estrutura
celular, independente do contato físico. Estes metabólitos mesmo em baixa
concentração interferem nas atividades biológicas, na redução ou paralisação do
crescimento e esporulação, redução na germinação de esporos, além de distorções na
hifa e endólise. O objetivo desse trabalho foi avaliar a capacidade de isolados de
Trichoderma spp. em inibir o desenvolvimento de Fusarium falciforme e detectar o
índice enzimático dos isolados de Trichoderma spp. (T2; T3; T5; T6 e T15) e de F.
falciforme, agente causal da podridão radicular da mandioca de mesa var. Rosinha. Para
obtenção dos extratos foram utilizados meio BD com crescimento micelial dos isolados
de Trichoderma spp. que foram centrifugados (duas vezes) durante 15 minutos a
4000rpm. O sobrenadante foi utilizado como extrato bruto. Utilizou-se ainda, o extrato
térmico (100°C) e extrato autoclavado (120°C a 1atm, durante 15 minutos). Para
detecção do índice enzimático foram utilizados isolados de Trichoderma spp. e de F.
falciforme, cultivados em meios de culturas específicos para cada enzima. Os extratos
brutos de T. harzianum (T2, T3 e T6), T. citrinoviride (T5) e T. orientale (T15) são
eficientes em inibir o desenvolvimento de Fusarium falciforme, sendo o extrato bruto a
50°C, o que proporcionou a maior porcentagem de redução de crescimento micelial
(85%), seguido do extrato a 100°C (59%) e 121°C (40%). As espécies de T. harzianum
(T2, T3 e T6), T. citrinoviride (T5) e T. orientale (T15) bem como o isolado de F.
falciforme produziram as enzimas amilase, celulase, gelatinase, lípase, protease e
quitinase. As espéceis T. harzianum (T3 e T6) e T. citrinoviride (T5) apresentaram o
maior desempenho na produção das enzimas.
Palavras - Chave: Bioativos, Biocontrole, fitopatógeno, antagonismo.

ENZYMATIC ACTIVITY OF ISOLATES OF Trichoderma spp E
EFFECT ON THE DEVELOPMENT OF Fusarium sp
ABSTRATIC
The antibiosis, the production of bioactive substances and the excretion of enzymes
capable of impeding the development or result in the complete lysis and dissolution of
the cellular structure, independent of the physical contact. These metabolites even in
low concentration interfere in biological activities, in the reduction or paralisation of
growth and sporulation, reduction in spore germination, besides distortions in the hypha
and endolysis. The objective of this work was to evaluate the capacity of Trichoderma
spp. In inhibiting the development of falciform Fusarium and to detect the enzymatic
index of the isolates of Trichoderma spp. (T2, T3, T5, T6 and T15) and F. falciformis,
causal agent of root rot of cassava var. Rosinha. To obtain the extracts were used BD
medium with mycelial growth of the isolates of Trichoderma spp. Which were
centrifuged (twice) for 15 minutes at 4000 rpm. The supernatant was used as crude
extract. The thermal extract (100 ° C) and autoclaved extract (120 ° C at 1atm, for 15
minutes) were also used. Trichoderma spp. Isolates were used to detect the enzymatic
index. And S falciform, cultured in culture media specific for each enzyme. The crude
extracts of T. harzianum (T2, T3 and T6), T. citrinoviride (T5) and T. orientale (T15)
are efficient in inhibiting the development of falciform Fusarium, the crude extract
being at 50 ° C, which provided The highest percentage of mycelial growth reduction
(85%), followed by the extract at 100 ° C (59%) and 121 ° C (40%). The T. harzianum
(T2, T3 and T6), T. citrinoviride (T5) and T. orientale (T15) species as well as the F.
falciform isolate produced the enzymes amylase, cellulase, gelatinase, lipase, protease
and chitinase. The species T. harzianum (T3 and T6) and T. citrinoviride (T5) showed
the highest performance in the production of the enzymes.

Keyword: Bioactive, Biocontrol, plant pathogens, antagonism.

4.1. INTRODUÇÃO
Um dos mecanismos importantes dos biocontroladores é a produção de
substâncias bioativas voláteis ou não voláteis que são capazes de impedir o
desenvolvimento de outros organismos de espécies diferentes (DIAS, 2011;
CARVALHO

FILHO,

2013).

A

produção

de

metabólitos

por

organismos

biocontroladores pode resultar na completa lise e dissolução da estrutura celular e
independe do contato físico entre os microrganismos (BETTIOL, 1991). Carvalho
(2006), afirma que a capacidade de produzir substâncias biocontroladoras pode variar
entre espécies de patógenos e/ou de isolados da mesma espécie.
Segundo Bomfim (2007) e Souza, (2013), o biocontrolador será bem sucedido se
capaz de romper a parede celular (composta por carboidratos, tais como quitina, além de
proteínas e lipídios em quantidades significativas) do fitopatógeno ou interromper os
processos relacionados à sua síntese e muitos agentes de biocontrole são capazes de
secretar essas enzimas.

Portanto, a produção de enzimas que hidrolisem os

componentes da parede celular dos fitopatógenos, particularmente quitinases e
glucanases, se faz importante para o processo de biocontrole. Vários são os mecanismos
utilizados por Trichoderma spp. no controle de fitopatógeno, sendo hiperparasitismo,
antibiose e competição os mais conhecidos.
A secreção de substâncias orgânicas antibióticas produzidas por microrganismos
que em baixa concentração interferem nas atividades metabólicas, na redução ou
paralisação do crescimento e esporulação, redução na germinação de esporos, além de
distorções na hifa e endólise, ou seja, são deletérias a outros organismos, quer de ação
específica ou de amplo aspecto de ação são importantes artifícios para eficiência do
antagonista (LOBO JUNIOR; ABREU, 2000; BOMFIM , 2007; SOUZA, 2013).
Lobo Junior; Abreu, (2000), afirma que antibióticos são produtos do
metabolismo secundário de seus produtores, e podem ser mais importantes na inibição
de outros organismos do que a competição por nutrientes. A produção de metabólitos
por antagonistas no solo ainda não é bem esclarecida, e baseia-se ainda em suposições.
Evidências indicam que várias destas enzimas atuam em sinergismo com outras enzimas
hidrolíticas para lisar a parede celular dos fitopatógenos hospedeiros (CARVALHO,
(2006).
O micoparasitismo é um processo complexo, no qual enzimas líticas secretadas
pelos fungos, como proteinases, quitinases e glucanases, estão envolvidas no processo

de penetração na parede celular do hospedeiro (ETHUR, 2006; CARVALHO, 2006;
BARRA, et al., 2008; AMORIM et al. 2011; DIAS, 2011; CARVALHO FILHO, 2013;
SOUZA, 2011). O processo de destruição física da parede celular pode ser físico ou
metabólico com digestão por enzimas hidrolíticas de hifas, estruturas de reprodução e
sobrevivência dos patógenos de planta, reduzindo a infecção e o inóculo do patógeno
(ETHUR, 2006). Carvalho, (2006), diz de forma esclarecedora que o microorganismo
antagonista vive sobre ou dentro do fungo antagonizado e que dentre as várias etapas a
que merece destaque é a liberação das exoenzimas cuja função supracitada
anteriormente. Zucchi (2010) relata que a atividade micoparasítica necrotrófica tem
grande eficiência em inúmeros fungos fitopatogênicos, principalmente aqueles com
estruturas de resistência consideradas difíceis de serem atacadas por microrganismos,
como esporos, escleródios, clamidósporos e microescleródios.
Assim sendo o objetivo principal desse trabalho foi avaliar a capacidade de
isolados de Trichoderma spp. em inibir o desenvolvimento de Fusarium falciforme e
detectar o índice enzimático dos isolados de Trichoderma spp. (T2; T3; T5; T6 e T15) e
de F. falciforme, agente causal da podridão radicular da mandioca de mesa (Manihot
esculenta Crantz) var. Rosinha.

4.2. MATERIAL E MÉTODOS
4.2.1. . LOCAL DE EXECUÇÃO.

Os trabalhos foram conduzidos no laboratório de Fitopatologia da Unidade
Acadêmica Centro de Ciências Agrárias (CECA) da Universidade Federal de Alagoas
(UFAL) - Campus Delza Gitaí, em Rio Largo, Estado de Alagoas.
4.2.2.

EFEITO

DO

EXTRATO

DE

Trichoderma

spp.

SOBRE

O

DESENVOLVIMENTO DE Fusarium falciforme.

Para obtenção do extrato bruto de Trichoderma, os cinco isolados que
apresentaram melhor nota na escala de Bell et al., (1982) e possível produção de
metabolitos secundários devido a mudança de cor do meio, bem como os que tiveram
melhor taxa de inibição de Fusarium sp., foram usados para o preparo dos extratos.
Cinco discos de BDA (5mm) contendo micélio de Trichoderma (T2; T3; T5; T6;
T15) foram colocados em recipientes de vidro com 200mL de meio líquido BD (Batatadextrose) durante 10 dias, em temperatura ambiente (25°C) e fotoperíodo de
aproximadamente 12h. Após o período de incubação dos isolados, foi observado que os
mesmos apresentaram três fases distintas, as quais foram homogeneizados e 25mL
foram colocados em tubos Falcon (45mL) que foram centrifugados durante 15 minutos
a 4000rpm (Figura 10). Depois de decorrida a centrifugação, o precipitado foi
descartado e o sobrenadante foi mais uma vez centrifugado como na fase anterior.
Depois da segunda centrifugação o sobrenadante foi cuidadosamente pipetado e
separado para os testes com os extratos usando concentrações e temperaturas que
variaram de 5 a 20% e temperaturas de 50 a 120°C. A centrifugação do meio líquido
contendo micélio crescido de Trichoderma spp., foi realizada com o objetivo de
precipitar a massa micelial e os conídios do fungo e utilizar apenas o sobrenadante e
metabólitos por eles produzidos para o controle do patógeno.

Figura 10. Extratos centrifugados dos isolados de Trichoderma spp.

Fonte: SILVA & NASCIMENTO JÚNIOR; (2016).

Para avaliar a atividade antifúngica, os extratos foram submetidos a três
condições de termoterapia: 50°C, 100°C e 120°C a 1 ATM, e quatro concentrações
(5%; 10%; 15% e 20%). O volume foi fixado em 40mL.
No tratamento a 50°C, os extratos dispostos em tubos Falcon, nas devidas
concentrações, tiveram seus volumes completados com meio de BDA a uma
temperatura próxima a 50°C. Em seguida, o meio e o extrato foram homogeneizados e
vertidos em placas de Petri (70mm).
No tratamento a 100°C, os extratos de Trichoderma sp., foram mergulhados,
durante 15 minutos, em Erlenmeyer com água aquecida até o ponto de ebulição
(100°C). A temperatura da água ao fim do tratamento foi de aproximadamente 70°C.
Decorrido o tempo de tratamento, os extratos termicamente tratados foram mais uma
vez centrifugados e os sobrenadantes diluídos nas referidas concentrações, completados
os volumes com BDA obtendo volume final de 40mL e vertidos em placas de Petri.
Para o extrato de Trichoderma sp., autoclavado, recipientes de vidro contendo
meio BD com crescimento micelial de Trichoderma spp., foram autoclavados a 120°C a
1atm durante 15 minutos. Após o procedimento, os mesmos foram centrifugados 2
vezes durante 15 minutos e utilizado o sobrenadante nas concentrações acima citados,
completados os volumes com meio de BDA e vertidos em placas de Petri.
Depois da solidificação do meio de cultura com as devidas concentrações de
extrato, discos de BDA (5mm) contendo Fusarium sp., foram dispostos no centro das

placas, sendo o crescimento micelial observado diariamente, bem como suas alterações
de cor, produção de metabolitos secundários e antibiose, caso houvessem, e o diâmetro
da colônia mensurado com auxílio de paquímetro digital. As placas foram mantidas em
temperatura ambiente (25±1ºC) e fotoperíodo de 12h, por 7 dias.
Como testemunha, utilizou-se o patógeno em meio BDA sem extrato de
Trichoderma spp. Para o cálculo da porcentagem de inibição do crescimento micelial
(PIC) foi aplicada a fórmula proposta por Abbott (1925), sendo que o fim da avaliação
foi no momento que o patógeno atingiu o diâmetro da placa no meio sem extrato
(Testemunha). Para avaliar as interações ocorrida no controle foram aplicadas a escala
de notas de Bell et al., (1982), conforme descrito no item 3.2.4.
O delineamento experimental utilizado foi inteiramente casualizado, com 61
tratamentos, em esquema fatorial 5 x 4 x 3 + testemunha, sendo 5 isolados de
Trichoderma, 4 concentrações, 3 temperaturas e 4 repetições. Os dados foram
submetidos à análise de variância e as médias comparadas pelo teste de Tukey a 5%.

4.2.3. ATIVIDADE ENZIMÁTICA DE ISOLADOS DE Trichoderma spp. E
EFEITO NO DESENVOLVIMENTO DE Fusarium falciforme

Para verificação da atividade enzimática foram utilizados o isolado de Fusarium
sp. e os isolados T2; T3; T5; T6 e T15 de Trichoderma sp., selecionados por
produzirem substâncias bioativas e inibição do fitopatógeno. As enzimas estudadas
foram amilase, celulase, gelatinase, lípase, protease e quitinase, que segundo Bueno et
al. (2009) a atividade destas enzimas no patógeno está relacionada com as doenças nas
plantas. Assim como Bomfim et al., (2010) e Souza (2013), relata que biocontroladores
que apresentam enzimas capazes de degradar a parede celular composta por
carboidratos, tais como quitina, além de proteínas e lipídios em quantidades
significativas do fitopatógeno ou interromper os processos relacionados a sua síntese
serão bem sucedidos no controle. Utilizados a partir das informações previamente
obtidas, os meios de cultura para detecção de halo enzimático abaixo discriminados:

4.2.3.1. Teste enzimático para AMILASE (HANKING e ANAGNOSTAKIS, 1975)

Extrato de carne......................................................3,0g
Ágar ........................................................................15g
Amido .....................................................................3%
Tampão citrato fosfato 0.1 M ............................ 1000mL
O amido e o ágar foram dissolvidos em 500 mL de tampão citrato fosfato
separadamente e homogeneizados. Após esse processamento, o meio de cultura foi
acondicionado em recipiente de vidro e esterilizado a 121°C durante 20 minutos. As
placas de Petri contendo o meio de cultura foram mantidas por seis dias em fotoperíodo
de 12h e temperatura ambiente. Para revelar o halo enzimático foi utilizado vapor de
iodo, e para fotografar, foi utilizado luz UV da câmara de fluxo laminar.
Para a produção de vapor de iodo foi utilizado 15g de cristal de Iodo em 100mL
de ADE em Erlenmeyer de 250mL fechado com tampa de vidro e aquecido em
microondas até formação de vapor. As placas de Petri contendo os meios de cultura e
isolados foram abertas e posicionadas em direção da abertura do Erlenmeyer para entrar
em contato com o vapor durante 15-30 segundos e assim revelado o halo enzimático.

4.2.3.2. Teste enzimático para CELULASE (HANKING e ANAGNOSTAKIS,
1975)

O meio de cultura utilizado para determinar a atividade de celulase foi o Ágar
Carboximetilcelulose preparado com:
Ágar.....................................................................................1,8%
Carboximetilcelulose..............................................................1,0
Tampão Acetato de sódio 0.1M pH 5.0............................500 mL
A carboximetilcelulose (CMC) foi dissolvida em 200 mL de tampão acetato de
Na+ 0.1M pH 5.0, aquecido em microondas. Após a dissolução de CMC, foi adicionado
o restante do tampão (300 mL) e em seguida o ágar. O meio de cultura foi
homogeneizado e esterilizado a 121°C durante 20 minutos. As placas de Petri contendo
o meio de cultura foram mantidas por oito dias em fotoperíodo de 12h e temperatura
ambiente. Para verificar a atividade celulolítica, utilizou-se como solução reveladora

vermelho congo 0,1%, durante 5 minutos, sendo lavados duas vezes com acetato de
sódio para retirar o excesso.

4.2.3.3. Teste enzimático para GELATINASE (HANKING e ANAGNOSTAKIS,
1975)

Extrato de carne....................................................................3,0g
Peptona .................................................................................5,0g
Ágar ...................................................................................20,0g
Gelatina ............................................................................150,0g
Tampão citrato fosfato 0.1 M ..........................................1000mL
Utilizou-se gelatina sem sabor com corante vermelho, que foi adicionada ao
ágar, seguida da dissolução em 500 mL de tampão citrato fosfato. Após a
homogeneização dos ingredientes, o meio de cultura foi acondicionado em recipiente de
vidro e esterilizado a 121°C, durante 20 minutos. As placas de Petri contendo o meio de
cultura foram mantidas por seis dias em fotoperíodo de 12h e temperatura ambiente.
Para revelar a formação do halo enzimático foi utilizado vapor de iodo, e para
fotografar, a luz UV. O meio depois que sofre a ação da enzima fica fluido, desta forma
antes de fotografar as placas foram colocadas em congelador a 12°C por 5 minutos para
solidificar o meio.
4.2.3.4. Teste enzimático para LIPASE (‘Hankin & Anagnostakis (1975)).
Tween 20...............................................................................1mL
Peptona ..............................................................................10,0g
Cloreto de sódio....................................................................5,0g
Cloreto de cálcio...................................................................0,1g
Ágar ...................................................................................17,0g
ADE.....................................................................................1,0L
O Tween 20 foi esterilizado separadamente por 20 minutos a 121°C a 1atm,
posteriormente foi adicionado a 100 mL de meio esterilizado e resfriado. Para auxiliar a
revelação do halo foi adicionado 5mL de Rodamina B.
Para preparar a solução reveladora foi necessário diluir 1g de Rodamina B em
50mL de ADE. Posteriormente foi retirado 0,3mL e diluído em 100mL de ADE. As

placas de Petri contendo o meio de cultura foram mantidas por dez dias em regime
escuro e temperatura ambiente. A revelação foi feita em luz UV da câmara de fluxo
laminar.

4.2.3.5. Teste enzimático para PROTEASE (Lacaz et al., 1991)
Ágar .............................................................................20,0g
Leite desnatado .............................................................100g
ADE............................................................................. 1,0L
O ágar foi dissolvido em 500 mL de água destilada. O leite desnatado foi diluído
em 500mL de água destilada. As soluções foram autoclavadas a 121°C, durante 20
minutos, separadas e após resfriamento (50°C) foram homogeneizadas em câmara de
fluxo laminar. As placas de Petri contendo o meio de cultura foram mantidas por seis
dias em fotoperíodo de 12h e temperatura ambiente. Não foi utilizado nenhum produto
para revelar o halo, que foi fotografado em luz UV.

4.2.3.6. Teste enzimático para QUITINASE (Renwech et al., 1991) com
modificação.
CaCO3.................................................................................0,02g
FeSO47H2O........................................................................0,01g
KCl......................................................................................1,71g
MgSO47H2O.......................................................................0,05g
Na2HPO47H2O...................................................................4,11g
Ágar ....................................................................................15,0g
Quitina coloidal.....................................................................0,8g
Água destilada.......................................................................1,0L
Todos os reagentes foram homogeneizados em 1000mL e autoclavados a 121°C,
durante 20 minutos. As placas de Petri contendo o meio de cultura foram mantidas por
doze dias em fotoperíodo de 12h e temperatura ambiente. Para revelar o halo foi
utilizado vapor de iodo, e para fotografar foi utilizado luz UV.

4.2.4. DETERMINAÇÃO ENZIMÁTICA

O índice enzimático (I.e.) foi calculado somando o diâmetro da colônia e do halo
formado, dividindo o resultado pelo valor do diâmetro da colônia segundo Furlaneto,
(1989). Øc = diâmetro da colônia (mm); Øh = diâmetro do halo (mm):

Foi adotada a escala sugerida pelo autor: (-) 0 a 0,99; (+) 1,0 a 1,10; (++) 1,11 a
1,20; (+++) 1,21 a 1,30; (++++) >1,31. Onde o sinal (-) = não produtor de enzimas; (+)
= produção mínima de enzimas; (2+) = produção fraca de enzimas; (3+) = produção
moderada de enzimas e (4+) = produção intensa de enzimas.

4.2.5. DELINEAMENTO EXPERIMENTAL E ANÁLISE ESTATÍSTICA

O experimento foi conduzido em um delineamento inteiramente casualizado
(DIC) com 36 tratamentos, em esquema fatorial 6 x 6, representados pelos seis isolados
e seis meios de cultura e quatro repetições. Os dados foram submetidos à análise de
variância e as médias comparada pelo teste de Tukey a 5%.

4.3. RESULTADOS E DISCUSSÕES

4.3.1. EFEITO DO EXTRATO BRUTO DE Trichoderma spp.

SOBRE O

DESENVOLVIMENTO DE Fusarium falciforme

Os resultados do efeito do extrato de Trichoderma sobre o desenvolvimento de
Fusarium sp., demonstram grande diversidade no que diz respeito à reação ocorrida
entre o biocontrolador e o fitopatógeno. Foi verificado que, após o segundo dia de
incubação, surgiram pequenas colônias brancas de Trichoderma spp., em todos os
tratamentos e a partir do terceiro dia havia alteração da cor do meio de cultura e também
da cor característica do micélio do fitopatógeno que variava de amarelo a vermelho.
Após o quarto dia, todos os isolados já tinham atingido o diâmetro da placa. As
mudanças na cor do meio variavam com o tempo e a concentração.
A mudança de cor do micélio do fitopatógeno em relação à presença dos
isolados de Trichoderma spp., está relacionada possivelmente, a uma característica de
defesa. Esta capacidade de alteração na coloração do micélio em cultura pura foi
percebida no momento em que o mesmo foi submetido à oscilação de temperatura que
variou de 20-28°C aproximadamente, e quando estava em contato com contaminantes.
A presença do Trichoderma spp., na forma de extrato, e seu desenvolvimento
hifal no meio de cultura, bem como suas atividades hiperparasítica e antibiótica
possivelmente estimulou as defesas do fitopatógeno como mostra a Figura 11.

Figura 11. Efeito dos extratos brutos de Trichoderma spp. sobre a porcentagem de
inibição do crescimento micelial de Fusarium falciforme, aos 3 e 6 dias de incubação:
T2; T3; T5; T6 e T15 (Trichoderma), T0 (Testemunha).

Todos os isolados de Trichoderma mostraram-se eficientes em controlar
Fusarium sp., pois a atividade de biocontrole variou de 79 a 85%, sendo que os isolados
T2 e T3 tiveram a maior PIC superior a 85%, seguidos pelo isolado T6 com PIC
próxima de 84%. Já os isolados T5 e T15 foram os que obtiveram menor desempenho
com PIC de 80,5% e 79,8% respectivamente (Figura 12A). Em relação à concentração
dos extratos verificou-se que o comportamento deles foi linear, quanto maior a
concentração maior é a PIC (Figura 12B).
O modelo quadrático foi o que apresentou o melhor ajuste para a PIC, onde

observa-se que a partir do terceiro dia de incubação ocorreu a diminuição do diâmetro
da colônia, devido ao desenvolvimento dos biocontroladores e início do antagonismo. A

reação do fitopatógeno em relação ao crescimento e as alterações fisiológicas ocorreram
a partir do segundo dia de confronto com o biocontrolador. Estas alterações podem ter
ocorrido devido à reação de defesa do patógeno em resposta a ação antibiótica e/ou
hiperparasitca do biocontrolador, que foi notado no momento em que o fitopatógeno
teve seu desenvolvimento vegetativo retardado e sua coloração alterada (Figura 11). No
terceiro dia, por ação hiperparasítica, o biocontrolador que já havia crescido, paralisado
e alterado fisiologicamente o fitopatógeno (mudança na coloração do micélio), penetra,
se alimenta, cresce e se reproduz sobre ele, para isso obteve-se como resultados a
redução do diâmetro da colônia do fitopatógeno e reprodução do biocontrolador.
No sexto dia o controle do patógeno já estava próximo a 90% e no sétimo dia
verificou-se que todos os isolados de Trichoderma spp. tinham colonizado toda a placa
de Petri e assumido 100% de biocontrole, dando aos isolados testados neste
experimento a nota máxima (1) adotada na escala descrita de Bell (1982), como pode
ser observado na Figura 12C.

Figura 12. Efeito dos extratos de Trichoderma spp. sobre a porcentagem de inibição do
crescimento micelial de Fusarium falciforme: A) atividade de biocontrole dos extratos,
B) efeito da concentração dos extratos e C) Efeito do tempo sobre a PIC.

Muitos trabalhos mostram o potencial de biocontrole exercido por extratos que
liberam bioativos (metabólitos) capazes de fornecer proteção às plantas contra o ataque
de organismos patogênicos (JAMAL et al., 2008;. SILVA et al., 2008; SILVA et al.,
2009; VENTUROSO et al, 2011; SANTOS et al., 2013). Esses bioativos nas plantas
são necessários para sua sobrevivência, mas os metabólitos secundários não possuem
uma atividade imediata na célula, e sim, servem como uma vantagem evolutiva para a
sua sobrevivência e reprodução, atuando como pesticidas naturais contra herbívoros ou
microrganismos patogênicos (VIZZOTTO et al., 2010; VENTUROSO et al., 2011)
Trabalhos realizados com bioativos de microrganismos são em sua maioria com
Trichoderma spp., pois atuam como biocontrolador competindo por nutriente, antibiose
e hiperparasitismo e contam ainda com a produção de bioativos voláteis e não voláteis e
enzimas que potencializa ainda mais a sua atividade (CARVALHO, 2006; BRITO et
al., 2010; ZUCCHI, 2010; DIAS, 2011; DA SILVA et al., 2011; SOUZA PEDRO,

2012; BIZI, 2015; CANCELA, 2015; FIPKE, et al., 2015). Encontra partida poucos
trabalhos relatam a extração destes bioativos em Trichoderma.

4.3.2

EFEITO

DO

EXTRATO

DE

Trichoderma

spp.

TRATADO

TERMICAMENTE SOBRE O DESENVOLVIMENTO DE Fusarium falciforme

O choque térmico de 100°C quando realizado por 15 minutos elevou a
temperatura do extrato até 98ºC e no fim do tempo decorrido caiu para 70°C,
temperatura ainda muito alta e que possivelmente rompeu as paredes das hifas,
inviabilizando os biocontroladores.
O tratamento do extrato a esta temperatura foi para inviabilizar as estruturas
reprodutivas do biocontrolador, impedindo assim a sua germinação e a possível
interferência pela ação de competição, antibiose e hiperparasitismo. Assim, o choque
térmico nos dá certeza de que os bioativos de Trichoderma spp. suportam temperaturas
elevadas, mantendo-se ativo e controlando o fitopatógeno. Da mesma forma ocorreu
com o extrato autoclavado que teve um choque térmico maior, 121°C pelo mesmo
tempo.
O desempenho do biocontrolador foi menor quando autoclavado, provavelmente
devido à desnaturação de alguns bioativos. Apesar disso, houve a manutenção da
estabilidade térmica dos bioativos, indicando a sua capacidade de suportarem
temperaturas mais elevadas. Em nenhum dos tratamentos houve crescimento do
biocontrolador. A redução da PIC ficou em torno de 30% e 50% para os extratos
tratados a 100°C e autoclavados respectivamente, em relação ao extrato bruto vivo
(Figura 13-A-B).

Figura 13. Efeito dos extratos de Trichoderma spp. sobre a porcentagem de inibição do
crescimento micelial de Fusarium falciforme: Atividade de biocontrole dos extratos (A)
e efeito do tempo sobre a PIC (B)

Os resultados obtidos mostram que o biocontrolador utiliza todas as formas nele
existentes para controlar o fitopatógeno, que vai desde as atividades mecânicas a
bioativas, como metabólitos e enzimas que lisam o micélio, facilitando a sua atividade
de controle.
Resultados semelhantes foram verificados por Isaias et al., (2014) ao testarem a
termoestabilidade de isolados de Trichoderma. Os autores relataram ter havido uma
diminuição nas porcentagens de inibição dos seus isolados. Os metabólitos de
Trichoderma spp., se mantiveram ativos mesmo após autoclavagem, pois inibiram o

crescimento micelial dos patógenos, indicando o potencial desses metabólitos
antifúngicos, nas condições experimentais utilizadas, corroborando com os resultados
obtidos neste trabalho que tiveram uma capacidade de inibição menor em relação aos
extratos brutos e extratos térmicos.
Kupper et.al., (2003) em seu trabalho usando os isolados de Bacillus spp.,
produziram, in vitro, metabólitos que foram capazes de inibir o crescimento micelial de
C. acutatum, os quais mantiveram suas atividades capazes de causar a inibição, após
autoclavagem a 120°C, durante 20 min. Segundo Jayaprakashvel et al., (2010) a
autoclavagem (121°C por 15 minutos) de metabólito proveniente de um agente de
biocontrole pode reduzir em 24% a sua atividade antifúngica quando comparada ao não
autoclavado. Já Guimarães (2014) postula que moléculas bioativas, presentes em
metabólitos de origem microbiana, podem se decompor em outras moléculas menos
ativas ou mesmo inativas, quando submetidas a condições inadequadas que levem à
degradação das moléculas.
Jayaprakashvel et al., (2010) verificaram que a inibição média de 35% do
crescimento micelial de Cladosporium herbarum, obtida com metabólitos previamente
submetidos à autoclavagem, por exemplo, chegaria a aproximadamente 45%, quando
comparado com ou sem autoclavagem. O fato de alguns desses metabólitos se
mostrarem estáveis em várias temperaturas sustenta a hipótese de que os mesmos
possam se manter ativos frente a diferentes fatores, como insolação e temperaturas mais
elevadas dos solos de diferentes regiões, conforme mencionado anteriormente.
Importante salientar que trabalhos desta natureza vislumbram a perspectiva de síntese
destes metabólitos secundários seletivos para determinados organismos, por serem
vantajosos em relação a outras moléculas de natureza química, sob a ótica ambiental.
Lopes et al. (2012) também relatam a redução da eficiência de controle da
maioria dos isolados testados por eles, que ficou em torno de 50% em comparação aos
metabólitos não autoclavados. Os trabalhos de Guimarães (2014) a eficiência foi
superior a 70%. Da Mata et. al., (2008) e Isaias et al., (2014) afirmam que a variação da
sensibilidade dos fungos fitopatogênicos à metabólitos produzidos por biocontroladores
e a capacidade de Trichoderma spp. de produzirem metabólitos secundários com efeito
fungicida, pode variar entre espécies e entre isolados da mesma espécie. Estes
resultados corroboram com os obtidos neste trabalho, pois o comportamento de cada

isolado foi diferente em relação a sua capacidade de controle com os extratos tratados
termicamente ou não.

4.3.3. ATIVIDADE ENZIMÁTICA DOS ISOLADOS DE Trichoderma spp. E
Fusarium falciforme
Os biocontroladores testados apresentaram índice enzimático que variaram de
acordo com isolado e o tipo de enzima secretada (Figura 14). Nesta Figura é possível
distinguir a proporção de produção de enzima através da escala descrita por Furlaneto
(1989): os isolados que apresentaram I.e.>1,31 receberam nota máxima (4+) ou seja
produção intensa. Neste trabalho observou-se que alguns isolados obtiveram I.e. cinco
vezes maior que a nota máxima. Desta forma, isolados que tiveram um I.e. superiores a
1,31 tiveram a mesma nota e não diferiram entre eles, mesmo tendo diferido
estatisticamente.
Figura 14. Índice enzimático dos isolados de Trichoderma spp. e Fusarium falciforme
(Escala de Furlanato (1989)).

(1+) produção mínima; (2+) produção fraca; (3+) produção moderada, (4+) produção intensa de enzimas.

Considerando a escala proposta por Furlaneto (1989), para a enzima amilase, os
isolados T3, T5 e T6 não diferiram entre eles e foram classificados com produção
intensa (4+), diferindo dos demais que tiveram produção moderada (3+) para os
isolados T2 e T15 e fraca (2+) para o fitopatogeno.

Para celulase e gelatinase os isolados T3, T5, T6 e T15 obtiveram produção
intensa (4+), diferindo do fitopatógeno e de T2 para celulase.
Os isolados que alcançaram melhor índice para lípase foram T2, T3, T5 e T6,
com produção fraca (2+) diferindo de T15 e do fitopatógeno com produção mínima.
Os isolados T2, T5, T6 e o fitopatógeno foram os que apresentaram produção
intensa (4+) de protease, diferindo dos isolados T3 com produção fraca (2+) e T15
mínima (1+).
Para a enzima quitinase, os isolados T2, T3, T5 e T6 foram classificados com
produção intensa (4+), diferindo do isolado T15, que teve produção mínima e do
fitopatógeno com produção fraca.
Analisando-se os resultados, verificou-se que os isolados de Trichoderma spp.,
T5 e T6, foram os que apresentaram o melhor desempenho na capacidade degradação
dos meios, com I.e intensos (4+) para amilase, celulase, gelatinase, protease e quitinase,
e fraco (2+) para lipase. O isolado T3, diferiu dos isolados T5 e T6 apenas em protease,
pois seu I.e também foi fraco. O isolado T2 teve produção moderada (3+) em amilase e
celulase, não diferindo do isolado T15 quanto à amilase e dos isolados T5 e T6 com
relação às demais enzimas. O isolado T15 foi o que apresentou os menores I.e entre os
biocontroladores, não diferindo dos isolados T3, T5 e T6 em relação a produção de
celulase e gelatinase e do isolado de F. falciforme, em lípase e diferindo de todos os
isolados com relação ao índice de protease e quitinase, cuja produção foi mínima (1+).
O isolado de F. falciforme, apresentou uma intensa atividade proteolítica (4+) não
diferindo dos biocontroladores com fraca produção (2+) de amilase, celulase e quitinase
(Figura 15 e Tabela 3).

Figura 15. Reação enzimática de Fusarium falciforme e Trichoderma spp. nos meios
específicos para secreção de enzimas.

Fonte: SILVA; NASCIMENTO JÚNIOR (2016).

No teste de amilase, o iodo coloriu o meio em violeta e onde teve a atividade
enzimática formou um halo opaco. Na produção de celulase, os resultados das reações
enzimáticas positivas foram identificados pela formação de um halo amarelo claro em
contraste com o meio de cultura vermelho após a adição da solução reveladora. Para a
lipase ocorreu à formação de uma borda clara em volta da colônia em razão da completa
degradação do sal.

Tabela 3. Média dos Índices de Atividade enzimática dos isolados de Trichoderma spp.
e Fusarium falciforme

ENZIMAS
AMILASE
CELULASE

FUS
1,15 Aa*
1,16 Aa
GELATINASE 1,11 Aa
LIPASE
1,09 Aa
PROTEASE
1,45 Aab
QUITINASE 1,11 Aab

T2
1,23 Aba
1,30 ABab
1,66 Bb
1,14 Aa
1,35 ABab
1,46 ABab

T3
1,33 ABab
2,04 Bcd
3,12 Cd
1,14 Aba
1,19 ABab
1,57 ABbc

T5
1,72 ABb
1,75 Bbc
2,39 Cc
1,15 Aa
1,60 ABb
1,58 ABbc

T6
2,64 Cc
2,71 Ce
2,63 Cc
1,19 Aa
1,54 ABab
1,95 Bc

T15
1,27 Aab
2,26 Bde
5,44 Ce
1,04 Aa
1,06 Aa
1,00 Aa

*Tratamentos com a mesma letra maiúscula, na coluna e tratamentos com a mesma letra minúscula, na
linha, não diferem entre si pelo teste Tukey a 5%.

Com relação à degradação de amido observou-se que o isolado T6 apresentou
essa capacidade, com a maior taxa de produção de amilase (2,64), seguido pelos
isolados T5 (1,72) T3; T15 e T2 que apresentaram os mais baixos índices enzimáticos
respectivamente (1,33; 1,27; 1,23). Fusarium falciforme foi o que teve o menor I.e de
todos com (1,15), mas não diferiu de T2; T3 e T15.
Vários trabalhos mostram a capacidade de degradação de amido por isolados de
fungos: Zampieri; Ribeiro (2005) comentam que isolados de Fusarium teve maior I.e na
avaliação de atividade de produção de amilase. Já Wenzel et. al., (2013), relatam baixo
I.e, tanto de Fusarium spp., quanto de Trichoderma spp., corroborando com os
resultados encontrados neste trabalho. Fernandes (2009) relata que o isolado Fusarium
sp. testado por ele não apresentou degradação de amido. Stamford et al., (2008); Da
Silva et al., (2011); Pereira (2012) e Elias et al. (2015), também relatam ausência de
halo enzimático em isolados de Fusarium e de Trichoderma testados em seus trabalhos,
contrariando os resultados obtidos neste trabalho, visto que o patógeno se nutre das
reservas de amido na raiz da mandioca.
Quanto a degradação da celulose, o isolado T6 apresentou o maior I.e. com
produção de (2,71) seguido dos isolados T15 (2,26), T3 (2,04) e T5 (1,75) que não
diferiram entre eles. O isolado de Fusarium sp. apresentou o menor I.e. (1,16) não
diferindo do isolado T2 (1,23).
Analisando-se os resultados encontrados percebe-se que capacidade de
degradação de celulose varia de isolado para isolado, entre indivíduos da mesma espécie
e espécies diferentes. Fato este observados por vários pesquisadores que trabalharam
com estes microrganismos.
Alguns corroboram outros discordam dos resultados obtidos neste trabalho:
Braga et al. (2009), afirmaram que todos os isolados de Fusarium spp., por eles

avaliados, cresceram em meio contendo celulose como única fonte de carbono,
indicando sua capacidade de síntese de enzimas celulolíticas, com variação de I.e entre
fraco (1,06) a intenso (1,32). Bueno et al., (2009) também obtiveram resultados
semelhantes, usando F. solani do cajueiro amarelo, cujos I.e variaram de fraco a
moderado. Da Silva et al., (2011) e Bortolazzo (2011), relata atividade enzimática muito
baixa de espécies de Fusarium.
Por outro lado, vários autores relatam um índice enzimático maior para isolados
de Fusarium, e também para Trichoderma spp., Ruegger; Tauk-Tornisielo (2004)
observaram a variação entre os isolados de Trichoderma em relação à atividade
enzimática que foram classificadas entre ausente, baixa (1,1) e intensa (4,0). Resultados
obtidos por Feldman et al., (1988) e Galliano et al., (1988), Souza et al. (2011) e Sazci
et al. (1986), entre outros autores, constataram que Trichoderma spp., possuem alta
capacidade de síntese de enzimas celulolíticas.
Pereira (2012) ressalta que os isolados de Fusarium spp. e Trichoderma spp.,
apresentaram elevados índices de atividade enzimática com I.e>2 ( 3,7) e (4,3), índices
que foram superiores aos encontrados neste trabalho. Resultados semelhantes foram
obtidos por Faheina Junior (2012) em relação a isolados de Fusarium sp. e F.
moniliforme, que apresentaram I.e>2 (4,35) e (5,42), respectivamente. Já no trabalho de
Ramos (2012) os isolados de T. harzianum, usados por ele, apresentou I.e que variaram
de 1,10 a 6,0 enquanto para de Faheina Junior (2012) os isolados de Trichoderma spp.,
apresentaram índices muito baixos em torno de 1,09.
Basso et. al., (2011) concluíram que as linhagens Trichoderma sp., apresentam
grandes diferenças em relação as suas atividades celulolíticas e afirmam que essas
enzimas são excretadas nos três primeiros dias de incubação. Desta forma a visualização
dos halos pode não ocorrer e o isolado considerado fraco ou ineficiente em produzir
enzimas celulolíticas, mesmo tendo uma assimilação de nutrientes comprovada pelo seu
crescimento no meio de cultura a base de celulose como única fonte de carbono.
Singhania et al., (2010) relatam que as celulases produzidas por microrganismos
aeróbios são facilmente secretadas na forma de molécula livre, e os fungos filamentosos
são os mais capacitados na produção de celulase, nisto inclui o gênero Fusarium spp., e
Trichoderma spp.
Quanto a produção de gelatinase, dentre os isolados que tiveram I.e ≥ 2,0
destacou-se o isolado T15 com um índice enzimático de (5,44) que diferiu de todos os

demais. O isolado T3 apresentou o segundo melhor índice (3,12). Os isolados T6 e T5
não diferiram entre si e obtiveram o terceiro melhor I.e na degradação de gelatinase,
(2,63 e 2,3). Os demais isolados apresentaram I.e<2, sendo o isolado T2 o quarto entre
os biocontroladores a obter o menor valor (1,66). O isolado de F. solani como pior dos
índices entre os isolados testados (1,11).
Resultados semelhantes foram encontrados no trabalho de Bueno et al. (2009),
com F. solani e Fusarium spp., pois o índice enzimático foi considerado fraco. Elias et
al. (2015), também encontram os mesmos resultados com F. oxysporum f. sp. dianthi.
Para o teste de degradação de lipídeos, nenhum isolado apresentou capacidade
de degradação significativa ( I.e < 2,0). Para Vaz, (2010) e Matos (2012), as lipases
podem ser produzidas por vários organismos como animais (pancrea), vegetais
(mamona e canola) e microrganismos (bactérias, leveduras, e fungos filamentosos,
sendo estes o que possuem o maior potencial em hidrolisar as ligações éstercarboxilicas e liberar ácidos e alcoóis orgânicos).
Luz et al., (2006), trabalhando com vários isolados de Fusarium spp.,
verificaram que 85% dos isolados não apresentaram atividade lipolítica e os 15%
restantes tiveram I.e<2. Fernandes, (2009) também encontrou resultados negativos para
produção de lípases por Fusarium. Zampieri; Ribeiro (2005) relatam que as lipases
foram secretadas em pequena quantidade por dois isolados de F. oxysporum e T.viride.
Já Roveda et al. (2010) comenta que não encontrou atividade lipolítica em fermentação
submetida aos isolados de Trichoderma spp, mas afirma que isolados de que Fusarium
sp. são bons produtores desta enzima, sendo F. solani o que apresentou maior potencial.
Já nos trabalhos realizados por Fernandes (2009), Fusarium sp., tiveram um I.e >2
contrapondo os resultados obtidos neste trabalho. De Brito et.al., (2016) comenta que os
isolados de Trichoderma secretaram lípases com mais intensidade e de forma
diferenciadas na presença dos fitopatógenos principalmente na presença de F.
oxysporum.
Com relação à capacidade de degradação proteolítica, os resultados obtidos neste
trabalho mostraram que todos os isolados apresentaram um I.e <2, sendo que o isolado
T5 foi o que deteve a maior produção de protease (1,6) mas não diferiu dos isolados T6;
Fusarium sp; T2 e T3 (1,54; 1,45; 1,35; 1,19). O isolado T15 foi o que apresentou o
mais baixo índice e só diferiu do T5.

Vários pesquisadores comentam sobre a baixa capacidade de degradação
proteolítca de Fusarium sp.: Bueno et al. (2009), Fernandes (2009), Da Silva et al.,
(2011) relatam que Fusarium spp., tiveram I.e, considerado fraco, com atividade
proteolítica I.e<2.
Com relação à Trichoderma spp., os trabalhos mostram que ocorreu uma
variação na sua capacidade de degradação, de acordo com a espécie estudada: Zampieri;
Ribeiro (2005) comentam que isolados de T. viride destacaram-se por uma atividade de
produção de proteases significativa, e Pereira (2011) verificou que a atividade
proteolítica de T. harzianum, obtidos de solo do cerrado, é maior quando este é
cultivado em meio contendo micélio do F. oxysporum, provando a importância desta
enzima na atividade de biocontrole de Trichoderma.
Segundo Carvalho, (2006); Santin, (2008) e Oliveira et al., (2013), as proteases
dos fungos estão significativamente envolvidas na atividade antagonista, não somente
no desarranjo da parede celular do hospedeiro, mas também por agir como inativadores
proteolíticos das enzimas dos patógenos envolvidos no processo de infecção nas
plantas.
Quanto a quitinase produzida pelos isolados, verifica-se que estes apresentaram
comportamento semelhante ao de produção de lipases com I.e<2. Apesar do isolado T6
ter apresentado o maior índice enzimático (1,95), ele não diferiu de T5 e T3 (1,58 e
1,57). O isolado de T2 (1,46) não diferiu dos isolados T3, T5 e Fusarium sp. (1,11) que
não diferiu do isolado T15 (1,0) que teve o menor índice entre todos os isolados.
Zampieri; Ribeiro (2005) relatam que não foram observados halos de
degradação de seus isolados, sendo então impossível calcular o índice enzimático para
quitinase, mas os fungos desenvolveram colônias de aspecto normal, indicando que as
fontes de carbono foram consumidas e, portanto, as enzimas foram produzidas e
liberadas no meio de cultura, pelos fungos testados. No presente trabalho foi verificado
que os isolados formaram o halo enzimático, mas não ficaram tão evidentes para
registro fotográfico. Pádua et al.,(2007) concluíram que não existiu correlação direta
entre o nível de produção de enzimas do sistema quitinolítica com o potencial de
biocontrole, pois isolados que apresentaram atividade enzimática baixo obtiveram boa
atividade de biocontrole e vice versa. Entretanto, devido à grande diversidade de
interações antagonistas, esse importante critério não deve ser totalmente descartado na
triagem e seleção de potenciais de isolados de Trichoderma como biocontrolador

eficiente, uma vez que a quitinase age de forma aleatória e degradam a parede celular de
fungos, liberando oligômeros que induzem as exoquitinases, começando assim o ataque
micoparasítico, hidrolisando os oligossacarídeos da parede celular do fitopatógeno.
(MARCELLO, 2008; GIESE et al., 2003; BAUERMEISTER et al., 2010).
Na Figura 16, pode ser observada a relação dos isolados e sua capacidade de
assimilação de nutriente do meio, com a liberação de enzimas líticas e sua intensidade.
Nota-se que todos os organismos testados produziram enzimas que degradam amido,
celulose, gelatina, lipídios, proteína e quitina, pois os mesmos formaram halo
enzimático nos meios testados variando seu I.e de 1 (mínima) a 5,54 (intensa).
Observa-se também que o isolado T6 foi o que deteve maior versatilidade e
potencial em produzir enzimas com I.e > 2 na maioria dos meios testados. O maior
índice enzimático foi a celulase (I.e=2,71) seguidos de amilase (I.e=2,64) e gelatinase
(I.e=2;63). As outras enzimas testadas apresentaram I.e<2, mas observamos que o
isolado tem uma intensa produção de quitinase (I.e=1,95) e protease (I.e=1,54), já em
lípase a produção é mínima (I.e=1,19). Os isolados T15 e T3 apresentaram pouca
variação entre eles, em relação à atividade enzimática, com produção de celulase (I.e =
2,22 e 2,04). No entanto, para gelatinase, T15 apresentou o maior índice de todos com
I.e=5,54. O isolado T3 apresentou uma ótima produção de gelatinase, obtendo o
segundo maior índice (I.e=3,12). Em relação às demais enzimas a produção de amilase
foi significativa, sendo sua produção moderada. Em relação às enzimas lípase e protease
a produção foi mínima para ambos, já para quitinase, o isolado T3 apresentou índice
considerado intenso (I.e=1,54), enquanto T15 teve produção mínima desta enzima.

Figura 16. Índice enzimático dos isolados de Trichoderma spp. e Fusarium falciforme.

O isolado T5 apesar do I.e>2 na enzima gelatinase, apresentou intensa produção
de celulase (I.e=1,75), amilase (I.e=1,72), protease (I.e=1,6) e quitinase (I.e=1,58) e
produção mínima (I.e=1,15) em lipase.
O isolado T2 foi o que apresentou menor atividade enzimática (I.e<2) entre os
isolados de Trichoderma spp. O isolado apresentou intensa produção de gelatinase
(I.e=1,66), quitinase (I.e=1,46) e protease (I.e=1,35), moderada produção de celulase
(I.e.= 1,30) e amilase (I.e=1,23) e fraca produção de lipase (I.e=1,14)
A atividade enzimática do Fusarium sp. foi mínima para lipase (I.e=1,09), fraca
para gelatinase e quitinase (I.e=1,11), amilase (I.e=1,15) e celulase (I.e=1,16) e intensa
para protease (I.e=1,45). Os resultados obtidos neste trabalho demonstraram que mesmo
com à produção mínima de enzimas o fitopatógeno possui atributos bioquímicos básicos
para lisar e degradar substratos diversos, causar infecção, se estabelecer, colonizar, se
reproduzir e também se defender de outros organismos.
Apesar da literatura não disponibilizar um valor padrão de Ie, para Oliveira et
al., (2006) e Nunes et al.(2013), estes são os melhores parâmetros semiquantitavos
usados para avaliar a capacidade de produção enzimática de microrganismos em meio

sólido, pois correlaciona diretamente o diâmetro do halo de degradação com a
habilidade degradativa.
Verificamos, neste trabalho, que mesmo em baixas concentrações, as substâncias
antibióticas

produzidas

e

secretadas

pelos

isolados

de

Trichoderma

spp.,

provavelmente, interfiram nas atividades metabólicas, na redução ou paralisação do
crescimento e esporulação, redução na germinação de esporos do isolado de Fusarium
sp., e são importantes artifícios para eficiência do biocontrolador. Estas ações
enzimáticas provocam a morte de um deles que, assim, servem de alimento para o
sobrevivente (LOBO JUNIOR; ABREU, 2000; HARMAN, 2000; BOMFIM, 2007;
BARRA et. al., 2008; ZUCCHI, 2010).
O sucesso de um biocontrolador está relacionado com a capacidade de romper a
parede celular (composta por carboidratos, tais como quitina, além de proteínas e
lipídios em quantidades significativas) do fitopatógeno ou interromper os processos
relacionados à sua síntese (Bomfim, 2007 e Souza, 2013).
Por serem proteínas que catalisam reações químicas, as enzimas, vem tendo
grande aplicabilidade biotecnológica e industrial de biocontrole de fitopatógenos. Por
isso as enzimas microbianas têm sido alvo de muitos estudos, já que a produção de
enzimas por microrganismos possui diversos benefícios em relação às outras opções. A
manipulação de microrganismos é mais fácil, possibilitando produção de enzimas em
grande escala. A diversidade de microrganismos existentes que possam ser utilizados
para produção enzimática é grande, e há possibilidade de descobertas de novas espécies
para esse fim (BARATTO et al., 2011; ORLANDELLI et al., 2012; FRANTZ et al.,
2014).
A classificação de intensidade da produção enzimática varia de acordo com os
pesquisadores. Furlaneto (1989), considera que o índice enzimático (I.e) intenso (4+) é
o que é igual ou maior que 1,31. Fungaro; Maccheroni (2002) estabeleceram que
valores maiores que 1,0 são indicativos de excreção de enzimas. Bispo (2010); Silva et
al. (2013) e Silva et. al. (2015) indicam I.e≥2 como característica de atividade
enzimática significativa sendo os microrganismos produtores, classificados como forte
produtor de enzimas (I.e≥2), considerado moderado (1,5 ≤ I.e <2), fraco produtor
(1<I.e<1,5) e ausência de halo de hidrólise (não produtoras). Fungaro; Maccheroni
(2002) e Florencio et al. (2012) consideraram em seus trabalhos o I.e>1,5 para

isolados de Trichoderma spp.

Silva et al., (2015) levantaram o questionamento sobre os índices enzimáticos de
celulose em seus isolados, assim como neste trabalho foi verificado que a escala adotada
por Furlaneto limita o I.e como forte produtor de enzima os isolados que apresentem
valor igual ou maior que 1,31 (4+). Por tanto a capacidade de produzir e secretar
enzimas que degradem estruturas biológicas complexas tais quais estudadas neste
trabalho, possivelmente, levem em consideração o fato de elas estarem ligadas a um
artifício biológico necessário para estabelecimento e o sucesso do microrganismo no
ambiente, degradando matéria orgânica como saprófito, fitopatógeno ou biocontrolador.
Bispo (2010); Silva et al. (2013) e Silva et. al. (2015) usaram a escala de
Furlaneto (1989) para determinação do índice enzimático, mas consideraram que os
organismos a serem utilizados em experimentos no seu trabalho, na indústria de
alimentos e aplicação biotecnológica, precisariam ter índice que variassem entre ( 1,5 ≤
I.e <2). Se os parâmetros da escala forem seguidos os microrganimos usados por estes
autores teriam seus índices variando entre 6+ a 11+.
Neste trabalho obtivemos isolados de Trichoderma spp. que chegou a I.e.= 5,44
(T15). Esse índice é extremamente superior aos que foram encontrados na maioria dos
trabalhos com fungos filamentosos, executados pelos pesquisadores acima citados.
Desta forma, se fez necessário o uso de uma nova escala com parâmetros mais
adequados que agrupasse melhor os microrganismos que secretam quantidades maiores
de enzimas que hidrolisam compostos orgânicos, tanto para estudos relacionados à
indústria alimentícia e biotecnológica quanto à atividade inerente ao sucesso dos
mesmos em subtrair os nutrientes necessários para sua sobrevivência, desenvolvimento
e reprodução.
Os isolados que obtiverem índice enzimático, que superaram a escala proposta
por Furlaneto (1989), foram classificados pelo Potencial Enzimático (P.E.). Os que
tiverem Potencial Enzimático (1≤P.E<1,5)= 1, foram produtores de enzimas
hidrolíticas, com produção mínima ou fraca e secretaram enzimas em quantidades
suficientes para sua sobrevivência, sendo portanto, classificados por níveis, neste caso
1+. Já os isolados com P.E (1,5 ≤ P.E. <2)=2 foram considerados potencialmente fortes
de nível 2+. Os isolados que ficaram entre (2 ≤ P.E. <2,5)=3 foram considerados
potencialmente fortes ou de nível 3+, enquanto os que ficaram (2,5 ≤ P.E. ≤3)=4+ foram
classificados

como

potencialmente

forte

nível

4 +.

Isolados

que

tiverem

(3,0≤P.E.>3,5)=5+ foram potencialmente fortes de nível 5+. Os que tiverem P.E>3,5
foram potencialmente forte de nível 6+.
Baseado nesta nova escala podemos observar que o potencial enzimático foi
detectado em todos os isolados de Trichoderma spp., bem como no fitopatógeno. Esse
teve produção mínima ou fraca para todas as enzimas testadas neste trabalho e seu P.E.
foi classificado com nível 1+. O isolado T2 obteve resultados semelhantes ao
fitopatógeno com exceção da enzima celulase, que apresentou P.E. nível 2+. O isolado
T3 foi o que obteve níveis diversos em relação ao potencial enzimático: para amilase,
lípase e protease o P.E. apresentou nível 1+, já para celulase e gelatinase o isolado
apresentou um alto potencial enzimático com níveis 3+ e 5+, respectivamente. O Isolado
T5 apresentou P.E. nível 1+ para lípase, 2+ para amilase, celulase, protease e quitinase e
3+ para gelatinase. Já o isolado T6 teve o mesmo P.E. de T5 para lípase, protease e
quitinase, e níveis extremamente altos para amilase, celulase e gelatinase com P.E.=4 +.
O isolado T15 teve potencial enzimático nível 1+ para enzimas amilase, lípases, protease
e quitinase, mas para celulose foi nível 3+ e, com relação à gelatinase, o isolado teve o
maior nível na escala, com potencial enzimático nível 6+ (Figura 17).

Figura 17. Potencial enzimático (P.E.) dos isolados de Trichoderma spp. e Fusarium
falciforme

7
6
5

AMILASE
CELULASE

4

GELATINASE
3

LIPASE

2

PROTEASE
QUITINASE

1
0
FUS

T2

T3

T5

T6

T15

Nivel 1+ (1≤P.E<1,5); nível 2+ (1,5 ≤ P.E. <2); Nivel 3+ (2 ≤ P.E. <2,5); nível 4+ (2,5
≤ P.E. ≤3); nivel 5+ (3,0≤P.E.>3,5) e nível 6+ (P.E>3,5).

Uma avaliação pertinente ao observar a Figura acima é que a enzima com menor
quantidade de excreção pelos microrganismos foi a lípase, que em todos os isolados
teve P.E. nível 1+, mas produzida em quantidades suficientes para hidrolisar óleos e
gorduras, ou seja, estruturas compostas por ácidos graxos, que estão presentes no
ambiente em que esses organismos são inseridos.
Facchin (2013); Sacco (2013) e Silva et al, (2015) destacam a importância da
excreção das enzimas amilase, celulases, lípase, protease por microrganismos, pois estes
podem desempenhar um papel muito importante e primordial no tratamento biológico
de efluentes, ou na decomposição da matéria orgânica em geral e no potencial
biotecnológico. Desta forma, os isolados testados, além de apresentarem características
de bons biocontroladores, detêm peculiaridades que os classificam como bons
decompositores de matéria orgânica.
A utilização de isolados que apresentam P.E. a partir do nível 2+ desta escala
está descrito nas pesquisas de Fungaro; Maccheroni (2002) que trabalhou com
microrganismos capazes de produzir enzimas no intuito de serem aplicadas na indústria
de alimentos. Florencio et al. (2012) também adota este mesmo nível para verificar a
degradação de celulose de isolados de Trichoderma, e Bispo (2010); Silva et al. (2013)
e Silva et. al. (2015) corroboram quando indicam I.e≥2, que nesta escala estaria como
nível 2+ com potencial enzimático moderado.
Com os resultados obtidos neste experimento, podemos perceber que a
produção de enzimas pelos isolados de Trichoderma spp., é importante para aumentar
sua capacidade de biocontrole, mas estas enzimas atuam de forma secundaria já que a
antibiose e o hiperparasitismo é a primeira ação destes biocontroladores. Notou-se ainda
que nível de enzima produzido, por menor que seja, atua de forma eficaz no complexo
ativo do hiperparasitismo. Isto é comprovadamente observado nos isolados T2 e T3,
seguido de T15, que apesar de não diferir de T5 e T6, tiveram o melhor desempenho em
relação à escala de Bell, mas também os menores I.e e consequentemente P.E. Portanto,
os níveis de produção de enzima é característica de ação qualitativa para o
biocontroladores estudados.

4.4. CONCLUSÕES
Os extratos de T. harzianum (T2, T3 e T6), T. citrinoviride (T5) e T. orientale
(T15) são eficientes em inibir o desenvolvimento de Fusarium falciforme, sendo o
extrato bruto a 50°C, o que proporciona a maior porcentagem de redução de
crescimento micelial (85%), seguido do extrato a 100°C (59%) e 121°C (40%).
Os isolados possuem bioativos estáveis a temperaturas elevadas.
Todos as espécies de Trichoderma e o isolado de Fusarium falciforme estudados
são produtores das enzimas amilase, celulase, gelatinase, lípase, protease e quitinase.
As espécies T. harzianum (T3 e T6) e T. citrinoviride (T5) apresentam o maior
desempenho na produção das enzimas.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

AGRIOS, G.N. Plant pathology. Amsterdam : Elsevier Academic Press. 5.ed, 2005.
922p.
ALFENAS, A. C.; FERREIRA, F. A.; MAFIA, R.G.; GONÇALVES, R. C. Isolamento
de fungos fitopatogênicos. In: ALFENAS, A. C.; MAFIA, R. G.; M (Ed.). Métodos em
Fitopatologia. Viçosa, MG: UFV, p. 53-90. 2007.
ALVES, A. A. C.; SILVA, A. F. Cultivo da mandioca para a região semi-árida.
Cruz das Almas: EMBRAPA-CNPMF, 2003.
AGUIAR, A. R. et al. Antagonismo a fungos associados às sementes de Paspalum
notatum flügge por Trichoderma. ENCICLOPÉDIA BIOSFERA, Centro Científico
Conhecer - Goiânia, v.9, n.17; p. 198. 2013.
AMORIM, L.; REZENDE, J. A. M.; BERGAMIN FILHO, A. Manual de
Fitopatologia. Piracicaba: Agronômica Ceres. v. 1,4. Ed, p. 383 -387, 2011.
BARATTO, C. M. et al. Seleção de microrganismos produtores de enzimas hidrolíticas
isolados da região do meio oeste de Santa Catarina, Brasil. Evidência-Ciência e
Biotecnologia, Joaçaba v. 11 n. 2, p. 15-28, julho/dezembro 2011.
BARRA, V. R. et al. Potencialidade antagonística em alguns procariotas agentes de
biocontrole de enfermidades de plantas. Summa Phytopathologica, v.34, n.2, p.121126, 2008.
BASSO, T. P.; GALLO, C. R.; BASSO, L. C. Atividade celulolítica de fungos isolados
de bagaço de cana-de-açúcar e madeira em decomposição. Pesquisa Agropecuária
Brasileira, v. 45, n. 11, p. 1282-1289, 2011.
BAUERMEISTER, A. et al.. 1,3-Glucanases Fúngicas: produção e aplicações
biotecnológicas. LONDRINA SP. Semina: Ciências Exatas e Tecnológicas, v. 31, n. 2,
p. 75-86. 2010.

BELL, D.K. et al. In vitro antagonism of Trichoderma species against six fungal plant
pathogens. Phytopathology, v.72, p.379-382, 1982.
BETTIOL, W. Controle biologico de doencas do filoplano. In: BETTIOL, W., org.
Controle biologico de doencas de plantas. Jaguariuna: EMBRAPA-CNPDA, 1991.
p.33-52 (EMBRAPA-CNPDA. Documentos, 15)
BETTIOL, W.: MORANDI, M.A.B. Controle Biológico de Doenças de Plantas no
Brasil. In: BETTIOL, W.: MORANDI, M.A.B. (Org). Biocontrole de Doenças de
Plantas: uso e perspectivas. Jaguariúna – SP: Embrapa Meio Ambiente, p. 7-14, 2009.
BETTIOL, W.; GHINI, R. Solos Supressivos. In: MICHEREFF,S. J.; ANDRADE, D.
E. G. T.; MENEZES, M. (Eds.) Ecologia e Manejo de patógenos radiculares em solos
tropicais. Recife:UFRPE, Imprensa Universitária, 2005. cap.6, p. 125-143
BISPO, A. S. R. Bioprospecção de actinomicetos isolados de solos noestado da
Bahia e seu potencial na produção de enzimas lingocelulolíticas. 2010. 104f.
Dissertação (Mestrado em Microbiologia Agrícola) – Universidade Federal do
Recôncavo da Bahia, Cruz das Almas-BA. 2010.
BIZI, R. M., Utilização de fungos no Controle Biológico de Doenças. <
http://www.floresta.ufpr.br/alias/lpf/public_html/contbio03.html.>

Acesso

em

16/11/2015.
BOMFIM, M. P., Antagonismo in vitro e in vivo de Trichoderma spp. a Rhizopus
stolonifer em maracujazeiro amarelo. Vitória da Conquista BA, 2007. 74f.:
Dissertação (Mestrado em Agronomia

do Programa d e Pós Graduação da

Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia). Universidade Estadual do Sudoeste da
Bahia, Unidade Acadêmica Vitória da Conquista BA. 2007.
BOMFIM, M. P., SÃO JOSÉ, A. R., REBOUÇAS, T. N. H., ALMEIDA, S. S. D.,
BORTOLAZZO, N. G.. Isolamento e seleção de fungos celulolíticos para hidrólise
enzimática do bagaço de cana-de-açúcar. 2011. 77f. Dissertação de mestrado. Escola
Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz. 2011.

BRAGA, R. M. et al. Avaliação da Produção de Celulase por Cepas de Fusarium.
XVII Simpósio Nacional de Bioprocessos. 6p. Natal-RN de 02 a05 de agosto de 2009.
BRITO, F. S.; MILLER, P. R. M., STADNIK, M. Presença de Trichoderma spp em
composto e suas características para o controle de fitopatógenos. Porto Alegre ISSN:
1980-9735. Rev. Bras. de Agroecologia, p. 43-53. 2010.
BUENO, C. J. et al. Produção de enzimas extracelulares por Fusarium solani de
maracujazeiro amarelo. Tropical Plant Pathology, 343-346.2009.
CANCELA, K. C., Controle Biológico Florestal Conceitos, Terminologia, Descrição
e

Caracterização

de

Agente.

Proteção

florestal

Disponível

em

<http://www.floresta.ufpr.br/alias/lpf/public_html/contbio01.html>

Acesso

em

16/11/2015.
CARVALHO FILHO, M. R., Relações filogenéticas, identificação e potencial de uso
de isolados de Trichoderma no controle do mofo branco e como promotores de
crescimento do feijoeiro. Brasília-DF, 2013. 123f. Tese de Doutorado. Programa de
Pós-graduação em Fitopatologia, Universidade de Brasília. Brasília. 2013.
CARVALHO, A. C., Bioprospecção de isolados de Trichoderma stromaticum para o
controle biológico da Vassoura-de-Bruxa do Cacaueiro. 2006. 82f. Dissertação.
Universidade Estadual de Santa Cruz. 2006.
CONAB - COMPANHIA NACIONAL DE ABASTECIMENTO. Perspectivas para a
agropecuária. Conab, Brasília, v.1, 154p. 2013.
DA MATA, J. F. et al.. Emprego de extratos orgânicos e aquoso obtidos a partir de
isolados de Trichoderma spp. no controle de fitopatógenos. BIOFAR (Revista de
biologia e farmácia), v.2,n.2 , p.12-23, 2008.
DA SILVA, D. C. V., TIAGO, P. V., e DE SOUZA-MOTTA, C. M. . Isolamento e
seleção de fungos filamentosos do solo de sistemas agroflorestais do Município de Bom
Jardim (PE) com base na capacidade de produção de enzimas hidrolíticas1. Revista
Brasil. Bot, 34(4), 607-610. 2011.

DE BRITO, J. P. C.; LOPES, F. A. C.; ULHOA, C. J. Avaliação da atividade de αManosidase, α-arabinofuranosidase e lipase secretada por isolados de Trichoderma
spp.em presença de parede celular de Fusarium solani, Fusarium oxysporum,
Rhizoctonia solani e Sclerotinia sclerotiorum. Instituto de Ciências Biológicas,
Universidade

Federal

de

Goiás,

Brasil.

http://www.sbpcnet.org.br/livro/63ra/conpeex/pivic/trabalhos/JOAO_PAU.PDFisponíve
l em . Visitado em 04 de fevereiro de 2016.
DEMAIN, A. L. Microbial biotechnology. Trends in biotechnology, v. 18, n. 1, p. 2631, 2000.
DIAS, P. P., Controle biológico de fitopatógenos de solo por meio de isolados de
fungos do gênero Trichoderma e sua contribuição no crescimento de plantas. 2011.
101 f. Tese Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro. Seropédica - Rio de Janeiro.
2011.
DOS SANTOS, H.A. Trichoderma spp. como promotores de crescimento em
plantas e como antagonistas a Fusarium oxysporum. 2008. Tese de Doutorado. Tese
de, Universidade de Brasília. 2008.
ELIAS, A.; FERREIRA, A.B.M.; BUENO, C.J. Produção in vitro de enzimas
extracelulares por fungos e sua relação com os sintomas descritos em planta hospedeira.
Summa Phytopathologica,v.41, n.4, p315-317, 2015.
ETHUR, L.Z. Dinâmica populacional e ação de Trichoderma no controle de
fusariose em mudas de tomateiro e pepino. 2006. 154p. Tese (Doutorado em
Fitopatologia) - Universidade Federal de Santa Maria, Santa Maria-RS. 2006
FACCHIN, S. Isolamento de microrganismos e seleção de enzimas microbianas
com aplicações biotecnológicas no tratamento de esgotos tratamento de esgotos.
2013. 87f. Tese (Pós-Graduação em Genética do Departamento de Biologia Geral do
Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais). PhD Thesis.
Universidade Federal de Minas Gerais. 2013.
FAHEINA JUNIOR, G.S. Produção de celulases por fermentação submersa

utilizando microorganismos prospectados em coleções de culturas nacionais. 2012.
75f. Dissertação (Mestrado) –Universidade Federal do Ceará, Centro de Tecnologia,
Departamento de Engenharia Química, Programa de Pós-Graduação em Engenharia
Química, Fortaleza, 2012.
FELDMAN, K.A.; LOVETT, J.S.; TSAO, G.T. Isolation of the cellulose enzymes from
the termophilic fungus Thermoascus aurantiacus and regulation of enzyme production.
Enzyme and Microbial Technology, New York, v.10, p. 262-272, 1988.
FERNANDES, A. P. Avaliação do potencial enzimático de fungos filamentosos
isolados de diferentes fontes. Dissertação de mestrado em Ciências do Alimento. 2009.
58f . Universidade Federal de Lavras- UFLA, 2009.
FIPKE, G. M; PAZINI, J.B.; ETHU,L. Z. Antagonismo de isolados de Trichoderma
spp. ao Sclerotinia sclerotiorum em diferentes temperaturas. Magistra, Cruz das Almas
BA, V. 27, N.1, p. 23 – 32, Jan./Mar. 2015.
FIRN, D. & JONES, C. G. Natural products–a simple model to explain chemical
diversity. Natural product reports, v. 20, n. 4, p. 382-391, 2003.
FLORENCIO, C., COURI, S., FARINAS, C. S. Correlation between agar plate
screening and solid-state fermentation for the prediction of cellulase production by
Trichoderma strains. Enzyme Research, p.1-7, 2012.
FRAIFE

FILHO

G.

A.,

BAHIA

J.

J.

S.,

Mandioca.

Ceplac-Cepec-BA.

http://www.ceplac.gov.br/radar/mandioca.htm . Acessado em 26 de novembro de 2015.
FRANTZ, S. C.; CARREIRO, S. C.; SILVA, J. B. A. Produção de enzimas
hidrolíticas por fungos isolados de folhas em decomposição. 10° seminário de
Iniciação cientifica da UFT. Câmpus de Palmas. 5p. 25 a 28 de novembro de 2014.
FUNGARO, M. H. P, MACCHERONI Jr, W. Melhoramento genético para produção
de enzimas aplicadas a Indústria de Alimentos. In: MELO, I. S, VALADARES
INGLIS, M. C., NASS, L. L., VALOIS, A. C. C., ed. Recursos Genéticos e
Melhoramento-Microrganismo . Jaguariúna, São Paulo, Brasil: Embrapa Meio

Ambiente, p. 426-453, 2002.
FURLANETO, M.C. Recombinação genética e produção de celulases em
Trichoderma Pseudo Koningii Var . 1989. 152 p. Dissertação (Mestrado) - Escola
Superior de Agricultura“Luiz de Queiroz”, Universidade de São Paulo, Piracicaba,
1989.
GALLIANO, H.; GAS, G.; DURANT, H. Lignocellulose biodegradation and ligninase
excretion by mutant strains of Phanerochaete chrysosporium hyperproducing cellulases.
Biotechnology Letters, Dordrecht, v. 10, p. 655-660, 1988.
GIESE, E. C.; BARBOSA, A. M.; SILVA M.L.C. Glucanases Fúngica: Produção e
aplicações das B -1,3 e -1,6 glucanases. Revista Biotecnologia Ciência e
Desenvolvimento Brasília-DF - ISSN 1414-6347. Edição nº 30 , P.97-104.. jan/jun
2003.
GOMES, J. C.; LEAL, E. C., Cultivo da Mandioca para a Região dos Tabuleiros
Costeiros. In.: Podridão Radicular. Embrapa Mandioca e Fruticultura. Sistemas de
Produção,

11.

ISSN

1678-8796

Versão

eletrônica/Jan/2003.https://sistemasdeproducao.cnptia.embrapa.br/FontesHTML/
Mandioca/mandioca_tabcosteiros/doencas.htm . Acesso 13/12/2015.
GUIMARÃES, G. R. Controle de Cladosporium herbarum e promoção de
crescimento do feijoeiro pelo emprego de Trichoderma harzianum. 2014. 54f.
Dissertação (Mestrado) Universidade Estadual de Goiás –Unidade Universitária de
Ipameri, 2014.
HARMAN, G. E. Myth and dogmas of biocontrol changes in perceptions derived
from research on Trichoderma harzianum T-22. Plant Disease, St. Paul, v. 84, p.377393, 2000.
HOFFMANN, C. A. et al.. Potencial de antagonismo de isolados de Trichoderma sp.
contra o isolados de Fusarium sp., in vitro. Revista Verde de Agroecologia e
Desenvolvimento Sustentável, v. 10, n. 1, p. 236-242, 2015.

HOHENFELD, C. S.. Podridão radicular da mandioca: metodologias de inoculação
e seleção de fontes de resistência. 2016.. 86f. Dissertação (Recursos Genéticos
Vegetais) Universidade Federal do Recôncavo da Bahia. Cruz das Almas, BA.2016.
ISAIAS, C.O.; MARTINS, I.; SILVA, J.B.T.; SILVA, J.P.; MELLO, S.C.M. Ação
antagônica e de metabólitos bioativos de Trichoderma spp. contra os patógenos
Sclerotium rolfsii eVerticillium dahliae. Summa Phytopathologica v.40, n.1, p.34-41,
2014.
JAYAPRAKASHVEL, M. et al. Hydrogen cyanide mediated biocontrol potential of
Pseudomonas sp. AMET1055 isolated from the rhizosphere of coastal sand dune
vegetation. Adv. Biotech.9(10): 39-42. 2010.
JAMAL, C. M. et al.. O uso de extratos vegetais no controle alternativo da podridão
pós- colheita da banana. In: SIMPÓSIO NACIONAL DO CERRADO, IX ,
2008,ParlaMundi. Anais. Brasília, DF: EMBRAPA Cerrados,p. 1-9. 2008.
KUPPER, K.C.; GIMENES-FERNANDES, N.; GOES, A. Controle biológico de
Colletotrichum acutatum , agente causal da queda prematura dos frutos cítricos.
Fitopatologia Brasileira, Viçosa, v. 28, n. 3, p. 251-257, 2003.
KWON-CHUNG, K.J. & BENNETT, J.E. - Medical mycology. Philadelphia, Lea &
Febiger, 866p. ill. 1992.
LARANJEIRA, D.; SANTOS, E. O. DOS; MARIANO, R. DE L. R.; BARROS, S. T.
Ocorrência da podridão negra da maniva e raiz da mandioca (Manihot esculenta)
causada por Scytalidium lignicola no estado de Pernambuco, Brasil. Fitopatologia
brasileira, Brasília, v. 19, n. 3, p. 466-469, 1994.
LAZAROTTO, M. et al. Seleção in vitro de Isolados de Trichoderma spp. com
Potencial de Antagonismo a Isolados Patogênicos de Fusarium spp. In: XVI
Simpósio De Ensino, Pesquisa E Extensão, Unifra, v. 3, 2012.
LOBO JUNIOR, M.; ABREU, M.S. Inibição do crescimento micelial de Sclerotinia
sclerotiorum por metabólitos voláteis produzidos por alguns antagonistas em diferentes

temperaturas e pH’s. Ciência Agrotécnica, Lavras, v.24, p.521-526, 2000.
LOPES , F.A.C. et al. Biochemical and metabolic profiles of Trichoderma strains
isolated from common bean crops in the Brazilian cerrado, and potential antagonism
against Sclerotinia sclerotiorum. Fungal Biology, v.116, p.815 -824, 2012.
LUZ, J. S.; SILVEIRA, E. B., & CAVALCANTE, U. M. T.. Atividade enzimática de
fungos endofíticos e efeito na promoção do crescimento de mudas de maracujazeiroamarelo. Revista Caatinga, v. 19, n. 2, 2006.
MACHADO, A. R. et al. New occurrences of Botryosphaeriaceae causing black root
rot of cassava in Brazil. Tropical Plant Pathology, v.39, p.464-470, 2014.
MACIEL, C. G.; WALKER C.; MUNIZ, M. F. B. e ARAÚJO, M. M. Antagonismo de
Trichoderma spp. e Bacillus subtilis (UFV3918) A Fusarium sambucinum em Pinus
elliottii ENGELM. Revista Árvore, Viçosa-MG, v.38, n.3, p.505-512, 2014.
MARCELLO, C. M. Avaliação da expressão e caracterização de uma exo-b-1,3glucanase envolvida no mecanismo de micoparasitismo de Trichoderma asperellum.
Brasília-DF, 2008. 89f. Tese de Doutorado. Laboratório de Enzimologia Departamento
de Biologia Celular do Instituto de Biologia da Universidade de Brasília – UnB. Brasília
– DF. 2008.
MARQUES, H. I. P. et al. Inibição do crescimento micelial de Trichoderma harzianum
por fertilizantes líquidos. Enciclopédia Biosfera, v. 10, n. 18, p. 2040, 2014.
MATOS, F. B. D. Isolamento e caracterização de fungos isolados de ambiente
marinho. 2012). 63f.

Dissertação de mestrado (Programa de Pós-graduação em

Microbiologia Agrícola e do Ambiente Universidade Federal do Rio Grande do Sul Instituto de Ciências Básicas da Saúde) 2012.
MATOS, K. DA S. et al. Estudo in vitro da potencialidade de Trichoderma spp., no
biocontrole de Fusarium guttiforme. ENCICLOPÉDIA BIOSFERA Centro Científico
Conhecer - Goiânia, v.10, n.19; p. 2014-2234. 2014.
MICHEREFF, S.J.; MENEZES, M.; MARIANO, R.L.R. Potencial de Trichoderma

para o controle da antracnose do sorgo. Fitopatologia Brasileira, Brasília, v. 18, p.
392-398, 1993.
MUNIZ, M. F. S. et al. Caracterização de isolados de Phytophthora drechsleri, agente
causal da podridão mole de raízes de mandioca.Fitopatologia Brasileira, Brasília, v.
31, p. 195-198, 2006.
NUNES, G. F. O. et al.. Atividade enzimática de isolados de rizóbio obtidos de
nódulos de leguminosas forrageiras. 4p. 34º Congresso Brasileiro de Ciencias do
solo.. Florianopolis-SC julho/agosto de 2013.
OLIVEIRA, A. N et al. Enzimas hidrolíticas extracelulares de isolados de rizóbia
nativos da Amazônia central, Amazonas, Brasil. Ciênc. Tecnol. Aliment. 26: 853-860.
2006.
OLIVEIRA, L. G.; SILVA; A. R. S; SILVA, A. C. S.; SILVA; R. L.; LIMA, D. W.
S.;LIMA, G.; COSTA, A. F., Atividade proteolítica de fungos de solo
fitopatogênicos ao Feijão-Caupi [Vigna unguiculata (L.) Walp.] In: III CONAC
Congresso Nacional de Feijão-Caupi. Pernambuco. 4p. Resumo expandido. Recife
Pernambuco. 22-24 de abril de 2013.
OLIVEIRA, N. T. de; ALVES, J. M. A.; UCHÔA, S. C. P.; RODRIGUES, G. S.;
MELVILLE, C. C.; ALBUQUERQUE, J. D. A. A. de. Caracterização e identificação
de clones de mandioca produzidas em Roraima para o consumo in natura. Revista
Agro@mbiente On-line, v. 5, n. 3, p. 188-193, 2012.
ORLANDELLI, R. C; SPECIAN, V; FELBER, A.C; PAMPHILE, J.A. Enzimas de
interesse industrial: produção por fungos e aplicações.Revista saúde e biologia, v.7,n.3,
p.97 -109, 2012
PÁDUA, R. R.;ALVARENGA, D. O.; QUEIROZ, P. R.; MELLO, S. C. M. Avaliação
e caracterização de potenciais antagonistas de Sclerotium rolfsii pertencentes ao
gênero Trichoderma . Boletim de pesquisa e desenvolvimento/Embrapa Recursos
Genéticos e Biotecnologia . Brasília, DF, ISSN 1676 - 1340; Boletim 165, 23 p. Dez.

2007.
PEREIRA, C O.F. Estudo da patogenicidade e controle biológico de Fusarium sp.
Com Trichoderma sp. 2013.74f. Dissertação. Universidade de Caxias do Sul. 2013.
PEREIRA, F. F. O. Produção, purificação e caracterização da atividade proteolítica
produzida por Trichoderma harzianum. 2011 72f. Dissertação (mestrado) –
Universidade Católica de Brasília, 2011.
PEREIRA, V. M. Avaliação do potencial enzimático de fungos filamentosos e
otimização da produção de celulases por Aspergillus sulphureus (Fresen) Wehmer,
2012. 111 f. : Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de Lavras, 2012.
POLTRONIERI, L. S; TRINDADE, D. R; ALBUQUERQUE, F. C; DUARTE, M. L.
R.; CARDOSO, S. S. Incidência de Fusarium solani em mandioca no estado do
Pará. Fitopatologia Brasileira, Brasília, v. 27, n. 5,p. 544, 2002.
RAMOS, E.H.S. Avaliação da produção de celulases por fungos filamentosos
utilizando bagaço de cana como substrato. 2012. 59f. Dissertação (Mestrado)–
Universidade Federal de Pernambuco. Centro de Ciências Biológicas, Bioquímica e
Fisiologia, 2012
ROVEDA, M.; HEMKEMEIER, M.; COLLA, L. M.. Avaliação da produção de
lipases por diferentes cepas de microrganismos isolados em efluentes de laticínios
por fermentação submersa. Ciência e Tecnologia de Alimentos, v. 30, n. 1, p. 126131, 2010.
RUEGGER, M.J.S.; TAUK-TORNISIELO, S.M. Atividade da celulase de fungos
isolados dosolo da Estação Ecológica de Juréia-Itatins. São Paulo, Brasil. Revista
Brasileira de Botânica, São Paulo, v. 27, p. 205-211, 2004.
SACCO, L. P. Isolamento de bactérias produtoras de enzimas de interesse em
processos biotecnológicos. , 2013.47f.Dissertação (mestrado) Universidade Estadual
Paulista, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, Jaboticabal-SP 2013.

SANTIN, R. C..M., Potencial do uso dos fungos Trichoderma spp. e Paecilomyces
lilacinus no biocontrole de Meloidogyne incognita em Phaseolus vulgaris. 2008. 91p.
Tese (Doutorado Fitotecnia, Área de Concentração Fitossanidade). Porto Alegre, Rio
Grande do Sul. 2008.
SANTOS, C. C., OLIVEIRA, F. A. de; SANTOS, M. S. dos; TALAMINI, V.;
FERREIRA, J. M. S.; SANTOS, F. J. dos., Influência de Trichoderma spp. sobre o
crescimento micelial de Thielaviopsis paradoxa. Scientia Plena 8, 047309
www.scientiaplena.org.br . 2012.
SANTOS, P. L. D., PRANDO, M. B., MORANDO, R., PEREIRA, G. V. N., e
KRONKA, A. Z. Utilização de extratos vegetais em proteção de plantas.
Enciclopédia Biosfera, 2562-2576. 2013.
SAZCI, A.; RADFORD, A.; ERENLER, K. Detection of cellulolytic fungi by using
Congo red as an indicator: a comparative study with the dinitrosalicyclic acid
reagent method. Journal Applied Bacteriol. v. 61, p. 559–562, 1986.
SERRA, I. M. R. S., SILVA, G. S. da; NASCIMENTO, F. S.; LIMA, L. K. F.
Scytalidium lignicola em mandioca: ocorrência no Estado do Maranhão e reação de
cultivares ao patógeno. Summa Phytopathologica, Botucatu, v. 35, n. 4, p. 327-328,
2009.
SILVA, A. N.; AZEVEDO, G. B.; ROCHA-SOBRINHO, G. G.; NOVAES, Q. S.;
Efeito de produtos químicos e de Trichoderma spp. no controle de Fusarium solani
do maracujazeiro. Interciencia, v. 6, p. 398-403, 2014.
SILVA, C. A. D., DE MEDEIROS, E. V., BEZERRA, C. B., DE MORAIS; SILVA,
W., DE BARROS, J. A., & DOS SANTOS, U. J. Interferência da incorporação de
matéria orgânica no solo no controle da podridão negra da mandioca, causada por
Scytalidium lignicola. Biosci. J., Uberlândia, v. 29, n. 6 , p. 1823-1831, Nov./Dec.
2013.
SILVA, C. A. D., Prospecção em fitopatógenicos e avaliação de fontes de matéria
orgânica sobre a supressividade da podridão radicular da mandioca. Garanhuns-

PE, 2013. 77 f. Dissertação (Mestrado em Produção Agrícola). Universidade Federal
Rural de Pernambuco – Unidade Acadêmica de Garanhuns, 2013.
SILVA, M.B.; NICOLI, A. COSTA, A.S.V.; BRASILEIRO, B.G.; JAMAL, C.M.,
SILVA, C. A.; PAULA JÚNIOR, T. J.; TEIXEIRA, H. Ação antimicrobiana de
extratos de plantas medicinais sobre espécies fitopatogênicas de fungos do gênero
Colletotrichum. Revista Brasileira de Plantas Medicinais , Botucatu, v.10, n.3, p.57-60,
2008.
SILVA, R. A.; SOUZA, T. O.; DIAS, L. P.; ANDRADE, T . J. A. S. Ação do extrato
metanólico da Moringa oleifera sobre o crescimento micelial de fitopatógenos, IV,
2009, Belém. Anais... Belém, PA:. p. 1- 4. 2009.
SILVA, V. M.; MARTINS, C. M. & SILVEIRA, S. C. Atividade celulolítica de
actinobactérias de região semiárida do Ceará. Enciclopédia Biosfera, v. 11, p. 20262036, 2015.
SINGHANIA, R.R.; SUKUMARAN, R.K.; PATEL, A.K.; LARROCHE, C.;
PANDEY, A. Advancement and comparative profiles in the production
technologies using solid-state and submerged fermentation for microbial cellulases.
Enzyme and Microbial Technology, v.46, p.541-549, 2010.
SOUZA PEDRO, E.A.; HARAKAVA, R.; LUCON, C. M. M., & GUZZO, S. D.
Promoção do crescimento do feijoeiro e controle da antracnose por Trichoderma
spp. Pesq. agropec. bras., Brasília, v. 47, n. 11, p. 1589-1595, 2012.
SOUZA, H.Q.de.; OLIVEIRA, L.A. de.; ANDRADE,J.S. Seleção de Basidiomycetes
da Amazonia para produção de enzimas de interesse biotecnológico. Ciência e
Tecnologia de Alimentos, Campinas, 2011.

SOUZA, J. R., Potencialidade de fungicida e agente biológico no controle de
requeima do tomateiro. 2013. 63f. Dissertação. Universidade Estadual do Sudoeste da
Bahia, Vitória da Conquista. Bahia – BR. 2013.

SOUZA, K. de A.;VAZ, M. C. A.; ALVES, G. C. S.; PAZ -LIMA, M. L.. Confronto in
vitro de isolados de Trichoderma spp. com fungos filamentosos. 2p. IV Congresso
Estadual de Iniciação Científica do IF Goiano 21 a 24 de setembro de 2015.
STAMFORD, T. L.M.; ARAÚJO, J. M.; STAMFORD, N. P. Atividade enzimática de
microrganismos isolados do jacatupé (Pachyrhizus erosus L. Urban). Ciência e
Tecnologia de Alimentos, v. 18, n. 4, p. 382-385, 1998.
TUITE, J. Plant phathological methods. Mineapolis: Burgess,1969. 239p.
VAZ, M. S. S.Caracterização do gene lip2 de Trichoderma harzianum .2010. 81 f.
Dissertação (Mestrado)-Escola Superior Agrária de Bragança, Bragança, 2010.
VENTUROSO, L.R.; BACCHI, L.M.A.; GAVASSONI, W.L. Atividade antifúngica
de extratos vegetais sobre o desenvolvimento de fitopatógenos. Summa
Phytopathologica, v.37, n.1, p.18-23, 2011.
VIZZOTTO, M.; KROLOW, A. C.; WEBER, G. E.B. Metabólitos secundários
encontrados em plantas e sua importância. Documento : Embrapa Clima Temperado,
Pelotas, n.316, p.7-15. 2010.
WENZEL, J. B., DE ALMEIDA MORESCO, A. A., BOAS, E. V., BURIN, F. A. G., &
DE SOUZA, R. O. Atividade enzimática e antimicrobiana de fungos endofíticos
isolados de soja. Biológicas & Saúde, v. 3, n. 9, 2013.
ZAMPIERI, D.; RIBEIRO, R. T. D. S. Avaliação qualitativa da secreção de enzimas
hidrolíticas por fungos endofíticos isolados do cacaueiro (theobroma cacao L.) E o
controle biológico de crinipellis perniciosa. Salão de iniciação Científica (17.: 2005:
Porto Alegre, RS). Livro de resumos. Porto Alegre: UFRGS, 2005.
ZUCCHI, F. O Trichoderma sp. em áreas agrícolas visando o controle de doenças
fúngicas de raízes de plantas cultivadas. Campinas SP. JV Biotecnologia. 15p. 2010.