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                    UNIVERSIDADE FEDERAL DE ALAGOAS
CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS
PÓS-GRADUAÇÃO EM PROTEÇÃO DE PLANTAS

Livoney Barbosa de Oliveira Goes

EFEITOS DE FONTES DE CARBONO E NITROGÊNIO NA PRODUÇÃO DE
SECRETOMA DE COLLETOTRICHUM spp.

Rio Largo
2017

LIVONEY BARBOSA DE OLIVEIRA GOES

EFEITOS DE FONTES DE CARBONO E NITROGÊNIO NA PRODUÇÃO DE
SECRETOMA DE COLLETOTRICHUM spp.

Tese apresentada ao Programa de Pós-graduação
em Proteção de Plantas, do Centro de Ciências
Agrárias, da Universidade Federal de Alagoas,
como parte dos requisitos para a obtenção do
título de Doutor em Proteção de Plantas.

Rio Largo
2017

LIVONEY BARBOSA DE OLIVEIRA GOES

EFEITOS DE FONTES DE CARBONO E NITROGÊNIO NA PRODUÇÃO DE
SECRETOMA DE COLLETOTRICHUM spp.

Tese apresentada à subscrita banca examinadora,
como requisito para a conclusão do curso de
Doutorado em Proteção de Plantas.

(Biólogo, Livoney Barbosa de Oliveira Goes, UFAL)

BANCA EXAMINADORA:

Prof. Gildemberg Amorim Leal Júnior - UFAL - Orientador

Prof.ª Maria de Fátima da Silva Muniz - UFAL - Examinadora

Prof. Júlio Alves Cardoso Filho - UFAL - Examinador

Profa. Marissonia de Araújo Noronha – Embrapa Tabuleiros Costeiros - Examinadora

Rio Largo
2017

RESUMO
O presente estudo investigou o efeito da limitação de carbono e nitrogênio nas
lesões foliares causadas pelo secretoma de fungos fitopatogênicos. Três espécies de
Colletotrichum e seus mutantes nit foram cultivadas com suplementação de carbono
10g/L (dextrose, sacarose, amido e sorbitol) e de nitrogênio 1g/L (molibdato de amônio,
cloreto de amônio, nitrato de potássio, L-asparagina e extrato de levedura). O objetivo foi
identificar quais fontes e combinações causam estresse fisiológico. Foram mensurados o
diâmetro das colônias, a produção de esporos, a massa fresca, seca e sua variação, a
variação de pH e a produção de proteínas e lesões foliares. Foi possível observar que
sacarose e fontes inorgânicas de nitrogênio causaram estresse nutricional nos isolados
fúngicos, sobretudo a associação sorbitol e nitrato de potássio que melhor simula o
estresse nutricional enfrentado nas fases iniciais de infecção. O hospedeiro Sl exibiu
maior e mais diversa reação ao secretoma. Nos mutantes nit observou-se que sorbitol e
extrato de levedura proporcionaram os menores estresses fisiológicos e a maior
diversidade de lesões foliares em Sl. Portanto o estresse nutricional contribui para o
potencial lesivo e para a inespecificidade ao hospedeiro, nas espécies de Colletotrichum
utilizadas nesse estudo, assim como para os seus mutantes nit. Contudo o estresse
nutricional também evidenciou o desempenho superior dos mutantes nit em utilizar fontes
de nitrogênio alternativas ao nitrato, quando comparados aos Tipos selvagens.

Palavras-chave: interação planta-patógeno; relação C:N, especificidade ao hospedeiro.

ABSTRACT
The present study investigated the effect of carbon and nitrogen limitation on foliar
lesions caused by the secretoma of phytopathogenic fungi. Three species of
Colletotrichum and their nit mutants were cultured with 10g / L carbon supplementation
(dextrose, sucrose, starch and sorbitol) and 1g / L nitrogen (ammonium molybdate,
ammonium chloride, potassium nitrate, L-asparagine and extract of yeast). The aim was
to identify which sources and combinations cause physiological stress. The diameter of
the colonies, spore production, fresh mass, dry matter and its variation, pH variation and
leaf protein and lesion production were measured. It was possible to observe that sucrose
and inorganic sources of nitrogen caused nutritional stress in fungal isolates, especially
the association of sorbitol and potassium nitrate, which best simulates the nutritional
stress encountered in the initial stages of infection. The host Sl exhibited a larger and
more diverse reaction to the secretoma. In the nit mutants it was observed that sorbitol
and yeast extract provided the lowest physiological stresses and the greatest diversity of
leaf lesions in Sl. Therefore nutritional stress contributes to the potential harmful and nonspecific host, in the Colletotrichum species used in this study, as well as to its nit mutants.
However, nutritional stress also evidenced the superior performance of nit mutants in
using nitrogen sources that were alternative to nitrate when compared to wild types.

Keywords: plant-pathogen interaction; C: N ratio, host specificity.

LISTA DE TABELAS
Tabela

Título

Página

1

Identificação molecular dos isolados de Colletotrichum empregados no estudo.

34

2

Diâmetro médio (cm) das colônias de espécies de Colletotrichum sete dias após

36

inoculação sob estresse nutricional de carbono.
3

Massa fresca (g) de espécies de Colletotrichum 21 dias após inoculação sob estresse

37

nutricional de fontes de carbono.
4

Massa seca (g) de espécies de Colletotrichum 21 dias após inoculação sob estresse

38

nutricional de fontes de carbono.
5

Variação de massa (g) de espécies de Colletotrichum 21 dias após inoculação sob

38

estresse nutricional de fontes de carbono.
6

Variação de pH do secretoma de espécies de Colletotrichum 21 dias após inoculação

39

sob estresse nutricional de fontes de carbono.
7

Produção de proteínas (µg/µL) de espécies de Colletotrichum 21 dias após inoculação

40

sob estresse nutricional de fontes de carbono.
8

Diâmetro médio (cm) das colônias de Colletotrichum cinco dias após inoculação sob

44

estresse nutricional de fontes de nitrogênio em sacarose.
9

Esporulação média 105esporos/mL de espécies de Colletotrichum dez dias após

45

inoculação sob estresse nutricional de fontes de nitrogênio em sacarose.
10

Massa fresca (g) de espécies de Colletotrichum 21 dias após inoculação sob estresse

47

nutricional de fontes de nitrogênio em sacarose.
11

Massa seca (g) de espécies de Colletotrichum 21 dias após inoculação sob estresse

48

nutricional de fontes de nitrogênio em sacarose.
12

Variação de massa (g) de espécies de Colletotrichum 21 dias após inoculação sob

48

estresse nutricional de fontes de nitrogênio em sacarose.
13

Esporulação média 105 esporos/mL de espécies de Colletotrichum 21 dias após

49

inoculação sob estresse nutricional de fontes de nitrogênio em sacarose.
14

Variação de pH do secretoma de espécies de Colletotrichum 21 dias após inoculação

50

sob estresse nutricional de fontes de nitrogênio em sacarose.
15

Produção de proteínas (µg/µL) de espécies de Colletotrichum 21 dias após inoculação

51

sob estresse nutricional de fontes de nitrogênio em sacarose.
16

Diâmetro médio (cm) das colônias de Colletotrichum cinco dias após inoculação sob

53

estresse nutricional de fontes de nitrogênio em sorbitol.
17

Esporulação média 105esporos/mL de espécies de Colletotrichum dez dias após

54

inoculação sob estresse nutricional de fontes de nitrogênio em sorbitol.
18

Massa fresca (g) de espécies de Colletotrichum 21 dias após inoculação sob estresse
nutricional de fontes de nitrogênio em sorbitol.

56

19

Massa seca (g) de espécies de Colletotrichum 21 dias após inoculação sob estresse

56

nutricional de fontes de nitrogênio em sorbitol.
20

Variação de massa (g) de espécies de Colletotrichum 21 dias após inoculação sob

57

estresse nutricional de fontes de nitrogênio em sorbitol.
21

Esporulação média 105esporos/mL de espécies de Colletotrichum 21 dias após

58

inoculação sob estresse nutricional de fontes de nitrogênio em sorbitol.
22

Variação de pH do secretoma de espécies de Colletotrichum 21 dias após inoculação

59

sob estresse nutricional de fontes de nitrogênio em sorbitol.
23

Produção de proteínas (µg/µL) na combinação de sorbitol com fontes de nitrogênio.

59

24

Diâmetro médio das colônias de isolados selvagens e mutantes de Colletotrichum em

82

KClO3 150mM aos sete dias de cultivo.
25

Produção de massa fresca (g) por isolados selvagens e mutantes de Colletotrichum

83

aos 21 dias de cultivo.
26

Produção de massa seca (g) por isolados selvagens e mutantes de Colletotrichum aos

84

21 dias de cultivo.
27

Variação de massa (g) em isolados selvagens e mutantes de Colletotrichum aos 21

86

dias de cultivo.
28

Esporulação média 105 esporos/mL em isolados selvagens e mutantes de

87

Colletotrichum aos 21 dias de cultivo.
29

Variação de pH do secretoma em isolados selvagens e mutantes de Colletotrichum
aos 21 dias de cultivo.

88

LISTA DE FIGURAS
Figura

Título

Página

1

Face abaxial das folhas de Solanum lycopersicum (A) e Phaseolus lunatus (B)

33

perfundida venalmente com agulha e seringa.
2

Teste de patogenicidade. Da esquerda para a direita Cs, Ct e Cm. Folhas de Solanum

35

lycopersicum (A-C) e folhas de Phaseolus lunatus (D-F).
3

Lesões em folhas de S. lycopersicum e de P. lunatus causadas pela infiltração com

41

secretomas de C. siamense, C. truncatum e C. musae cultivados em meio contendo
dextrose como fonte de carbono. S. lycopersicum (A-D); P. lunatus (E-H); Controles
(A e E), Cs (B e F), Ct (C e G), Cm (D e H).
4

Lesões em folhas de S. lycopersicum e de P. lunatus causadas pela infiltração com

41

secretomas de C. siamense, C. truncatum e C. musae cultivados em meio contendo
sacarose como fonte de carbono. S. lycopersicum (A-D); P. lunatus (E-H); Controles
(A e E), Cs (B e F), Ct (C e G), Cm (D e H).
5

Lesões em folhas de S. lycopersicum e de P. lunatus causadas pela infiltração com

43

secretomas de C. siamense, C. truncatum e C. musae cultivados em meio contendo
amido como fonte de carbono. S. lycopersicum (A-D); P. lunatus (E-H); Controles (A
e E), Cs (B e F), Ct (C e G), Cm (D e H).
6

Lesões em folhas de S. lycopersicum e de P. lunatus causadas pela infiltração com

43

secretomas de C. siamense, C. truncatum e C. musae cultivados em meio contendo
sorbitol como fonte de carbono. S. lycopersicum (A-D); P. lunatus (E-H); Controles
(A e E), Cs (B e F), Ct (C e G), Cm (D e H).
7

Crescimento micelial aos 5dai em sacarose sob estresse de fontes de nitrogênio. Nas

46

linhas da esquerda para a direita Cs, Ct e Cm respectivamente. A-C Molibdato de
amônio, D-F Cloreto de amônio, G-I Nitrato de potássio, J-M Asparagina, N-P
Extrato de levedura.
8

Lesões induzidas em folhas de S. lycopersicum perfundidas com secretoma obtido de

52

cultivos que combinavam fontes de nitrogênio em sacarose. Nas colunas da esquerda
para a direita: Controles, Cs, Ct e Cm. A – D cloreto de amônio, E-H nitrato de
potássio, I-M asparagina, N-Q extrato de levedura.
9

Lesões induzidas em folhas de P. lunatus perfundidas com secretoma obtido de

52

cultivos que combinavam fontes de nitrogênio em sacarose. Nas colunas da esquerda
para a direita: Controles, Cs, Ct e Cm. A – D cloreto de amônio, E-H nitrato de
potássio, I-M asparagina, N-Q extrato de levedura.
10

Crescimento micelial aos 5dai em sorbitol sob estresse de fontes de nitrogênio. Nas
linhas da esquerda para a direita Cs, Ct e Cm respectivamente. A-C Molibdato de
amônio, D-F Cloreto de amônio, G-I Nitrato de potássio, J-M Asparagina, N-P
Extrato de levedura.

55

11

Lesões induzidas em folhas de S. lycopersicum perfundidas com secretoma obtido de

61

cultivos que combinavam fontes de nitrogênio em sorbitol. Nas colunas da esquerda
para a direita: Controles, Cs, Ct e Cm. A – D cloreto de amônio, E-H nitrato de
potássio, I-M asparagina, N-Q extrato de levedura.
12

Lesões induzidas em folhas de P. lunatus perfundidas com secretoma obtido de

61

cultivos que combinavam fontes de nitrogênio em sorbitol. Nas colunas da esquerda
para a direita: Controles, Cs, Ct e Cm. A – D cloreto de amônio, E-H nitrato de
potássio, I-M asparagina, N-Q extrato de levedura.
13

Crescimento micelial de isolados selvagens e mutantes de Colletotrichum em KClO3

81

150mM e batata 10/L aos 30dai. A – Cs, B – CsM1, C – CsM2, D – Ct, E – CtM1, F
– CtM2, G – Cm, H – CmM1, I – CmM2.
14

Lesões induzidas em folhas de S. lycopersicum perfundidas com secretoma obtido de

91

cultivos que combinavam nitrato de potássio (A-J) e extrato de levedura (L-U) em
sacarose. A e L - Controles, B e M – Cs, C e N – CsM1, D e O CsM2, E e P – Ct, F e
Q – CtM1, G e R – CtM2, H e S – Cm, I e T – CmM1, J e U – CmM2.
15

Lesões induzidas em folhas de S. lycopersicum perfundidas com secretoma obtido de

91

cultivos que combinavam nitrato de potássio (A-J) e extrato de levedura (L-U) em
sorbitol. A e L - Controles, B e M – Cs, C e N – CsM1, D e O CsM2, E e P – Ct, F e
Q – CtM1, G e R – CtM2, H e S – Cm, I e T – CmM1, J e U – CmM2.
16

Lesões induzidas em folhas de Phaseolus lunatus perfundidas com nitrato de
potássio (A-D e I) e extrato de levedura (E-H e J-L) respectivamente em sacarose e
sorbitol. A, E, I, J - Controles, B – CsM2, C e G – Ct, D e L - CmM2, F – CsM1, H
– CmM1.

92

SUMÁRIO
1
2
2.1
2.2
2.3
2.4
3
3.1
3.2
3.2.1
3.3
3.3.1
3.3.2
3.3.3
3.3.4
3.3.5
3.3.6
3.3.7
3.3.8
3.3.9
3.4
3.5
4
4.1
4.2
4.2.1
4.2.2
4.2.3
4.3
4.3.1
4.3.2
4.3.3
4.4
4.5

INTRODUÇÃO ........................................................................................................
REVISÃO DE LITERATURA ................................................................................
Considerações sobre Colletotrichum spp. ...............................................................
Fatores de virulência ................................................................................................
Fisiologia e estresse nutricional em fungos .............................................................
Considerações finais .................................................................................................
REFERÊNCIAS ........................................................................................................
Reação dos tecidos de Solanum lycopersicum e Phaseolus lunatus ao secretoma
de Colletotrichum spp. produzido em diferentes condições nutricionais. .............
Introdução .................................................................................................................
Metodologia ...............................................................................................................
Delineamento experimental e análise estatística ....................................................
Resultados ..................................................................................................................
Estresse nutricional de fontes de carbono em meio sólido .........................................
Estresse nutricional de fontes de carbono em meio
líquido..........................................................................................................................
Lesão tecidual sob estresse de fontes de carbono .........................................................
Estresse nutricional de fontes de nitrogênio em sacarose no meio sólido ..................
Estresse nutricional de fontes de nitrogênio em sacarose no meio líquido ...................
Lesão tecidual sob estresse de fontes de nitrogênio em sacarose .................................
Estresse nutricional de fontes de nitrogênio em sorbitol no meio sólido ......................
Estresse nutricional de fontes de nitrogênio em sorbitol no meio líquido ....................
Lesão tecidual sob estresse de fontes de nitrogênio em sorbitol ...................................
Discussão ....................................................................................................................
Conclusões .................................................................................................................
REFERÊNCIAS ........................................................................................................
Reação dos tecidos de Solanum lycopersicum E Phaseolus lunatus ao secretoma
de mutantes nit de Colletotrichum spp. produzidos em estresse nutricional ........
Introdução .................................................................................................................
Metodologia ...............................................................................................................
Estresse nutricional .....................................................................................................
Condições de crescimento e variáveis analisadas ........................................................
Delineamento experimental e análise estatística ..........................................................
Resultados ..................................................................................................................
Obtenção de mutantes Nit ............................................................................................
Estresse nutricional .....................................................................................................
Lesões teciduais ..........................................................................................................
Discussão ....................................................................................................................
Conclusões .................................................................................................................
REFERÊNCIAS ........................................................................................................

8
10
11
12
14
18
19
27
29
30
33
34
36
37
40
44
47
51
53
54
60
62
66
67
75
77
79
79
79
80
80
80
82
89
93
96
97

8

1. INTRODUÇÃO
Os fungos surgiram primeiro que as plantas e a interação entre ambos só se deu com o
surgimento de plantas vasculares terrestres (FIELD et al., 2012; HUMPHREYS et al., 2010).
Os vegetais tiveram sua adaptação ao ambiente terrestre facilitada pelos fungos à medida que,
em interação simbiótica, os fungos promoviam o crescimento e desenvolvimento dos vegetais
(REDECKER et al., 2000; ZEILINGER et al., 2015).
Nessas interações benéficas, os fungos dispunham das reservas de carbono dos vegetais,
enquanto facilitavam a absorção de sais minerais e água do solo (BUSCOT et al., 2000).
Contudo, as interações maléficas que geravam instabilidade no vegetal, exerciam sobre eles
pressão de seleção levando-os à evolução (JONES; DANGL, 2006). Decorridos mais de 400
milhões de anos de coevolução, a interação entre plantas e fungos tornou-se complexa e
produziu resultados diversos, desde a mineralização e consequente disposição da matéria
orgânica ao vegetal até a patogênese (KEMEN; JONES, 2012).
Na interação com a planta os fungos podem desequilibrar o benefício mútuo adotando as
formas de colonização biotrófica, hemibiotrófica e necrotrófica, contudo os limites de
desequilíbrio não são bem conhecidos (GARDINER et al., 2013), podendo um mesmo fungo
ter características de colonização diferentes de acordo com o hospedeiro ou ainda mudar essa
característica conforme a fase de infecção.
Fungos fitopatogênicos dispõem de um amplo arsenal molecular extracelulares. Algumas
dessas moléculas são enzimas hidrolíticas que catabolizam a parede celular vegetal facilitando
assim a penetração e a maceração dos tecidos (AMARAL et al., 2012; JARAMILLO et al.,
2013; TYLER et al., 2006).
Outras são pequenas demais para desempenhar atividade catalítica, estas podem então
atuar como PAMP’s (pathogen associated molecular patterns) e desencadear resposta de defesa
no vegetal, ou ainda como efetores neutralizando, suprimindo e/ou conspurcando o sistema
imune vegetal (AMARAL et al., 2012; BENT; MACKEY, 2007; JARAMILLO et al, 2013).
Os padrões moleculares relacionados à defesa vegetal são desencadeados pela interação
entre moléculas do fungo e receptores vegetais, e determinam o tipo de relação a ser
estabelecida (ZEILINGER et al., 2015).
Diferentemente das condições artificiais de laboratório, na natureza os fitopatógenos
sofrem restrições na disponibilidade de carbono e nitrogênio nas primeiras fases da colonização,
tais restrições alteram sua fisiologia e podem afetar a comunicação bioquímica com o
hospedeiro e o estabelecimento da relação típica.

9

O gênero Colletotrichum infecta em pré e pós-colheita várias plantas cultivadas de
importância econômica. Contudo esses fungos exibem um conjunto bem mais amplo de hábitos,
tais como saprobiose, endo e epifitía (KUMAR; HYDE, 2004; LIU et al., 2007; PRIHASTUTI
et al., 2009). Existem espécies patogênicas generalistas como também adaptadas a hospedeiros
e famílias botânicas específicas (HYDE et al., 2009). O hábito hemibiotrófico de algumas
espécies de Colletotrichum já foi bem relatado, incluso os sinais moleculares que desencadeiam
a mudança entre as fases biotrófica e necrotrófica da infecção (GAN et al., 2013; MÜCH et al.,
2008).
O objetivo foi inferir sobre os efeitos do estresse nutricional na fisiologia de
Colletotrichum spp. e nos sintomas gerados nos tecidos hospedeiro e não-hospedeiro.

10

2. REVISÃO DE LITERATURA
Os vegetais hospedam um ou mais fungos endofíticos com a finalidade de aumentar a
resistência a patógenos, herbívoros e/ou a estresses (STROBEL; DAISY, 2003). Esses
microrganismos desenvolveram estratégias para suprimir ou conspurcar a defesa vegetal,
permitindo-lhes colonizar a superfície ou o interior do hospedeiro, mesmo seguindo padrões e
estruturas de colonização semelhantes aos patogênicos (CORRADI; BONFANTE, 2012;
ZAMIOUDIS; PIETERSE, 2012).
Os ferimentos e estômatos são aberturas pelas quais os fungos acessam o interior vegetal,
contudo enzimas que degradam a parede celular (CWDEs cell wall-degrading enzymes) e
estruturas específicas de penetração podem ser usadas para tal fim.
Os fungos necrotróficos causam rápidos danos ao tecido infectado ao combinar CWDEs,
espécies reativas de oxigênio (ROS reactive oxigen species) e/ou toxinas, logo a virulência de
muitos patógenos está correlacionada com esses fatores (WANG et al., 2014). De forma
contrária são os fungos biotróficos, enquanto parasitas obrigatórios não produzem toxinas, mas
sim efetores que vão suprimir a imunidade vegetal (PERFECT; GREEN, 2001). Esses fungos
colonizam hospedeiros específicos, com os quais interagem por meio de hifas biotróficas
especializadas em uma zona interfacial onde ambos, fungo e hospedeiro, secretam biomoléculas
(YI; VALENT, 2013).
Os fungos hemibiotróficos tem uma estratégia de colonização intermediária, inicialmente
comportam-se como biotróficos e depois mudam para necrotróficos (GARDINER et al., 2013).
Os fatores fisiológicos e moleculares que desencadeiam essa transição de estilos de colonização
ainda não são claros. Alguns hemibiotróficos requerem longos períodos de colonização
biotrófica para estabelecer uma infecção, enquanto outros requerem apenas algumas horas
(KABBAGE et al., 2015). Especula-se que a fase biotrófica necessita de tempo para impedir a
defesa vegetal e suprimir a morte celular programada ou então, uma vez que o limite de defesa
seja atingido o patógeno detecte que a biotrofia não é mais vantajosa. Assim a doença inicia-se
e a pressão de defesa do hospedeiro desencadeia a transição para necrotrofia, em certos
momentos a morte da célula hospedeira pode ser apenas o resultado da reação de defesa do
vegetal e não a mudança para necrotrofia transitada. É possível que tanto a manutenção quanto
a duração do estágio biotrófico não dependa de como o fungo gerencia as barreiras de defesa
vegetal, mas sim de uma exigência para a melhor nutrição fúngica (ZEILINGER et al., 2015;
KABBAGE et al., 2015).

11

As plantas reagem à infecções com mudanças fisiológicas na respiração, fotossíntese,
translocação de nutrientes, transpiração e crescimento, e muitas dessas reações estão associadas
ao metabolismo primário do carbono (BERGER et al., 2007). Na natureza as plantas são
resistentes à maioria dos fungos, pois possuem mecanismos de defesa e o ambiente é
heterogênio, logo as associações simbióticas e neutras são mais frequentes que as parasitárias
(STASKAWICZ, 2001). Contudo, nos agroecossistemas, as características de homogeneidade
das plantas e do ambiente favorecem a prevalência dos parasitas.

2.1. Considerações sobre Colletorichum spp.
O gênero Colletotrichum engloba tanto espécies de fungos fitopatogênicos cosmopolitas
que causam antracnose em plantas de interesse econômico, como também espécies endofiticas
em plantas tropicais (CANNON; SIMMONS, 2002; SURYANARAYANAN et al., 2002).
As espécies endofiticas colonizam os tecidos vegetais vivos sem causar sintomas de
doença (PETRINI, 1991). No entanto muitas espécies endofiticas são relatadas como patógenos
biotróficos e necrotróficos em outros hospedeiros (DELAYE et al, 2013).
Segundo O’Connell et al. (2012) a infecção por Colletotrichum spp. se dá pela
diferenciação de células especializadas responsáveis pela penetração, crescimento no tecido
vegetal vivo (estratégia biotrófica) e destruição tecidual (estratégia necrotrófica).
As proteínas extracelulares atuam em todas as estratégias nutricionais desde as fases
iniciais da patogênese, por exemplo, Kleemann et al. (2008) investigando a biblioteca de cDNA
preparada a partir de apressórios maduros de Colletotrichum higginsianum crescidos in vitro,
identificaram 26 proteínas solúveis secretadas com provável atuação no processo infectivo.
Outras proteínas evitam a morte celular por Resposta de Hipersensibilidade (RH) durante a fase
biotrófica da infecção, é o caso do efetor CgDN3 de Colletotrichum gloeosporioides, essencial
para a patogenicidade sobre Stylosanthes guianensis (STEPHENSON et al., 2000).
Algumas cutinases, pectinases e celulases em Colletotrichum spp. foram identificadas e
caracterizadas, além da sua regulação e genética moleculares esclarecidas (LIMA FILHO et al.,
2003) no entanto a necessidade dessas ECP’s no processo de infecção é controverso. De modo
geral proteinases extracelulares são fatores significantes de patogênese e virulência de
Colletotrichum, por exemplo, C. coccodes, que mediante mutagênese para proteinases passou
de um patógeno virulento a um endofítico não-patogênico (REDMAN; RODRIGUEZ, 2002).
Em condições de limitação de nutrientes o glicerol, necessário à formação e
funcionamento do apressório de Colletotrichum spp., é produzido a partir do catabolismo de
lipídeos, ácidos graxos, glicogênio e trealose e ativação do ciclo do glioxilato (BROWN et al.,

12

2008; FOSTER et al., 2003; THINES et al., 2000; WANG et al., 2011). A presença de uma
fonte de nitrogênio parece ser um importante regulador da expressão de fatores de virulência
para C. gloeosporioides (MIYARA et al., 2008), a secreção de pectato liase nesse
microrganismo é um bom exemplo de como a disponibilidade de nitrogênio e o pH do ambiente
estão intimamente relacionados a esse fator de virulência (DRORI et al., 2003).
Alguns estudos, com diferentes propósitos (JACKSON; BOTHAST,1990; PATEL;
GUPTE, 2016) dedicaram-se a estabelecer condições ótimas para o crescimento e a esporulação
de espécies de Colletotrichum e outros fungos em meio de cultivo líquido e sólido, ou seja,
nutrir o fungo de forma a que o mesmo expresse todo seu potencial fisiológico, incluso a
produção de ECP´s. Os autores demonstraram a importância da relação C:N nos eventos de
crescimento e esporulação. Ao passo que meios de cultivo com grandes quantidade de carbono
promovem o abundante crescimento micelial e induzem a formação de microesclerócios,
concentrações menores de carbono combinadas com fontes complexas e orgânicas de
nitrogênio incrementam a esporulação de Colletotrichum sp.
Em fungos, tais como os do gênero Colletotrichum, o déficit nutricional de nitrogênio
estimula a sincronia no desenvolvimento pré-infectivo (HOROWITZ et al., 2006), a expressão
de genes que afetam a formação e diferenciação de apressórios (SOANES et al., 2002) e outros
determinantes de virulência como enzimas antioxidantes e degradadoras de parede celular.
O acúmulo de amônio nos tecidos vegetais tem sido apontado como um forte contribuinte
para a patogenicidade de Colletotrichum devido a ativação de fatores de patogenicidade como
a secreção de pectato liase (KRAMER-HAIMOVICH et al., 2006). Assim a alcalinização
decorrente do acúmulo de amônio é crucial para uma transição bem-sucedida da fase quiescente
para a fase de colonização ativa, embora ainda faltem as evidências (ALKAN et al., 2008).

2.2. Fatores de virulência
Os fungos produzem uma diversidade de proteínas extracelulares que atuam tanto no
apoplasto, onde podem interferir nos processos de defesa do hospedeiro inibindo proteases
vegetais e enzimas líticas, quanto no simplasto interrompendo a rota de transdução de sinal que
media as respostas de defesa vegetal (BHADAURIA et al., 2011). As proteínas extracelulares
são chamadas de fatores de virulência dada sua importância para o sucesso da colonização e,
principalmente, pela produção das lesões típicas da doença.
A interação bioquímica entre planta e patógenos pode ser entendida coevolutivamente,
onde o patógeno desenvolve estratégias para colonizar com sucesso seus hospedeiros, e as
plantas elaboram métodos de detecção e defesa para repelir os ataques. O conjunto de

13

ferramentas morfológicas e bioquímicas usado pelos fungos no desenvolvimento das suas
relações com as plantas hospedeiras evoluiu no sentido de incluir mecanismos complexos que
fornecem vantagens no controle dos mecanismos de defesa do hospedeiro (ZEILINGER et al.,
2015).
O resultado dessa interação pode ser alterado por mutações nos genes do patógeno ou do
hospedeiro, assim um vegetal resistente pode tornar-se suscetível ou vice-versa (GIRALDO;
VALENT, 2013). Dada sua importância para o sucesso da colonização as biomoléculas
extracelulares dos patógenos são chamadas de fatores de virulência.
Nesse sentido, importantes avanços foram feitos na microscopia com o desenvolvimento
de técnicas para acompanhar o trânsito tridimensional de moléculas em tempo real dentro das
células e tecidos. Técnicas de complementação de biomoléculas por sondas fluorescentes já
foram empregadas com sucesso na investigação da cinética de conjugados proteicos da
interação planta-patógeno (HAYWARD et al., 2010; HOFF; KÜCK, 2005; HOWARD, 2001;
ISHIKAWA-ANKERHOLD et al., 2012).
A pesquisa por proteínas extracelulares (ECP´s) na interação fungos fitopatogênicos e
seus hospedeiros é um exemplo onde a combinação de diferentes técnicas e abordagens
metodológicas resultam em importantes contribuições para o entendimento do processo
biológico. Essas proteínas abrangem uma diversidade de enzimas hidrolíticas degradadoras de
moléculas complexas ricas em carbono ou nitrogênio da parede celular vegetal, assim
fitopatógenos produtores de ECP´s facilitam sua penetração e maceração dos tecidos do
hospedeiro (AMARAL et al., 2012; JARAMILLO, 2013; TYLER et al., 2006).
No entanto algumas ECP’s são pequenas demais para desempenhar atividade catalítica,
estas podem então atuar como PAMP’s (pathogen associated molecular patterns) e
desencadear resposta de defesa no vegetal ou ainda como efetores neutralizando, suprimindo
e/ou mascarando o sistema imune vegetal (AMARAL et al., 2012; BENT; MACKEY, 2007;
JARAMILLO, 2013).
Muitos autores tem se dedicado a identificar e caracterizar ECP´s no secretoma, in vivo,
in vitro e in silico, de fungos fitopatogênicos tais como Aspergillus niger, A. flavus, Botrytis
cinerea, Fusarium graminearum e Ustilagos maydis apontando quais possivelmente são fatores
de virulência (FERNÁNDEZ-ACERO et al., 2010; LU et al., 2010; MEDINA et al., 2005;
MONTANINI et al., 2006; MUELLER et al., 2008; PHALIP et al., 2005).

14

2.3. Fisiologia e estresse nutricional em fungos

Mudanças fisiológicas são observadas no vegetal hospedeiro infectado por fitopatógenos.
A respiração é um dos primeiros processos a ser afetado, há o incremento da atividade de
enzimas envolvidas na respiração, acúmulo de substâncias fenólicas e aumento no metabolismo
de pentoses (SHARMA, 2004).
Os tomateiros atacados pelo fungo necrotrófico Botrytis cinerea mostram uma regulação
coordenada entre defesa e metabolismo de carboidratos, observa-se correlação entre a
magnitude da regulação gênica e o desenvolvimento de sintomas (BERGER et al., 2004).
Adicionalmente o ataque de patógenos biotróficos gera uma redução do metabolismo no local
infectado, isso resulta em uma mudança nos padrões de translocação de nutrientes que são
trazidos às folhas infectadas com a finalidade de suprir as necessidades do patógeno
(ZEILINGER et al., 2015).
Nos estágios iniciais de infecção os fitopatógenos ainda não acessam os nutrientes
contidos no hospedeiro (SNOEIJER et al., 2000), essa indisponibilidade somada ao tipo de
fonte e a concentração dos nutrientes, em especial carbono e nitrogênio, alteram a produção de
enzimas e por conseguinte o proteoma extracelular (JUN et al., 2013; MAJEAU et al., 2010).
Por exemplo, a regulação, transcricional e dependente da fonte de carbono, da produção de
enzimas em Trichoderma reesei e Aspergilus niger (JUHASZ et al., 2005; STRICKER et al.,
2008).
Enzimas degradadoras de fontes de carbono e nitrogênio, muitas vezes, são capazes de
produzir sintomas característicos das doenças, como observado por Talbot et al. (1997)
estudando os produtos de secreção de Magnaporthe grisea sob estresse de nitrogênio. Uma
forma de estimular a produção de ECP´s in vitro é simular as condições enfrentadas pelo
fitopatógeno nas fases iniciais da infecção. Tal procedimento tem ajudado a entender melhor o
processo de patogênese fúngica nos estágios iniciais da infecção (CHU et al., 2015).
Considerando que a disponibilidade, a fonte e a concentração de carbono afetam a
produção de enzimas (MAJEAU et al., 2010) e o metabolismo secundário em fungos, esses
fatores devem ser cuidadosamente ajustados para a produção de ECP´s em estudos de
exoproteoma. Por exemplo, em Trichoderma reesi a transcrição dos principais genes de
celulases é induzida não somente pela presença da celulose, mas também por uma gama de
mono e dissacarídeos como a xilose, lactose e celobiose (NOGAWA et al., 2001; SALOHEIMO
et al., 1997), no entanto a indução dessas enzimas é diminuída na presença de uma fonte
preferencial de carbono, como por exemplo a glicose e a frutose.

15

A preferência pelo consumo de fontes de carbono mais simples, que não necessitam de
incremento na transcrição de ECP’s para seu aproveitamento, enseja evita-las na formulação
dos cultivos destinados à pesquisa de ECP´s, pois, diferente das condições padrões em
laboratório, a disponibilidade de carbono sob a forma de glicose é limitada no habitat dos
fitopatógenos.
Muito é conhecido sobre a expressão de genes de Saccharomyces cerevisiae sob limitação
de glicose (BOER et al., 2003; DARAN-LAPUJADE et al., 2004; WU et al., 2004), porém
pouco é publicado sobre mudanças no proteoma durante esse estresse (KROLL et al., 2014).
Cerca de 21 proteínas são diferencialmente reguladas em S. cerevisiae para adapta-la a
concentrações tanto superiores quanto inferiores a 2% de glicose (GUIDI et al., 2010). Os
autores observaram que em concentrações superiores houve aumento na abundância de
proteínas envolvidas na gliconeogênese, na fermentação alcóolica e na biossíntese de glicerol.
Contudo em níveis baixos de glicose foram mais abundantes as proteínas envolvidas na
respiração e no metabolismo de aminoácidos. Houve também incremento na expressão do
antioxidante peroxirredoxina TSA1 em ambas as situações. Em suma o estudo demonstrou que
o excesso de glicose ocasiona estresse osmótico e oxidativo, ao passo que a restrição de glicose
tem mais efeitos benéficos sobre o crescimento e metabolismo de S. cerevisiae.
Em estudo semelhante, porém com abordagem proteômica, Kolkman et al. (2006)
verificaram que quando a disponibilidade de glicose é limitada há o aumento da quantidade de
proteínas envolvidas com a glicólise, ciclo do TCA, fosforilação oxidativa e biogênese de
peroxissomos. Este último aponta para a β-oxidação de ácidos graxos pois ambos, biogênese
de peroxissomos e oxidação de ácidos graxos são regulados pela via do ativador repressível por
glicose Ard1p (GURVITZ et al., 2001).
O trabalho de Kolkman et al. (2006) também relatou que o aumento das quantidades da
aldeido-desidrogenase, AldA ocorria durante a ausência de glicose o que indica para a ativação
da via de utilização do etanol (alc). Essa via é induzida pelo fator de transcrição AlcR que é
regulado pelo repressor catabólico CreA (FELENBOK, 1991; FLIPPHI et al., 2003). Na
presença de glicose, CreA reprime AlcR, portanto quando não há glicose o catabolismo de
etanol é ativado.
A limitação em nitrogênio é tão impactante sobre a fisiologia dos fungos quanto a
restrição de carbono e constitui um importante estímulo para a expressão de virulência em
fitopatógenos. O nitrogênio requerido para o desenvolvimento de fungos fitopatogênicos vem
inteiramente do hospedeiro sob a forma de íons nitrato, amônio e aminoácidos (MUR et al,
2016). Alguns trabalhos sugerem que as fontes de nitrogênio na planta são limitadas e que essa

16

restrição desencadeia o desenvolvimento da doença controlando a expressão de genes de
patogenicidade (LÓPEZ-BERGES et al., 2010; THOMMA et al., 2006). No entanto, outros
estudos sugerem que as quantidade de nitrogênio no tecido vegetal são suficientes para o pleno
desenvolvimento do fungo (PAGEAU et al., 2006; SOLOMON et al., 2003; TAVERNIER et
al., 2007; WALTERS; BINGHAM, 2007).
No apoplasto de tomateiro foi registrada a presença de variados aminoácidos, entre eles,
glutamina, glutamato, alanina e ácido γ-aminobutírico (GABA) em concentrações suficientes
para suportar o desenvolvimento nas fases iniciais da infecção por Cladosporium fulvum
(SOLOMON; OLIVER, 2001). Os mesmos autores observaram que C. fulvum utiliza GABA
como fonte de nitrogênio, desenvolvendo-se de forma similar a observada em aspartato ou
glutamato evidenciando o seu potencial e eficiência como fonte de nitrogênio para o patógeno.
Em S. cerevisiae a falta de um único aminoácido ativa a expressão de genes para a
biossíntese deles em um mecanismo chamado de controle geral de aminoácidos (resposta GCN)
(HINNEBUSCH, 1988). Esse é regulado pelo fator de transcrição ScGcn4p (ARNDT; FINK,
1986) que possui um homólogo funcional CaGcn4p em Candida albicans (TRIPATHI et al.,
2002).
Yin et al. (2004) analisaram o grau de conservação da resposta GCN entre S. cerevisiae
e C. albicans, para tanto compararam, sob restrição de aminoácidos, o proteoma de linhagens
selvagens e homozigotas para deleção de Gcn4p. Concluíram que há similaridade da resposta
GCN entre S. cerevisiae e C. albicans, além do incremento de proteínas relacionadas a
biossíntese de aminoácidos foram induzidas a resposta geral a estresse e o metabolismo de
carboidratos. Essa observação aponta, além da conservação da resposta GCN entre esses
organismos, para a forte relação entre carbono e nitrogênio no metabolismo de fungos. Outros
estudos que corroboram essa relação foram os de Kamthan et al. (2012) e Tripathi et al. (2002)
que estudando os efeitos da fonte de carbono N-acetilglicosamina (GlcNAc) na morfogênese
relataram atividade da resposta GCN e mudanças morfogenéticas para pseudohifas de C.
albicans.
O metabolismo de nitrogênio em fungos filamentosos é regulado por uma série de
proteínas que garantem a assimilação de compostos nitrogenados na ausência de amônio e
glutamina, as fontes preferenciais de nitrogênio (CADDICK et al., 1994; MARZLUF, 1997;
PEREIRA et al., 2003). O nitrato é um desses composto nitrogenados não-preferenciais, após
ser transportado para o meio intracelular por uma permease, o nitrato é reduzido
sequencialmente a nitrito e depois amônio respectivamente pelas enzimas nitrato e nitrito
redutase (PEREIRA et al., 2003).

17

A utilização de diferentes fontes de nitrogênio por fungos é regulada por um sistema de
controle global e um específico. O sistemas de controle global positivo areA de Aspergillus
nidulans e seu correspondente nit-2 em Neurospora crassa, e outros sistemas específicos
realizam a desrepressão de mais de 100 genes estruturais, incluindo, por exemplo, genes que
codificam transportadores de aminoácidos e de purinas, proteases extracelulares e enzimas
catabólicas. Essa desrepressão é dependente da presença do indutor e da ausência de fontes
preferências de nitrogênio (FU; MARZLUF, 1990). O desligamento de Clnr1 ortólogo de
areA/nit2 em C. lindemuthianum tem efeito severo sobre a patogenicidade comprometendo o
estágio de formação das hifas secundárias e com isso eliminando os sintomas de antracnose em
Phaseolus vulgaris (PELLIER et al., 2003).
No patossistema Magnaporthe grisea e arroz os genes expressos durante a fase de
penetração foram induzidos pela limitação de nitrogênio (TALBOT et al., 1997). A importância
dos reguladores globais de nitrogênio na patogênese também já foi demonstrada para M. grisea
e outros fungos fitopatogênicos, tais como Fusarium oxysporum e C. acutatum (DIVON et al.,
2006; HOROWITZ et al., 2006) porém poucos estudos investigaram o impacto da restrição de
nitrogênio sobre a expressão de proteínas.
Entre os poucos, destaca-se o trabalho de Desjardins et al. (1993) que investigou o fator
de virulência dioxinivalenol (DON) produzido por F. graminearum. A restrição de nitrogênio
ativa a via do tricoteceno e induz a biossíntese de DON. Os autores hipotetizaram que a restrição
de nitrogênio promove fosforilações que ativam a biossíntese de DON, pois observou-se a
elevação simultânea dos níveis de fosforilação, durante a restrição de nitrogênio, de metade das
fosfoproteínas analisadas.
Wang et al. (2011) estudando o secretoma durante a restrição de nitrogênio em
Magnaporthe oryzae identificaram 85 proteínas diferencialmente reguladas. As que cresceram
em abundância estavam relacionadas com modificação de paredes celulares, por exemplo β-13-glicosidade e quitinases. Provavelmente os constituintes nitrogenados da parede celular
vegetal foram usados como substrato nutrindo o fungo como também favorecendo sua
penetração. Também foram verificados aumentos na abundância de enzimas detoxificantes de
espécies reativas de oxigênio (ROS) como a catalase e a Cu/Zn superóxido desmutase as quais
ajudam ao fungo suportar as ROS produzidas como defesa do hospedeiro. Por esse suporte as
referidas enzimas são associadas à virulência segundo Skamnioti et al. (2007) e Tanabe et al.
(2011).
Dados semelhantes foram registrados em Colletotricum acutatum patogênico ao
morango, nesse fungo a proteção contra ROS é importante durante a fase de penetração via

18

apressório, pois a aplicação de antioxidantes exógenos extinguiu a produção de ROS e diminuiu
a frequência de apressórios formados (BROWN et al., 2008).

2.4. Considerações finais
Para entender a complexa interação bioquímica entre fungo e hospedeiro, é fundamental
conhecer as funções das moléculas sinalizadoras e seus receptores nas plantas e nos patógenos,
como também o desencadeamento da defesa vegetal. As mais variadas abordagens são
empregadas para esse fim, desde a identificação, detecção, translocação e cinética metabólica
de biomoléculas secretadas nas interações fungo-planta. Contudo, frequentemente há a
combinação de diversas abordagens e técnicas para fornecer resultados mais precisos,
completos e inovadores nas pesquisas de interação bioquímica entre planta e patógeno.
O entendimento controvertido do papel dessas proteínas na patogenicidade pode advir do
fato que mecanismos pós-transcricionais e a degradação proteica podem resultar na falta de
correspondência entre mRNA e a abundância proteica. Assim a abordagem exoproteômica
emerge com uma ferramenta de grande valia nos estudos de interação entre fungo e hospedeiro,
embora poucos estudos tenham sido feitos para caracterizar proteínas extracelulares fúngicas
(PHALIP et al., 2005).
Proteínas pouco abundantes no secretoma são mal representadas em gel de eletroforese
2D. Essa técnica não consegue detectar todo o conjunto de proteínas que estão envolvidas em
uma via metabólica ou de transdução de sinal. Avanços significantes foram feitos para superar
essa limitação, principalmente com o emprego de instrumentos de espectrometria de massa. No
entanto essas técnicas sozinhas não fornecem um quadro completo sobre a resposta de fungos
a estresse (KROLL et al., 2014).
As concentrações e fontes de carbono e nitrogênio tem efeitos sobre o metabolismo dos
fungos e em seu desenvolvimento pré-infectivo, vegetativo e reprodutivo. Assim relatar como
fontes simples e complexas de carbono e orgânicas e inorgânicas de nitrogênio modificam o
secretoma pode contribuir para entender mais sobre a interação bioquímica do fitopatógeno
com o hospedeiro.

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27

3. Reação dos tecidos foliares de Solanum lycopersicum e Phaseolus lunatus ao secretoma
de Colletotrichum spp. produzidos em diferentes condições nutricionais.
RESUMO
As proteínas extracelulares são fatores significantes de patogênese e virulência de
Colletotrichum. O estresse nutricional enfrentado pelos fungos nas primeiras fases da infecção
constitui um estímulo à produção de fatores de patogenicidade necessários ao sucesso da
colonização. Portanto, estudar esses fatores sob estresse nutricional contribui para o melhor
entendimento da interação planta-patógeno. O presente estudo objetivou registrar o efeito do
estresse nutricional de carbono e nitrogênio sobre as lesões teciduais causadas por
Colletotrichum spp. em Solanum lycopersicum (Sl) e Phaseolus lunatus (Pl). Três espécies de
Colletotrichum foram cultivadas sob estresse nutricional de fontes de carbono 10g/L (dextrose,
sacarose, amido e sorbitol) e fontes de nitrogênio 1g/L (molibdato de amônio, cloreto de
amônio, nitrato de potássio, L-asparagina e extrato de levedura). Foram avaliados o diâmetro
das colônias, produção de esporos, massa fresca, seca, variação de massa, variação de pH e a
produção de proteínas, e lesões teciduais. De modo geral sacarose e as fontes inorgânicas de
nitrogênio causaram estresse nutricional nos fungos. As combinações sacarose com nitrato de
potássio e sorbitol com asparagina registraram alcalinização e sorbitol com cloreto de amônio
registrou acidificação. O tratamento sorbitol com extrato de levedura sustentou a maior
produção de proteínas e sorbitol com cloreto de amônio a menor. No entanto a associação
sorbitol com nitrato de potássio proporcionou lesões teciduais compatíveis com o teste de
patogenicidade e Sl exibiu maior diversidade de lesões foliares. Assim, sorbitol combinado com
nitrato de potássio simula melhor o estresse nutricional enfrentado nas fases iniciais de infecção,
mantendo as relações de especificidade entre patógeno e hospedeiro.

Palavras-chave: Carbono, nitrogênio, relação C:N, especificidade.

28

ABSTRACT
The extracellular proteins are significant factors of pathogenesis and virulence of
Colletotrichum. The nutritional stress faced by fungi in the early stages of infection is a stimulus
to the production of pathogenicity factors necessary for successful colonization. Therefore,
studying these factors under nutritional stress contributes to a better understanding of the plantpathogen interaction. The present study aimed to record the effect of nutritional stress of carbon
and nitrogen on the tissue lesions caused by Colletotrichum spp. in Solanum lycopersicum (Sl)
and Phaseolus lunatus (Pl). Three species of Colletotrichum were cultivated under nutritional
stress from 10g / L carbon sources (dextrose, sucrose, starch and sorbitol) and nitrogen sources
1g / L (ammonium molybdate, ammonium chloride, potassium nitrate, L-asparagine and extract
of yeast). The diameter of the colonies, spore production, fresh mass, dry matter, mass variation,
pH variation and protein production, and tissue lesions were evaluated. In general sucrose and
inorganic sources of nitrogen caused nutritional stress in fungi. The sucrose combinations with
potassium nitrate and sorbitol with asparagine registered alkalinization and sorbitol with
ammonium chloride registered acidification. The sorbitol treatment with yeast extract sustained
the highest production of proteins and sorbitol with the lowest ammonium chloride. However,
the association of sorbitol with potassium nitrate provided tissue lesions compatible with the
pathogenicity test and Sl showed greater diversity of leaf lesions. Thus, sorbitol combined with
potassium nitrate better simulates the nutritional stress faced in the initial stages of infection,
maintaining the specificity relations between pathogen and host.

Keywords: Carbon, nitrogen, C: N ratio, specificity.

29

3.1. Introdução
Diferente das condições de laboratório, a disponibilidade de carbono sob a forma de
glicose é limitada durante a fase inicial da infecção. Tanto a limitação de carbono quanto a de
nitrogênio são impactantes sobre a fisiologia dos fungo. Os dados sobre mudanças na expressão
genética durante o déficit nutricional de glicose são numerosos, especialmente em
Saccharomyces cerevisiae (BOER et al., 2003; DARAN-LAPUJADE et al., 2004; WU et al.,
2004), porém pouco é conhecido sobre mudanças no proteoma durante esse estresse (KROLL
et al., 2014).
As fontes de nitrogênio na planta são limitadas, e o déficit de nitrogênio pode ser o gatilho
para o desenvolvimento da doença regulando a expressão de genes de patogenicidade (LÓPEZBERGES et al., 2010; THOMMA et al., 2006). Contudo, estudos mostram que há um
suprimento de nitrogênio nos tecidos vegetais, suficiente para o pleno desenvolvimento do
patógeno (PAGEAU et al., 2006; SOLOMON et al., 2003; TAVERNIER et al., 2007;
WALTERS; BINGHAM, 2007).
A presença de uma fonte de nitrogênio parece ser um importante regulador da expressão
de fatores de virulência para Colletotrichum gloeosporioides (MIYARA et al. 2008), já o déficit
desse nutriente estimula a sincronia no desenvolvimento pré-infectivo em espécies de
Colletotrichum (HOROWITZ et al., 2006), ratificando o papel do estresse nutricional nos
primeiros momentos da infecção como estímulo à produção dos fatores de virulência (SOANES
et al., 2002).
No patossistema Magnaporthe grisea e arroz a expressão de genes ativos durante a fase
de penetração foi induzida pela limitação de nitrogênio (TALBOT et al., 1997). Os reguladores
globais de nitrogênio também contribuem para a patogênese de M. grisea, Fusarium
oxysporum, C. lindemuthianum e C. acutatum (DIVON et al., 2006; HOROWITZ et al., 2006;
PELLIER et al., 2003) porém poucos estudos investigam o impacto da restrição de nitrogênio
sobre a expressão de proteínas.
Estudos (JACKSON; BOTHAST,1990; PATEL; GUPTE, 2016) dedicaram-se a
estabelecer condições ótimas para o crescimento e esporulação de espécies de Colletotrichum
e outros fungos em meio de cultivo líquidos e sólidos, ou seja, nutrir o fungo de forma que o
mesmo expresse todo seu potencial fisiológico estando ai incluso o proteoma.
Simular in vitro as condições de estresse nutricional enfrentadas pelos fitopatógenos nas
fases iniciais da infecção é uma estratégia válida para investigar os efeitos do estresse
nutricional sobre proteínas e outras compostos extracelulares.

30

Os fungos do gênero Colletotrichum usam diferentes estratégias nutricionais e são
patogênicos a vários órgãos vegetais em diferentes fases fenológicas, por isso são patógenos de
interesse econômico. A cultivar MicroTom de Solanum lycopersicum enquadra-se como planta
de interesse comercial, apresenta protocolos adaptados para estudo da genética reversa e possui
uma gama de mutantes correlatos com os da planta modelo Arabidopsis thaliana. MicroTom e
Colletotrichum spp são dois organismos modelo, o que facilita o uso em estudos da resistência
não específica.
O tomate é e continuará sendo um dos mais populares vegetais do mundo mesmo com
perdas agrícolas e redução na produtividade ocasionada por doenças. O melhoramento de
plantas moderno tem produzido cultivares novas resistentes a doenças, no entanto, a emergência
de novas raças de patógenos em um curto espaço de tempo muitas vezes quebra a resistência
em um curto período. Mesmo com o desenvolvimento de fungicidas efetivos contra doenças do
tomateiro a ocorrência de linhagens resistentes acaba por anulá-la. Isso sugere que as interações
tomate-patógeno ainda necessitam de investigação detalhada dos mecanismos que conferem
uma resistência ampla e duradoura. (ARIE et al., 2007).
Estudar a produção de fatores de patogenicidade sob estresse nutricional contribui para o
melhor entendimento da interação planta-patógeno, os resultados podem ter relevância genérica
para as interações planta-patógeno. Este trabalho objetivou estabelecer condições de cultivo,
em déficit nutricional baseado em carbono e nitrogênio, que permitam avaliar o efeito de
substâncias extracelulares de Colletotrichum spp. ativas contra tecidos foliares de S.
lycopersicum e Phaseolus lunatus.

3.2. Material e métodos
Os três isolados de Colletotrichum spp. foram selecionados dentre os que integram as
coleções de laboratórios situados no Centro de Ciências Agrárias (CECA) da Universidade
Federal de Alagoas (UFAL). Os isolados foram selecionados conforme informações e
identificações morfológicas e moleculares das referidas coleções.
Os isolados foram caracterizados molecularmente pelo sequenciamento parcial do gene
que codifica a Glicerol-3-fostato-dehidrogenase (GAPDH) amplificados por reação enzimática
da DNA polimerase e iniciadores alvo para o gene (GLASS; DONALDSON, 1995;
NOIREUNG et al., 2012). As sequências de nucleotídeos identificadas foram comparadas com
sequências depositadas no banco de dados NCBI utilizando a ferramenta Blast n. A

31

identificação foi baseada no valor de máxima similaridade determinado pela comparação com
as sequências do banco de dados.
Os isolados fúngicos foram crescidos em meio BDA, fotoperíodo de 12h a 25oC durante
cinco dias para produção e crescimento de micélio que foi utilizado como inóculo no teste de
patogenicidade e nos ensaios de estresse nutricional in vitro.
O teste de patogenicidade foi realizando mediante deposição de discos de meio de cultivo
contendo micélio sobre folhas de S. lycopersicum e P. lunatus. Cada isolado foi inoculado em
três plantas distintas, de cada planta foram inoculados nove folíolos. A testemunha foi
constituída por disco de meio de cultivo sem micélio. Após inoculação as plantas foram
mantidas em BOD no escuro, sob câmara úmida por 48h. Após esse período foram mantidas
em BOD sob fotoperíodo de 12h de luz, ± 25° até o momento da avaliação. As plantas foram
examinadas aos sete dias após inoculação e avaliadas considerando a presença das lesões
características da antracnose. Dessas lesões foram reisolados os fungos inoculados.
Foram realizados experimentos de estresse nutricional com objetivo quantificar as taxas
de crescimento e esporulação, além de registrar e comparar coloração e textura micelial de três
espécies de Colletotrichum. Inferindo assim sobre os impactos dessas fontes na fisiologia desses
fungos.
Nos ensaio de estresse nutricional foi utilizado um meio base de minerais no qual foram
adicionados fontes de carbono e nitrogênio. O meio base foi constituído de KH2PO4 (1g);
ZnSO4 (4,4*10-4 g); FeCl3 (4,8*10-4g); MnCl2 (3,6*10-4g); MgSO4 (0,1g) e de solução traço
(0,01mL) em 1L de água destilada. A solução traço continha ácido cítrico (50g);
Fe(NH4)2(SO4)2 (10g); CuSO4 (2,5g); MnSO4 (5g); H3BO3 (0,5g); NaMoO4 (0,5g) em 1L de
água destilada.
No primeiro experimento foram utilizadas quatro fontes de carbono (dextrose, sacarose,
amido e sorbitol) na concentração final de 10g/L. Baseado nos resultados desse experimento as
fontes de nitrogênio foram associadas as fontes de carbono (sacarose e sorbitol). Essas duas
fontes de carbono foram selecionadas considerando dano à fisiologia fúngica e secretoma com
diversidade de sintomas no tecido vegetal. As duas fontes de carbono foram combinadas
separadamente às fontes inorgânicas de nitrogênio (molibdato de amônio, cloreto de amônio,
nitrato de potássio) e orgânicas simples (L-asparagina) e complexa (extrato de levedura) todas
na concentração final de 1g/L. Os ensaios foram conduzidos em meio sólido (Agar a 18g/L)
vertido em placas de Petri (80mm) e em meio líquido (50mL em Erlenmeyer de 250mL). Cada
placa de Petri e cada Erlenmeyer constituiu uma unidade experimental.

32

O experimento em meio sólidos foi mantido em BOD a 25oC e fotoperíodo de 12h por
dez dias. O diâmetro médio do crescimento micelial, número médio de esporos produzidos,
textura e coloração das colônias de cada espécie fúngica foram avaliadas.
O experimento em meio líquido foram mantidos em condições ambientais idênticas
durante 21 dias. Foram avaliadas a produção de massa fresca e seca, variação de massa,
produção de esporos e variação de pH de cada espécie fúngica. A fase líquida (secretoma) foi
separada do crescimento micelial mediante filtração em oito dobras de compressa cirúrgica
estéril.
O crescimento micelial foi determinado pela massa fresca, massa seca (após 24h de
secagem a 30oC) e variação de massa (dada pela diferença entre massa fresca e seca). O pH do
secretoma foi medido com o auxílio do pHmetro (Quimis Q400AS), a variação de pH foi
calculada pela diferença entre o pH das testemunhas não inoculadas e o pH dos respectivos
tratamentos inoculados.
A produção de esporos foi quantificada pela média de três contagens ao hemacitômetro.
Os esporos foram separados do secretoma por centrifugação de 1 minuto a 1000 rpm e
aproximadamente 200µL do secretoma livre de esporos foi infiltrado na nervura central (figura
1) de folhas de S. lycopersicum e P. lunatus. Cada secretoma foi infiltrado em três plantas de
cada espécie, em cada planta nove folíolos, os quais foram observados durante sete dias e o tipo
de lesão foi registrado.
A classificação do estresse fisiológico foi feita conforme o desempenho dos isolados
contra às diferentes fontes de carbono e nitrogênio. Foi considerado mais estressante a fonte
que proporcionou o pior desempenho fúngico na maioria das variáveis analisadas.

33

Figura 1 - Face abaxial das folhas de Solanum lycopesicum
(A) e Phaseolus lunatus (B) perfundida venalmente com
agulha e seringa.

Para quantificar a fração proteica dos secretomas foram elaboradas duas diluições seriais
de albumina de soro bovino BSA (bovine serum albumin), uma de 1 a 0,1 mg/mL e outra de
0,1 a 0,01 mg/mL. Tais séries diluídas foram submetidas a espectrofotometria sob o
comprimento de onda de 280nm. O conjunto das absorbâncias médias de cada diluição de BSA
foi submetida a uma regressão linear obtendo-se assim uma equação de reta usada para inferir
sobre as concentrações de proteínas nos secretomas. Água destilada estéril foi usada como
branco nas leituras para a confecção das curvas-padrão e a testemunha de cada tratamento como
branco nas leituras dos secretomas.

3.2.1. Delineamento experimental e análise estatística
O experimento em meio sólido de estresse em fontes de carbono contou com 16
tratamentos com quatro repetições perfazendo 64 parcelas. Os de fontes de nitrogênio em
sacarose e em sorbitol contaram, cada um, com 20 tratamentos com quatro repetições
perfazendo 80 parcelas. Já em meio líquido os experimentos contaram com 16 tratamentos com
quatro repetições perfazendo 64 parcelas.
Foram quantificadas as concentrações estimadas de proteína em 48 tratamentos com
quatro repetições perfazendo 192 parcelas.
Todos os experimentos foram conduzidos em delineamento inteiramente casualisado.
As médias dos tratamentos foram comparadas pelo teste de Tukey no nível de 5% de
probabilidade, cada experimento e variável foi analisado individualmente.

34

Para reduzir o coeficiente de variação e melhorar a resolução do teste de médias os
dados, variação de pH e produção de proteínas foram transformados por SQDR (Y+1).
Dessa maneira também foram transformados os dados de massa seca dos experimentos
que combinavam sacarose e sorbitol com fontes de nitrogênio. Ainda nesses experimentos a
variação de pH foi transformada por SQDR (YGauss+1).

3.3. Resultados
O fragmento de DNA amplificado referente ao gene do GAPDH apresentou um tamanho
estimado de 300 pares de bases e o sequenciamento revelou fragmentos amplificados com
aproximadamente 200 pares de bases. As sequências obtidas foram identificadas com auxílio
da ferramenta Blast n disponível no endereço eletrônico do National Center for Biotechnology
Information (www.ncbi.nlm.nih.gov). Baseado principalmente na similaridade com sequências
depositadas no GenBank. O isolado foram identificado como Colletotrichum siamense, C.
truncatum e C. musae (Tabela 1).

Tabela 1 – Identificação molecular dos isolados de Colletotrichum empregados no estudo.
Identificação
Sequência no
Identificação Similaridade Pontuação Valor E
NCBI
cultural
C. siamense
KP703271.1
CBS112985
99%
418
6e-113
KJ769241.1
RR 12-4
98%
424
1e-114
C. truncatum
KC109590.1
CTM12
98%
448
8e-122
KU743257.1
F21182A
98%
414
8e-112
C. musae
JX009929.1
CBS192.31
99%
438
4e-119
99%
431
7e-117
O teste de patogenicidade confirmou que C. siamense (Cs) é patogênico ao hospedeiro
S. lycopersicum var. MicroTom. O C. truncatum (Ct) é patogênico somente ao hospedeiro P.
lunatus. O isolado de C. musae (Cm) não promoveu lesões em nenhum dos dois hospedeiros
testados (Figura 2). As lesões observadas evoluíam desde pequenos pontos necróticos
circundados por uma halo de clorose até grandes manchas de coloração amarronzadas e
ligeiramente deprimidas.

35

Figura 2 - Teste de patogenicidade. Da esquerda para a direita Cs, Ct e Cm.
Folhas de Solanum lycopersicum (A-C) e folhas de Phaseolus lunatus (D-F).

36

3.3.1. Estresse nutricional de fontes de carbono em meio sólido
No experimento de estresse nutricional em meio sólido o diâmetro médio das colônias
sete dias após inoculação (7 dai) variou de 5,5 a 7,5 centímetros (Tabela 2). O meio com sorbitol
promoveu o maior diâmetro médio e o meio com sacarose exibiu o menor diâmetro médio. Não
houve diferença significativa entre os meios com amido e com dextrose. Comparando o
crescimento dos isolados em cada fonte de carbono, para todas a fontes testadas, o C. truncatum
produziu o menor e C. musae o maior diâmetro.
Diante dos resultados a sacarose e o sorbitol foram selecionadas como fonte de carbono
para o experimento de estresse nutricional com fontes de nitrogênio por induzir o menor e maior
diâmetro médio respectivamente.

Tabela 2 - Diâmetro médio (cm) das colônias de espécies de
Colletotrichum sete dias após inoculação sob estresse nutricional de
carbono.
Fontes de carbono

Cs

Ct

Cm

Dextrose

6,5 ABb

5,6 Aa

7,5 Bc

Sacarose

6,3 Ab

5,5 Aa

7,0 Ac

Amido

6,8 Bb

6,0 Ba

7,5 Bc

Sorbitol

7,0 Cb

6,1 Ba

7,3 ABc
C.V.%=3,82

Médias seguidas letra distintas, maiúsculas nas colunas e minúsculas nas
linhas, diferem entre si pelo teste de Tukey (p<0.05). Cs = Colletotrichum
siamense; Ct = C. truncatum; Cm = C. musae.

37

A produção de esporos variou de 0 a 2 x105 esporos/mL, somente C. musae respondeu à
fonte de carbono na indução da esporulação. Para essa espécie a fonte que determinou a menor
produção de esporos foi a sacarose.

3.3.2. Estresse nutricional de fontes de carbono em meio líquido
No experimento em meio líquido, o acúmulo de massa fresca variou de 0,13 a 4,17 gramas
(Tabela 3). O menor acúmulo de massa fresca ocorreu nos cultivos com dextrose (Ct) e sacarose
(Cs e Cm) e diferiu significativamente dos meios com amido e sorbitol. Comparando isolados
entre as diferentes fontes de carbono, o isolado Cs exibiu a maior capacidade de produção de
massa fresca em todas as fontes e o isolados Ct o menor crescimento para a maioria das fontes,
exceto para sorbitol.
Tabela 3 - Massa fresca (g) de espécies de Colletotrichum 21 dias após
inoculação sob estresse nutricional de fontes de carbono.
Fontes de carbono

Cs

Ct

Cm

Dextrose

3,00 Ab

0,13 Aa

0,59 Aa

Sacarose

3,18 Ab

0,35 Aa

0,39 Aa

Amido

3,79 ABb

1,78 Ba

2,14 Ba

Sorbitol

4,17 Bb

1,92 Ba

1,46 Ba
C.V.%=16,4

Médias seguidas letra distintas, maiúsculas nas colunas e minúsculas nas
linhas, diferem entre si pelo teste de Tukey (p<0.05). Cs = Colletotrichum
siamense; Ct = C. truncatum; Cm = C. musae.
Avaliando o acúmulo de massa seca, o menor acúmulo aconteceu no cultivo com dextrose
para todos o isolados e o maior acúmulo de massa seca aconteceu para Cs com sorbitol e para
Ct e Cm com amido (Tabela 4). Comparando os isolados entre as diferentes fontes de carbono,
os isolados variaram no desempenho. O Cs teve o menor acúmulo para amido, o Ct teve menor
acúmulo para sacarose e o Cm teve menor desempenho para dextrose, sacarose e amido. O
melhor desempenho dos três isolados também variou entre as fontes. O Cs teve melhor
desempenho no meio suplementado com dextrose, sacarose e sorbitol. Os isolados Ct e Cm
apresentaram o maior acúmulo de matéria seca no meio com amido.

38

Tabela 4 - Massa seca (g) de espécies de Colletotrichum 21 dias após
inoculação sob estresse nutricional de fontes de carbono.
Fontes de carbono

Cs

Ct

Cm

Dextrose

0,05 Ab

0,01 Aab

0,02 Aab

Sacarose

0,08 ABb

0,03 Aa

0,03 Aa

Amido

0,09 BCa

0,13 Bab

0,14 Bb

Sorbitol

0,11 Cb

0,09 Bab

0,05 Aa
C.V.%=2,13

Médias seguidas letra distintas, maiúsculas nas colunas e minúsculas nas
linhas, diferem entre si pelo teste de Tukey (p<0.05). Cs = Colletotrichum
siamense; Ct = C. truncatum; Cm = C. musae.
Os valores de variação entre massa fresca e seca foi aplicada para balizar as diferenças de
comportamento entre ambas. Uma maior massa fresca não representava uma maior massa seca
devido a capacidade diferenciada de retenção de líquido. A variação de massa ficou entre 0,12
e 4,07 gramas (Tabela 5). As menores variações ocorreram nos cultivos com dextrose e as
maiores com sorbitol. Não houve diferença significativa entre dextrose e sacarose e entre amido
e sorbitol para os isolados Ct e Cm. O isolado C. siamense mostrou diferença significativa dos
demais em todos os cultivos.
Tabela 5 – Variação de massa (g) de espécies de Colletotrichum 21 dias
após inoculação sob estresse nutricional de fontes de carbono.
Fontes de carbono

Cs

Ct

Cm

Dextrose

2,96 Ab

0,12 Aa

0,57 Aa

Sacarose

3,11 Ab

0,31 Aa

0,37 Aa

Amido

3,70 ABb

1,65 Ba

2,00 Ba

Sorbitol

4,07 Bb

1,84 Ba

1,38 Ba
C.V.%=25,92

Médias seguidas letra distintas, maiúsculas nas colunas e minúsculas nas
linhas, diferem entre si pelo teste de Tukey (p<0.05). Cs = Colletotrichum
siamense; Ct = C. truncatum; Cm = C. musae.

39

A suplementação de carbono influenciou a esporulação de C. musae, apenas o cultivo
dessa espécie com a fonte de carbono dextrose não diferiu significativamente do controle. Nele
o número de esporos por mL variou de 0,05 a 0,1 x105esporos/mL.
Na variável pH, observou-se acidificação nos cultivos em diferente fontes de carbono
(Tabela 6). Os maiores valores de acidificação foram registrados nos cultivos de C. siamense
em sacarose e de C. truncatum em dextrose. No entanto para C. musae a maior acidificação foi
observada no meio com sorbitol.

Tabela 6 – Variação de pH do secretoma de espécies de Colletotrichum 21 dias após
inoculação sob estresse nutricional de fontes de carbono.
Fontes de carbono

Cs

Ct

Cm

Dextrose

-0,25 Ab

-0,47 Cc

-0,10 Aa

Sacarose

-0,59 Bc

-0,52 Cc

-0,17 ABb

Amido

-0,24 Ab

-0,23 Bb

-0,07 Aa

Sorbitol

-0,27 Ac

-0,16 Ab

-0,24 Bbc
C.V.% = 3,64

Médias seguidas letra distintas, maiúsculas nas colunas e minúsculas nas linhas,
diferem entre si pelo teste de Tukey (p<0.05), SQDR (Y+1). Cs = Colletotrichum
siamense; Ct = C. truncatum; Cm = C. musae.
A produção de proteína variou de 0 a 5,4 µg/µL (Tabela 7). Os meios suplementados com
dextrose, sacarose e sorbitol não diferenciaram nos níveis de proteínas secretadas tendo uma
variação de 0 a 0,124 µg/µL. O meio suplementado com amido proporcionou maiores níveis de
proteínas secretado com valores acima de 0,824 µg/µL para os três isolados. Ao comparar os
níveis de proteínas secretado pelos isolados para cada fonte de carbono não houve diferença
significativa.

40

Tabela 7 – Produção de proteínas (µg/µL) de espécies de Colletotrichum 21
dias após inoculação sob estresse nutricional de fontes de carbono.
Fontes de carbono

Cs

Ct

Cm

Dextrose

0,124 Aa

0,060 Aa

0,060 Aa

Sacarose

0,135 Aa

0,036 Aa

0 Aa

Amido

0,824 Ba

5,410 Bb

1,034 Ba

Sorbitol

0,100 Aa

0,095 Aa

0,316 ABa
C.V.%=10,62

Médias seguidas letra distintas, maiúsculas nas colunas e minúsculas nas
linhas, diferem entre si pelo teste de Tukey (p<0.05), SQDR (Y+1). Cs =
Colletotrichum siamense; Ct = C. truncatum; Cm = C. musae.
3.3.3. Lesão tecidual sob estresse de fontes de carbonoA infiltração do meio de cultivo
livre de esporos (secretoma) causou lesão nas folhas infiltradas (Figura 3). O efeito
foi mais acentuado nas folhas de S. lycopersicum. O cultivo com dextrose para o
isolado Cs revelou maior capacidade de induzir lesões. Observa-se também clorose
por toda a folha. Os secretoma das espécies Ct e Cm causaram lesões menores e
clorose contidas apenas na região infiltrada. As infiltrações no P. lunatus geraram
lesões com clorose contidas nas regiões marginais próximas da lesão causada pela
agulha utilizada para infiltrar o secretoma.
O cultivo dos fungos em sacarose alterou o padrão de lesão nas folhas infiltradas de S.
lycopersicum (Figura 4) causando lesões menores. O isolado Cs produziu um secretoma que
causou uma lesão contida a região infiltrada. A redução da lesão causada nas folhas pelo
secretoma foi mais acentudado para os isolados Ct e Cm. No entanto, a clorose nas folhas foi
intensa para os três secretomas infiltrados. As infiltração no P. lunatus não diferiram do padrão
de lesão apresentado para o secretoma produzido no meio com dextrose. O fato novo foi que os
secretomas produzidos em meio com sacarose não induziram clorose.

41

Figura 3 – Lesões em folhas de S. lycopersicum e de P. lunatus causadas pela infiltração
com secretomas de C. siamense, C. truncatum e C. musae cultivados em meio contendo
dextrose como fonte de carbono. S. lycopersicum (A-D); P. lunatus (E-H); Controles (A e
E), Cs (B e F), Ct (C e G), Cm (D e H).

Figura 4 - Lesões em folhas de S. lycopersicum e de P. lunatus causadas pela infiltração
com secretomas de C. siamense, C. truncatum e C. musae cultivados em meio contendo
sacarose como fonte de carbono. S. lycopersicum (A-D); P. lunatus (E-H); Controles (A e
E), Cs (B e F), Ct (C e G), Cm (D e H).

42

O cultivo dos fungos em amido alterou o padrão de lesão das folhas infiltradas de S.
lycopersicum (Figura 5). O secretoma dos três isolados desenvolveram o mesmo tipo de lesão
de coloração negra com depressão restrita a áreas da infiltração. Nota-se a redução da clorose
relatada anteriormente. As infiltrações em P. lunatus também causaram lesões menores. As
lesões que eram reduzidas para as outras infiltrações quase desapareceram sendo o efeito mais
evidente na infiltração com o secretoma do Ct.
O cultivo dos fungos em sorbitol alterou o padrão de reposta nas folhas infiltradas de S.
lycopersicum (Figura 6), neste caso houve redução das lesões. O secretoma do cultivo com Cs
apresentou lesões restritas e menores que a área infiltrada, porém com clorose acentuada. Os
secretomas das espécies Ct e Cm não causaram reação nas folhas. A redução dos danos causados
pelo secretoma produzido, tendo amido como fonte de carbono, também foi observada nas
infiltrações em P. lunatus; as lesões desapareceram nos três isolados.

43

Figura 5 - Lesões em folhas de S. lycopersicum e de P. lunatus causadas pela infiltração
com secretomas de C. siamense, C. truncatum e C. musae cultivados em meio contendo
amido como fonte de carbono. S. lycopersicum (A-D); P. lunatus (E-H); Controles (A e E),
Cs (B e F), Ct (C e G), Cm (D e H).

Figura 6 - Lesões em folhas de S. lycopersicum e de P. lunatus causadas pela infiltração
com secretomas de C. siamense, C. truncatum e C. musae cultivados em meio contendo
sorbitol como fonte de carbono. S. lycopersicum (A-D); P. lunatus (E-H); Controles (A e
E), Cs (B e F), Ct (C e G), Cm (D e H).

44

3.3.4. Estresse nutricional de fontes de nitrogênio em sacarose no meio sólido
A fonte de nitrogênio influenciou o crescimento da colônia em meio sólido. O diâmetro
médio variou de 0 a 7,95 centímetros (Tabela 8). O meio com nitrato de potássio promoveu o
maior diâmetro no quinto dia após inoculação (5 dai). O meio com cloreto de amônio exibiu o
menor diâmetro médio aos cinco dai. O meio com molibdato de amônio inibiu totalmente o
crescimento das colônias.
Os isolados diferiram entre si nos meio de cultivo testados, exceto em cloreto de amônio
no qual o C. truncatum e C. musae não diferiram e em molibdato de amônio onde os isolados
não diferiram entre si e nem do controle. O molibdato de amônio foi excluído dos experimento
seguintes de estresse nutricional com fontes de nitrogênio em meio líquido por inibir o
crescimento fúngico.

Tabela 8 - Diâmetro médio (cm) das colônias de Colletotrichum cinco dias após inoculação
sob estresse nutricional de fontes de nitrogênio em sacarose.
Fontes de nitrogênio

Cs

Ct

Cm

Molibdato de Amônio

0 Aa

0,1 Aa

0 Aa

Cloreto de Amônio

2,05 Bb

1,4 Ba

1,1 Ba

Nitrato de potássio

6,7 Eb

4,5 Da

7,95 Dc

Asparagina

6,3 Db

3,45 Ca

6,9 Cc

Extrato de levedura

5,5 Cb

4,95 Ea

7,95 Dc
C.V.%=4,33

Médias seguidas letra distintas, maiúsculas nas colunas e minúsculas nas linhas, diferem
entre si pelo teste de Tukey (p<0.05). Cs = Colletotrichum siamense; Ct = C. truncatum; Cm
= C. musae.
A produção de esporos variou de 0 a 51,75 x105 esporos/mL (Tabela 9). A esporulação
de C. siamense e de C. musae sofreu influência da fonte de nitrogênio. C. siamense esporulou
em meio com nitrato de potássio e em meio com asparagina, havendo diferença significativa
entre os dois meios. C. musae produziu a maior quantidade de esporos que foi registrada no
meio com extrato de levedura e não houve esporulação no meio com molibdato de amônio. C.
truncatum não esporulou em nenhum meio testado. Por inibir a esporulação fúngica o meio
com molibdato de amônio foi excluído do experimento de estresse nutricional com fontes de
nitrogênio em meio líquido.

45

Tabela 9 – Esporulação média 105esporos/mL de espécies de Colletotrichum dez dias após
inoculação sob estresse nutricional de fontes de nitrogênio em sacarose.
Fontes de nitrogênio

Cs

Ct

Cm

Molibdato de amônio

0 Aa

0 Aa

0 Aa

Cloreto de amônio

0 Aa

0 Aa

2,15 Bb

Nitrato de potássio

1,3 Ba

0 Aa

7,5 Cb

Asparagina

0,1 Aa

0 Aa

9,55 Cb

Extrato de levedura

0 Aa

0 Aa

51,75 Db
C.V.%=9,96

Médias seguidas letra distintas, maiúsculas nas colunas e minúsculas nas linhas, diferem
entre si pelo teste de Tukey (p<0.05), SQDR (Y+1). Cs = Colletotrichum siamense; Ct = C.
truncatum; Cm = C. musae.
As culturas crescidas na combinação de sacarose com fontes de nitrogênio produziram
micélio esbranquiçado a amarelado (Figura 7). As fontes orgânicas asparagina e extrato de
levedura promoveram o desenvolvimento maior de micélio aéreo que o observado para as
fontes inorgânicas nitrato de potássio e cloreto de amônio. Não foi possível registrar aspectos
morfoculturais no cultivo sólido contendo meio com molibdato de amônio, pois houve inibição
do crescimento micelial.

46

Figura 7 - Crescimento micelial aos 5dai em sacarose sob estresse de fontes de
nitrogênio. Nas linhas da esquerda para a direita Cs, Ct e Cm respectivamente.
A-C Molibdato de amônio, D-F Cloreto de amônio, G-I Nitrato de potássio, JM Asparagina, N-P Extrato de levedura.

47

3.3.5. Estresse nutricional de fontes de nitrogênio em sacarose no meio líquido
O acúmulo de massa fresca variou de 3,76 a 10,93 gramas (Tabela 10). Os menores
acúmulos ocorreram nos cultivos com cloreto de amônio que diferiu significativamente das
demais fontes de nitrogênio. Os maiores acúmulos de massa fresca foram registrados nos
cultivos com nitrato de potássio (Cs e Ct) e com asparagina (Cm). Não houve diferença
significativa entre a massa fresca de C. musae nos cultivos com nitrato de potássio, asparagina
e extrato de levedura. Comparando os isolados dentro do tratamento fonte de nitrogênio, não
foi observado diferenças para cloreto de amônio e o isolados Cs e Ct tiveram maior acúmulo de
matéria fresca nos meios com nitrato de potássio, asparagina e extrato de levedura.
Tabela 10 - Massa fresca (g) de espécies de Colletotrichum 21 dias após inoculação sob
estresse nutricional de fontes de nitrogênio em sacarose.
Fontes de nitrogênio

Cs

Ct

Cm

Cloreto de amônio

4,59 Aa

3,76 Aa

3,94 Aa

Nitrato de potássio

10,93 Cb

10,67 Db

8,70 Ba

Asparagina

6,65 Ba

6,63 Ba

8,72 Bb

Extrato de levedura

9,28 Cb

8,17 Cab

7,79 Ba
C.V.%=9,72

Médias seguidas letra distintas, maiúsculas nas colunas e minúsculas nas linhas, diferem
entre si pelo teste de Tukey (p<0.05). Cs = Colletotrichum siamense; Ct = C. truncatum; Cm
= C. musae.

Avaliando o acúmulo de massa seca, o menor acúmulo aconteceu no cultivo com cloreto
de amônio e o maior aconteceu no cultivo com nitrato de potássio (Cs e Ct) e com extrato de
levedura (Cm) (Tabela 11). Não houve diferença significativa na massa seca dos isolados em
cada fonte de nitrogênio.

48

Tabela 11 - Massa seca (g) de espécies de Colletotrichum 21 dias após
inoculação sob estresse nutricional de fontes de nitrogênio em
sacarose.
Fontes de nitrogênio

Cs

Ct

Cm

Cloreto de amônio

0,11 Aa

0,10 Aa

0,07 Aa

Nitrato de potássio

3,41 Bbc

4,14 Cc

2,26 Bb

Asparagina

0,81 Aab

0,79 Aab

1,91 Bb

Extrato de levedura

3,19 Bb

1,99 Bb

2,81 Bb
C.V.%=9,29

Médias seguidas letra distintas, maiúsculas nas colunas e minúsculas
nas linhas, diferem entre si pelo teste de Tukey (p<0.05), SQDR
(Y+1). Cs = Colletotrichum siamense; Ct = C. truncatum; Cm = C.
musae.

A variação de massa ficou entre 3,65 e 7,52 gramas (Tabela 12). As menores variações
ocorreram nos cultivos com cloreto de amônio e as maiores com nitrato de potássio (Cs e Ct) e
com asparagina (Cm). Não houve diferença significativa na variação de massa de C. musae nos
cultivos com nitrato de potássio, asparagina e extrato de levedura. C. musae diferiu dos demais
isolados somente no cultivo com extrato de levedura, onde exibiu a menor variação de massa.
Tabela 12 – Variação de massa (g) de espécies de Colletotrichum 21 dias após
inoculação sob estresse nutricional de fontes de nitrogênio em sacarose.
Fontes de nitrogênio

Cs

Ct

Cm

Cloreto de amônio

4,47 Aa

3,65 Aa

3,85 Aa

Nitrato de potássio

7,52 Bb

6,53 Cab

6,44 Ba

Asparagina

5,83 Aa

5,84 Ba

6,81 Ba

Extrato de levedura

6,09 Bb

6,18 Cb

4,98 Ba
C.V.%=9,45

Médias seguidas letra distintas, maiúsculas nas colunas e minúsculas nas linhas,
diferem entre si pelo teste de Tukey (p<0.05). Cs = Colletotrichum siamense; Ct
= C. truncatum; Cm = C. musae.

A produção de esporos variou de 0 a 70,62 x105 esporos /mL (Tabela 13). Apenas a
esporulação de C. musae sofreu influência da fonte de nitrogênio, para este isolado a maior

49

quantidade de esporos foi registrada no meio com extrato de levedura. C. siamense não
esporulou e C. truncatum esporulou apenas no meio com nitrato de potássio sem diferir
significativamente dos demais meios e do controle.
Tabela 13 - Esporulação média 105 esporos/mL de espécies de Colletotrichum 21
dias após inoculação sob estresse nutricional de fontes de nitrogênio em sacarose.
Fontes de nitrogênio

Cs

Ct

Cm

Cloreto de amônio

0 Aa

0 Aa

0,02 Aa

Nitrato de potássio

0 Aa

0,90 Aa

25,12 Cb

Asparagina

0 Aa

0 Aa

4,52 Bb

Extrato de levedura

0 Aa

0 Aa

70,62 Db
C.V.%=16,66

Médias seguidas letra distintas, maiúsculas nas colunas e minúsculas nas linhas,
diferem entre si pelo teste de Tukey (p<0.05), SQDR (Y+1). Cs = Colletotrichum
siamense; Ct = C. truncatum; Cm = C. musae.

50

Sob estresse nutricional da combinação sacarose com fontes de nitrogênio os isolados
exibiram variações de pH expressivas (Tabela 14). O cultivo com cloreto de amônio exibiu a
maior acidificação, enquanto que o cultivo com nitrato de potássio promoveu a maior
alcalinização. O cultivo com extrato de levedura não variou significativamente o pH inicial 5,0.
Em função da distribuição anormal dos dados foi aplicado o estimador de densidade Kernel o
qual apontou para uma ajuste com a distribuição gaussiana. Os valores estimados para o modelo
foram então transformados em SQDR (YGauss+1).

Tabela 14 – Variação de pH do secretoma de espécies de Colletotrichum
21 dias após inoculação sob estresse nutricional de fontes de nitrogênio
em sacarose.
Fontes de nitrogênio

Cs

Ct

Cm

Cloreto de amônio

-2,64 Aa

-2,7 Aa

-2,67 Aa

Nitrato de potássio

2,32 Db

2,17 Db

2,34 Db

Asparagina

-1,32 Bb

-2,29 Aa

-1,46 Bab

Extrato de levedura

0,2 Cbc

-0,82 Ca

0,44 Cc
C.V.%=-2,66

Médias seguidas letra distintas, maiúsculas nas colunas e minúsculas nas
linhas, diferem entre si pelo teste de Tukey (p<0.05), SQDR (YGauss+1).
Cs = Colletotrichum siamense; Ct = C. truncatum; Cm = C. musae.
A produção de proteínas variou de 0,363 a 14,120 µg/µL (Tabela 15). As menores
quantidades de proteínas foram registradas nos cultivos com cloreto de amônio e as maiores
foram produzidas com fontes de nitrogênio diferentes para cada isolado. C. siamense produziu
mais proteínas em meio com asparagina, C. truncatum em meio com nitrato de potássio e C.
musae em meio com extrato de levedura.

51

Tabela 15 - Produção de proteínas (µg/µL) de espécies de Colletotrichum 21 dias após
inoculação sob estresse nutricional de fontes de nitrogênio em sacarose.
Fontes de nitrogênio

Cs

Ct

Cm

Cloreto de amônio

1,851 Aa

0,491 Aa

0,363 Aa

Nitrato de potássio

7,446 Bb

4,044 Bab

2,615 Aa

Asparagina

14,120 Cc

0,719 ABab

2,947 Ab

Extrato de levedura

4,120 ABa

3,455 ABa

7,370 Bb
C.V.%=25,91

Médias seguidas letra distintas, maiúsculas nas colunas e minúsculas nas linhas, diferem
entre si pelo teste de Tukey (p<0.05), SQDR (Y+1). Cs = Colletotrichum siamense; Ct
= C. truncatum; Cm = C. musae.
3.3.6. Lesão tecidual sob estresse de fontes de nitrogênio em sacarose.
As lesões produzidas pelo secretoma de Colletotrichum spp. nas folhas de S.
lycopersicum foram variadas (Figura 8). O isolado Cs ocasionou lesões necróticas em todos os
tratamentos. Clorose periférica foi observada nos tratamentos com cloreto de amônio e com
asparagina. No tratamento com nitrato de potássio observou-se lesões necróticas de coloração
esbranquiçada e no tratamento com extrato de levedura foram observadas lesões necróticas de
coloração amarronzada.
O fungo C. truncatum ocasionou lesões em todos os tratamentos exceto naquele que
continha extrato de levedura. Houve necrose de coloração esbranquiçada no tratamento com
cloreto de amônio, necrose semelhante e murcha parcial no tratamento com nitrato de potássio
e necrose de coloração amarronzada no tratamento com asparagina. O isolado Cm ocasionou
lesões somente no tratamento com nitrato de potássio estas foram necroses esbranquiçadas.
As lesões produzidas pelo secretoma livre de esporos nas folhas de P. lunatus são de
coloração amarronzada e concentram-se na região perfundida (Figura 9).

52

Figura 8 – Lesões induzidas em folhas de S. lycopersicum perfundidas com secretoma obtido
de cultivos que combinavam fontes de nitrogênio em sacarose. Nas colunas da esquerda para a
direita: Controles, Cs, Ct e Cm. A – D cloreto de amônio, E-H nitrato de potássio, I-M
asparagina, N-Q extrato de levedura.

Figura 9 - Lesões induzidas em folhas de P. lunatus perfundidas com secretoma obtido de
cultivos que combinavam fontes de nitrogênio em sacarose. Nas colunas da esquerda para a
direita: Controles, Cs, Ct e Cm. A – D cloreto de amônio, E-H nitrato de potássio, I-M
asparagina, N-Q extrato de levedura.

53

A infiltração com secretoma de C. truncatum exibe uma área foliar lesionada compatível
com a área infiltrada em todos os tratamentos, os demais isolados exibem áreas foliares
danificadas menores que Ct especialmente nos tratamentos com cloreto de amônio e extrato de
levedura. Os meios com nitrato de potássio e com asparagina não mostraram variação
expressivas entre as lesões ocasionadas pelos diferentes isolados.

3.3.7. Estresse nutricional de fontes de nitrogênio em sorbitol no meio sólido
A fonte de nitrogênio influenciou o crescimento micelial em meio sólido, o qual variou
de 1,1 a 7,35 centímetros (Tabela 16). O meio com extrato de levedura promoveu o maior
diâmetro médio de colônia no quinto dia após a inoculação (5 dai) Os menores diâmetros foram
registrado para C. siamense no meio asparagina, C. truncatum no meio cloreto de amônio e
para C. musae no meio molibdato de amônio.
Os isolados não diferiram entre si no meio com asparagina. O C. musae exibiu o menor
diâmetro nos meios testados, exceto no meio com extrato de levedura no qual promoveu o maior
crescimento.
Tabela 16 - Diâmetro médio (cm) das colônias de Colletotrichum cinco
dias após inoculação sob estresse nutricional de fontes de nitrogênio em
sorbitol.
Fontes de nitrogênio

Cs

Ct

Cm

Molibdato de Amônio

2,15 Ab

2,5 Bb

1,1 Aa

Cloreto de Amônio

2,9 Bb

1,75 Aa

1,7 Ba

Nitrato de potássio

4,95 Cc

4,15 Cb

3,65 Ca

Asparagina

2 Ab

1,8 Aab

1,25 ABa

Extrato de levedura

6,55 Da

6,5 Da

7,35 Db
C.V.%=11,22

Médias seguidas letra distintas, maiúsculas nas colunas e minúsculas nas
linhas, diferem entre si pelo teste de Tukey (p<0.05). Cs = Colletotrichum
siamense; Ct = C. truncatum; Cm = C. musae.
A produção de esporos variou de 0 a 3 x105 esporos/mL (Tabela 17). A esporulação sofreu
influência da fonte de nitrogênio, evidenciada pela maior quantidade de esporos registrada no
meio com extrato de levedura (Cm). C. truncatum esporulou somete no meio com nitrato de

54

potássio e C. siamense somente no meio com extrato de levedura, porém não diferiram dos
demais meios ou do controle.
Tabela 17 – Esporulação média 105esporos/mL de espécies de
Colletotrichum dez dias após inoculação sob estresse nutricional de fontes
de nitrogênio em sorbitol.
Fontes de nitrogênio

Cs

Ct

Cm

Molibdato de amônio

0 Aa

0 Aa

0,20 Aa

Cloreto de amônio

0 Aa

0 Aa

1,05 Bb

Nitrato de potássio

0 Aa

0,65 Bb

0,10 Aa

Asparagina

0 Aa

0 Aa

1,15 Bb

Extrato de levedura

0,10 Aa

0 Aa

3,00 Cb
C.V.%=11,83

Médias seguidas letra distintas, maiúsculas nas colunas e minúsculas nas
linhas, diferem entre si pelo teste de Tukey (p<0.05), SQDR (Y+1). Cs =
Colletotrichum siamense; Ct = C. truncatum; Cm = C. musae.
As culturas crescidas na combinação sorbitol com fontes de nitrogênio variaram na
coloração (Figura 10). O Meio com molibdato de amônio produziu micélio mais amarelado que
os demais meios. Houve redução na quantidade de micélio aéreo nos meios com nitrato de
potássio e asparagina quando comparado com as combinações sacarose com fontes de
nitrogênio. C. truncatum produziu menos micélio aéreo que os demais isolados em todos as
fontes de nitrogênio testadas.
3.3.8. Estresse nutricional de fontes de nitrogênio em sorbitol no meio líquido
O acúmulo de massa fresca variou de 1,09 a 6,66 gramas (Tabela 18). Os menores
acúmulos ocorreram nos cultivos com asparagina (Cs e Ct) e com nitrato de potássio (Cm). Os
maiores acúmulos foram registrados no meio com extrato de levedura que diferiu
significativamente dos demais. C. siamense proporcionou os maiores acúmulos.

55

Figura 10 - Crescimento micelial aos 5dai em sorbitol sob estresse de fontes de nitrogênio. Nas
linhas da esquerda para a direita Cs, Ct e Cm respectivamente. A-C Molibdato de amônio, D-F
Cloreto de amônio, G-I Nitrato de potássio, J-M Asparagina, N-P Extrato de levedura.

56

Tabela 18 - Massa fresca (g) de espécies de Colletotrichum 21 dias após
inoculação sob estresse nutricional de fontes de nitrogênio em sorbitol.
Fontes de nitrogênio

Cs

Ct

Cm

Cloreto de amônio

5,53 Bb

1,95 ABa

2,54 Aa

Nitrato de potássio

4,77 ABc

1,66 ABab

2,06 Ab

Asparagina

2,99 Ac

1,09 Aab

2,69 Abc

Extrato de levedura

6,66 Bb

3,53 Ba

6,39 Bb
C.V.%=28,11

Médias seguidas letra distintas, maiúsculas nas colunas e minúsculas nas
linhas, diferem entre si pelo teste de Tukey (p<0.05). Cs = Colletotrichum
siamense; Ct = C. truncatum; Cm = C. musae.

O acúmulo de massa seca variou de 0 a 1,57 gramas (Tabela 19). Os menores acúmulo
foram registrados para os cultivos com asparagina (Ct e Cm) e com cloreto de amônio (Cs). Os
maiores acúmulos foram observados nos cultivos com extrato de levedura (Cs e Cm) e com
cloreto de amônio (Ct). C. truncatum exibiu os menores acúmulos não diferindo
significativamente entre as fontes de nitrogênio e nem do controle.
Tabela 19 - Massa seca (g) de espécies de Colletotrichum 21 dias após
inoculação sob estresse nutricional de fontes de nitrogênio em sorbitol.
Fontes de nitrogênio

Cs

Ct

Cm

Cloreto de amônio

0,30 Bb

0,07 Aa

0,09 Aa

Nitrato de potássio

1,17 ABb

0,04 Aa

0,06 Aa

Asparagina

0,66 Aa

0 Aa

0,01 Aa

Extrato de levedura

1,57 Bb

0,06 Aa

0,90 Bb
C.V.%=8,99

Médias seguidas letra distintas, maiúsculas nas colunas e minúsculas nas
linhas, diferem entre si pelo teste de Tukey (p<0.05), SQDR (Y+1). Cs =
Colletotrichum siamense; Ct = C. truncatum; Cm = C. musae.
A variação de massa ficou entre 1,13 e 5,49 gramas (Tabela 20). As menores variações
ocorreram no cultivo com asparagina (Cs e Ct) e no cultivo com nitrato de potássio (Cm). As

57

maiores variações foram registradas nos cultivos com extrato de levedura o qual diferiu
significativamente dos demais.
Tabela 20 – Variação de massa (g) de espécies de Colletotrichum 21 dias
após inoculação sob estresse nutricional de fontes de nitrogênio em sorbitol.
Fontes de nitrogênio

Cs

Ct

Cm

Cloreto de amônio

4,22 BCb

1,87 Aa

2,45 Aa

Nitrato de potássio

3,59 ABb

1,62 Aa

2,00 Aa

Asparagina

2,67 Ab

1,13 Aa

2,69 Ab

Extrato de levedura

5,09 Cb

3,47 Ba

5,49 Bb
C.V.%=25,62

Médias seguidas letra distintas, maiúsculas nas colunas e minúsculas nas
linhas, diferem entre si pelo teste de Tukey (p<0.05). Cs = Colletotrichum
siamense; Ct = C. truncatum; Cm = C. musae.

58

A produção de esporos variou de 0 a 1,3 x105 esporos/mL (Tabela 21). Houve influência
da fonte de nitrogênio sobre a esporulação de C. musae e C. siamense. O primeiro exibiu a
maior esporulação no meio com asparagina. C. siamense esporulou mais em cloreto de amônio.
Tabela 21 - Esporulação média 105esporos/mL de espécies de Colletotrichum 21
dias após inoculação sob estresse nutricional de fontes de nitrogênio em sorbitol.
Fontes de nitrogênio

Cs

Ct

Cm

Cloreto de amônio

1,30 Bb

0 Aa

0,02 Aa

Nitrato de potássio

0,65 ABa

0 Aa

0,10 Aa

Asparagina

0,90 ABab

0 Aa

1,15 Bb

Extrato de levedura

0 Aa

0,45 Aa

0,77 ABa
C.V.%=16

Médias seguidas letra distintas, maiúsculas nas colunas e minúsculas nas linhas,
diferem entre si pelo teste de Tukey (p<0.05). Cs = Colletotrichum siamense; Ct =
C. truncatum; Cm = C. musae.
Sob estresse nutricional da combinação sorbitol com fontes de nitrogênio os isolados
exibiram variações de pH expressivas (Tabela 22). O cultivo com cloreto de amônio exibiu a
maior acidificação, enquanto que os cultivos com nitrato de potássio (Cs) e asparagina (Ct e
Cm) promoveram as maiores alcalinizações. O cultivo com extrato de levedura não variou
significativamente o pH inicial 5,0 (Cs e Cm). Em função da distribuição anormal dos dados
foi aplicado o estimador de densidade Kernel o qual apontou para uma ajuste com a distribuição
gaussiana. Os valores estimados para o modelo foram então transformados em SQDR
(YGauss+1).

59

Tabela 22 – Variação de pH do secretoma de espécies de Colletotrichum 21 dias
após inoculação sob estresse nutricional de fontes de nitrogênio em sorbitol.
Fontes de nitrogênio

Cs

Ct

Cm

Cloreto de amônio

-3,52 Aa

-2,62 Aa

-2,28 Aa

Nitrato de potássio

1,61 Cc

0,44 Bab

0,62 Bbc

Asparagina

1,50 Cb

2,84 Cc

2,74 Cc

Extrato de levedura

-0,74 Ba

1,99 Cc

0,96 BCc
C.V.%=-4,6

Médias seguidas letra distintas, maiúsculas nas colunas e minúsculas nas
linhas, diferem entre si pelo teste de Tukey (p<0.05), SQDR (YGauss+1). Cs
= Colletotrichum siamense; Ct = C. truncatum; Cm = C. musae.
A produção de proteínas variou de 0 a 7,592 µg/µL (Tabela 23). As menores quantidades
de proteínas foram registradas no cultivo com cloreto de amônio, enquanto que as maiores
foram observadas nos cultivos com extrato de levedura (Cs e Cm) e asparagina (Ct) A produção
de proteínas por C. truncatum não diferiu significativamente entre as fontes de nitrogênio
testadas. C. siamense exibiu a maior produção de proteínas quando comparado aos demais
isolados.
Tabela 23 – Produção de proteínas (µg/µL) na combinação de sorbitol com
fontes de nitrogênio.
Fontes de nitrogênio

Cs

Ct

Cm

Cloreto de Amônio

1,151 Ab

0,121 Aa

0,252 Aa

Nitrato de potássio

2,300 Bb

0 Aa

0,415 Aa

Asparagina

4,435 Cc

0,188 Aab

0,503 Ab

Extrato de levedura

7,592 Dc

0,118 Aa

1,676 Bb
C.V.%=10,28

Médias seguidas letra distintas, maiúsculas nas colunas e minúsculas nas
linhas, diferem entre si pelo teste de Tukey (p<0.05), SQDR (Y+1). Cs =
Colletotrichum siamense; Ct = C. truncatum; Cm = C. musae.

60

3.3.9. Lesão tecidual sob estresse de fontes de nitrogênio em sorbitol.
As lesões ocasionadas pelo secretoma nas folhas de S. lycopersicum foram menos
diversas que as observadas no experimento anterior, onde foram combinadas fontes de
nitrogênio a sacarose (Figura 11). No presente experimento C. siamense ocasionou lesões
necróticas de coloração amarronzada no tratamento com cloreto de amônio e de coloração
esbranquiçada no tratamento com nitrato de potássio.
O fungo C. truncatum ocasionou pequenas lesões necróticas compatíveis com o ponto de
introdução da agulha durante a perfusão, essas lesões foram de coloração esbranquiçada no
tratamento com cloreto de amônio e de coloração amarronzada no tratamento com extrato de
levedura. O isolado Cm não ocasionou nenhuma lesão no tecido foliar de S. lycopersicum.
As lesões produzidas pelo secretoma livre de esporos nas folhas de P. lunatus são de
coloração marrom e concentram-se na região perfundida (Figura 12). Os secretomas do três
isolados produzidos no meio com nitrato de potássio causaram as menores lesões entre os
tratamentos, essas lesões foram representadas por pequenos pontos necróticos próximos ao
local de perfusão.
O isolado Cs causou lesões necróticas de coloração amarronzada no tratamento com
cloreto de amônio, as lesões causadas por esse isolado nos tratamento com asparagina e extrato
de levedura foram progressivamente e respectivamente maiores e de coloração esbranquiçada.
Colletotrichum truncatum ocasionou pequenas lesões necróticas restritas a área
perfundida. O isolado Cm seguiu o padrão descrito para Cs, lesões necróticas progressivamente
maiores e mais esbranquiçadas, do tratamentos com cloreto de amônio ao com extrato de
levedura, excetuando o tratamento com nitrato de potássio.

61

Figura 11 - Lesões induzidas em folhas de S. lycopersicum perfundidas com secretoma
obtido de cultivos que combinavam fontes de nitrogênio em sorbitol. Nas colunas da
esquerda para a direita: Controles, Cs, Ct e Cm. A – D cloreto de amônio, E-H nitrato
de potássio, I-M asparagina, N-Q extrato de levedura.

Figura 12 - Lesões induzidas em folhas de P. lunatus perfundidas com secretoma obtido de
cultivos que combinavam fontes de nitrogênio em sorbitol. Nas colunas da esquerda para a
direita: Controles, Cs, Ct e Cm. A – D cloreto de amônio, E-H nitrato de potássio, I-M
asparagina, N-Q extrato de levedura.

62

3.4. Discussão
A disponibilidade, a fonte e a concentração de carbono e nitrogênio são fatores que afetam
a fisiologia dos fungos, o impacto dessas variáveis é refletido sobre as taxas de crescimento,
esporulação, cor e textura micelial e abundância de ECP’s. (JUN et al., 2013; MAJEAU et al.,
2010).
O experimento com quatro fontes de carbono mostrou que a sacarose teve impacto
negativo na fisiologia fúngica quando comparada aos demais tratamentos, fato atestado pelos
menores crescimento micelial e esporulação registrados. Por outro lado a fonte de carbono
sorbitol impactou positivamente a fisiologia das espécies fúngicas promovendo as maiores
taxas absolutas de crescimento micelial e esporulação. Comparado ao dissacarídeo sacarose, o
poliálcool sorbitol é uma molécula mais simples com metade dos carbonos e sem os radicais
hidroxila presentes na sacarose. Logo é facilmente absorvido e metabolizado.
De forma geral a presença do substrato, neste caso carboidratos, promove uma regulação
transcricional da enzima responsável por metaboliza-lo como demostrado por (JUHASZ et al.,
2005; STRICKER et al., 2008) em Trichoderma reesi e Aspergillus niger. Ainda em T. reesi a
transcrição dos principais genes de celulases era induzida não somente pela presença da
celulose, mas também por uma gama de mono e dissacarídeos como a xilose, lactose e celobiose
(NOGAWA et al., 2001; SALOHEIMO et al., 1997), no entanto a indução dessas enzimas é
reduzida na presença de uma fonte preferencial de carbono, como por exemplo a glicose e a
frutose. Nota-se uma preferência pelo consumo de fontes de carbono mais simples, as quais não
necessitam de incremento na transcrição de ECP’s para seu aproveitamento.
Uma vez que o catabolismo de fontes simples de carbono dispensa a biossíntese de ECP´s
enzimáticas, e portanto requer um menor gasto energético, o microrganismo pode reverter essa
energia para o crescimento e reprodução. Isso vai de encontro ao observado por Patel e Gupte
(2016), uma correlação linear entre a biomassa e a produção da enzima lacase. Isso pode ser
explicado pelo fato de que a lacase, além de estar associada com a degradação de lignina tem
numerosas funções estruturais para o fungo tais como esporulação, produção de pigmentos e
desenvolvimento de corpos de frutificação (THURSTON, 1994). Portanto, a correlação não
explica a baixa produção de ECP´s em sorbibol, mesmo com a alta produção de biomassa.
Assim, tanto o maior crescimento e esporulação quanto a menor produção de ECP´s
apontam no sentido de que a fonte de carbono sorbitol é preferencialmente consumida por
Colletotrichum spp.
Sabendo que a sacarose promove impacto negativo sobre o desenvolvimento fúngico e o
sorbitol positivo comparado às demais fontes de carbono testadas, ambos foram utilizados

63

combinados às fontes orgânicas e inorgânicas de nitrogênio. Observou-se então que as taxas de
crescimento micelial e esporulação foram maiores na presença de extrato de levedura, como
fonte de nitrogênio, e menores para cloreto de amônio. Os dados apontam para o melhor
aproveitamento de fontes orgânicas do que inorgânicas de nitrogênio.
Jackson e Bothast (1990), e Patel e Gupte (2016) concluíram que meios de cultivo com
grandes quantidade de carbono promovem o crescimento micelial, e que concentrações
menores de carbono combinadas com fontes complexas e orgânicas de nitrogênio incrementam
a esporulação de Colletotrichum sp. Dados semelhantes também foram aqui observados, não
somente a esporulação é incrementada na presença de baixas concentrações de carbono
combinadas a fontes complexas e orgânicas de nitrogênio, mas também o crescimento micelial
de Colletotrichum spp.
Ainda sobre esporulação, Jackson e Bothast (1990) observaram que a resposta ao carbono
não é universal entre espécies diferentes de Colletotrichum, enquanto concentrações superiores
2,5% de carbono inibiram a esporulação de C. truncatum, o mesmo não acontecia com C.
gloeosporioides f sp. aeschynomene. Dado semelhante foi observado no presente trabalho, nos
tratamentos que associam sacarose e sorbitol a fontes de nitrogênio.
Nessa fase inicial de infecção os fungos fitopatogênicos precisam superar a restrição de
nitrogênio por ainda não acessar os nutrientes contidos no hospedeiro (SNOEIJER et al., 2000)
contando apenas com suas reservas energéticas para iniciar o espólio das fontes complexas de
carbono e nitrogênio do hospedeiro.
Diversos autores (PATEL et al., 2009; PATEL; GUPTE, 2016) relatam que substratos
complexos como a palha e o farelo de trigo, além da cascas de frutos como o tamarindo, são os
melhores substratos para a produção de enzimas em meio sólido, foram relatados incrementos
de até 59 vezes a produção enzimática em meio suplementado com os substratos complexos.
Isso demonstra que a falta de carboidratos pode ser contornada utilizando suas reservas
energéticas por glicogenólise ou gliconeogenólise, contudo a restrição de nitrogênio deve ser
superada dispondo apenas de substratos complexas, que para fitopatógenos é a superfície do
hospedeiro. Essa condição é similar a encontrada no tratamento experimental que combinou
sorbitol e extrato de levedura. Curiosamente nesse tratamento observou-se a maior produção de
ECP´s.
Vários genes, tanto de bactérias como de fungos, são induzidos especificamente durante
o estresse de nitrogênio e/ou durante as fases iniciais de infecção ao hospedeiro. (DONOFRIO
et al., 2006) Tal estresse desencadeia a síntese de enzimas que catabolizam o nitrogênio contido
no hospedeiro e o disponibiliza para o patógeno.

64

O amônio, junto a glutamina, são as formas preferenciais de absorção de nitrogênio pelos
fungos, quando ausentes podem ser catabolizadas de compostos inorgânicos como por exemplo
o nitrato por reduções sequenciais. (PEREIRA et al., 2003) Assim há o acúmulo de amônio
extracelular que eleva o pH do ambiente, os resultados obtidos para variação de pH (ΔpH)
mostram tal alcalinização, exceto no que combinava sacarose com nitrato de potássio, sacarose
com asparagina e o que combinava sorbitol e cloreto de amônio. Em outros termos uma fonte
complexa de carbono com uma inorgânica ou simples de nitrogênio e uma simples de carbono
com uma inorgânica de nitrogênio.
As menores variações de pH traduzem um pH~5, pois os meios líquidos foram ajustados
para tal pH no início do ensaio. Os tratamentos associados a estes valores de pH exibiram altas
taxas de produção micelial e de ECP´s, corroborando com vários estudos que demonstram a
máxima produção micelial e consequente máxima produção proteica em cultivos com pH 5.
(CHHAYA; GUPTE, 2013; PATEL; GUPTE, 2016; RAVIKUMAR et al., 2012). Por outro
lado as baixas produções de biomassa e de ECP´s e a acidificação observada nos cultivos
contendo cloreto de amônio indicam que essa fonte de nitrogênio foi facilmente absorvida pelos
fungos, assim não foi necessário incremento de biomassa para a biossíntese de enzimas que
catabolizam fontes complexas de nitrogênio acumulando amônio e consequentemente
alcalinizando o meio. (PEREIRA et al., 2003)
O ambiente alcalino é necessário às atividade e expressão de algumas enzimas incluindo
a pectato liase codificada pelo gene pelB, um fator de virulência para C. gloeosporioides em
abacateiro (DRORI et al., 2003; YAKOBY et al., 2001). As ECP´s muitas vezes são capazes
de produzir sintomas característicos das doenças, como observado por Talbot et al. (1997)
estudando os produtos de secreção de Magnaporthe grisea sob estresse de nitrogênio.
Entre as ECP´s estão enzimas envolvidas com a degradação de carboidratos, proteases,
eliciadores e outras de função desconhecida. (PAPER et al., 2007; PHALIP et al., 2005; YANG
et al., 2012) Por isso lesões teciduais são formadas durante o desenvolvimento da doença ou
quando o secretoma produzido in vitro é perfundido no tecido vegetal.
Analisando qualitativamente as lesões teciduais em folhas de Solanum lycopersicum (Sl)
e Phaseolus lunatus (Pl) geradas após a perfusão venal dos secretomas produzidos sob estresse
nutricional, observou-se que Sl conserva a especificidade observada no teste de patogenicidade
sendo lesionado apenas por seu patógeno adaptado Colletotrichum siamense crescido com a
fonte de carbono sorbitol.
Por outro lado em Pl essa especificidade entre patógeno e hospedeiro foi quebrada
especialmente quando foi perfundido os secretomas obtidos com Amido. Sabe-se que a

65

composição do secretoma e a secreção de efetores e outras proteínas de fungos hemibiotróficos
sofre influência e regulação dos sinais oriundos da planta hospedeira. (CHAUDHARI et al.,
2014; McCOTTER et al., 2016; VLEESHOUWERS; OLIVER, 2014) Isso pode explicar o
comportamento diferenciado entre Sl e Pl perfundidos com secretoma produzido in vitro,
apontando para uma baixa regulação por Sl e alta por Pl. Essa disparidade entre esse resultado
e o observado no teste de patogenicidade pode ser resolvida com a produção do secretoma nos
tecidos do hospedeiro.
A ideia de que as fontes simples de nutrientes são melhor aproveitadas e contribuem
melhor com a expressão da fisiologia normal do fungo é reforçada com os dados de respostas
tecidual ao cultivo com sorbitol e os de patogenicidade dos isolados. De forma contrária foi o
tratamento com sacarose, que mostrou lesões nos tecidos de Sl e Pl não importando a
especificidade entre patógeno e hospedeiro. Resposta ainda mais discrepante foi observada no
tratamento com Amido, um polissacarídeo mais complexo que a sacarose, o qual não
proporcionou as lesão esperadas de C. trumcatum em Pl, seu patógeno adaptado e ainda
lesionou as folhas de Sl perfundidas.
As lesões teciduais podem ser resposta do hospedeiro a presença ou ação de um patógeno
ou ainda a efetiva ação do patógeno sobre o hospedeiro. Portanto a presença de lesões pode
indicar a presença e atividade de proteínas relacionadas à patogênese, por exemplo enzimas
degradadoras de parede celular. Contudo a concentração de proteínas não parece estar
relacionada com a ocorrência de lesões, visto que o tratamento com amido ocasionou a maior
produção de proteínas e mesmo assim as lesões teciduais ocasionadas não refletem o
comportamento natural das espécies de Colletotrichum testadas.
Percebe-se ainda que na presença de nitrogênio há o incremento da quantidade de
proteínas produzidas. As fontes orgânicas proporcionam as maiores produções de proteínas
principalmente quando associadas ao sorbitol. As quantidade de proteína nas combinações de
sorbitol com as fontes de nitrogênio mostram a relação entre a complexidade da fonte de
nitrogênio e a quantidade de ECP´s. Ao passo que cloreto de amônio produz as menores
quantidade de proteínas o nitrato de potássio, a asparagina e o extrato de levedura mostram
nessa ordem crescente as maiores taxas de produção.
A preferência de fungos por amônio e glutamina (CADDICK et al., 1994; MARZLUF,
1997) explica as quantidade de proteínas produzidas com a combinação sorbitol e fontes de
nitrogênio. A complexidade das fontes requer uma maior quantidade de passos catabólicos para
chegar a amônio, logo uma maior quantidade de ECP´s é observada na combinação sorbitol e
extrato de levedura.

66

As lesões teciduais geradas pelos secretomas produzidos em meio de cultivo que
associavam fontes de carbono com fontes de nitrogênio parecem não estar relacionadas somente
a quantidade de proteínas produzidas, mas também à composição do meio de cultivo. Os
resultados evidenciam que a especificidade ao hospedeiro foi mantida nas associações sacarose
extrato de levedura e sorbitol nitrato de potássio, ou seja, fontes complexas de carbono e
nitrogênio associadas e fontes mais simples de carbono e nitrogênio associadas.

3.5.

Conclusões

A fonte de carbono sacarose impactou negativamente a fisiologia dos isolados, enquanto
que sorbitol a impactou positivamente. Assim como as fontes inorgânicas de nitrogênio
impactaram negativamente o desenvolvimento fúngico e as fontes orgânicas positivamente.
As combinações sacarose nitrato de potássio e sorbitol asparagina registraram
alcalinização enquanto que sacarose e sorbitol associados a cloreto de amônio registraram
acidificação. A combinação sorbitol extrato de levedura sustentou a maior produção de
proteínas e sorbitol cloreto de amônio a menor.
O tratamento sorbitol com nitrato de potássio produziu lesões teciduais compatíveis com
o teste de patogenicidade. Sorbitol combinado com nitrato de potássio simula melhor o estresse
nutricional enfrentado nas fases iniciais de infecção.
A inespecificidade do patógeno observada nos ensaios de perfusão venal de secretoma,
aponta para a importância das fases pré-penetração na patogênese e na defesa vegetal.
Provavelmente os fatores essências para a especificidade entre patógeno e hospedeiro atuem
nessa fase, sem os quais a mudança de hospedeiro foi permitida.

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4. Reação dos tecidos foliares de Solanum lycopersicum e Phaseolus lunatus ao secretoma
de muntantes nit de Colletotrichum spp. produzidos em estresse nutricional.

RESUMO
A atuação de elementos transponíveis como geradores de instabilidade e variabilidade genética
tem sido investigada em fitopatógenos com altos níveis de variabilidade como é o caso de
Colletotrichum spp. Essa instabilidade pode causar a inativação espontânea de genes que
codificam o catabolismo de nitrato, especialmente a enzima nitrato redutase, com implicações
sobre a patogênese. O objetivo do presente estudo é verificar se mutantes Nit de Colletotrichum
spp. alteram a atividade de substâncias extracelulares ativas contra tecidos foliares de Solanum
lycopersicum (Sl) e Phaseolus lunatus (Pl). Os mutantes resistentes a clorato foram obtidos
mediante germinação de esporos em meio mínimo acrescido de batata (100g/L) e clorato de
potássio (150mM). As colônias dos Tipos selvagem e seus mutantes foram submetidos a
estresse nutricional em meio mínimo líquido acrescido de fontes combinadas de carbono 10g/L
(sacarose e sorbitol) e nitrogênio 1g/L (nitrato de potássio e extrato de levedura). As massas
seca e fresca, variação de massa, esporulação, variação de pH e lesões teciduais provocadas
pela infiltração do secretoma nas folhas de Sl e Pl. Os resultados de produção de biomassa,
esporulação e variação de pH mostram que a fonte de carbono sacarose e a de nitrogênio nitrato
de potássio ocasionaram estresse nutricional nos isolados, especialmente aos mutantes Nit
devido a deficiência em metabolizar o nitrato. As lesões teciduais foram mais diversas para a
fonte de carbono sacarose e para a de nitrogênio extrato de levedura. Os mutantes Nit na
presença de extrato de levedura exibiram maior capacidade lesiva que os Tipos selvagens, tanto
em tecidos de hospedeiros quanto em não-hospedeiros. A habilidade de utilizar fontes de
nitrogênio alternativas ao nitrato parece contribuir para o sucesso da patogênese, incluso com
a inespecificidade entre patógeno e hospedeiro.

Palavras-chave: clorato, nitrato, variabilidade, inespecificidade.

76

ABSTRACT
The performance of transposable elements as generators of instability and genetic variability
has been investigated in phytopathogens with high levels of variability such as Colletotrichum
spp. This instability may cause spontaneous inactivation of genes encoding nitrate catabolism,
especially the nitrate reductase enzyme, with implications for pathogenesis. The objective of
the present study is to verify if Nit mutants of Colletotrichum spp. alter the activity of active
extracellular substances against leaf tissues of Solanum lycopersicum (Sl) and Phaseolus
lunatus (Pl). Chlorate resistant mutants were obtained by germination of spores in minimal
medium supplemented with potato (100g / L) and potassium chlorate (150mM). The colonies
of wild types and their mutants were submitted to nutritional stress in liquid medium
supplemented with combined sources of carbon 10g / L (sucrose and sorbitol) and nitrogen 1g
/ L (potassium nitrate and yeast extract). The dry and fresh masses, mass variation, sporulation,
pH variation and tissue damage caused by the infiltration of the secretoma in the leaves of Sl
and Pl. The results of biomass production, sporulation and pH variation show that the sucrose
carbon source and of nitrogen potassium nitrate caused nutritional stress in the isolates,
especially Nit mutants due to deficiency in nitrate metabolism. The tissue lesions were more
diverse for the carbon source sucrose and for the nitrogen of yeast extract. Nit mutants in the
presence of yeast extract exhibited greater deleterious capacity than wild types in both host and
non-host tissues. The ability to utilize nitrogen sources that are alternative to nitrate seems to
contribute to the success of the pathogenesis, including the pathogen and host non-specificity.

Keywords: chlorate, nitrate, variability, non-specificity.

77

4.1. Introdução
Os mutantes Nit são empregados em estudos de instabilidade e estrutura genética,
dinâmica de populações e para avaliar as reações de compatibilidade entre linhagens em várias
espécies de fungo (LESLIE, 1993). Estudos de compatibilidade vegetativa com mutantes Nit
foram feitos para várias espécies de Colletotrichum (ABANG et al., 2004; BEYNON et al.,
1995; FURGAL-WEGRZYKA, 1997;). Mutantes enzimáticos deficientes em uma via de
aquisição de nutrientes, como a do nitrato, podem contribuir para o melhor entendimento da
interação bioquímica entre patógeno e hospedeiro.
A instabilidade de genética de Colletotrichum spp. é notada pela frequente emissão
espontânea de setores, assim como acontece em outros fitopatógenos tais como Fusarium spp.
cujas colônias podem produzir setores que diferem na morfologia, virulência e em outras
características da colônia parental (KLITTICH E LESLIE, 1988). Vários mecanismos explicam
a alta variabilidade patogênica e a instabilidade genética de Colletotrichum spp. Estes incluem
heterocariose, aneuploidia, recombinação, mutações causadas por elementos transponíveis e
ciclo parasexual com parameiose (CASELA; FREDERIKSEN, 1994; SOUZA-PACCOLA et
al., 2003). O envolvimento de elementos transponíveis como geradores de instabilidade e
variabilidade genética tem sido investigada em fitopatógenos com altos níveis de variabilidade
(DABOUSSI E CAPY, 2003) como é o caso de Colletotrichum spp.
Uma das estratégias usadas para identificar elementos transponíveis em fungos
patogênicos é baseada na inativação espontânea de genes que codificam o catabolismo de
nitrato, especialmente a enzima nitrato redutase (AMUTAN et al., 1996; DABOUSSI, 1996;
MAURER et al., 1997). Devido ao caráter espontâneo de isolados fúngicos mutantes para esses
genes são facilmente obtidos por seleção positiva via resistência ao clorato. O clorato é
transportado para o meio intracelular por uma permease e é reduzido a clorito pela ação da
nitrato redutase da mesma forma que o nitrato. O clorito é tóxico à célula fúngica promovendo
a sua morte, estudos demonstram que o clorito gera um estresse oxidativo e danifica importantes
biomoléculas na célula. (INGRAM et al., 2003). Portanto células que apresentam um complexo
nitrato redutase funcional morrem e aquelas que dispõem de uma cópia do complexo nãofuncional sobrevivem a interação com clorato.
As colônias que crescem em meio de cultura contendo clorato são resistentes a clorato
porém não necessariamente são mutantes para a enzima nitrato redutase. Mutações em cinco
genes podem exibir o fenótipo de resistência a clorato: (i) mutação para permeasse de nitrato,
(ii) mutação no gene do regulador específico de assimilação do nitrato, (iii) mutação no gene
do regulador geral de assimilação do nitrato, (iv) mutações em genes envolvidos com o cofator

78

molibdênio e (v) mutações no gene da nitrato redutase. (COVE, 1979). Essas mutações
correlacionam-se com o crescimento ou não em meio mínimo contendo separadamente as
fontes de nitrogênio: nitrato, nitrito, hipoxantina, glutamato e amônio.
Os mutantes obtidos são chamados de mutantes Nit e geralmente contem alterações na
estrutura do loci ou nos reguladores do metabolismo de nitrato ou rotas metabólicas
relacionadas. Por serem resistentes ao clorato os mutantes Nit podem ser obtidos a partir de
setores de crescimento rápido em meio de cultivo contendo clorato (CRAWFORD; ARST,
1993). Nesse meio o crescimento das linhagens selvagens é restrito pois elas reduzem clorato a
clorito tóxico pela atividade da nitrato redutase. Os mutantes Nit não reduzem clorato a clorito
tóxico, logo são resistentes ao clorato e não sofrem restrições no crescimento (COVE, 1976a,
b). Os mutantes Nit também tem sido empregados em estudos de instabilidade e estrutura
genética, dinâmica de populações e para avaliar as reações de compatibilidade entre linhagens
em várias espécies de fungo (LESLIE, 1993). Estudos de compatibilidade vegetativa com
mutantes Nit foram feitos para várias espécies de Colletotrichum (ABANG et al., 2004;
BEYNON et al., 1995; FURGAL-WEGRZYKA, 1997;).
Mutantes enzimáticos deficientes em uma via de aquisição de nitrogênio podem
contribuir para o melhor entendimento do efeito da falta de nitrogênio na interação bioquímica
entre patógeno e hospedeiro. A alteração no metabolismo de nitrogênio pode afetar a habilidade
dos fitopatógenos em modular seu secretoma (KIM et al, 2013; MEINHARDT et al., 2014) que
facilita a aquisição de nutrientes e sobrepõe a resposta imune da planta. (McCOTTER et al.,
2016). Estudos moleculares utilizando mutantes enzimáticos demonstram que proteínas
extracelulares possuem um papel na patogênese (REDMAN; RODRIGUEZ, 2002). O objetivo
do presente estudo é verificar se isolados de Colletotrichum spp. resistentes a clorato alteram o
efeito de substâncias extracelulares ativas contra tecidos foliares de S. lycopersicum e P. lunatus
em relação aos Tipos selvagens.

79

4.2. Metodologia
Os mutantes de Colletotrichum spp. resistentes a clorato foram obtidos com o cultivo dos
Tipos selvagens em meio de cultura constituído por batata (100g), KH2PO4 (1,5g), KCl (0,5g),
MgSO4 (0,5g), FeSO4 (0,01g), ZnSO4 (0,01g), dextrose (10g), agar (15g) em 1L de água
destilada, aos quais foram adicionados 150mM de clorato de potássio. O volume de 100µL de
uma suspensão de esporos contendo 105 esporos*mL-1 foi depositado e espalhado sobre esse
meio. As placas com meio de cultivo inoculado foram mantidas em BOD no escuro a 25oC
durante 15 dias. As colônias formadas foram repicadas e submetidas a confirmação de
mutagênese.
O meio de cultivo usado para confirmar a mutagênese continha KH2PO4 (1,5g), KCl
(0,5g), MgSO4 (0,5g), FeSO4 (0,01g), ZnSO4 (0,01g), dextrose (10g), agar (15g) em 1L de água
destilada, aos quais foram adicionados 150mM de clorato de potássio. As colônias que
cresceram nessa condição foram preservadas e usadas como inóculo nos experimentos de
estresse nutricional.

4.2.1. Estresse nutricional
O meio líquido base foi constituído de KH2PO4 (1g); ZnSO4 (4,4*10-4 g); FeCl3 (4,8*104

g); MnCl2 (3,6*10-4g); MgSO4 (0,1g) e de solução traço (0,01mL). A solução traço continha

ácido cítrico (50g); Fe(NH4)2(SO4)2 (10g); CuSO4 (2,5g); MnSO4 (5g); H3BO3 (0,5g); NaMoO4
(0,5g), ao meio base foram adicionadas, separadamente, duas fontes de carbono e duas de
nitrogênio. A fonte de carbono sacarose (10g/L) foi combinada separadamente às fontes de
nitrogênio: nitrato de potássio e extrato de levedura, ambas na concentração de 1g/L. A mesma
proporção foi aplicada na associação da fonte de carbono sorbitol com as de nitrogênio nitrato
de potássio e extrato de levedura. Foram inoculados três discos (10mm) de meio de cultivo
contendo micélio em 30mL de meio de cultivo líquido contido em tubos tipo Falcon de 50mL
de capacidades. Os isolados cresceram em meio líquido durante 21 dias. No sétimo e no décimo
quarto dia de crescimento os cultivos foram submetidos a aeração, processo conduzido em
câmara de fluxo laminar onde os tubos foram ventilados para renovação do ar em seu interior.

4.2.2. Condições de crescimento e variáveis analisadas
A produção de massa fresca, seca e sua variação, a variação de pH entre tratamentos e
controles e a produção de esporos foram avaliadas. A fase líquida (secretoma) foi separada do
crescimento micelial mediante filtração em tecido tipo gaze. O crescimento micelial foi
determinado pela massa fresca, a massa seca após 24h de secagem a 30oC e a variação de massa

80

dada pela diferença entre massa fresca e seca. O pH do secretoma foi medido com o auxílio do
pHmetro (Quimis Q400AS), a variação de pH foi calculada pela diferença entre o pH das
testemunhas não inoculadas e o pH dos respectivos tratamentos inoculados. Os esporos foram
separados do secretoma por centrifugação de 1 minuto a 1000 rpm. Aproximadamente 200µL
do secretoma livre de esporos foi infiltrado na nervura central de folhas de Sl e Pl. Cada
tratamento foi infiltrado em três plantas de cada espécie, em cada planta nove folíolos foram
infiltrados. Os folíolos foram observadas durante sete dias e o tipo de lesão foi registrado.

4.2.3. Delineamento experimental e análise estatística
O experimento contou com 40 tratamentos (Carbono x Nitrogênio x Isolados +
Testemunhas) com três repetições perfazendo 120 parcelas em delineamento inteiramente
casualisado. Os tratamentos foram comparadas pelo teste de Tukey no nível de 5% de
probabilidade, cada experimento e variável foi analisado individualmente. Nas análise de
variância que resultaram em coeficientes de variação acima de 30%, para otimizar a resolução
do teste de médias os dados de esporulação e variação de massa foram transformados por SQDR
(Y+1) e a variação de pH foi transformada por SQDR (YGauss+1).

4.3. Resultados
4.3.1. Obtenção de mutantes Nit.
No total foram isolados 22 colônias resistentes a clorato para cada espécie de
Colletotrichum. O crescimento da colônias selvagens e resistentes a clorato em meio contendo
batata 10g/L e clorato de potássio (KClO3) 150mM durante 30 dias (Figura 13) revelou colônias
de Colletotrichum siamense com micélio branco leitoso e presença de micélio aéreo. Os
mutantes CsM1 e CsM2 apresentaram coloração e textura semelhantes ao Tipo selvagem.
Colletotrichum truncatum exibiu colônias de micélio branco leitoso com presença de micélio
aéreo compactado. Os mutantes CtM1 e CtM2 apresentaram coloração e textura semelhantes
ao Tipo selvagem. As colônias de Colletotrichum musae exibiram coloração bege com uma
zona alaranjada ao centro e micélio aéreo de coloração branca. Os mutantes CmM1 e CmM2
tiveram características morfoculturais semelhantes ao Tipo selvagem.

81

Figura 13 - Crescimento micelial de isolados selvagens e mutantes de Colletotrichum em KClO3
150mM e batata 10/L aos 30dai. A – Cs, B – CsM1, C – CsM2, D – Ct, E – CtM1, F – CtM2,
G – Cm, H – CmM1, I – CmM2.

Aleatoriamente, dois mutantes foram selecionadas e repicadas para meio contendo meio
mínimo e 150 mM de clorato de potássio (KClO3) como única fonte de nitrogênio. O diâmetro
médio das colônias (Tabela 24) de Colletotrichum siamense foi de 14 mm, enquanto que os
seus mutantes CsM1 e CsM2 apresentaram médias de 82 e 70 mm. Os três isolados diferiram
significativamente do controle e entre si. Colletotrichum truncatum não cresceu nem diferiu
significativamente do controle nessa condição e seus mutantes CtM1 e CtM2 exibiram
diâmetros médios de 49 e 46 mm respectivamente diferindo significativamente do seu Tipo
selvagem. Colletotrichum musae não cresceu na presença de clorato de potássio como única
fonte de nitrogênio e seus mutantes CmM1 e CmM2 obtiveram diâmetros médios de 32 e 35
mm respectivamente, diferindo significativamente do controle e do seu Tipo selvagem.

82

Tabela 24 – Diâmetro médio das colônias de isolados selvagens e
mutantes de Colletotrichum em KClO3 150mM aos sete dias de cultivo.
Isolado
Código
Diâmetro (mm)
Colletotrichum siamense

Cs

14 B

C. siamense Mutante 1

CsM1

82 F

C. siamense Mutante 2

CsM2

70 E

Colletotrichum truncatum

Ct

0A

C. truncatum Mutante 1

CtM1

49 D

C. truncatum Mutante 2

CtM2

46 D

Colletotrichum musae

Cm

0A

C. musae Mutante 1

CmM1

32 C

C. musae Mutante 2

CmM2

35 C

Controles

Ctrl

0A
C.V.%=8,12

Médias seguidas letra distintas diferem entre si pelo teste de Tukey
(p<0.05).
4.3.2. Estresse nutricional
O acúmulo de massa fresca variou de 1,02 a 4,80 gramas (Tabela 25), o isolado Cm
produziu a maior quantidade de massa fresca no tratamento sacarose nitrato de potássio. As
fontes de nitrogênio influenciaram o crescimento micelial. A fonte de nitrogênio Extrato de
levedura proporcionou as maiores médias de massa fresca enquanto que nitrato de potássio
ocasionou as menores médias.
O isolado Cs cresceu de 1,34 a 2,73 gramas, esses extremos foram registrados na presença
de sorbitol associado às fontes de nitrogênio nitrato de potássio e extrato de levedura
respectivamente. O tratamento sorbitol nitrato de potássio diferiu significativamente dos demais
tratamentos. O mutante CsM1 produziu de 1,02 a 3,67 gramas de massa fresca, esses extremos
foram registrados na presença de sacarose associada às fontes nitrato de potássio e extrato de
levedura respectivamente. As menores quantidades de massa fresca foram registradas nos
tratamentos com nitrato de potássio que diferiram significativamente daqueles com extrato de
levedura. CsM2 produziu de 1,30 a 3,76 gramas de massa fresca, esses extremos foram
registrados na presença de sorbitol associado às fontes de nitrogênio nitrato de potássio e extrato
de levedura respectivamente.

83

Tabela 25 – Produção de massa fresca (g) por isolados selvagens e mutantes de
Colletotrichum aos 21 dias de cultivo.
Sacarose
Nitrato de
potássio

Sorbitol

Extrato de
levedura

Nitrato de
potássio

Extrato de
levedura

Cs

2,34 Bb

2,68 ABb

1,34 Aa

2,73 ABb

CsM1

1,02 Aa

3,67 BCDb

1,82 Aa

3,19 Bb

CsM2

2,39 ABab

2,29 ABCbc

1,30 Aa

3,76 Bc

Ct

3,98 Cb

3,91 BCDab

2,45 ABa

2,99 Bab

CtM1

1,71 ABa

2,34 ABab

2,08 ABab

2,86 ABb

CtM2

1,94 ABa

1,92 Aa

1,64 Aa

3,63 Bb

Cm

4,80 Cb

4,45 Db

3,06 Ba

2,85 Ba

CmM1

2,00 ABa

3,84 CDb

2,62 ABa

2,93 ABab

CmM2

2,50 ABa

4,09 Db

2,23 ABa

2,87 ABa

Controles

1,57 ABa

1,64 Aa

1,99 ABa

1,77 Aa
C.V.%=19,42

Médias seguidas letra distintas, maiúsculas nas colunas e minúsculas nas linhas,
diferem entre si pelo teste de Tukey (p<0.05).
Colletotrichum truncatum produziu de 2,45 a 3,98 gramas de massa fresca, as menores
quantidades foram registrada nos tratamentos com sorbitol. O mutante CtM1 produziu de 1,71
a 2,86 gramas de massa fresca, as menores quantidades foram obtidas nos tratamentos com
nitrato de potássio. O isolado CtM2 produziu de 1,64 a 3,63 gramas de massa fresca, esses
extremos foram observados nos tratamentos com sorbitol associado a nitrato de potássio e
extrato de levedura respectivamente.
O isolado Cm produziu de 2,85 a 4,80 gramas de massa fresca. A fonte de carbono que
sustentou a produção das menores quantidades de massa fresca foi o sorbitol e a fonte de
nitrogênio foi o extrato de levedura. O mutante CmM1 produziu de 2 a 3,84 gramas de massa
fresca, esses extremos foram observados nos tratamentos com sacarose associada a nitrato de
potássio e extrato de levedura respectivamente. O isolado CmM2 produziu de 2,23 a 4,09
gramas de massa fresca, as menores quantidades foram registradas nos tratamentos com sorbitol
e com nitrato de potássio.

84

A produção de massa seca variou de 0,81 a 1,43 gramas (Tabela 26), o isolado CmM2 no
tratamento sorbitol extrato de levedura produziu a maior quantidade de massa seca. De modo
geral o tratamento sacarose nitrato de potássio exibiu as menores médias de massa seca,
enquanto que o tratamento sorbitol extrato de levedura exibiu as maiores. Os demais
tratamentos não diferiram significativamente entre si.

Tabela 26 - Produção de massa seca (g) por isolados selvagens e mutantes de
Colletotrichum aos 21 dias de cultivo.
Sacarose

Sorbitol

Nitrato de
potássio

Extrato de
levedura

Nitrato de
potássio

Extrato de
levedura

Cs

0,84 Aa

0,87 ABCa

0,89 ABa

1,08 BCb

CsM1

0,82 Aa

0,89 ABCa

0,88 ABa

1,14 Cb

CsM2

0,82 Aa

0,90 ABCa

0,81 Aa

1,43 Db

Ct

0,88 Aa

0,89 ABCa

0,85 ABa

1,04 ABCb

CtM1

0,88 Aa

0,89 ABCa

0,85 ABa

1,10 Cb

CtM2

0,87 Aa

0,81 Aa

0,87 ABa

1,01 ABCb

Cm

0,92 Aab

0,81 Aa

0,97 Bb

0,96 ABb

CmM1

0,87 Aa

0,95 BCa

0,98 Ba

0,95 ABa

CmM2

0,86 Aa

1,00 Cb

0,92 ABab

0,92 Aab

Controles

0,80 Aa

0,84 ABab

0,95 ABb

0,94 Ab
C.V.%=5,93

Médias seguidas letra distintas, maiúsculas nas colunas e minúsculas nas linhas,
diferem entre si pelo teste de Tukey (p<0.05).
O isolado Cs produziu de 0,84 a 1,08 gramas de massa seca em sacarose nitrato de
potássio e sorbitol extrato de levedura respectivamente. O tratamento sorbitol extrato de
levedura diferiu significativamente dos demais tratamentos. O mutante CsM1 produziu de 0,82
a 1,14 gramas, novamente as menores quantidades foram registradas em sacarose nitrato de
potássio e as maiores no tratamento sorbitol extrato de levedura que diferiu significativamente
dos demais tratamentos. O isolado CsM2 produziu de 0,81 a 1,43 gramas de massa seca, esses
extremos foram registrados na presença de sorbitol associado às fontes de nitrogênio nitrato de

85

potássio e extrato de levedura respectivamente. O tratamento sorbitol extrato de levedura diferiu
significativamente dos demais.
Colletotrichum truncatum produziu de 0,85 a 1,04 gramas de massa seca, seu mutante
CtM1 produziu de 0,85 a 1,10 gramas, em ambos, esses extremos foram registrados nos
tratamentos sorbitol nitrato de potássio e sorbitol extrato de levedura respectivamente. O
tratamento sorbitol extrato de levedura diferiu dos demais. O isolado CtM2 produziu de 0,81 a
1,01 gramas de massa seca, as menores quantidades de massa seca foram registradas no
tratamento sacarose extrato de levedura e as maiores no tratamento sorbitol extrato de levedura.
Colletotrichum musae produziu de 0,81 a 0,97 gramas de massa seca, as menores
quantidades foram observadas em cultivos contendo sacarose e as maiores em cultivos com
sorbitol. O mutante CmM1 produziu de 0,87 a 0,98 gramas de massa seca, contudo não houve
diferença significativa entre os tratamentos. O isolado CmM2 produziu de 0,86 a 1 grama de
massa seca, o maior acúmulo de massa foi registrado para o tratamento sacarose extrato de
levedura que diferiu significativamente dos demais.
Os valores de variação de massa foram de 0,19 a 4,02 gramas (Tabela 27), o isolado Cm
registrou a maior variação de massa no tratamento sacarose nitrato de potássio. De modo geral
as fontes de nitrogênio influenciaram na variação da massa fresca. O extrato de levedura
proporcionou as maiores variações de massa enquanto que nitrato de potássio ocasionou as
menores variações.
O isolado Cs registrou variações de massa entre 0,45 e 1,81 gramas, os menores valores
foram observados no meio de cultivo sorbitol nitrato de potássio e os maiores valores em
sacarose extrato de levedura. O tratamento sorbitol nitrato de potássio diferiu
significativamente dos demais tratamentos.
O mutante CsM1 produziu variações de 0,19 a 2,78 gramas, esses extremos foram
observados na presença de sacarose associada a nitrato de potássio e a extrato de levedura
respectivamente. As menores variações de massa foram registradas nos tratamentos com nitrato
de potássio que diferiram significativamente daqueles com extrato de levedura.
A variação de massa do mutante CsM2 foi de 0,49 a 2,65 gramas, esses extremos foram
registrados na presença de sorbitol associado às fontes de nitrogênio nitrato de potássio e extrato
de levedura respectivamente.
Colletotrichum truncatum produziu variações de massa entre 1,6 e 3,10 gramas, as
menores quantidades foram registradas nos tratamentos com sorbitol. As variações de massa
observadas para o mutante CtM1 foram de 0,83 a 1,78 gramas, as menores quantidades foram
observadas nos tratamentos com nitrato de potássio. A variação de massa do isolado CtM2 foi

86

de 0,82 a 2,70 gramas, esses extremos foram observados nos tratamentos com sorbitol associado
a nitrato de potássio e extrato de levedura respectivamente.
O isolado Cm produziu variações de massa entre 1,96 a 4,02 gramas, a fonte de carbono
sorbitol e a de nitrogênio extrato de levedura ocasionaram as menores variações de massa. A
variação de massa do mutante CmM1 foi de 1,07 a 2,79 gramas, esses extremos foram
observados no tratamento sacarose nitrato de potássio e extrato de levedura respectivamente. O
isolado CmM2 produziu variações de massa entre 1,31 e 3,03 gramas, as menores quantidades
foram registradas nos tratamentos com sorbitol e com nitrato de potássio.

Tabela 27 – Variação de massa (g) em isolados selvagens e mutantes de Colletotrichum
aos 21 dias de cultivo.
Sacarose

Sorbitol

Nitrato de
potássio

Extrato de
levedura

Nitrato de
potássio

Extrato de
levedura

Cs

1,50 BCb

1,81 ABCDb

0,45 Aa

1,64 ABb

CsM1

0,19 Aa

2,78 BCDEFb

0,94 ABa

2,05 Bb

CsM2

1,56 Bbc

1,38 ABCab

0,49 ABa

2,65 Bc

Ct

3,10 CDc

3,02 CDEFab

1,60 BCa

1,98 Bab

CtM1

0,83 ABa

1,41 ABCab

1,26 ABCab

1,78 ABb

CtM2

1,07 Ba

1,12 ABa

0,82 ABa

2,70 Bb

Cm

4,02 Db

3,64 Fb

2,03 Ca

1,96 Ba

CmM1

1,07 ABa

2,79 DEFb

1,63 BCa

1,97 Bab

CmM2

1,59 Ba

3,03 EFb

1,31 ABCa

1,94 ABab

Controles

0,77 ABa

0,80 Aa

1,04 ABCa

0,83 Aa
C.V.%=9,03

Médias seguidas letra distintas, maiúsculas nas colunas e minúsculas nas linhas, diferem
entre si pelo teste de Tukey (p<0.05), SQDR (Y+1).
A produção de esporos variou de 0 a 7,9x105 esporos/mL (Tabela 28). O C. siamense e
seus mutantes Nit não esporularam. O C. truncatum esporulou somente no meio de cultivo
sorbitol extrato de levedura, contudo sem diferenciar dos demais tratamentos. A esporulação de
Cm variou de 0 a 7,9 x105 esporos/mL, a maior produção foi registrado no tratamento sorbitol

87

extrato de levedura que diferiu significativamente dos demais tratamentos. O mutantes CmM1
registrou esporulações entre 0,3 e 5,3 x105 esporos/mL e o mutante CmM2 registrou
esporulações de 0,1 a 6,1 x105 esporos/mL, em ambos as maiores esporulações foram
observadas nos tratamentos com extrato de levedura.
De modo geral as fontes de nitrogênio influenciaram a esporulação, nitrato de potássio
ocasionou as menores taxas de esporulação, enquanto que extrato de levedura proporcionou as
maiores.

Tabela 28 - Esporulação média 105 esporos/mL em isolados selvagens
e mutantes de Colletotrichum aos 21 dias de cultivo.
Sacarose

Sorbitol

Nitrato de
potássio

Extrato de
levedura

Nitrato de
potássio

Extrato de
levedura

Cs

0 Aa

0 Aa

0 Aa

0 Aa

CsM1

0 Aa

0 Aa

0 Aa

0 Aa

CsM2

0 Aa

0 Aa

0 Aa

0 Aa

Ct

0 Aa

0 Aa

0 Aa

0,1 Aa

CtM1

0 Aa

0 Aa

0 Aa

0 Aa

CtM2

0 Aa

0 Aa

0 Aa

0 Aa

Cm

0,3 Aa

0 Aa

0,2 Aa

7,9 Cb

CmM1

0,3 Aa

3,2 Bb

0,3 Aa

5,3 Bb

CmM2

0,1 Aa

2,2 Bb

0,8 Aa

6,1 BCc

Controles

0 Aa

0 Aa

0 Aa

0 Aa
C.V.%=18,28

Médias seguidas letra distintas, maiúsculas nas colunas e minúsculas
nas linhas, diferem entre si pelo teste de Tukey (p<0.05), SQDR (Y+1).
As combinação sacarose com fontes de nitrogênio os isolados exibiram variações de pH
significativas (Tabela 29). O isolado Cs causou alcalinização, exceto no tratamento sacarose
extrato de levedura no qual não houve variação de pH expressiva. Os mutantes CsM1 e CsM2
promoveram alcalinização somente no tratamento sorbitol extrato de levedura o qual diferiu
significativamente dos demais.

88

O isolado Ct sofreu ocasionou acidificação nos tratamentos com sacarose e alcalinização
naqueles com sorbitol. Os mutaantes CtM1 e CtM2 registraram acidificação nos meios com
nitrato de potássio e alcalinização nos tratamentos com extrato de levedura.
Colletotrichum musae ocasionou acidificação nos tratamentos com sacarose e
alcalinização naqueles com sorbitol. Em função da distribuição anormal dos dados foi aplicado
o estimador de densidade Kernel o qual apontou para uma ajuste com a distribuição gaussiana.
Os valores estimados para o modelo foram então transformados em SQDR (YGauss+1)

Tabela 29 – Variação de pH do secretoma em isolados selvagens e mutantes de
Colletotrichum aos 21 dias de cultivo.
Sacarose

Sorbitol

Nitrato de
potássio

Extrato de
levedura

Nitrato de
potássio

Extrato de
levedura

Cs

0,66 Cb

-0,05 Ca

0,99 Cb

1,17 Bb

CsM1

-0,89 Aa

-1,03 ABab

-0,36 Ab

0,75 Bc

CsM2

-0,95 Aa

0,11 BCbc

-0,06 ABb

0,46 ABc

Ct

-0,27 BCb

-1,41 Aa

0,48 BCc

0,85 Bc

CtM1

-0,74 Aa

0,26 Cc

-0,26 Ab

0,82 Bd

CtM2

-0,90 Aa

0,24 Cc

-0,29 Ab

0,87 Bd

Cm

-0,75 Aa

-1,21 Aa

0,72 Cb

0,92 Bb

CmM1

-0,59 ABab

-1,25 Aa

-0,29 Ab

0,78 Bc

CmM2

-0,65 ABab

-1,32 Aa

-0,33 Ab

0,78 Bc

Controles

0 Ca

0 Ca

0 ABa

0 Aa
C.V.%=4,32

Médias seguidas letra distintas, maiúsculas nas colunas e minúsculas nas linhas, diferem
entre si pelo teste de Tukey (p<0.05), SQDR (YGauss+1).

89

De modo geral as fontes de carbono interferiram na variação de pH, sacarose
proporcionou os menores valores de variação implicando na acidificação do meio de cultivo. A
fonte de carbono sorbitol registrou os maiores valores de variação de pH ocasionando a
alcalinização do meio de cultivo, principalmente na associação com extrato de levedura, a qual
diferiu significativamente da associação sorbitol nitrato de potássio.

4.3.3. Lesões teciduais
A infiltração do secretoma obtido dos isolados selvagens e mutantes crescidos nos meios
de cultivo sacarose nitrato de potássio (Figura 14 A-J), sacarose extrato de levedura (Figura 14
L-U), sorbitol nitrato de potássio (Figura 15 A-J) e sortbitol extrato de levedura (Figura 15 LU) ocasionaram lesões no tecido foliar de S. lycopersicum.
Nos tratamentos com sacarose o isolado Cs ocasionou pequenas lesões necróticas restritas
ao ponto de introdução da agulha durante a perfusão. O tratamento nitrato de potássio ocasionou
lesões mais expressivas que extrato de levedura. O mutante CsM1 não ocasionou lesões na
presença de nitrato de potássio, porém com extrato de levedura promoveu lesões necróticas
amplas e de fundo claro. Na presença de nitrato de potássio CsM2 ocasionou leve
escurecimento dos tecidos perfundidos, com extrato de levedura as lesões necróticas foram
amplas e com murcha marginal do folíolo.
O isolado C. truncatum ocasionou lesões necróticas de fundo escuro no tratamento com
nitrato de potássio e lesões necróticas de fundo claro no tratamento com extrato de levedura.
Os mutantes CtM1 e CtM2 não promoveram lesões nos tecidos de S. lycopersicum.
Colletotricum musae e seu mutante CmM2 não ocasionaram lesões nos tecidos
perfundidos. CmM1 causou lesões necróticas de fundo claro apenas na presença de nitrato de
potássio.
Na presença de sorbitol o isolado Cs não ocasionou lesões nos tecidos perfundidos. No
tratamento com nitrato de potássio o mutante CsM1 promoveu pequenas lesões necróticas de
fundo claro restritas ao ponto de introdução da agulha, no tratamento com extrato de levedura
as lesões foram amplas. O isolado CsM2 ocasionou lesões necróticas e murcha marginal nos
tecidos perfundidos, no tratamento com nitrato de potássio essas lesões foram de fundo claro e
no tratamento com extrato de levedura foram de fundo escuro.
Os isolados C. trumcatum e CtM1 não ocasionaram lesões nos tecidos perfundidos. O isolado
CtM2 promoveu lesões necróticas no tratamento com extrato de levedura.
Colletotricum musae promoveu pequenas lesões necróticas restritas ao ponto de
introdução da agulha durante a perfusão, no tratamento com nitrato de potássio essas lesões

90

foram de fundo claro enquanto que no tratamento com extrato de levedura elas foram de fundo
escuro. O isolado CmM1 ocasionou lesões necróticas de fundo escuro somente no tratamento
com extrato de levedura. CmM2 promoveu um escurecimento dos tecidos perfundidos no
tratamento com nitrato de potássio.

91

Figura 14 - Lesões induzidas em folhas de S. lycopersicum perfundidas com secretoma obtido
de cultivos que combinavam nitrato de potássio (A-J) e extrato de levedura (L-U) em sacarose.
A e L - Controles, B e M – Cs, C e N – CsM1, D e O CsM2, E e P – Ct, F e Q – CtM1, G e R
– CtM2, H e S – Cm, I e T – CmM1, J e U – CmM2.

Figura 15 - Lesões induzidas em folhas de S. lycopersicum perfundidas com secretoma obtido
de cultivos que combinavam nitrato de potássio (A-J) e extrato de levedura (L-U) em sorbitol.
A e L - Controles, B e M – Cs, C e N – CsM1, D e O CsM2, E e P – Ct, F e Q – CtM1, G e R
– CtM2, H e S – Cm, I e T – CmM1, J e U – CmM2.

92

A perfusão nos tecidos foliares de Phaseolus lunatus revelou que algumas das infiltração
do secretoma obtido dos isolados selvagens e mutantes ocasionaram pequenas lesões necróticas
amarronzadas. (Figura 16). No tratamento sacarose nitrato de potássio somente os isolados
CsM2, Ct e CmM2 ocasionaram lesões, com sacarose extrato de levedura CsM1, Ct e CmM1
ocasionaram lesões. No tratamento sorbitol nitrato de potássio não houveram lesões, porém
houveram injúrias do ato de perfusão, com sorbitol extrato de levedura apenas o isolado CmM2
ocasionou lesões.
Figura 16 - Lesões induzidas em folhas de Phaseolus lunatus perfundidas com nitrato de
potássio (A-D e I) e extrato de levedura (E-H e J-L) respectivamente em sacarose e sorbitol.
A, E, I, J - Controles, B – CsM2, C e G – Ct, D e L - CmM2, F – CsM1, H – CmM1.

93

4.4.

Discussão
A espontaneidade de mutações que conferem resistência a clorato (PEREIRA et al., 2003)

foi corroborada nesse ensaio pelo elevado número de colônias resistentes isoladas (66 colônias).
No estudo foram escolhidas aleatoriamente duas colônias oriundas de cada tipo selvagem que
foram utilizadas no experimento que confirmou-as como mutantes Nit. O número relativamente
baixo de colônias submetidas ao teste que confirmou a mutagênese é explicado pelo grande
número de parcelas experimentais exigidas pelo delineamento e tratamento estatísticos
empregados nos ensaios que se seguiram. Foram 120 parcelas, das quais avaliou-se massa seca,
massa fresca, variação de massa, produção de esporos, variação de pH e lesões teciduais.
No experimento para confirmação da mutagênese os isolados selvagens Ct e Cm
comportaram-se como o esperado não diferenciando significativamente do controle. O isolado
selvagem Cs exibiu diâmetro de 14 mm diferindo do controle e demais selvagens. Tal fenômeno
pode ser atribuído a natureza do inóculo utilizado no experimento em questão, disco de meio
de cultivo mínimo acrescido de 150 mM de clorato de potássio e 100 g/L de batata. O caldo de
batata contem outros compostos nitrogenados que podem ter sido preferencialmente utilizados
por Cs para crescer antes de intoxicar-se pela captação do clorato presente no meio de cultivo.
Glutamina e amônio são fontes preferencias de nitrogênio para fungos (CADDICK et al., 1994;
MARZLUF, 1997; PEREIRA et al., 2003). A diferença de comportamento de Cs em relação
aos demais selvagens pode ter várias explicações: (i) Cs pode ser menos sensível ao clorato que
as demais espécies, (ii) Cs pode ser mais eficiente em aproveitar quantidades residuais de
glutamina e amônio do disco de meio de cultivo contendo micélio usado como inóculo, ou ainda
(iii) Cs utilizou reservas de nitrogênio contidas no micélio inóculo para esse crescimento inicial.
As colônias resistentes ao clorato confirmaram ser mutantes Nit por crescerem na
presença de clorato de potássio a 150mM como única fonte de nitrogênio. Sabendo que os
mutantes Nit são incapazes de reduzir o clorato a clorito, logo não são intoxicados e não tem
seu desenvolvimento prejudicado.
No ensaio onde foram fornecidas duas fontes de nitrogênio para os Tipos selvagens e para
os mutantes Nit, nos tratamentos com nitrato de potássio os mutantes apresentaram
crescimentos reduzidos como era esperado devido a natureza da sua mutação. Nos tratamentos
com extrato de levedura foi observado um desempenho superior dos mutantes em relação aos
Tipos selvagens, pois o extrato de levedura é uma fonte orgânica que disponibiliza ao fungo
uma gama de compostos nitrogenados úteis para os mutantes Nit.
Na avaliação da massa fresca foi possível observar que os Tipos selvagem tiveram melhor
desempenho na sacarose do que no sorbitol. Considerando as fontes de nitrogênio, Cs e Ct

94

foram mais sensíveis a nitrato de potássio e Cm foi a extrato de levedura. Todos os mutantes
Nit foram sensíveis a nitrato de potássio como era esperado. Analisando a variável Massa seca
percebe-se que os Tipos selvagens foram mais sensíveis a fonte de carbono sacarose e a fonte
de nitrogênio nitrato de potássio, com exceção do isolado Cm que foi mais sensível a extrato de
levedura. Os mutantes foram mais sensíveis a sacarose entre as fontes de carbono e, como
esperado, todos os mutantes Nit foram sensíveis a nitrato de potássio.
Os resultados para variação de massa mostram os menores valores na presença de nitrato
de potássio independentemente da fonte de carbono associada. Os menores valores registrados
nesse tratamento nas variáveis Massa fresca, Massa seca e Variação de massa corroboram entre
si no sentido em que menores quantidades de micélio acumulam menores quantidades de
líquido e por isso produzem menores variações de massa.
A produção de esporos revelou que sorbitol combinado com extrato de levedura foi a
melhor associação para estimular a esporulação, embora tenha ocorrido esporulação somente
do isolado Cm e seus respectivos mutantes. O tratamento sacarose e extrato de levedura o Tipo
selvagem não esporulou ao passo que seus mutantes sim, diferindo significativamente. Jackson
e Bothast (1990) e Patel e Gupte (2016) verificaram que meios de cultivo com baixas
concentrações de carbono combinadas com fontes complexas e orgânicas de nitrogênio
incrementam a esporulação de Colletotrichum sp., corroborando o observado para o meio de
cultivo com extrato de levedura no presente experimento.
No cultivo in vitro de fungos o aumento do pH do ambiente está associado ao acúmulo
de amônio extracelular. Vários genes são induzidos especificamente durante o estresse de
nitrogênio. (DONOFRIO et al. 2006). Tal estresse desencadeia a síntese de enzimas que
catabolizam o nitrogênio contido no meio de cultivo e o disponibiliza para o fungo. O amônio
e a glutamina são as formas preferenciais de absorção de nitrogênio pelos fungos, quando
ausentes podem ser catabolizadas de compostos inorgânicos como por exemplo o nitrato por
reduções sequenciais. (PEREIRA et al., 2003).
Analisando a variação de pH foi possível observar a alcalinização esperada apenas no
tratamento sorbitol extrato de levedura. De modo geral os tratamentos com nitrato de potássio
foram acidificados. A condição de mutante Nit implica na impossibilidade de usar o nitrato
como fonte de nitrogênio, logo esses isolados obtiveram melhor desempenho fisiológico na
presença de extrato de levedura o que refletiu na alcalinização do meio de cultivo devido
provavelmente a fontes alternativas de nitrogênio. Solomon e Oliver (2001) relataram a
presença de glutamina, glutamato, alanina e ácido γ-aminobutírico (GABA) no meio

95

intercelular de tomateiros e apontaram a possibilidade de utilização dessas fontes na nutrição
de fitopatógenos. Essa utilização acumula amônio e por isso alcaliniza o meio intercelular.
O pH é um importante fator para a atividade de enzimas, o ambiente alcalino é necessário
às atividade e expressão de algumas enzimas incluindo a pectato liase codificada pelo gene
pelB, um fator de virulência para C. gloeosporioides patógeno do abacate (DRORI et al., 2003;
YAKOBY et al., 2001). Essas e outras ECP´s reguladas por estresse nutricional muitas vezes
são capazes de produzir sintomas característicos das doenças (TALBOT et al., 1997).
Tipicamente entre as ECP´s estão enzimas envolvidas com a degradação de carboidratos
e proteases. (YANG et al., 2012; PHALIP et al., 2005; PAPER et al., 2007). Por isso lesões
teciduais são formadas durante o desenvolvimento da doença ou quando o secretoma produzido
in vitro é perfundido no tecido vegetal. No ensaio de perfusão tecidual e avaliação de lesões
geradas pelos secretomas foi possível registrar a maior diversidade e quantidade de lesões em
S. lycopersicum quando comparado a P. lunatus. Não obstante a composição do secretoma e a
secreção de efetores e outras proteínas de fungos hemibiotróficos sofre influência e regulação
dos sinais oriundos da planta hospedeira (McCOTTER et al., 2016; CHAUDHARI et al., 2014;
VLEESHOUWERS E OLIVER, 2014), isso pode explicar o comportamento diferenciado entre
Sl e Pl perfundidos com secretoma produzido in vitro, apontando para uma baixa regulação por
Sl e alta por Pl. Talvez a produção de secretoma in vivo possa refletir fielmente a especificidade
natural de patogenicidade.
Os tratamentos com sorbitol e com extrato de levedura ocasionaram injúrias mais
consistentes com a relação de patogenicidade natural dos Tipos selvagens com o hospedeiro e
favoreceram, sobretudo, a atividade dos mutantes Nit. As lesões causadas exclusivamente pelos
mutantes nesses tratamentos pode ser explicadas pela natureza dos mutantes que não podem
aproveitar o nitrogênio do nitrato de potássio para sintetizar as enzimas celulolíticas e outras
necessárias a produção de lesões no tecido foliar.

96

4.5.

Conclusões
Mutantes Nit de Colletotrichum foram facilmente acessados pela seleção de mutações

espontâneas para resistência a clorato de potássio. A espécie C. siamense parece ser menos
sensível a clorato que C. truncatum e C. musae.
A produção de biomassa foi afetada por sacarose e nitrato de potássio tanto entre os Tipos
selvagens quanto entre os mutantes. Somente C. musae e seus mutantes Nit esporularam
diferindo significativamente das testemunhas. A associação sorbitol extrato de levedura
sustentou a maior produção de esporos.
Os cultivos com nitrato de potássio foram acidificados e os com extrato de levedura foram
alcalinizados, sobretudo quando associado a sorbitol.
Os secretomas foram mais ativos contra os tecidos foliares de S. lycopersicum do que os
de P. lunatus. Os tratamentos com sorbitol e com extrato de levedura ocasionaram lesões mais
consistentes com a relação de patogenicidade natural, entre Tipos selvagens e hospedeiros,
como também e favoreceram a atividade dos mutantes.

97

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