Identificação de espécies de Colletotrichum em orquídeas no Brasil e sensibilidade a fungicidas
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE ALAGOAS
CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PROTEÇÃO DE PLANTAS
JANAÍNE ROSSANE ARAÚJO SILVA CABRAL
IDENTIFICAÇÃO DE ESPÉCIES DE Colletotrichum EM ORQUÍDEAS NO BRASIL E
SENSIBILIDADE A FUNGICIDAS
RIO LARGO – AL
2019
JANAÍNE ROSSANE ARAÚJO SILVA CABRAL
IDENTIFICAÇÃO DE ESPÉCIES DE Colletotrichum EM ORQUÍDEAS NO BRASIL E
SENSIBILIDADE A FUNGICIDAS
Tese de Doutorado apresentada ao Programa de PósGraduação em Proteção de Plantas do Centro de
Ciências Agrárias da Universidade Federal de
Alagoas como requisito parcial para obtenção do
grau de Doutora em Proteção de Plantas.
Orientadora: Profa. Dra. Iraildes Pereira Assunção
Coorientadora: Profa. Dra.Jaqueline Figueredo de
Oliveira Costa
RIO LARGO – AL
2019
Catalogação na fonte
Universidade Federal de Alagoas
Biblioteca Setorial do Centro de Ciências Agrárias
Bibliotecário: Erisson Rodrigues de Santana
C117i Cabral, Janaíne Rossane Araújo Silva
Identificação de espécies de Colletotrichum em orquídeas no Brasil
e sensibilidade a fungicidas. Rio Largo-AL – 2019.
71 f.; il; 33 cm
Tese (Doutorado em Proteção de Plantas) - Universidade Federal
de Alagoas, Centro de Ciências Agrárias. Rio Largo, 2019.
Orientador(a): Profª. Drª. Iraildes Pereira Assunção.
Co-orientador: Profª. Drª. Jaqueline Figueredo de
Oliveira Costa.
1. Antracnose. 2. Controle químico. 3. Filogenia multi-locus. 4.
Orchidaceae. I. Título.
CDU: 632.9
“Bendito és Tu, ó Senhor, Deus de nosso pai Israel, de eternidade
em eternidade. Tua é, Senhor, a magnificência, e o poder, e a
glória, e a vitória, e a majestade, porque Teu é tudo quanto há nos
céus e na terra; Teu é, ó Senhor, o reino, e tu te exaltaste como
chefe sobre todos. Tanto riquezas como honra vêm de ti, e tu
dominas sobre tudo, e na tua mão há força e poder; e na tua mão
está o engrandecer e o dar força a tudo. Agora, pois, ó Deus
nosso, graças te damos, e louvamos o nome da tua glória. Porque
quem sou eu, e quem é o meu povo, para que pudéssemos
oferecer voluntariamente coisas semelhantes? Porque tudo vem
de Ti, e do que é teu To damos.” 1 Crônicas 29:10-14.
AGRADECIMENTOS
A minha maior gratidão a Deus, meu consolo e fortaleza nos momentos de dificuldade.
Agradeço imensamente a minha família. Meus pais, Maria da Silva e José Araújo da Silva,
uma das razões de eu não desistir de sonhar e lutar, pelo amor, apoio, incentivo, investimento,
dedicação e esforços despendidos a mim para realização deste sonho. Aos meus irmãos Jamila
Ranyelle Araújo Silva Frutuoso, Janiele Rayssa Araújo Silva Melo e Jamis Henri Araújo
Silva e a minha sobrinha Maria Luiza Araújo Frutuoso pela amizade, cuidado e amor. Ao meu
esposo, Marlisson Araújo Cabral, pelo amor, paciência, companhia e apoio em todos os
momentos desta longa caminhada. Vocês são meu porto seguro! Não existe amor mais
profundo e amizade mais sincera. A vocês todo meu amor e gratidão.
A Profa. Dra. Iraildes Pereira Assunção pela confiança e orientação na realização deste
trabalho. Ao Prof. Dr. Gaus Silvestre de Andrade Lima pela confiança e apoio.
A Profa. Dra. Jaqueline Figueredo Oliveira Costa pela amizade e coorientação. Mais que uma
coorientadora você foi um ombro amigo em muitas ocasiões. Nossa parceria nos trabalhos
começou em 2012 e espero que perdure por muitos anos (rsrsrsrs...). Obrigada de coração!
A Profa. Dra. Sarah Jacqueline Cavalcanti Silva pela amizade, ajuda e colaboração em muitos
momentos desta minha trajetória na pós-graduação. Valeu, Sarita! Você é um ser humano e
uma profissional maravilhosa.
À CAPES pela concessão da bolsa de estudo.
Ao corpo docente do Programa de Pós-graduação em Proteção de Plantas do Centro de
Ciências Agrárias pelos ensinamentos que contribuíram para minha formação.
Aos funcionários da pós-graduação pelo serviço prestado. Em especial a Michele Cristina
Mela pela convivência e simpatia.
Aos colegas do Laboratório de Fitopatologia Molecular e Virologia Vegetal que tive a
oportunidade de conhecer e conviver ao longo destes 7 anos. Foram muitas experiências,
saberes e resenhas compartilhadas. Todo esse tempo foi de muito apredizado e crescimento
para mim. Em especial a Élida Marins, Lauristela Hermógenes, Maria Érika Sales e Maria
Jussara pela amizade e incentivo. Deus me deu a amizade de vocês de presente.
Aos colegas e amigos da pós-graduação pela convivência durante a realização do curso. Em
especial a Caio Holanda, Luan Paz e Mayra Ferro. Levarei as boas lembraças das aulas,
trabalhos e horas de estudo compartilhadas.
E a todos que, direita ou indiretamente, contribuíram para a realização desse trabalho.
RESUMO GERAL
O gênero Colletotrichum é cosmopolita e tem sido considerado um dos patógenos fúngicos
mais importantes do mundo. A antracnose é a principal doença causada pelas espécies deste
gênero e ocorre sobre uma vasta gama de hospedeiros. Em espécies da família Orchidaceae a
doença causa sérios problemas na produtividade, principalmente em regiões tropicais e
subtropicais. Embora cerca de 43 espécies do gênero tenham sido relatadas causando
antracnose em orquídeas em diferentes partes do mundo, pouco se sabe sobre a etiologia da
doença no Brasil. O objetivo deste estudo foi identificar espécies do gênero Colletotrichum
que estão associadas a plantas de orquídeas no nordeste do Brasil. Seis espécies de
Colletotrichum foram identificadas neste estudo: Colletotrichum fructicola, C.
gloeosporioides sensu stricto, C. karstii, C. orchidophilum, C. siamense e C. tropicale. Este é
o primeiro relato das espécies C. tropicale e C. fructicola em orquídeas no mundo e de C.
orchidophilum no Brasil. Estas espécies também foram avaliadas em relação a sensibilidade
micelial in vitro a quatro fungicidas de diferentes princípios ativos. Os fungicidas
tebuconazole, difenoconazole, tiofanato metílico e azoxistrobina+tebuconazole foram
considerados eficientes no controle in vitro das seis espécies de Colletotrichum, mas a
resposta de sensibilidade micelial das espécies variou de acordo com o fungicida e a
concentração. Tebuconazole e difenoconazole apresentaram-se como os mais eficientes na
inibição do crescimento micelial, enquanto que tiofanato metílico foi o menos eficiente. As
espécies de Colletotrichum foram classificadas como alta e moderadamente sensíveis aos
fungicidas baseado no cálculo da EC50.
Palavras-chave: antracnose, controle químico, filogenia multi-locus, Orchidaceae.
GENERAL ABSTRACT
The genus Colletotrichum is cosmopolitan and has been considered one of the most important
fungal pathogens in the world. Anthracnose is the main disease caused by the species of this
genus and occurs on a wide range of hosts. In species of the family Orchidaceae the disease
causes serious problems in productivity, mainly in tropical and subtropical regions. Although
more than 40 species of the genus have been reported causing anthracnose in orchids in
different parts of the world, little is known about the etiology of the disease in Brazil. The
objective of this study was to identify species of the genus Colletotrichum associated to
orchid plants in northeastern Brazil. Six species of Colletotrichum were identified in this
study: Colletotrichum fructicola, C. gloeosporioides sensu stricto, C. karstii, C.
orchidophilum, C. siamense and C. tropicale. This is first report of the species C. tropicale
and C. fructicola on orchids in the world and of C. orchidophilum in Brazil. These species
were also evaluated in relation to the mycelial sensitivity in vitro to four fungicides of
different active principles. The fungicides tebuconazole, difenoconazole, thiophanate methyl
and azoxystrobin+tebuconazole were considered efficient in the in vitro control of the six
species of Colletotrichum, but the mycelial sensitivity of the species varied according to
fungicide and concentration. Tebuconazole and difenoconazole were the most efficient in
inhibiting mycelial growth, whereas methyl thiophanate was the least efficient.
Colletotrichum species were classified as high and moderately sensitive to fungicides based
on EC50 calculation.
Key words: anthracnose, chemical control, multi-locus phylogeny, Orchidaceae.
SUMÁRIO
CAPÍTULO 1 – INTRODUÇÃO GERAL.................................................................................9
1.1 A Cultura da Orquídea..........................................................................................................9
1.2 A Antracnose em Orquídeas...............................................................................................11
1.3 O Gênero Colletotrichum....................................................................................................13
1.4 O Controle da Antracnose em Orquídeas...........................................................................15
Referências................................................................................................................................18
CAPÍTULO 2 – IDENTIFICAÇÃO DE ESPÉCIES DE Colletotrichum EM ORQUÍDEAS
NO NORDESTE DO BRASIL.................................................................................................26
RESUMO..................................................................................................................................27
ABSTRACT..............................................................................................................................27
2.1 INTRODUÇÃO..................................................................................................................28
2.2 MATERIAL E MÉTODOS................................................................................................29
2.3 RESULTADOS...................................................................................................................32
2.4 DISCUSSÃO......................................................................................................................34
2.5 CONCLUSÕES..................................................................................................................38
REFERÊNCIAS........................................................................................................................38
CAPÍTULO 3 – SENSIBILIDADE A FUNGICIDAS DE ESPÉCIES DE Colletotrichum EM
ORQUÍDEAS............................................................................................................................53
RESUMO..................................................................................................................................54
ABSTRACT..............................................................................................................................54
3.1 INTRODUÇÃO..................................................................................................................55
3.2 MATERIAL E MÉTODOS................................................................................................56
3.4 RESULTADOS...................................................................................................................57
3.5 DISCUSSÃO......................................................................................................................60
3.6 CONCLUSÕES..................................................................................................................63
REFERÊNCIAS........................................................................................................................64
9
CAPÍTULO 1 – INTRODUÇÃO GERAL
1.1 A Cultura da Orquídea
As orquídeas são plantas herbáceas e perenes que pertencem a família botânica
Orchidaceae, dividida em cinco subfamílias: Cypripedioideae, Apostasioideae, Vanilloideae,
Orchidoideae e Epidendroideae (CHASE et al., 2003; ZHAI et al., 2013). Estima-se que
existem cerca de 24 mil espécies de orquídeas, inseridas em cerca de 800 gêneros, e mais de
77.400 híbridos naturais e artificiais, distribuídos em todos os continentes, exceto na
Antártida (CHANDANKUMAR, 2009; fay; chase, 2009). No entanto, sua maior diversidade
está presente principalmente nas regiões tropicais das Américas do Sul e Central, da África e
da Ásia Equatorial. O Brasil possui uma das maiores floras orquidáceas do mundo,
representada por 235 gêneros e cerca de 2.419 espécies (BARROS et al., 2010;
RODRIGUES, 2011).
A ampla distribuição geográfica das orquídeas se deve a sua adaptação a diferentes
habitats. Desta forma, as orquídeas podem ser: terrestres - crescem sobre o solo; rupícolas crescem sobre rochas; saprófitas - sobrevivem em matéria orgânica em decomposição; e
epífitas - crescem sobre outras plantas ou suportes, mas sem parasitá-los, sendo este último o
modo de crescimento mais comum da família, compreendendo cerca de 73% das espécies
(TERAO; CARVALHO; BARROSO, 2005; RODRIGUES, 2011).
As espécies desta família têm sido consideradas um dos mais diversos e evoluídos
grupos de plantas angiospermas. E apesar de apresentarem grande variabilidade das
características botânicas, basicamente compartilham as seguintes estruturas: caules, composto
por rizoma e pseudobulbo; raízes fasciculadas, envolvidas por uma ou mais camadas de
células suberificadas e mortas constituindo o velame; folhas de formato e cor variadas com
nervuras paralelas; inflorescência, podendo ter de uma a muitas flores; flores hermafroditas,
raramente unissexuais, com uma estrutura básica de três sépalas e três pétalas, sendo a pétala
oposta ao estame fértil, morfologicamente modificada, chamada labelo. O estigma e os
estames são unidos formando o ginostêmio. Os grãos de pólen estão unidos em uma massa
compacta, denominada polínia; e frutos capsulares, quase secos, com sementes minúsculas,
embrião rudimentar e desprovidas de endosperma (TERAO; CARVALHO; BARROSO,
2005; RODRIGUES, 2011).
10
A imensa variabilidade de cores, tamanhos, formatos e fragrâncias das flores
conferem extrema beleza as orquídeas e despertam o interesse de pesquisadores,
orquidicultores e orquidófilos amadores em todo o mundo. Embora o interesse pelas
orquídeas remonta a civilizações antigas, sua acessão no mercado da floricultura iniciou com
as explorações das orquídeas tropicais após o descobrimento das américas e o aprimoramento
das técnicas de cultivo pelos europeus. Com o passar do tempo, o cultivo de orquídeas cresceu
e se tornou uma atividade mundial economicamente importante (TERAO; CARVALHO;
BARROSO, 2005; FAY; CHASE, 2009).
Alguns dos principais gêneros cultivados no mundo são: Arundia, Sobralia,
Coelogyne, Dendrobium, Bulbophyllum, Pleurothallis, Epidendrum, Cattleya, Phalaenopsis,
Vanda, Maxillaria, Bifrenaria, Cymbidium, Catasetum, Stanhopea, Oncidium e Ionopsis.
Estes pertencem a subfamília Epidendroideae, considerada a maior subfamília das
orquidáceas. A maioria são plantas epífitas das regiões tropicais da América e sudeste da
Ásia. Podemos destacar também o gênero Vanilla, da subfamília Vanilloideae, que é
amplamente cultivado para extração da baunilha (SHIRAKI; DIAZ, 2012).
O comércio de orquídeas representa cerca de 8% do comércio de flores ornamentais,
movimentando cerca de US$ 20 bilhões a cada ano, e está baseado na importação e
exportação de mudas, de flores de corte e plantas em vaso. Países como Holanda, Estados
Unidos, Alemanha, Malásia, Tailândia, Inglaterra, Taiwan, Austrália, África do Sul,
Colômbia, Peru e Equador merecem destaque no comércio internacional desta planta
(STANCATO; BEMELMANS; VEGRO, 2001; REIS, 2011; MANTOVANI, 2013). No
Brasil, a orquidicultura tem aumentado progressivamente, consolidando-se como importante
atividade econômica em várias regiões do país (STANCATO; BEMELMANS; VEGRO,
2001; REIS, 2011) e contribuindo para o crescimento da floricultura que faturou R$ 6,65
bilhões em 2016 (IBRAFLOR, 2017).
Além da beleza e diversidade, o fácil cultivo das orquidáceas é um dos fatores que
contribui para o sucesso da sua comercialização. As orquídeas são consideradas plantas
rústicas que conseguem sobreviver a condições adversas ao seu desenvolvimento por um
longo tempo. Assim, o fornecimento de condições adequadas de temperatura, luz, umidade,
aeração, substrato e nutrientes tem permitido o cultivo destas plantas dentro de casa, ripados,
telados, estufas ou até mesmo ao ar livre (TERAO; CARVALHO; BARROSO, 2005;
SHIRAKI; DIAZ, 2012).
11
O surgimento de técnicas para propagação e multiplicação in vitro destas plantas
também é outro fator importante para a disseminação e comercialização de espécies e híbridos
de orquídeas. Na natureza, a reprodução das orquídeas pode ocorrer de diversas formas, desde
a apomixia até a polinização cruzada obrigatória (quase todas dependentes de insetos), e a
germinação das sementes depende de uma relação simbiótica com fungos micorrízicos que
fornecem nutrientes para o seu desenvolvimento até que a plântula possa realizar fotossíntese.
Com a utilização de técnicas como a cultura de tecidos e a micropropagação, inúmeras mudas
podem ser facilmente produzidas em um ambiente controlado e totalmente estéril. No mundo
todo, centenas de laboratórios comerciais de cultura de tecidos, micropropagam orquídeas e
ajudam a revolucionar a orquidicultura em vários países (STANCATO; BEMELMANS;
VEGRO, 2001; TERAO; CARVALHO; BARROSO, 2005; CHANDANKUMAR, 2009).
1.2 A Antracnose em Orquídeas
Na
orquidicultura,
problemas
fitossanitários
limitam
significativamente
a
produtividade. Com o mercado de flores cada vez mais exigente, plantas ou flores com sinais
de ataque de pragas ou sintomas de doenças se tornam depreciadas e ficam abaixo dos
padrões de qualidade exigidos pelo setor (BUAINAIN; BATALHA, 2007; BARROS et al.,
2009). As orquídeas são suscetíveis a um grande número de doenças, sendo um sério
problema no cultivo, especialmente as de origem fúngicas que são de ocorrência comum
(KLEIN, 2008).
A doença antracnose, causada por espécies do gênero Colletotrichum, é considerada
uma das principais doenças fúngicas das orquidáceas. Presente em orquidários do mundo
todo, é um grave problema para regiões tropicais e subtropicais. Os sintomas iniciam-se
geralmente na face superior da folha, com o aparecimento de lesões escuras e de formato bem
definido, circular ou elíptico. Estas aumentam rapidamente de tamanho e formam grandes
manchas que podem ocupar todo o limbo foliar. O centro é deprimido e de coloração
castanho-pardacenta, com inúmeros anéis concêntricos. É possível observar a presença de
pequenos pontos escuros nas lesões, os acérvulos, de onde emerge uma massa de conídios
envolta numa matriz mucilaginosa de coloração rosada ou alaranjada. Outras partes da planta
podem apresentar sintomas, porém com menor frequência. Nas flores, os sintomas
caracterizam-se pelo aparecimento de pontuações escuras nas pétalas (KIMATI et al., 1997;
KLEIN, 2008; MANTOVANI, 2013).
12
A disseminação ocorre pelos respingos de água de chuva ou irrigação e a infecção é
facilitada por ferimentos, injúrias mecânicas ou bióticas (incidência de raios solares e frio)
que funcionam como porta aberta para entrada do patógeno. As condições favoráveis para o
desenvolvimento da doença são alta umidade, períodos de dias nublados e temperatura em
torno de 20 a 25 °C (KIMATI et al., 1997; KLEIN, 2008; MANTOVANI, 2013).
Até o momento, quarenta e três espécies de Colletotrichum foram associadas a
antracnose em diferentes espécies de orquídeas ao redor do mundo: Colletotrichum acutatum
J.H. Simmonds, C. arxii F. Liu, L. Cai, Crous & Damm, C. bletiae Halst., C. bletillum Tao,
Liu, Liu, Gao & Cai, C. boninense Moriwaki, Toy. Sato & Tsuki, C. cattleyicola Damm &
Toy. Sato, C. caudasporum Tao, Liu, Liu, Gao & Cai, C. cereale Manns, C.cinctum (Berk. &
M.A. Curtis) Stoneman, C. cirrhopetali Sawada, C. cliviae Yan L. Yang, Zuo Y. Liu, K.D.
Hyde & L. Cai, C. cliviicola Damm & Crous, C. coelogynes Damm, C. crassipes (Speg.) Arx,
C. crossandrae Patel,Kamat & C.B. Pande, C. cymbidiicola Damm, P.F. Cannon, Crous, P.R.
Johnst. & B. Weir, C. dematium (Pers.) Grove, C. destructivum O'Gara, C. duyunensis G.
Tao, Zuo Y. Liu & L. Cai, C. effiguratum Sydow, C. endophytum G. Tao, Zuo Y. Liu & L.
Cai, C. excelsum-altitudinum G. Tao et al., C. gloeosporioides sensu stricto (s.s.) (Penz.)
Penz. & Sacc., C. guizhouensis G. Tao, Zuo Y. Liu & L. Cai, C. kahawae J.M Waller &
Bridge, C. karstii Y.L.Yang, Zuo Y. Liu, K.D. Hyde & L. Cai, C. liriopes Damm, P.F.
Cannon & Crous, C. lujae Verpl. & Clem., C. macrosporum Wheeler W. H.; C. miscanthi
J.A. Crouch, B.B. Clarke, J.F. White & B.I. Hillman, C. ochracea Tao, Liu, Liu, Gao & Cai,
C. oncidii Damm, P.F. Cannon & Crous, C. orchidearum Allesch., C. orchidophilum Damm,
P.F. Cannon & Crous, C. parsonsiae Damm, P.F. Cannon, Crous, P.R. Johnst. & B. Weir, C.
phalaenopsidis Sawada, K., C. plurivorum Damm, Alizadeh & Toy. Sato, C. siamense
Phoulivong, L. Cai & K.D. Hyde, C. sojae Damm & Alizadeh, C. stanhopeae Henn., C.
tofieldiae (Pat.) Damm, P.F. Cannon & Crous, C. tropicicola Phouliv. et al., C. vanillae Scalia
(SACCARDO,
1896;
PATEL;
KAMAT;
PANDE,
1953;
MORIWAKI;
SATO;
TSUKIBOSHI, 2003; TALUBNAK; SOYTONG, 2010; CHEN et al., 2011; YANG et al.,
2011; DAMM et al., 2012a; DAMM et al., 2012b; SATO et al., 2012; TAO et al., 2013;
CHOWDAPPA et al., 2014; YAO et al., 2013; LIU et al., 2014; ALMANZA-ÁLVARES et
al., 2017; FARR; ROSSMAN, 2018; DAMM et al., 2019).
Muitas destas espécies foram identificadas e nomeadas com base em características
fenotípicas, gama de hospedeiros e análise de sequências da região ITS-rDNA. Segundo
YANG et al. (2011) alguns destes nomes entraram em desuso, não sendo encontrados na
13
literatura científica atual, enquanto outros deveriam ser considerados ambíguos, uma vez que
suas culturas ex-tipo não estão disponíveis para novos estudos, como: C. bletiae, C.cinctum,
C. cirrhopetali, C. effiguratum, C. lujae, C. macrosporum, C. phalaenopsidis, C. stanhopeae
e C. vanillae. Além disso, novas espécies foram relatadas e reclassificadas com o avanço da
molecular, contribuindo para elevar o número de espécies associada a este hospedeiro (YANG
et al., 2011; JADRANE et al., 2012; NOIREUNG et al., 2012; SATO et al., 2012;
CHOWDAPPA et al., 2014; DAMM et al., 2019).
No Brasil, os estudos de identificação do gênero Colletotrichum em orquídeas ainda
são escassos. Apenas levantamentos de gêneros fúngicos e identificações baseadas em
morfologia e análise da região ITS-rDNA são encontrados, sendo C. gloeosporioides s.s. a
única espécie relatada (MAFIA et al., 2005; KLEIN, 2008; BARROS et al., 2009; SOUZA,
2010; OLIVEIRA et al., 2011; SANTOS, 2012; OLIVEIRA et al., 2014).
1.3 O Gênero Colletotrichum
O gênero Colletotrichum Corda (1831) pertence ao grupo dos fungos anamórficos e
está inserido na classe-forma Celomicetos (AMORIM; REZENDE; BERGAMIN FILHO,
2011). A fase teleomórfica de suas espécies, quando conhecida, é atribuída ao gênero
Glomerella, filo Ascomycota. Baseado em estudos filogenéticos, ambas as formas estão
acomodadas na classe Sordariomycetes, ordem Glomerellales e família Glomerellaceae
(ZHANG et al., 2006; RÉBLOVÁ et al., 2011;).
As principais características morfológicas de Colletotrichum são: micélio septado;
conidioma acervular, frequentemente pouco desenvolvido e geralmente com setas escuras
bem
desenvolvidas;
conidióforos
pouco
desenvolvidos,
tendo
pequenas
células
conidiogênicas aglomeradas em forma de frasco, que apresentam conidiogênese
enteroblástica; e conídios cilíndricos, fusiformes ou semilunares, hialinos, de paredes finas e
unicelulares que germinam para produzir apressórios marrom-escuros com formatos
circulares a irregulares (PUTZKE, J.; PUTZKE, M., 2002; CANNON; KIRK, 2007;
LINS;ABREU; ALVES, 2007).
As espécies deste gênero são amplamente estudadas devido sua importância
econômica como patógenos de plantas, atuando como hemibiotróficos, saprofíticos e
endofíticos (DEAN et al., 2012; GAN et al., 2013; JAYAWARDENA et al., 2016). A
identificação precisa das espécies de Colletotrichum é essencial para compreender a etiologia
14
da doença e estabelecer um manejo adequado. No entanto, a taxonomia do gênero foi
considerada confusa e várias revisões foram realizadas ao longo dos anos (VON ARX, 1957;
SUTTON, 1980; HYDE et al., 2009; CANNON et al., 2012; JAYAWARDENA et al., 2016).
Após a introdução do gênero por Corda em 1831 até meados do século XX, cerca de
750 nomes foram incluídos em Colletotrichum, baseados na especificidade do hospedeiro
(CANNON et al., 2012). Em 1957, o trabalho monográfico de Von Arx trouxe um grande
impacto sobre a taxonomia de Colletotrichum. Em seu trabalho, o gênero foi reorganizado
com base na morfologia das espécies e o número foi reduzido para 11. Além disso, espécies
fúngicas dos gêneros Colletotrichum, Vermicularia e Gloeosporium foram consideradas
pertencentes a um mesmo gênero, sendo conservado o nome Colletotrichum. No entanto, Von
Arx identificou muitos destes táxons baseados em descrições da literatura e não na avaliação
dos espécimes tipo. Sutton (1980) ao observar esta incoerência no trabalho de Von Arx,
reconheceu no gênero 22 espécies, baseado na morfologia e características culturais. Estudos
baseados nestas características continuou a elevar o número de espécies para 40 em Sutton
(1992) e 60 no Dicionário de Fungos (KIRK et al., 2008).
Após o início da década de 1990, foram registradas as primeiras aplicações do DNA
para distinguir espécies em Colletotrichum e o número de artigos utilizando métodos
moleculares para elucidar as relações dentro do gênero aumentaram rapidamente (CANNON
et al., 2012). Inicialmente, a maioria dos estudos estavam baseados em análises da região ITSrDNA, mas outras regiões genômicas começaram a ser utilizadas em análises filogenéticas
multi-locus (SREENIVASAPRASAD; BROWN; MILLS, 1992; SHERRIFF et al., 1994;
JOHNSTON; JONES, 1997; TALHINHAS et al., 2002; GUERBER et al., 2003; DU et al.,
2005).
Muitos trabalhos apresentaram as limitações das características morfoculturais e o
uso de apenas uma região genômica na delimitação de espécies de Colletotrichum,
principalmente da região ITS-rDNA (CAI et al., 2009; HYDE et al., 2009; DAMM et al.,
2009; CANNON et al., 2012; SHARMA; PINNAKA; SHENOY, 2013). Hyde et al. (2009)
enfatizaram a necessidade de epitificação das espécies e o uso de análises filogenéticas multilocus, com genes mais informativos. Cai et al. (2009) indicaram o uso de uma abordagem
polifásica que inclui a utilização de dados moleculares, morfológicos, fisiológicos e
relacionados à patogenicidade para uma identificação mais precisa e confiável das espécies,
visto que a antiga forma de classificação tornou os limites das espécies ambíguos e confusos.
15
A partir de então, as análises filogenéticas multi-locus passaram a ser norma e as
principais regiões genômicas utilizadas são: gliceraldeido-3-fosfato desidrogenase (GAPDH),
actina (ACT), quitina sintetase (CHS-1), β-tubulina (TUB2), calmodulina (CAL), histona
(HIS3), glutamina sintetase (GS), superóxido-dismutase de manganês (SOD) e a região do
espaçador interno transcrito (ITS) (CANNON et al., 2012; WEIR; JOHNSTON; DAMM,
2012). O gene GAPDH tem sido indicado como barcode secundário na identificação de
espécies do gênero Colletotrichum, pois sua combinação com outros genes tem permitido
distinguir de forma confiável a maioria dos táxons (WEIR; JOHNSTON; DAMM, 2012) e
vem sendo utilizado como medida inicial de diversidade em estudos de identificação de
espécies do gênero associadas a um hospedeiro específico (LIMA et al., 2013; SHARMA;
SHENOY, 2013; LIU et al., 2016; SILVA et al., 2017; OLIVEIRA et al., 2018; WACULICZANDRADE et al., 2018).
Com base nesta abordagem, iniciou-se uma revisão do gênero, ainda em curso, em
que várias espécies foram revisadas e tipificadas ou recém-descritas e vários complexos de
espécies foram detectados. Atualmente, 201 espécies são reconhecidas em Colletotrichum,
sendo 18 espécies isoladas (singleton) e 183 espécies agrupadas em um dos 14 complexos
reconhecidos: C. gloeosporioides, C. gigasporum, C. boninense, C. acutatum, C. graminicola,
C. caudatum, C. spaethianum, C. destructivum, C. dematium, C. truncatum, C. orbiculare, C.
dracaenophilum, C. magnum e C. orchidearum (CROUCH; INGUAGIATO, 2009; DAMM et
al., 2009; CANNON et al., 2012; DAMM et al., 2012a; DAMM et al., 2012b; WEIR;
JOHNSTON; DAMM, 2012; DAMM et al., 2013; CROUCH, 2014; DAMM et al., 2014;
HYDE et al., 2014; LIU et al., 2014; LIU et al., 2015; HOU et al., 2016; JAYAWARDENA
et al., 2016; DAMM et al., 2019).
1.4 Controle da Antracnose em Orquídeas
O controle de doenças de plantas é um princípio fundamental para minimizar as
perdas e garantir o máximo na produtividade. No entanto, há uma escassez na literatura
científica no que diz respeito ao controle da antracnose em orquídeas. A grande maioria do
material produzido está disponível em sites, blogs, manuais e livros como resultado do
esforço da comunidade orquidófila.
Dentre os métodos mais indicados estão práticas preventivas que integram controle
cultural e físico, como: a utilização de material propagativo sadio; irrigação adequada com
16
água de boa qualidade, evitando o molhamento das folhas; adoção de medidas de sanitização,
removendo e destruindo plantas invasoras, restos vegetais e partes doentes das plantas; adoção
de práticas de desinfestação, mantendo bancadas, equipamentos e utensílios de corte limpos,
principalmente quando usados em plantas diferentes; utilização de substrato esterilizado,
através de solarização; disposição das plantas nos telados, ripados e estufas que devem ser
mantidas a mais de um metro do solo, em locais ventilados e sem aglomeração, evitando
baixadas, acúmulo de umidade e baixas temperaturas; adubação balanceada, evitando
principalmente o excesso de nitrogênio; e em casos de ataques severos, isolar a planta doente
até seu completo restabelecimento. Todas estas medidas visam a erradicação, exclusão,
evasão e regulação da doença, evitando a disseminação, a formação de microclima favorável
ao patógeno e minimizando a produção de inóculo (MAFIA et al., 2005; MANTOVANI,
2013; AGROFIT, 2018).
O controle químico também é utilizado de forma preventiva com os fungicidas
mancozeb, oxicloreto de cobre e tiofanato metílico, assim como o uso de fumigantes para
desinfestação de substrato (MANTOVANI, 2013; AGROFIT, 2018). Adicionalmente, os
fungicidas sistêmicos a base de azoxistrobina, difenoconazole e bitertanol são usados para
tratamento curativo da doença, principalmente em caso de ataque severo (ZAGER, 2018).
Dentre estes químicos, apenas o mancozeb e o oxicloreto de cobre são recomendados para a
cultura pelo Ministério da Agricultura (AGROFIT, 2018).
Alguns estudos, realizados com fungicidas no controle da antracnose em orquídeas,
obtiveram resultados satisfatórios com o fosfonato de potássio, mancozeb, cimoxanil,
carbendazim, iprodione e fenamidona contra C. gloeosporioides s.s. em Phalaenopsis
(MEERA et al., 2016) e calda bordalesa, clorotalonil, rabicida e mancozeb contra C.
orchidearum em orquídeas (FENGLI et al., 1990).
Podemos citar ainda o uso do controle biológico, recomendado como alternativa ao
controle químico. Estudos com Emericella nidulans em Vanilla planifolia (TALUBNAK;
SOYTONG, 2010), Bacillus subtilis B6 na orquídea Lady's Slipper (KUENPECH;
AKARAPISAN, 2014), B. subtilis SSE 4 em Dendrobium (PRAPAGDEE et al., 2008) e
Streptomyces hygroscopicus em orquídeas (PRAPAGDEE et al., 2012) apresentaram
resultados significativos no combate à doença, utilizando isolados identificados como C.
gloeosporioides s.s.
Embora exista um enorme número de espécies de Colletotrichum associadas a
antracnose em orquídeas no mundo, apenas C. gloeosporioides s.s. e C. orchidearum têm sido
17
utilizados nos estudos de controle da doença. Já foi demostrado que as espécies de
Colletotrichum apresentam comportamento diferenciado frente aos diferentes fungicidas e que
este conhecimento pode ser utilizado para auxiliar e direcionar a escolha dos ingredientes
ativos mais adequados no controle da doença (LIMA et al., 2015). Portanto, estudos
comparativos do efeito dos diferentes fungicidas sobre as diferentes espécies que ocorrem em
orquídeas precisam ser desenvolvidos com o objetivo de evitar a resistência dos patógenos
pelo uso indiscriminado destes químicos.
18
REFERÊNCIAS
AGROFIT/MAPA - SISTEMA DE AGROTÓXICOS FITOSSANITÁRIOS. Disponível em:
<http://agrofit.agricultura.gov.br/agrofit_cons/principal_agrofit_cons>. Acesso em: 15 jun.
2018.
ALMANZA-ÁLVAREZ, J.et al. Identification and control of pathogenic fungi in Neotropical
valued orchids (Laelia spp.). Tropical Plant Pathology, v. 42, n. 5, p. 339-351, oct. 2017.
AMORIM, L.; REZENDE, J. A. M.; BERGAMIN FILHO, A. Manual de Fitopatologia:
Princípios e Conceitos. 4 ed. v.1. Piracicaba: Agronômica Ceres, 2011. 704p.
BARROS, A. P. O. de et al. Manchas foliares em Catasetum expansum (Orchidaceae)
incitadas por Colletotrichum sp. In: JORNADA DE ENSINO, PESQUISA E EXTENSÃO, 9,
2009, Recife. Disponível
em:<http://www.eventosufrpe.com.br/jepex2009/cd/listaresumos.htm>. Acesso em 14 de
Ago. 2018.
BARROS F. de et al. Orchidaceae. In: FORZZA, R. C. et al. (Org.). Catálogo de plantas e
fungos do Brasil. Rio de Janeiro: Andrea Jakobsson Estúdio: Instituto de Pesquisas Jardim
Botânico do Rio de Janeiro, 2010. v. 2, 828 p.
BUAINAIN, A. M.; BATALHA, M. O. (Coord.).Cadeias Produtivas de Flores e
Mel.Brasília: IICA/MAPA/SPA, 2007. 140 p. (Série Agronegócios).
CAI L. et al. A polyphasic approach for studying Colletotrichum. Fungal Diversity, v. 39, p.
183-204, dec. 2009.
CANNON, P. F.; KIRK, P. M. (Ed.). Fungal families of the world. Cambrigde, UK: CAB
International, 2007.456 p.
CANNON, P.F. et al. Colletotrichum- current status and future directions. StudiesMycology,
v.73, n. 1, p.181-213, sep. 2012.
CHANDANKUMAR, G. H. Business appraisal of orchid flower production in
Karnataka. Dissertação (Mestrado em MBA de Gestão Agroempresarial) – University of
Agricultural Sciences, Bengaluru, 2009.
19
CHASE, M. W. et al. DNA data and Orchidaceae systematics: a new phylogenetic
classification. In: Dixon K.W. et al. (Ed.).Orchid conservation. Kota Kinabalu: Natural
History Publications (Borneo), 2003, p. 69–89.
CHEN, J. et al. Endophytic fungi assemblages from 10 Dendrobium medicinal plants
(Orchidaceae). World Journal of Microbiology and Biotechnology, v. 27, p.1009-1016,
2011.
CHOWDAPPA, P. et al. Multilocus gene phylogeny reveals occurrence of Colletotrichum
cymbidiicola and C. cliviae on orchids in North East India. Journal of Plant Pathology, Bari,
Itália, v. 96, n. 2, p. 327-334, jul.2014.
CROUCH J. A.; INGUAGIATO, J. C. First report of anthracnose disease of ornamental
feather reed grass (Calamagrostis× acutifolia 'Karl Foerster') caused by Colletotrichum
cereale. Plant Disease, v. 93, n. 2, p. 203, feb. 2009.
CROUCH, J. A. Colletotrichum caudatums.l. is a species complex. IMA Fungus, v. 5, n. 1,
p. 17-30, mar. 2014.
DAMM, U. et al. Colletotrichum species with curved conidia from herbaceous hosts. Fungal
Diversity, v. 39, p. 45-87, dec. 2009.
DAMM, U. et al. The Colletotrichum acutatum species complex. Studies in Mycology, v. 73,
p.37-113, sept. 2012a.
DAMM, U. et al. The Colletotrichum boninense species complex. Studies in Mycology, v.
73, p.1-36, sept. 2012b.
DAMM, U. et al. The Colletotrichum destructivum species complex – hemibiotrophic
pathogens of forage and field crops. Studies in Mycology, v. 79, p. 49-84, sept. 2014.
DAMM, U. et al. The Colletotrichum dracaenophilum, C. magnum and C. orchidearum
species complexes. Studies in Mycology, v.92, p. 1-46, mar. 2019.
DAMM, U. et al. The Colletotrichum orbiculare species complex: Important pathogens of
field crops and weeds. Fungal Diversity, v. 61, p. 29-59, jul. 2013.
DEAN, R. et al. The Top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology. Molecular Plant
Pathology,v. 13, n. 4, p. 414–430, may. 2012.
20
DU, M. et al. Using mating-type gene sequences for improved phylogenetic resolution of
Colletotrichum species complexes. Mycologia, v. 97, p. 641-658, may-jun. 2005.
FARR D.F.; ROSSMAN A.Y. Fungal Databases, U.S. National Fungus Collections, ARS,
USDA. Disponível em: <https://nt.ars-grin.gov/fungaldatabases/>. Acesso em 15 de Ago.
2018.
FAY, M. F.; CHASE, M. W. Orchid biology: from Linnaeus via Darwin to the 21st century.
Annals of Botany, UK, v. 104, n. 1, p. 359–364, jul. 2009.
FENGLI, J. et al. Disease Occurrence and Chemical Control of Orchid Anthracnose. Journal
of Zhejiang Forestry College, n. 1, p. 43-48, 1990.
GAN, P. et al. Comparative genomic and transcriptomic analyses revealthe hemibiotrophic
stage shift of Colletotrichum fungi. New Phytologist, v. 197, p. 1236–1249, 2013.
GUERBER, J. C. et al. Characterization of diversity in Colletotrichum acutatum sensu lato by
sequence analysis of two gene introns, mtDNA and intron RFLPs, and mating compatibility.
Mycologia,v. 95, n. 5, p. 872-895, sept-oct. 2003.
HOU, L. W.et al. Colletotrichum aracearum and C. camelliae-japonicae, two holomorphic
new species from China and Japan. Mycosphere, v. 7, n. 8, p. 1111-1123, dec. 2016.
HYDE, K. D. et al. Colletotrichum – names in current use. Fungal Diversity, v. 39, p. 147182, dec. 2009.
HYDE, K. D. et al. One stop shop: backbones trees for important phytopathogenic genera:
I.Fungal Diversity, v. 67, n. 1, p. 21-125, jul. 2014.
INSTITUTO BRASILEIRO DE FLORICULTURA – IBRAFLOR. Disponível em:
<http://www.ibraflor.com/site/wp-content/uploads/2017/11/Mercado-de-flores-VeraLonguini-19_08_2017.pdf >. Acesso em: 15 jul.de 2018.
JAYAWARDENA, R. S.et al. Notes on currently accepted species ofColletotrichum.
Mycosphere,v. 7, n. 8,p. 1192-1260, dec. 2016.
21
JADRANE, I. et al. First Report of flower anthracnose caused by Colletotrichum karstii in
white Phalaenopsis orchids in the United States. Plant Disease, v. 96, n. 8 p.1227, aug.2012.
JOHNSTON, P. R.; JONES, D. Relationships among Colletotrichum isolates from fruit-rots
assessed using rDNA sequences. Mycologia, v. 9, n.3, p. 420-430. may-jun. 1997.
KIMATI, H. L et al. (Ed.). Manual de Fitopatologia: doenças das plantas cultivadas. 3. ed.
São Paulo: Agronômica Ceres, 1997. 705 p.
KIRK, P. M. et al. Dictionary of the fungi. 10. ed. Wallingford: CABI Europe - UK, 2008.
784 p.
KLEIN, E. H. S. Levantamento e Desenvolvimento de Kit Diagnóstico de Patógenos e
Propagação In Vitro de Orquídeas no Estado do Rio de Janeiro, dissertação (Mestrado
em Entomologia Aplicada) - Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Seropédica, 2008.
KUENPECH, W.; AKARAPISAN, A.Biological control of anthracnose disease in Lady’s
Slipper using Bacillus subtilis isolate B6. Science Journal of Microbiology, v. 2014, p. 4,
feb. 2014.
LIMA, N. B. et al. Comparative epidemiology of Colletotrichum species from mango in
northeastern Brazil. European Journal of Plant Pathology, v. 141, n. 4, p. 679-688, apr.
2015.
LIMA, N.B. et al. Five Colletotrichum species are responsible for mangoanthracnose in
northeastern Brazil. Fungal Diversity, v.61, n. 1, p. 75–88, jul. 2013.
LINS, S. R.O.; ABREU, M. S.; ALVES, E. Estudos histopatológicos de Colletotrichum spp.
em plântulas de cafeeiro. FitopatologiaBrasileira, v. 32, n. 6, p. 488-495, 2007.
LIU, F. et al. Molecular and phenotypic characterization of Colletotrichum species associated
with anthracnose disease in peppers from Sichuan Province, China. Scientific Reports, v. 6,
n. 32761, sept. 2016. Disponível em: <https://www.nature.com/articles/srep32761>. Acesso
em: 02 ago. 2018.
LIU, F. et al. The Colletotrichum gigasporum species complex. Persoonia, v. 33, p. 83-97,
dec. 2014.
22
LIU, F. et al. Unravelling Colletotrichum species associated with Camellia: employing
ApMat and GS loci to resolve species in the C. gloeosporioides complex. Persoonia, v. 35, p.
63–86. dec. 2015.
MAFIA, R. G. et al. Antracnose em Paphiopedilum insigne (Orquidaceae) causada por
Colletotrichum gloeosporioides. Fitopatologia Brasileira,v. 30, n. 4, p. 436, jul-aug. 2005.
MANTOVANI, C. Manual de identificação das doenças das orquídeas. 2013. Disponível
em:
<http://www.orquideasmantovani.com.br/download?arquivo=Doen%C3%A7as%20das%20O
rqu%C3%ADdeas.pdf>. Acesso em: 09 ago. 2018.
MEERA, T. M.;LOUIS, V.; BEENA, S. Diseases of Phalaenopsis: Symptoms, Etiology and
Management. International Journal of Agriculture Innovations and Research, v. 5, n. 2,
p. 296-300, nov. 2016.
MORIWAKI, J.; SATO, T.; TSUKIBOSHI, T. Morphological and molecular characterization
of Colletotrichum boninense sp. nov. from Japan. Mycoscience, v. 44, p. 47-53, feb. 2003.
NOIREUNG, P. et al. Novel species of Colletotrichum revealed by morphology and
molecular analysis. Criptogamie Mycology, v. 33, n.3, p. 347-362, sept. 2012.
OLIVEIRA, M. Z. A.de et al. Patógenos associados a doenças de plantas ornamentais na
região metropolitana de Salvador, Bahia. In: JORNADA CIENTÍFICA – EMBRAPA
MANDIOCA E FRUTICULTURA, 5, Cruz das Almas. 2011. Disponível em:
<https://www.embrapa.br/mandioca-e-fruticultura/busca-de-publicacoes//publicacao/918354/patogenos-associados-a-doencas-de-plantas-ornamentais-na-regiaometropolitana-de-salvador-bahia>. Acesso em: 25 de ago. 2011.
OLIVEIRA, S. F. et al. Endophytic and mycorrhizal fungi associated with roots ofendangered
native orchids from the Atlantic Forest, Brazil. Mycorrhiza, v. 24, n. 1, p. 55-64, jan.2014.
OLIVEIRA, L.F.M. et al. Identification of Colletotrichum species associated with brown
spotof cactus prickly pear in Brazil.Tropical Plant Pathology, v.43, n. 3, p.247–253, jun.
2018.
PATEL, M. K.; KAMAT, M. N.; PANDE, C. B. A new leaf blight of Crossandra
infundibuliformis Nees. Indian Phytopathology, v. 5, p. 136, jan.1953.
23
PRAPAGDEE, B. et al. Efficacy of crude extract of antifungal compounds produced from
Bacillus subtilis on prevention of anthracnose disease in Dendrobium orchid. Environment
Asia, v.5, n. 1, p. 32-38, jan. 2012.
PRAPAGDEE, B.; AKRAPIKULCHART, U.; MONGKOLSUK, S. Potential of a soil-borne
Streptomyces hygroscopicus for biocontrol of anthracnose disease caused by Colletotrichum
gloeosporioides in orchid. Journal of Biological Sciences, v. 8, n. 7, p. 1187-1192, jul. 2008.
PUTZKE, J.; PUTZKE, M. T. L. Os Reinos dos Fungos. 2. ed. Santa Cruz do Sul: Edunisc,
2002. 491 p.
RÉBLOVÁ, M.; GAMS, W.; SEIFERT, K. A. Monilochaetes and allied genera of the
Glomerellales, and a reconsideration of families in the Microascales. Studies in Mycology, v.
68, p. 163-191, mar. 2011.
REIS, J. N. P. Cultivo de orquídeas: uma opção à agricultura familiar? In: ENCONTRO DA
SOCIEDADE BRASILEIRA DA ECNONOMIA ECOLÓGICA, 9., 2011, Brasília. Anais do
IX encontro da Sociedade Brasileira de Economia Ecológica – ECOECO2. Brasília, DF:
Sociedade Brasileira de Economia Ecológica-ECOECO, 2011.
RODRIGUES, V. T. Orchidaceae Juss. aspectos morfológicos e taxonômicos. 2011.
Instituto de Botânica de São Paulo. Disponível em:
<https://pt.scribd.com/document/293970990/Orchidaceae-Juss-Aspectos-Morfologicos-eTaxonomicos>. Acesso em 19 de Ago. de 2018.
SACCARDO, P. A. Fungi aliquot Brasiliensesphyllogeni. Bulletin de laSociétéRoyale de
BotaniqueBelgique,v. 35, p. 127–132, 1896.
SANTOS, C. D. dos. Fungos e oomiceto associados a espécies nativas e cultivadas de
orquídeas no sul da Bahia. Dissertação (Mestrado em Produção Vegetal) - Universidade
Estadual de Santa Cruz, Ilhéus, BA,2012.
SATO, T. et al. Molecular phylogenetic analyses and morphological re-examination of strains
belonging to three rare Colletotrichum species in Japan. Microbiology and Culture
Collections, v. 28, n. 2, p. 121-134.2012.
SHARMA, G.; PINNAKA, A. K.; SHENOY, B. D. ITS-based diversity of Colletotrichum
from India. Current Research in Environmental & Applied Mycology. v. 3, n. 2, p. 194–
220, oct. 2013.
24
SHARMA, G.; SHENOY, B. D. Colletotrichum fructicola and C. siamense are involved in
chilli anthracnose in India. Archives of Phytopathology and Plant Protection, v. 47, n. 10,
p. 1179-1194, sept. 2013.
SHERRIFF, C. et al. Ribosomal DNA sequence analysis reveals new species groupings in the
genus Colletotrichum. Experimental Mycology, v. 18, n. 2, p. 121-138, jun. 1994.
SHIRAKI, J. N.; DIAZ, E. M. Orquídeas. São Paulo: Secretaria do verde e do meio
ambiente, 2012. 175 p.
SILVA, J. R. A. et al. Molecular and morpho-cultural characterization of Colletotrichum spp.
associated with anthracnose on Capsicum spp. in northeastern Brazil. Tropical
PlantPathology, v. 42, n. 4, p. 315-319, aug. 2017.
SOUSA, E. M. R. Fungos causadores de doenças em orquídeas. Monografia (Graduação
em Ciências Biológicas) - Universidade Federal do Recôncavo da Bahia, Cruz das Almas,
BA,2010.
SREENIVASAPRASAD S.; BROWN A.E.; MILLS P.R. DNA sequence variation and
interrelationship among Colletotrichum species causing strawberry anthracnose.
Physiological and Molecular Plant Pathology, v. 41, n. 4, p. 265-281, oct. 1992.
STANCATO, G. C.; BEMELMANS, P. F.; VEGRO, C. L. R. Produção de mudas de
orquídeas a partir de sementes in vitro e sua viabilidade econômica: estudo de caso. Revista
Brasileira de Horticultura Ornamental, Campinas, v.7, n.1, p. 25-33, 2001.
SUTTON, B. C. The genus Glomerella and its anamorph Colletotrichum. In: BAILEY, J.A.;
JEGER, M.J. (Ed.) Colletotrichum– Biology, Pathology and Control. Wallingford: CAB
International, 1992. p. 1-26.
SUTTON, B.C. The Coelomycetes: Fungi imperfecti with pycnidia acervuli and stromata.
Kew: Commonwealth Mycological Institute, 1980.696p.
TALHINHAS, P. et al. Genetic and morphological characterization of Colletotrichum
acutatum causing anthracnose of lupins. Phytopathology, v. 92, n. 9, p. 986-996, sept. 2002.
TALUBNAK, C.;SOYTONG, K. Biological control of vanilla anthracnose using Emericella
nidulans. Journal of Agricultural Technology, v.6, n. 1, p. 47-55, jan.2010.
25
TAO, G. et al. Endophytic Colletotrichum species from Bletilla ochracea (Orchidaceae), with
descriptions of seven new species. Fungal Diversity, v. 61, n. 1, p. 139-164, jul. 2013.
TERAO, D.; CARVALHO, A. C. P. P. de; BARROSO, T. C. da S. F. (Ed.); SOBRAL, S. del
C. C. de T.; RIDD, M. D. (Trad.). Flores tropicais – Tropical Flowers. 1. ed. Brasília, DF:
Embrapa Informação Tecnológica, 2005. 255p.
VON ARX, J. A. Revision der zu Gloeosporium gestellten Pilze. Amsterdan: N. V. NoordHollandscheUitgevers Maatschappij, 1957. 157p.
WACULICZ-ANDRADE, C. E. et al. Colletotrichum gloeosporioides sensu stricto: an
endophytic species or citrus pathogen in Brazil? Australasian Plant Pathology, v. 46, n. 2, p.
191-203, mar. 2017.
WEIR, B. S.; JOHNSTON, P. R.; DAMM, U. The Colletotrichum gloeosporioides species
complex. Studies in Mycology, v. 73, p.115-180, sept. 2012.
YANG, Y. L. et al. Colletotrichum Species on Orchidaceae in Southwest China.
Cryptogamie Mycologie, v. 32, n. 3, p. 229-253, sept. 2011.
YAO, J. A. et al. Sequence analysis of ITS and PCR rapid detection ofColletotrichum
gloeosporioides from Cymbidium ensifolium. Acta Phytophylacica Sinica, v. 40, n. 3, p.
249–254.2013.
ZAGER, M.Fungos e Bactérias nas Orquídeas. 2018. Disponível em:
<https://www.portaldoorquidofilo.com/fungos-e-bacterias> Acesso em: 12 de ago. 2018.
ZHANG, N. et al. An overview of the systematics of the Sordariomycetes based on four-gene
phylogeny. Mycologia, v. 98, n. 6, p. 1076-1087, nov. 2006.
ZHAI, J. W. et al. A new Orchid genus, Danxiaorchis, and phylogeneticanalysis of the tribe
Calypsoeae. Plos One, v. 8, n. 4, abr. 2013. Disponível
em:<https://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0060371>. Acesso em:
02 de set. 2018.
26
CAPÍTULO 2
IDENTIFICAÇÃO DE ESPÉCIES DE Colletotrichum EM ORQUÍDEAS NO NORDESTE
DO BRASIL
27
1
IDENTIFICAÇÃO DE ESPÉCIES DE Colletotrichum EM ORQUÍDEAS NO
2
NORDESTE DO BRASIL
3
4
Janaíne Rossane Araújo Silva-Cabral1
5
1
6
Largo, AL, 57100-000, Brasil, janaine_rossane@hotmail.com.
Centro de Ciências Agrárias, Universidade Federal de Alagoas, Br 104, Km 85 Norte, Rio
7
8
Resumo - As doenças fúngicas são de ocorrência comum sobre espécies da família
9
Orchidaceae. A antracnose é uma das doenças mais importantes da orquidofloria,
10
principalmente em regiões tropicais. Muitas espécies do gênero Colletotrichum são
11
responsáveis por causar esta doença em orquídeas no mundo todo, no entanto, pouco se sabe
12
sobre a etiologia da doença no Brasil. O objetivo deste estudo foi identificar espécies do
13
gênero Colletotrichum que infectam orquídeas no Nordeste do Brasil, utilizando análises
14
filogenéticas multi-locus associadas a características morfoculturais. Vinte e dois isolados,
15
obtidos de plantas de orquídeas com sintomas de antracnose, se agruparam com seis espécies
16
de Colletotrichum: C. fructicola, C. gloeosporioides sensu stricto, C. karstii, C.
17
orchidophilum, C. siamense e C. tropicale. Este é o primeiro relato de C. tropicale e C.
18
fructicola em orquídeas no mundo e de C. orchidophilum no Brasil.
19
Palavras-chave: antracnose, filogenia multi-locus, Orchidaceae.
20
21
Abstract - Fungal diseases are a common occurrence on species of the Orchidaceae family.
22
The anthracnose is one of the most important diseases of the orchid, mainly in tropical
23
regions. Many species of the genus Colletotrichum are responsible for causing this disease in
24
orchids worldwide, however, little is known about the etiology of the disease in Brazil. The
25
objective of this study was to identify species of the genus Colletotrichum that infect orchids
26
in the northeastern Brazil, using multi-locus phylogenetic analyzes associated with morpho-
27
cultural characteristics. Twenty-two isolates, obtained from orchid plants with symptoms of
28
anthracnose, gathered with six species of Colletotrichum: C. fructicola, C. gloeosporioides
29
s.s., C. karstii, C. orchidophilum, C. siamense and C. tropicale. This is the first report of C.
30
tropicale and C. fructicola in orchids in the world and C. orchidophilum in Brazil.
31
Keywords: anthracnose, multi-locus phylogeny, Orchidaceae.
32
33
28
34
2.1 INTRODUÇÃO
35
36
As orquídeas pertencem a família Orchidaceae, uma das mais diversas e numerosas
37
famílias botânicas do mundo (FAY; CHASE, 2009). Devido a beleza e extensa diversidade de
38
suas flores são grande potencial econômico para floricultura nacional e internacional. O Brasil
39
possui uma das maiores floras orquidáceas, por isso tem se inserido cada vez mais no
40
mercado nacional e internacional de orquídeas, como centro exportador de plantas em vaso,
41
flores cortadas e espécies para colecionadores (STANCATO; BEMELMANS; VEGRO,
42
2001; TERAO; CARVALHO; BARROSO, 2005). As doenças de origem fúngicas são um dos
43
principais fatores limitantes para a produção comercial de orquídeas. A antracnose, doença
44
causada por espécies fúngicas do gênero Colletotrichum, é de ocorrência comum em
45
orquidáceas e causa lesões necróticas em folhas, flores e bulbos. As lesões depreciam
46
esteticamente as plantas e flores, comprometendo sua comercialização (MAFIA et al., 2005;
47
ALMANZA-ÁLVAREZ et al., 2017).
48
Até o momento, quarenta e três espécies do gênero Colletotrichum estão associadas a
49
antracnose em orquídea no mundo: Colletotrichum acutatum J.H. Simmonds, C. arxii F. Liu,
50
L. Cai, Crous & Damm, C. bletiae Halst., C. bletillum Tao, Liu, Liu, Gao & Cai, C. boninense
51
Moriwaki, Toy. Sato & Tsuki, C. cattleyicola Damm & Toy. Sato, C. caudasporum Tao, Liu,
52
Liu, Gao & Cai, C. cereale Manns, C.cinctum (Berk. & M.A. Curtis) Stoneman, C.
53
cirrhopetali Sawada, C. cliviae Yan L. Yang, Zuo Y. Liu, K.D. Hyde & L. Cai, C. cliviicola
54
Damm & Crous, C. coelogynes Damm, C. crassipes (Speg.) Arx, C. crossandrae Patel,Kamat
55
& C.B. Pande, C. cymbidiicola Damm, P.F. Cannon, Crous, P.R. Johnst. & B. Weir, C.
56
dematium (Pers.) Grove, C. destructivum O'Gara, C. duyunensis G. Tao, Zuo Y. Liu & L. Cai,
57
C. effiguratum Sydow, C. endophytum G. Tao, Zuo Y. Liu & L. Cai, C. excelsum-altitudinum
58
G. Tao et al., C. gloeosporioides sensu stricto (s.s.) (Penz.) Penz. & Sacc., C. guizhouensis G.
59
Tao, Zuo Y. Liu & L. Cai, C. kahawae J.M Waller & Bridge, C. karstii Y.L.Yang, Zuo Y.
60
Liu, K.D. Hyde & L. Cai, C. liriopes Damm, P.F. Cannon & Crous, C. lujae Verpl. & Clem.,
61
C. macrosporum Wheeler W. H.; C. miscanthi J.A. Crouch, B.B. Clarke, J.F. White & B.I.
62
Hillman, C. ochracea Tao, Liu, Liu, Gao & Cai, C. oncidii Damm, P.F. Cannon & Crous, C.
63
orchidearum Allesch., C. orchidophilum Damm, P.F. Cannon & Crous, C. parsonsiae Damm,
64
P.F. Cannon, Crous, P.R. Johnst. & B. Weir, C. phalaenopsidis Sawada, K., C. plurivorum
65
Damm, Alizadeh & Toy. Sato, C. siamense Phoulivong, L. Cai & K.D. Hyde, C. sojae Damm
66
& Alizadeh, C. stanhopeae Henn., C. tofieldiae (Pat.) Damm, P.F. Cannon & Crous, C.
29
67
tropicicola Phouliv. et al., C. vanillae Scalia (PATEL; KAMAT; PANDE, 1953;
68
MORIWAKI; SATO; TSUKIBOSHI, 2003; TALUBNAK; SOYTONG, 2010; CHEN et al.,
69
2011;YANG et al., 2011; DAMM et al., 2012a; DAMM et al., 2012b; SATO et al., 2012;
70
TAO et al., 2013, YAO et al., 2013; CHOWDAPPA et al., 2014; LIU et al., 2014;
71
ALMANZA-ÁLVARES et al., 2017; FARR; ROSSMAN, 2018; DAMM et al., 2019). No
72
Brasil, os trabalhos de identificação de Colletotrichum spp. em orquídeas ainda são escassos e
73
se baseiam apenas em morfologia e análise da região ITS-rDNA (MAFIA et al., 2005;
74
FREIRE; MOSCA, 2009; OLIVEIRA et al., 2014).
75
Atualmente, a identificação de espécies do gênero Colletotrichum está baseada em
76
uma abordagem polifásica que compreende a utilização de análises filogenéticas multi-locus
77
associadas a características morfoculturais. Esta nova abordagem tem contribuído
78
significativamente para o entendimento do gênero Colletotrichum, possibilitando uma
79
identificação mais precisa das espécies, resolvendo ambiguidades causadas pelos antigos
80
critérios de classificação e ampliando o registro de novas espécies em diferentes hospedeiros
81
ao redor do mundo (YANG et al., 2011; CANNON et al., 2012; DAMM et al., 2012b;
82
NOIREUNG et al., 2012; HOU et al., 2016; JAYAWARDENA et al., 2016; SILVA et al.,
83
2017; OLIVEIRA et al., 2018; VELOSO et al., 2018; WACULICZ-ANDRADE et al., 2018;
84
DAMM et al., 2019).
85
O objetivo deste estudo foi identificar espécies de Colletotrichum associadas a
86
antracnose em orquídeas no Nordeste do Brasil, utilizando análises filogenéticas multi-locus e
87
características morfoculturais.
88
89
2.2 MATERIAL E MÉTODOS
90
91
2.2.1 Obtenção dos isolados de Colletotrichum
92
93
Para a obtenção dos isolados fúngicos de Colletotrichum foram realizadas coletas de
94
folhas, flores e bulbos de orquídeas com sintomas típicos de antracnose nos municípios de
95
Maceió, Bezerros e Paulo Afonso nos estados de Alagoas, Pernambuco e Bahia do nordeste
96
brasileiro, respectivamente. Os isolados foram obtidos de lesões individuais, normalmente, a
97
partir de duas lesões por folha/planta coletada. Fragmentos do tecido, obtidos da região de
98
transição entre o tecido doente e o sadio, foram desinfestados superficialmente, em álcool a
99
70% por 30 segundos e hipoclorito de sódio a 1% por 1 minuto, lavados duas vezes em água
30
100
destilada esterilizada (ADE), secos em papel filtro e transferidos para placas de Petri com
101
meio de cultura Batata-Dextrose-Ágar (BDA). As placas foram mantidas sob temperatura de
102
25ºC até o crescimento do micélio, a partir do qual foram retirados discos das bordas das
103
colônias e transferidos para novas placas de Petri contendo o meio de cultura BDA.
104
Culturas monospóricas foram obtidas dos isolados identificados como pertencentes
105
ao gênero Colletotrichum baseado na morfologia dos conídios (SUTTON, 1980). Os isolados
106
foram preservados pelo método de armazenamento por congelamento em tiras de papel-filtro
107
(ALFENAS; MAFIA, 2007) e em seguida depositados na Coleção de Culturas de Fungos
108
Fitopatogênicos da Universidade Federal de Alagoas (COUFAL). Análises moleculares e
109
morfoculturais foram realizadas a partir da obtenção das culturas monospóricas.
110
111
2.2.2 Caracterização molecular
112
113
Todos os isolados foram cultivados por 5 dias em meio Sacarose-Extrato de
114
levedura-Asparagina sem adição de ágar, mantidos em temperatura ambiente. O micélio foi
115
coletado e o DNA total foi extraído usando o protocolo de Doyle; Doyle (1987).
116
As sequências parciais do gene do gliceraldeído-3-fosfatodesidrogenase (GAPDH)
117
foram amplificadas de todos os isolados para uma identificação preliminar das espécies
118
presentes em orquídeas. Para posicionamento taxonômico definitivo das espécies do gênero
119
Colletotrichum, isolados representativos de cada espécie identificada foram submetidos à
120
amplificação da região do espaçador interno transcrito ribossomal (ITS) e do gene β-tubulina
121
2 (TUB2). As reações foram realizadas com tampão 10X (3 µL), MgCl2 50 mM (0,9 µL), 10
122
mM DNTP's (2,4 µL), 10 µM de cada oligonucleotídeo (2 µL), 1U Taq DNA polimerase(0,2
123
µL) e DNA 1μL (25ng/µL). O volume final das reações foi ajustado para 30μL com água
124
desionizada esterilizada (Milli-Q). As condições de termociclagem e primers utilizados na
125
amplificação dos genes GAPDH, TUB2 e da região ITS foram realizados como descritos por
126
Weir et al. (2012). Em seguida, os produtos de PCR foram purificados e sequenciados pela
127
Macrogen Inc., Seul, Coréia do Sul.
128
As sequências consenso de cada região genômica foram montadas e editadas usando
129
o Staden Package software (STADEN; BEAL; BONFIELD, 1998) e foram depositados no
130
GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Estas sequências foram inicialmente analisadas com
131
o algoritmo BLASTn do banco de dados de nucleotídeos não-redundante GenBank para
132
determinar as espécies fúngicas com as quais elas compartilhavam maior identidade
31
133
nucleotídica. Posteriormente, alinhamentos múltiplos para cada região genômica foram
134
montados usando o algoritmo MUSCLE (EDGAR, 2004) e manualmente ajustados usando o
135
MEGA6 (Molecular Evolutionary Genetics Analysis). Sequências de referência disponíveis
136
no GenBank para cada região genômica foram obtidas e incluídas nos alinhamentos
137
(Tabela1).
138
As árvores de inferência Bayesiana foram construídas utilizando os alinhamentos das
139
sequências parciais do gene GAPDH e dados concatenados (GAPDH, TUB2 e ITS),
140
separadamente, empregando o método da cadeia de Markov Monte Carlo, no portal web
141
CIPRES (MILLER et al., 2010) usando MrBayes v. 3.2.3 (RONQUIST et al., 2012). O
142
melhor modelo de substituição de nucleotídeos foi determinado para cada região genômica
143
usando MrModeltest 2.3 (POSADA; BUCKLEY, 2004) de acordo com o Akaike Information
144
Criterion (AIC). As árvores foram visualizadas e editadas no software FigTree v. 1.4
145
(ztree.bio.ed.ac.uk/software/figtree).
146
147
2.2.3 Estudos morfoculturais das espécies de Colletotrichum
148
149
A caracterização cultural consistiu na obtenção da taxa de crescimento micelial
150
(TCM) dos isolados. A partir de colônias cultivadas em meio BDA durante 7 dias, foram
151
retirados cinco discos (5mm) da borda da colônia e transferidos para o centro de cinco placas
152
de Petri contendo meio BDA sintético. As placas foram mantidas em incubadora a 25°C em
153
fotoperíodo de 12 horas, durante 7 dias. Para obtenção da TCM, o diâmetro das colônias foi
154
mensurado diariamente. Após os 7 dias, também foi observado a coloração das colônias.
155
A caracterização morfológica baseou-se na avaliação da forma e tamanho de 50
156
conídios e apressórios. As medidas de comprimento e largura destas estruturas foram obtidas
157
por meio de imagens capturadas por câmera digital Olympus SC30 acoplada ao microscópio
158
de luz (Olympus CKX41), utilizando o software Cellsenses Standard.
159
160
Para os estudos morfoculturais foram selecionados isolados de cada espécie
identificada nas análises filogenéticas multi-locus.
161
162
2.2.4 Teste de patogenicidade e gama de hospedeiros
163
164
Isolados das espécies de Colletotrichum identificadas no presente estudo foram
165
selecionados para realização dos testes de patogenicidade e gama de hospedeiros. Os isolados
32
166
foram inoculados em folhas destacadas de orquídeas para o teste de patogenicidade e em
167
frutos sadios para o teste de gama de hospedeiros.
168
As orquídeas foram selecionadas de acordo com a obtenção dos isolados, sendo cada
169
isolado testado na orquídea de onde foi obtido. E os frutos foram selecionadas de acordo com
170
o hospedeiro original das espécies, ou seja, o hospedeiro em que a espécie foi identificada
171
pela primeira vez.
172
Folhas
assintomáticas
dos
gêneros
Cattleya,
Oncidium,
Phalaenopsis
e
173
Schomburgkia e frutos de goiaba (Psidium guajava L.), mamão (Carica papaya L.), manga
174
(Mangifera indica L.) e pera (Pyrus communis L.) foram lavadas em água corrente,
175
desinfestadas superficialmente em solução de hipoclorito de sódio (NaOCl) a 1% por 3
176
minutos, lavados 3 vezes em ADE e secos com papel estéril. O inóculo consistiu de uma gota
177
de 10µL de suspensão de esporos com concentração de 105 conídios/mL, para as folhas de
178
orquídeas, e para os frutos, discos de BDA (5mm) retirados das margens de colônias crescida
179
por sete dias. Os inóculos foram depositados sobre a superfície de cada órgão vegetal ferido
180
com auxílio de uma agulha estéril, com quatro repetições. Como testemunha foi utilizado
181
ADE e BDA. As folhas e os frutos foram acondicionadas em gerbox com papel filtro
182
esterilizado umedecido com ADE, cobertos com saco de polietileno e incubados em estufa
183
Biochemistry Oxigen Demand (BOD) a 25 ºC e fotoperíodo de 12 h até o aparecimento dos
184
sintomas. O fungo foi reisolado para comprovar a patogenicidade das espécies e verificar as
185
características morfoculturais.
186
187
2.3 RESULTADOS
188
189
2.3.1 Obtenção dos isolados de Colletotrichum
190
191
Um total de vinte e dois isolados de Colletotrichum foram obtidos de sete diferentes
192
gêneros de orquídeas nativas e comercias (Tabela 1). Doze isolados foram obtidos do gênero
193
Cattleya, seguido por Oncidium com 3 isolados e Phalaenopsis com 2 isolados. Os demais
194
gêneros foram representados por apenas um isolado. As folhas foram os órgãos vegetais mais
195
coletados e com o maior número de isolados. Apenas um isolado foi obtido de bulbo e
196
nenhum de flores.
197
198
33
199
2.3.2 Caracterização molecular
200
201
Baseado nos resultados de pesquisa BLAST do banco de dados GenBank e na análise
202
inicial realizada com as sequências parciais do gene GAPDH, dezenove isolados de
203
Colletotrichum spp. obtidos neste estudo foram alocados no complexo C. gloeosporioides,
204
dois isolados no complexo C. boninense, e um isolado foi relacionado a espécie singleton, C.
205
orchidophilum.
206
Para representar as espécies identificadas na análise com o gene GAPDH, doze
207
isolados de orquídeas foram selecionados e submetidos a análises filogenéticas multi-locus
208
(GAPDH, TUB2 e ITS). A filogenia das espécies do complexo C. gloeosporioides incluiu
209
nove isolados representativos, que foram agrupados em 4 clados com alto suporte de
210
probabilidade posterior Bayesiana: O isolado COUFAL0213 foi atribuído ao clado da espécie
211
C. gloeosporioides strictu sensu, os isolados COUFAL0215 e COUFAL0225 foram
212
agrupados no clado da espécie C. fructicola Prihastuti, L. Cai & K.D. Hyde, COUFAL0209,
213
COUFAL0216 e COUFAL0223 ao clado de C. siamense e o clado de C. tropicale E.I. Rojas,
214
S.A. Rehner & Samuels agrupou os isolados COUFAL0205, COUFAL0214 e COUFAL0217
215
(Figura 1).
216
A identidade dos isolados de orquídeas que foram relacionados ao complexo C.
217
boninense e a espécie C. orchidophilum é apresentada na Figura 2. Os isolados
218
COUFAL0220 e COUFAL0221 foram atribuídos a espécie C. karstii, enquanto o isolado
219
COUFAL0219 a espécie singleton C. orchidophilum.
220
221
Os
alinhamentos
e
árvores
foram
depositados
no
TreeBASE
(http://www.treebase.org; números de acesso: 20248; 20260).
222
223
2.3.3 Estudos morfoculturais das espécies de Colletotrichum
224
225
Os isolados representando as seis espécies de Colletotrichum encontradas neste
226
estudo foram identificados como pertencentes ao gênero Colletotrichum, de acordo com seus
227
caracteres morfológicos e culturais (Figura 3). Embora a coloração predominante tenha sido o
228
branco e o laranja, os isolados se mostraram muito heterogêneos em relação as características
229
das colônias. Os valores médios do diâmetro das colônias, comprimento e largura de conídios
230
e apressórios apresentaram-se superiores ou inferiores aqueles observados para as espécies
231
identificadas, no entanto, os intervalos de tamanhos foram semelhantes as características das
34
232
espécies do complexo Colletotrichum gloeosporioides (WEIR; JOHNSTON; DAMM, 2012),
233
complexo C. boninense (DAMM et al., 2012b) e a espécie C. orchidophilum (DAMM et al.,
234
2012a) (Tabela 2).
235
236
2.3.4 Teste de patogenicidade e gama de hospedeiros
237
238
Todos os isolados foram patogênicos as folhas de orquídeas e frutos sadios (Figura 4
239
e 5), que induziram sintomas entre cinco a dezoito dias após a inoculação, sendo o isolado
240
COUFAL0220, inoculado em orquídea, o mais tardio.
241
Em orquídeas, os isolados das espécies de Collettrichum induziram lesões necróticas
242
deprimidas pequenas na superfície das folhas com ferimento. Nos frutos, as lesões foram
243
necróticas, deprimidas, enxarcadas e com diferentes tamanhos.
244
gloeosporioides s.s., e C. siamense induziram as maiores lesões quando inoculadas em
245
mamão (2,0-1,5cm) e pera (2,7-2,5cm) , respectivamente. Nenhum sintoma foi observado na
246
testemunha (Tabela 2).
As espécies C.
247
248
2.4 DISCUSSÃO
249
250
Neste estudo a filogenia multi-locus combinada aos dados morfoculturais revelou
251
uma alta diversidade de espécies de Colletotrichum associadas à antracnose em orquídeas no
252
nordeste do Brasil. Seis espécies foram identificadas: C. fructicola, C. gloeosporioides s.s., C.
253
karstii, C. orchidophilum, C. siamense e C. tropicale.
254
A vasta diversidade de espécies de Colletotrichum ocorrendo em orquídeas já era
255
esperada, uma vez que 43 espécies do gênero foram relatadas neste hospedeiro ao redor do
256
mundo (FARR; ROSSMAN, 2018). Dentre as espécies identificadas apenas C. tropicale e C.
257
fructicola nunca foram anteriormente relatadas em orquídeas.
258
A espécie C. orchidophilum forma um grupo basal ao complexo C. acutatum e é
259
classificada como uma espécie singleton, pois não pertence a nenhum complexo reconhecido
260
do gênero. O nome desta espécie advém de seu hospedeiro, já que é relatada somente em
261
espécies da família Orchidaceae, e não existem relatos de sua ocorrência em nenhum outro
262
hospedeiro. Colletotrichum orchidophilum já foi relatada em Cycnoches aureum, no Panamá,
263
Ascocenda sp. e Dendrobium sp. nos Estados Unidos, Phalaenopsis sp. no Reino Unido e V.
264
planifolia em Reunião (DAMM et al., 2012a; CHARRON et al., 2018). O isolado
35
265
COUFAL0219 correspondente a C. orchidophilum foi obtido somente de Ca. labiata Lindl.,
266
espécie originária do nordeste brasileiro conhecida como rainha do Nordeste. Segundo nossos
267
conhecimentos, este é o primeiro relato desta espécie em orquídeas no Brasil e em Cattleya
268
sp. no mundo.
269
Colletotrichum fructicola, C. gloeosporioides s.s., C. siamense e C. tropicale,
270
membros do complexo C. gloeosporioides e C. karstii, membro do complexo C. boninense
271
são espécies amplamente disseminadas que ocorrem sobre uma vasta gama de hospedeiros de
272
importância econômica (DAMM et al., 2012b; WEIR; JOHNSTON; DAMM, 2012;
273
UDAYANGA et al., 2013; ALANIZ; HERNÁNDEZ; MONDINO, 2015; LIU et al., 2015;
274
LIU et al., 2016; VELOSO et al., 2018).
275
Colletotrichum gloeosporioides s.s. é a segunda espécie mais relatada em orquídeas
276
no mundo, sendo associada as seguintes espécies e gêneros da família Orchidaceae:
277
Anoectochilus roxburghii (Wall.) Lindl., Ca. gaskelliana (N.E.Br.) Rchb.f., Cattleya sp.,
278
Cymbidium sp., Cy. insigne Rolfe, Cy. kanran Makino, Cy. sinense [And.] Willd., Cy. sp. var.
279
wondrous, Coelogyne graminifolia Rchb. f., Dendrobium chrysotoxum Lindl., D. moschatum
280
(Buch.-Ham.) Sw., D. nobile Lindl., D. officinale Kimura & Migo, Epidendrum sp.,
281
Hoffmannseggella cinnabarina (Batem. ex Lindl.) H.G.Jones, Laeliocattleya sp., Oncidium
282
altissimum (Jacq.) Sw., Oncidium sp., Phalaenopsis sp., Phaius tankervilleae (Banks) Blume,
283
Saccolabium sp., Schomburgkia tibicinis (Bateman ex Lindl.) Rolfe, Spatiglotis sp.,
284
Stanhopea sp., Vanda sp., V. planifolia, em Austrália, África do Sul, Brasil, China, Coréia,
285
Cuba, EUA, Ilhas Virgens, Índia, Indonésia, Maurícia, Porto Rico e Tailândia (FREIRE;
286
MOSCA, 2009; YUAN et al., 2009; BOCOURT et al., 2011;YANG et al., 2011;
287
CHOWDAPPA et al., 2012; HUANG et al., 2012; OLIVEIRA et al., 2014; LAN et al., 2016;
288
FARR; ROSSMAN, 2018).
289
A maioria destes registros estão baseados em morfologia, gama de hospedeiro e
290
análise da região ITS, com alguns poucos estudos utilizando análise filogenética multi-locus.
291
A revisão destes relatos mais antigos seria oportuna, uma vez que o complexo C.
292
gloeosporioides agrupa inúmeras espécies crípticas e muitos isolados foram erroneamente
293
identificados como C. gloeosporioides s.s. com base nos antigos critérios de classificação. A
294
espécie C. gloeosporioides var. minor (como var. minus), por exemplo, foi reclassificada
295
como C. queenslandicum por Weir; Johnston; Damm (2012), e existem relatos de C.
296
gloeosporioides var. minor em orquídeas (SIMMONDS, 1966), porém nenhum isolado deste
297
hospedeiro foi avaliado nesta revisão.
36
298
Os resultados do presente estudo contrariam a abundância desta espécie em
299
orquídeas, pois somente o isolado COUFAL0213 obtido de Ca. alba correspondeu a C.
300
gloeosporioides s.s., além disso, as outras espécies deste complexo relatadas aqui foram mais
301
frequentes do que C. gloeosporioides s.s.. A espécie C. tropicale foi a mais prevalente,
302
representada por 10 isolados, seguida por C. siamense, com 6 isolados e por C. fructicola com
303
2 isolados. Colletotrichum tropicale e C. fructicola não foram relatadas em nenhuma orquídea
304
no mundo, enquanto que a espécie C. siamense foi relatada apenas em Arundina graminifolia
305
((D.Don) Hochr.) na China (YANG et al., 2011). Concluímos, então, que este é o primeiro
306
relato de C. tropicale em Brassia longissima [Rchb.f] Nash, Cattleya sp., Ca. labiata, Ca.
307
maikai, Maxilaria sp., Oncidium sp. e Phalaenopsis sp.; de C. fructicola em Cattleya sp.
308
(híbrida) e Phalaenopsis sp.; de C. gloeosporioides s.s. em Ca. alba e de C. siamense em
309
Cattleya sp., Ca. labiata, Ca. maikai, Harpophyllum giganteum Hartweg ex Lindl. e S. crispa
310
no mundo.
311
Interessante notar que as espécies C. fructicola, C. tropicale e C. siamense foram
312
relacionados a infecções mistas em Ca. labiata e Phalaenopsis sp., sendo identificadas de
313
isolados obtidos de lesões distintas da mesma folha/planta. Foi o caso dos isolados
314
COUFAL0205 e COUFAL0206, obtidos de folhas de Ca. labiata, identificados como C.
315
tropicale e C. siamense, respectivamente. E os isolados COUFAL0214 e COUFAL0215 que
316
foram obtidos de folhas de Phalaenopsis sp., identificados como C. tropicale e C. fructicola,
317
respectivamente.
318
A espécie C. karstii foi identificada pela primeira vez em orquídeas (A. graminifolia,
319
Calanthe argenteostriata C.Z. Tang & S.J. Cheng, Eria coronaria (Lindl.) Rchb.f., Pleione
320
bulbocodioides (Franchet) Rolfe e Vanda sp. na China (YANG et al., 2011). Posteriormente
321
foi relatada em Phalaenopsis sp. (híbrido) nos EUA e Bletilla ochracea Schltr. na China
322
(JADRANE et al., 2012; TAO et al., 2013). Porém, esta espécie não é restrita a orquídeas,
323
sendo considerada a espécie mais comum e geograficamente diversificada do complexo C.
324
boninense. Na revisão deste complexo, muitos isolados obtidos de Dracaena sp., Passiflora
325
edulis Sims, Cucumis melo L., Clivia miniata (Stuefer) Engels, Eucaluptus sp. Leucospermum
326
sp. e Protea cynaroides (L.) L. na África do Sul, Austrália, EUA, Japão e Zimbábue,
327
anteriormente identificados como C. boninense, foram reclassificados como C. karstii
328
(DAMM et al., 2012b). Alguns destes isolados revisados foram obtidos do estudo de
329
Moriwaki; Sato; Tsukiboshi (2003), onde a espécie C. boninense foi identificada de isolados
330
oriundos de Cattleya sp., Cymbidium sp. e D. kingianum Bidwill ex Lindl. no Japão, no
37
331
entanto estes isolados de orquídeas não foram incluídos na revisão de Damm et al. (2012b).
332
Talvez subestimando a abrangência desta espécie em gêneros de orquidáceas. No presente
333
estudo C. karstii é relatado pela primeira vez em O. sherry baby O’Flaherty e Ca. labiata.
334
Em relação a heterogeneidade observada nas características morfoculturais dos
335
isolados neste estudo, podemos notar que estas características são altamente variáveis. Outros
336
estudos mostraram a mesma variabilidade destas características. Weir; Johnston; Damm
337
(2012) concluíram que existem pequenas variações entre isolados de uma mesma espécie em
338
relação ao tamanho dos conídios e forma dos apressórios,e que os intervalos de tamanho dos
339
conídios entre as espécies são geralmente pequenos e se sobrepõem. Eles encontraram
340
também uma alta divergência na aparência macroscópica das culturas, provavelmente
341
refletindo diferentes históricos de armazenamento. Damm et al. (2012b) relataram uma alta
342
variabilidade na morfologia dos isolados da espécie C. karstii e Damm et al. (2012a)
343
observaram diferenças no tamanho de conídios e apressórios entre os isolados examinados da
344
espécie C. orchidophilum e também uma variação na coloração da colônia dependendo do
345
meio utilizado. Segundo Cai et al. (2009) as características fenotípicas podem variar
346
dependendo do meio de cultura, temperatura e das condições de cultivo. Todas estas
347
observações refletem a fragilidade da identificação de Colletotrichum spp. baseada apenas em
348
dados morfoculturais.
349
No teste de patogenicidade e gama de hospedeiro, as espécies de Colletotrichum
350
induziram lesões mais evidentes nos frutos do que nas folhas de orquídeas, hospedeiro
351
original dos isolados testados. Estes resultados corroboram com outros estudos de
352
patogenicidade cruzada deste gênero desenvolvidos em diferentes hospedeiros e regiões do
353
mundo que confirmam a inespecifidade das espécies de Colletotrichum em relação ao
354
hospedeiro. Este comportamento evidencia que a interação patógeno/hospedeiro deste gênero
355
precisa ser melhor explorada, uma vez que pode estar associado com particularidades do
356
isolado e/ou dos frutos inoculados, como por exemplo, níveis de suscetibilidade do
357
hospedeiro e densidade do inóculo (SILVA et al., 2006; LIMA et al. 2015; PHOULIVONG et
358
al., 2010; YANG et al., 2011).
359
O presente estudo demonstrou que a diversidade de espécies de Colletotrichum
360
associadas à antracnose de orquídeas no nordeste do Brasil tem sido subestimada. Seis
361
espécies foram identificadas como agentes causais da antracnose, sendo o primeiro relato da
362
maioria destas espécies em orquídeas no Brasil. A aplicação de estudos filogenéticos na
363
identificação de espécies de Colletotrichum é fundamental para conhecer a diversidade,
38
364
estrutura populacional, gama de hospedeiros e distribuição geográfica deste grupo de fungos.
365
Este conhecimento contribui significativamente para o desenvolvimento de medidas de
366
controle mais efetivas da doença.
367
368
2.5 CONCLUSÕES
369
370
371
372
373
374
375
376
377
378
379
As espécies C. fructicola, C. gloeosporioides s.s., C. karstii, C. orchidophilum, C.
siamense e C. tropicale são associadas à antracnose em orquídeas no Nordeste do Brasil.
Este é o primeiro relato de C. fructicola e C. tropicale em orquídeas no mundo e de
C. orchidophilum no Brasil.
As espécies C. gloeosporioides s.s., C. karstii, C. siamense e C. orchidophilum são
relatadas pela primeira vez em pelo menos um dos gêneros de orquídeas aqui estudados.
Colletotrichum tropicale é a espécie mais prevalente entre os gêneros de orquídeas,
ocorrendo em Cattleya, Maxillaria, Brassia, Phalaenopsis e Oncidium.
O gênero Cattleya apresenta maior diversidade de Colletotrichum spp. associadas à
doença antracnose no Nordeste do Brasil.
380
381
AGRADECIMENTOS
382
383
O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal
384
de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001. Agradecemos também à
385
Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Alagoas - FAPEAL.
386
387
REFERÊNCIAS
388
389
390
391
392
ALANIZ, S.; HERNÁNDEZ, L.; MONDINO, P. Colletotrichum fructicola is the dominant
and one of the mostaggressive species causing bitter rot of apple in Uruguay. Tropical Plant
Pathology, v. 40, p. 265–274, jul. 2015.
393
394
395
ALFENAS, A. C.; MAFIA, R. G. Métodos em fitopatologia, Viçosa: Editora UFV, 2007,
382p.
396
397
398
ALMANZA-ÁLVAREZ, J. et al. Identification and control of pathogenic fungi in neotropical
valued orchids (Laelia spp.). Tropical Plant Pathology, v. 42, n. 5, p. 339-351, oct. 2017.
39
399
400
401
BOCOURT, Y. P. et al. Hongos Patógenos en plantas ornamentales de importancia para
Cuba. Fitosanidad, v. 15, n. 4, p. 205-214, dic. 2011.
402
403
404
CAI L. et al. A polyphasic approach for studying Colletotrichum. Fungal Diversity, v. 39, p.
183-204, dec. 2009.
405
406
407
CANNON, P.F. et al. Colletotrichum- current status and future directions. Studies Mycology,
v.73, n. 1, p.181-213, sep. 2012.
408
409
410
CHARRON, C. et. al. Characterization of Colletotrichum orchidophilum, the agent of black
spot disease of vanilla. Journal of Phytopathology, v. 166, p. 525–531, 2018.
411
412
413
414
CHEN, J. et al. Endophytic fungi assemblages from 10 Dendrobium medicinal plants
(Orchidaceae). World Journal of Microbiology and Biotechnology, v. 27, p.1009-1016,
2011.
415
416
417
418
CHOWDAPPA, P. et al. Morphological and molecular characterization ofColletotrichum
gloeosporioides (Penz) Sac. isolates causinganthracnose of orchids in India. Biotechnology,
Bioinformatics and Bioengineering, v. 2, n. 1, p. 567-572, 2012.
419
420
421
422
CHOWDAPPA, P. et al. Multilocus gene phylogeny reveals occurrence of Colletotrichum
cymbidiicola and C. cliviae on orchids in North East India. Journal of Plant Pathology, Bari,
Italy, v. 96, n. 2, p. 327-334, jul. 2014.
423
424
425
DAMM, U. et al. The Colletotrichum acutatum species complex. Studies in Mycology, v. 73,
p.37-113, sept. 2012a.
426
427
428
DAMM, U. et al. The Colletotrichum boninense species complex. Studies in Mycology, v.
73, p.1-36, sept. 2012b.
429
430
431
DAMM, U. et al. The Colletotrichum dracaenophilum, C. magnum and C. orchidearum
species complexes. Studies in Mycology, v.92, p. 1-46, mar. 2019.
432
433
434
DOYLE J.J.; DOYLE J.L. A rapid DNA isolation procedure for smallquantities of fresh leaf
tissue. Phytochem Bull, v. 19, p.11–15, 1987.
435
436
437
EDGAR, R.C. MUSCLE: A multiple sequence alignment method with reduced time and
space complexity. BMC Bioinformatics, v.5, p.1-19, 2004.
40
438
439
440
441
FARR D.F.; ROSSMAN A.Y. Fungal Databases, U.S. National Fungus Collections, ARS,
USDA. Disponível em: <https://nt.ars-grin.gov/fungaldatabases/>. Acesso em: 15 de Ago.
2018.
442
443
444
FAY, M. F.; CHASE, M. W. Orchid biology: from Linnaeus via Darwin to the 21st century.
Annals of Botany, UK, v. 104, n. 1, p. 359–364, jul. 2009.
445
446
447
448
FREIRE, F. das C. O.; MOSCA, J. L. Patógenos associados a doenças de plantas ornamentais
no estado do Ceará. Revista Brasileira de Horticultura Ornamental, v. 15, n. 1, p. 83-89,
2009.
449
450
451
HOU, L. W.et al. Colletotrichum aracearum and C. camelliae-japonicae, two holomorphic
new species from China and Japan. Mycosphere, v. 7, n. 8, p. 1111-1123, dec. 2016.
452
453
454
HUANG, J. H. et al. First Report of Anthracnose Caused by Colletotrichum gloeosporioides
on Cymbidium sinense in China. Plant Disease, v. 96, n. 6, p. 915,jun. 2012.
455
456
457
JADRANE, I. et al. First Report of flower anthracnose caused by Colletotrichum karstii in
white Phalaenopsis orchids in the United States. Plant Disease, v. 96, p.1227, 2012.
458
459
460
JAYAWARDENA, R. S.et al. Notes on currently accepted species ofColletotrichum.
Mycosphere,v. 7, n. 8,p. 1192-1260, dec. 2016.
461
462
463
464
LAN, C. Z. et al. First report of anthracnose on Dendrobium officinale Kimura et Migo
caused by Colletotrichum gloeosporioides in China. Plant Disease, v. 100, n. 1, p. 226, jan.
2016.
465
466
467
468
LIMA, N. B. et al. Comparative epidemiology of Colletotrichum species from mango in
northeastern Brazil. European Journal of Plant Pathology, v. 141, n. 4, p. 679-688, apr.
2015.
469
470
471
472
473
LIU, F. et al. Molecular and phenotypic characterization of Colletotrichum species associated
with anthracnose disease in peppers from Sichuan Province, China. Scientific Reports, v. 6,
n. 32761, sept. 2016. Disponível em: <https://www.nature.com/articles/srep32761>. Acesso
em: 02 ago. 2018.
474
475
476
LIU, F. et al. The Colletotrichum gigasporum species complex. Persoonia, v. 33, p. 83-97,
dec. 2014.
41
477
478
479
480
LIU, F. et al. Unravelling Colletotrichum species associated with Camellia: employing
ApMat and GS loci to resolve species in the C. gloeosporioides complex. Persoonia, v. 35, p.
63–86. dec. 2015.
481
482
483
MAFIA, R. G. et al. Antracnose em Paphiopedilum insigne (Orquidaceae) causada por
Colletotrichum gloeosporioides. Fitopatologia Brasileira, v. 30, n. 4, p. 436, jul-aug. 2005.
484
485
486
MILLER, M. A. et al. The CIPRES Portals. Website.
<http://www.phylo.org/sub_sections/portal>. Acesso em: 6 de jun. 2018.
487
488
489
MORIWAKI, J.; SATO, T.; TSUKIBOSHI, T. Morphological and molecular characterization
of Colletotrichum boninense sp. nov. from Japan. Mycoscience, v. 44, p. 47-53, feb. 2003.
490
491
492
NOIREUNG, P. et al. Novel species of Colletotrichum revealed by morphology and
molecular analysis. Criptogamie Mycology, v. 33, n.3, p. 347-362, sept. 2012.
493
494
495
496
OLIVEIRA, L.F.M. et al. Identification of Colletotrichum species associated with brown
spotof cactus prickly pear in Brazil.Tropical Plant Pathology, v.43, n. 3, p.247–253, jun.
2018.
497
498
499
500
OLIVEIRA, S. F. et al. Endophytic and mycorrhizal fungi associated with roots of
endangered native orchids from the Atlantic Forest, Brazil. Mycorrhiza, v. 24, n. 1, p. 55-64,
jan. 2014.
501
502
503
PATEL, M. K.; KAMAT, M. N.; PANDE, C. B. A new leaf blight of Crossandra
infundibuliformis Nees. Indian Phytopathology, v. 5, p. 136, jan.1953.
504
505
506
PHOULIVONG, S. et al. Colletotrichum gloeosporioides is not a common pathogen on
tropical fruits. Fungal Diversity, v. 44, p. 33–43, 2010.
507
508
509
510
POSADA, D.; BUCKLEY, T.R. Model selection and model averaging in phylogenetics:
advantages of Akaikeinformation criterion and Bayesian approaches over likelihood ratio
tests. Systematic Biology, v.53, n. 5, p.793-808, 2004.
511
512
513
RONQUIST, F. et al. MrBayes 3.2: Efficient Bayesian Phylogenetic Inference and Model
Choice across a Large Model Space. Systematic Biology, v. 61, n. 3, p. 539-42, 2012.
Disponível
em:
42
514
515
516
517
SATO, T. et al. Molecular phylogenetic analyses and morphological re-examination of strains
belonging to three rare Colletotrichum species in Japan. Microbiology and Culture
Collections, v. 28, n. 2, p. 121-134.2012.
518
519
520
521
SILVA, J. R. A. et al. Molecular and morpho-cultural characterization of Colletotrichum spp.
Associated with anthracnose on Capsicum spp. in northeastern Brazil. Tropical Plant
Pathology, v. 42, n. 4, p. 315-319, aug. 2017.
522
523
524
525
SILVA, K. S.. et al. Patogenicidade causada pelo fungo Colletotrichum gloeosporioides
(Penz) em diferentes espécies frutíferas. Revista Brasileira de Fruticultura, v. 28, n. 1, p.
131-133, 2006.
526
527
528
SIMMONDS, J.H. Host index of plant diseases in Queensland. Brisbane: Queensland
Department of Primary Industries, 1966. 111p.
529
530
531
532
STADEN, R.; BEAL, K.F.; BONFIELD, J.K. The Staden package. In: MISENER, S.,
KRAWETZ S.A. (Eds) Bioinformatics methods and protocols. New York, USA: Humana,
1998. p.115–130.
533
534
535
536
STANCATO, G. C.; BEMELMANS, P. F.; VEGRO, C. L. R. Produção de mudas de
orquídeas a partir de sementes in vitro e sua viabilidade econômica: estudo de caso. Revista
Brasileira de Horticultura Ornamental, Campinas, v.7, n.1, p. 25-33, 2001.
537
538
539
SUTTON, B.C. The Coelomycetes: Fungi imperfecti with pycnidia acervuli and stromata.
Kew: Commonwealth Mycological Institute, 1980.696p.
540
541
542
TALUBNAK, C.; SOYTONG, K. Biological control of vanilla anthracnose using Emericella
nidulans. Journal of Agricultural Technology, v.6, n. 1, p. 47-55, jan.2010.
543
544
545
546
TAMURA, K. et al. MEGA 5: Molecular evolutionary genetics analysis using maximum
likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods. Molecular Biology and
Evolution, v.28, n. 10, p. 2731-2739, 2011.
547
548
549
TAO, G. et al. Endophytic Colletotrichum species from Bletilla ochracea (Orchidaceae), with
descriptions of seven new species. Fungal Diversity, v. 61, n. 1, p. 139-164, jul. 2013.
550
551
552
553
TERAO, D.; CARVALHO, A. C. P. P. de; BARROSO, T. C. da S. F. (Ed.); SOBRAL, S. del
C. C. de T.; RIDD, M. D. (Trad.). Flores tropicais – Tropical Flowers. 1. ed. Brasília, DF:
Embrapa Informação Tecnológica, 2005. 255p.
43
554
555
556
UDAYANGA, D. et al. What are the common anthracnose pathogens of tropical fruits?
Fungal Diversity, v. 61, n.1, p. 165–179, 2013.
557
558
559
VELOSO, J. S. et al. Why species delimitation matters forfungal ecology: Colletotrichum
diversity on wild and cultivated cashew in Brazil. Fungal Biology, v. 122, p. 677-691, 2018.
560
561
562
563
WACULICZ-ANDRADE, C. E. et al. Colletotrichum gloeosporioides sensu stricto: an
endophytic species or citrus pathogen in Brazil? Australasian Plant Pathology, v. 46, n. 2, p.
191-203, mar. 2017.
564
565
566
WEIR, B. S.; JOHNSTON, P. R.; DAMM, U. The Colletotrichum gloeosporioides species
complex. Studies in Mycology, v. 73, p.115-180, sept. 2012.
567
568
569
YANG, Y. L. et al. Colletotrichum Species on Orchidaceae in Southwest China.
Cryptogamie Mycologie, v. 32, n. 3, p. 229-253, sept. 2011.
570
571
572
573
YAO, J. A. et al. Sequence analysis of ITS and PCR rapid detection of Colletotrichum
gloeosporioides from Cymbidium ensifolium. Acta Phytophylacica Sinica, v. 40, n. 3, p.
249–254. 2013.
574
575
576
577
YUAN, Z.; CHEN, Y.; YANG, Y. Diverse non-mycorrhizal fungal endophytes inhabitingan
epiphytic, medicinal orchid (Dendrobium nobile): estimationand characterization. World
Journal of Microbiology and Biotechnology, v. 25, p. 295–303, 2009.
578
579
580
581
582
583
584
585
586
587
588
589
590
44
591
592
Tabela 1. Espécies de Colletotrichum com detalhes do hospedeiro, localização e número de acesso das culturas e do GenBank utilizados para a análise filogenética neste
estudo.
Espécies
Código da cultura
Hospedeiro
Localização
C. aenigma
ICMP 18608*
ICMP18686
ICMP 17673*
ICMP17919*
ICMP18122
ICMP 12071*
ICMP18621
CBS129826*
ICMP18580*
MTCC11680
CBS123755*
CBS128547
CGMCC3.18118*
CGMCC3.18117
CGMCC3.15227*
CAUG17*
LC0324*
LC0327
ICMP18581*
ICMP17921
COUFAL0215
COUFAL0225
IMI356878*
LF318
COUFAL0213
JZB330028*
CBS128500
CBS128550
COUFAL0220
COUFAL0221
ICMP 19119*
ICMP17817
ICMP 12944*
ICMP 12064
ICMP18187*
ICMP17940
CBS 632.80*
COUFAL0219
Persea americana
Pyrus pyrifolia
Aeschynomene virginica
Dioscore alata
Dioscore alata
Malus domestica
Persea americana
Hevea brasiliensis
Coffea arabica
Mangifera indica
Crinum asiaticum var. Sinicum
Camellia sp.
Camellia japonica
Camellia japonica
Citrus unshiu
Capsicum annuum
Pennisetum purpureum
Pennisetum purpureum
Coffea Arabica
Ficus edulis
Phalaenopsis sp.
Cattleya sp. (híbrida)
Citrus sinensis
Camellia sinensis
Cattleya alba
Vitis vinifera
Annona cherimola
Annona cherimola
Oncidium sherry baby
Cattleya labiata
Musa sp.
Musa sapientum
Capsicum annum
Citrus grapefruit
Nuphar lutea subsp. polysepala
Nymphaea ordorata
Dendrobium sp.
Cattleya labiata
Israel
Japão
EUA
Índia
Nigéria
Nova Zelândia
Nova Zelândia
Colômbia
Tailândia
Índia
Japão
Nova Zelândia
Japão
Japão
China
China
Tailândia
Tailândia
Tailândia
Alemanha
Brasil
Brasil
Itália
China
Brasil
China
Nova Zelândia
México
Brasil
Brasil
EUA
Quênia
Nova Zelândia
Nova Zelândia
EUA
EUA
EUA
Brasil
C. aeschynomenes
C. alatae
C. alienum
C. annellatum
C. asianum
C. boninense
C. camelliae-japonicae
C. citricola
C. conoides
C. endophytica
C. fructicola
C. gloeosporioides
C. hebeiense
C. karstii
C. musae
C. novae-zelandiae
C. nupharicola
C. orchidophilum
Número de acesso do GenBank
ITS
GAPDH
TUB2
JX010244
JX010044
JX010389
JX010243
JX009913
JX010390
JX010176
JX009930
JX010392
JX010190
JX009990
JX010383
JX010191
JX010011
JX010449
JX010251
JX010028
JX010411
JX010246
JX009959
JX010386
JQ005222
JQ005309
JQ005656
FJ972612
JX010053
JX010406
JQ894679
JQ894623
JA894601
JQ005153
JQ005240
JQ005588
JQ005159
JQ005246
JQ005333
KX853165
KX893584
KX893580
KX853164
KX893583
KX893579
KC293576
KC293736
KC293656
KP890168
KP890162
KP890174
KC633854
KC832854
KC633855
KC832846
JX010165
JX010033
JX010405
JX010181
JX009923
JX010400
MH939970 MH939936 MH939958
MH939969 MH939937 MH939959
JX010152
JX010056
JX010445
KJ955127
KJ954828
KJ955275
MH939971 MH939938 MH939960
KF156863
KF377495
KF288975
JQ005202
JQ005289
JQ005636
JQ005219
JQ005306
JQ005653
MH939979 MH939957 MH939967
MH939978 MH939956 MH939966
JX010146
JX010050
HQ596280
JX010142
JX010015
JX010395
JQ005228
JQ005315
JQ005662
JQ005228
JQ005316
JQ005663
JX010187
JX009972
JX010398
JX010188
JX010031
JX010399
JQ948151
JQ948481
JQ949802
MH939980 MH939955 MH939968
45
C. petchii
C. phyllanthi
C. proteae
C. pseudoacutatum
C. queenslandicum
C. salsolae
C. siamense
C. tropicale
C. viniferum
CBS378.94*
CBS379.94
CBS175.67*
CBS132882*
CBS134301
CBS 436.77*
ICMP1778*
ICMP18705
ICMP19051*
ICMP18578*
ICMP18121
COUFAL0206
COUFAL0209
COUFAL0212
COUFAL0216
COUFAL0218
COUFAL0223
ICMP18653*
ICMP18672
COUFAL0205
COUFAL0207
COUFAL0208
COUFAL0210
COUFAL0211
COUFAL0214
COUFAL0217
COUFAL0222
COUFAL0226
COUFAL0224
GZAAS 5.08601*
GZAAS 5.08608
Dracaena marginata
Dracaena marginata
Phyllanthus acidus
Protea sp.
Protea sp.
Pinus radiata
Carica papaya
Coffea sp.
Salsola tragus
Coffea arabica
Dioscorea rotundata
Cattleya labiata
Harpophyllum giganteum
Cattleya sp.
Cattleya maikai
Orchidaceae
Schomburgkia crispa
Theobroma cacao
Litchi chinensis
Cattleya labiata
Cattleya labiata
Maxillaria sp.
Brassia longissima
Cattleya maikai
Phalaenopsis
Cattleya maikai
Oncidium sherry baby
Cattleya sp.
Oncidium sp.
Vitis vinifera cv. shuijing
Vitis vinifera cv. hongti
Itália
Itália
Índia
África do Sul
África do Sul
Chile
Austrália
Fiji
Hungria
Tailândia
Nigéria
Brasil
Brasil
Brasil
Brasil
Brasil
Brasil
Panamá
Japão
Brasil
Brasil
Brasil
Brasil
Brasil
Brasil
Brasil
Brasil
Brasil
Brasil
China
China
*ex-holotype or ex-epitypecultures. Os isolados obtidos neste estudo estão destacados em negrito.
JQ005223
JQ005224
JQ005221
KC297079
KC842385
JQ948480
JX010276
JX010185
JX010242
JX010171
JX010245
MH939973
MH939974
MH939972
JX010264
JX010275
MH939975
MH939976
MH939977
JN412804
JN412802
JQ005310
JQ005311
JQ005308
KC297009
KC842379
JQ948811
JX009934
JX010036
JX009916
JX009924
JX009942
MH939939
MH939940
MH939942
MH939941
MH939943
MH939944
JX010007
JX010020
MH939945
MH939946
MH939947
MH939948
MH939952
MH939949
MH939953
MH939954
MH939950
MH939951
JN412798
JN412800
JQ005657
593
JQ005658
JQ005655
KC297101
KC842387
JQ950131
JX010414
JX010412
JX010403
JX010404
JX010402
MH939962
MH939961
JX010407
JX010396
MH939964
MH939965
MH939963
JN412813
-
46
595
Tabela 2. Resumo das características morfológicas e culturais das espécies de Colletotrichum.
Conídios (µm)
Apressórios (µm)
Espécies
Comprimento
596
597
598
599
600
601
602
603
604
C.fructicola
15.50
COUFAL0215
(10.63-26.36)
COUFAL0225
C. gloeosporioides
15.31
COUFAL0213
(11.03-18.09)
C. orchidophilum
17.51
COUFAL0219
(15.70-19.83)
C. siamense
16.26
COUFAL0223
(11.78-22.18)
COUFAL0216
C. tropicale
14.53
COUFAL0205
(10.62-18.11)
COUFAL0217
C. karstii
16.17
COUFAL0220
(13.4-18.37)
COUFAL0221*
*Este isolado não produziu apressórios.
Largura
Formato
Comprimento
Largura
5.21
(3,62-6.94)
Cilíndrico
11.91
(8.08-20.29)
8.01
(4.20-14.89)
9.8
(3.8-16.0)
9.03
(5.68-13.51)
7.7
(2.9-12.4)
5.81
(4.31-8.63)
5.31
(3.54-7.09)
4.21
(3.11-5.44)
Cilíndrico
Cilíndrico
TCM
(cm/dia)
Colônias
0.85
Teste de
patogenicidade
Orquídeas
Frutos
Branca
0.4-0.3
0.8-0.6
1.02
Cinza rosado com
bordas brancas
0.3-0.3
2.0-1.5
0.81
Branca
0.2-0.4
-
0.2-0.3
2.7-2.5
0.1-0.2
0.6-0.7
0.3-0.4
0.5-0.5
5.14
(4.0-6.36)
Cilíndrico
11.61
(6.40-19.62)
8.51
(4.32-11.81)
0.66
5.17
(2,04-6.26)
Cilíndrico
9.13
(4.69-15.23)
7.34
(3.97-11.05)
1.06
7.85
(6.89-8.93)
Cilíndrico
11.13
(7.84-22.09)
9.43
(6.71-13.72)
0.88
Branco a alaranjado
com bordas cinza e
brancas
Branco a alaranjado
com bordas cinza e
brancas
Branco a alaranjado
com bordas beges
47
605
606
607
608
609
610
611
612
613
614
615
616
617
618
619
620
621
622
623
624
Figura 1. Árvore filogenética de inferência Bayesiana do complexo Colletotrichum gloeosporioides baseada em
sequências concatenadas dos genes GAPDH, TUB2 e ITS. Valores de probabilidade posteriores Bayesianos
>0,60 são indicados nos nós. Colletotrichum boninense foi utilizado como grupo externo. Os isolados obtidos
neste estudo estão destacados em negrito. As culturas ex-tipo estão marcadas com um asterisco. A barra de
escala (0,02) representa substituições de nucleotídeos por sítio.
48
625
626
627
628
629
630
631
632
633
634
635
636
637
638
639
640
641
642
Figura 2. Árvore filogenética de inferência Bayesiana do complexo Colletotrichum boninense baseada em
sequências concatenadas dos genes GAPDH, TUB2 e ITS. Valores de probabilidade posteriores Bayesianos
>0,94 são indicados nos nós. Colletotrichum gloeosporioides foi utilizado como grupo externo. Os isolados
obtidos neste estudo estão destacados em negrito. As culturas ex-tipo estão marcadas com um asterisco. A barra
de escala (0,03) representa substituições de nucleotídeos por sítio.
49
643
644
645
646
647
648
649
650
651
652
653
654
655
656
657
658
659
660
661
662
663
664
665
666
667
668
669
670
671
672
673
674
675
676
677
678
679
680
681
682
683
684
685
686
687
688
689
690
691
692
693
694
695
696
697
698
699
700
701
702
Figura 3. Características morfoculturais das espécies de Colletotrichum: a. colônia, b. conídios e c. apressórios
de C. fructicola; d. colônia, e. conídios e f. apressórios de C. gloeosporioides; g e h. colônias, i. conídios e
apressórios de C. karstii; j. colônia, k. conídios e apressórios de C. orchidophilum; l e m. colônias, n. conídios e
o. apressórios de C. siamense; p e q. colônias, r. conídios e s. apressórios de C. tropicale.
a
c
b
a
d
g
j
e
f
h
i
k
50
703
704
705
706
707
708
709
710
711
712
713
714
715
716
717
718
719
720
721
722
723
724
725
726
727
728
729
730
731
732
733
734
735
736
737
738
739
740
741
742
743
744
745
746
747
748
749
750
751
752
753
754
755
756
757
758
759
760
761
l
m
o
n
p
q
r
s
51
762
763
764
765
766
Figura 4. Teste de patogenicidade em folhas de orquídeas: a. Colletotrichum gloeosporioides (COUFAL0213)
em Cattleya alba; b. C. karstii (COUFAL0220) em Oncidium sherry baby; c. C. siamense (COUFAL0223) em
Schomburgkia crispa; d. C. tropicale (COUFAL0205) em Ca. labiata; e. C. orchidophilum (COUFAL0219) em
Ca. labiata; f. C. fructicola (COUFAL0215) em Phalaeonopsis.
767
768
769
770
T
T
771
f
772
773
774
775
776
T
777
778
779
780
781
782
T
783
784
785
786
787
788
789
T
790
791
792
793
794
795
796
e
52
797
798
799
800
801
Figura 5. Teste de gama de hospedeiros em frutos de goiaba, mamão, manga e pera: a. Colletotrichum
gloeosporioides (COUFAL0213) em mamão; b. C. karstii (COUFAL0220) em mamão; c. C. siamense
(COUFAL0223) em pera; d. C. tropicale (COUFAL0205) em manga; e. C. fructicola (COUFAL0205) em
goiaba; f. Testemunha da goiaba.
802
803
804
805
806
a
b
c
d
e
f
807
808
809
810
811
812
813
814
815
816
817
818
819
820
821
822
823
824
825
826
827
828
829
830
831
53
832
833
834
835
836
837
838
839
840
841
842
843
844
845
846
847
CAPÍTULO 3
848
849
850
851
852
853
854
855
856
857
858
859
860
861
862
863
864
SENSIBILIDADE A FUNGICIDAS DE ESPÉCIES DE Colletotrichum EM ORQUÍDEAS
54
865
SENSIBILIDADE
866
ORQUÍDEAS
A
FUNGICIDAS
DE
ESPÉCIES
DE
Colletotrichum
EM
867
868
Janaíne Rossane Araújo Silva-Cabral1;
869
1
870
Largo, AL, 57100-000, Brasil, janaine_rossane@hotmail.com.
Centro de Ciências Agrárias, Universidade Federal de Alagoas, Br 104, Km 85 Norte, Rio
871
872
Resumo – A antracnose em orquídeas é causada por várias espécies do gênero
873
Colletotrichum. O desenvolvimento de estatrégias de controle mais eficientes para esta
874
doença deve levar em consideração os níveis de resistência apresentados pelas espécies de
875
Colletotrichum a fungicidas. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito de diferentes
876
fungicidas sobre o crescimento micelial de seis espécies de Colletotrichum obtidos de
877
orquídeas. Testes in vitro com os fungicidas tiofanato metílico, difenoconazole, tebuconazole
878
e azoxistrobina+difeconazole foram realizados pelo método de incorporação de fungicidas ao
879
meio de cultura BDA. Todos os fungicidas foram eficientes no controle in vitro das seis
880
espécies de Colletotrichum, mas a resposta de sensibilidade micelial das espécies variou de
881
acordo com o fungicida e a concentração. Tebuconazole e difenoconazole apresentaram-se
882
como os mais eficientes na inibição do crescimento micelial, enquanto que tiofanato metílico
883
foi o menos eficiente. A concentração de 10 µg/ml -1 do ingrediente ativo induziu os menores
884
índices de crescimento micelial para todos os fungicidas. As espécies de Colletotrichum
885
foram classificadas como alta e moderadamente sensíveis aos fungicidas baseado no cálculo
886
da EC50.
887
Palavras-chave: antracnose, benzimidazois, estrobilurinas, Orchidaceae, triazois.
888
889
Abstract - Anthracnose in orchids is caused by several species of the genus Colletotrichum.
890
The development of more efficient control strategies for this disease should take into account
891
the resistance levels presented by Colletotrichum species to fungicides. The objective of this
892
study was to evaluate the effect of different fungicides on mycelial growth of six
893
Colletotrichum species obtained from orchids. In vitro tests with the fungicides methyl
894
thiophanate, difenoconazole, tebuconazole and azoxitrobin+difeconazole were carried out by
895
the method of incorporation of fungicides into the BDA culture medium. All fungicides were
896
efficient in the in vitro control of the six Colletotrichum species, but the mycelial sensitivity
897
response of the species varied according to fungicide and concentration. Tebuconazole and
55
898
difenoconazole were the most efficient in inhibiting mycelial growth, whereas methyl
899
thiophanate was the least efficient. The concentration of 10 μg/ml-1 of the active ingredient
900
induced the lowest mycelial growth rates for all fungicides. Colletotrichum species were
901
classified as high and moderately sensitive to fungicides based on EC50 calculation.
902
Keywords: anthracnose, benzimidazoles, strobilurins, Orchidaceae, triazoles.
903
904
3.1 INTRODUÇÃO
905
906
A antracnose é uma das principais doenças fúngicas associadas a orquídeas no
907
mundo, ocorrendo principalmente nas regiões tropicais e subtropicais. O controle da doença
908
está baseado em medidas culturais, físicas e químicas aplicadas de maneira preventiva (Mafia
909
et al., 2005; Agrofit, 2018). Em caso de ataques severos, fungicidas sistêmicos são indicados
910
para o controle curativo. Somente os fungicidas mancozeb e oxicloreto de cobre são
911
recomendados para o controle químico das orquidáceas no Brasil (Agrofit, 2018). No entanto,
912
estudos com os fungicidas carbendazin, cimoxanil, iprodione, fenamidona e clorotalonil
913
mostraram resultados positivos no controle de isolados obtidos de orquídeas (Fengli et al.,
914
1990; Meera et al., 2016). Adicionalmente, os fungicidas tiofanato metílico, azoxistrobina,
915
difenoconazole e bitertanol são aplicados em casos severos da doença pela comunidade
916
orquidófila (Zanger, 2018).
917
Embora um número considerável de espécies do gênero Colletotrichum tenha sido
918
associado a antracnose em orquídeas em diferentes países do mundo, no Brasil, a doença foi
919
atribuída exclusivamente a C. gloeosporioides (Mafia et al., 2005; Oliveira et al., 2014; Farr;
920
Rossman, 2018; Damm et al., 2019). No entanto, um estudo filogenético multi-locus realizado
921
com isolados obtidos de orquídeas no Nordeste do Brasil revelou que seis espécies de
922
Colletotrichum (C. fructicola, C. gloeosporioidess.s., C. karstii, C. orchidophilum, C.
923
siamense e C. tropicale) são responsáveis por causar antracnose neste hospedeiro (dados não
924
publicados).
925
O conhecimento de espécies que ocorrem sobre um determinado hospedeiro e o
926
efeito de fungicidas é importante para auxiliar e direcionar a escolha dos ingredientes ativos
927
mais adequados para seu controle e otimizar o manejo da doença (Lima et al., 2015). O uso
928
intensivo e indiscriminado dos fungicidas aumenta o risco de resistência adquirida pelo
929
patógeno, assim como diminui a eficiência dos mesmos (Parreira et al., 2009; Prapagdee et al,
930
2012).
56
931
932
O objetivo deste estudo foi avaliar in vitro o efeito de fungicidas sobre o crescimento
micelial das seis espécies de Colletotrichum associadas a orquídeas no Nordeste do Brasil.
933
934
3.2 MATERIAL E MÉTODOS
935
936
3.2.1 Obtenção dos isolados fúngicos
937
938
Dez isolados representativos de seis espécies de Colletotrichum obtidos de orquídeas
939
no nordeste do Brasil foram adquiridos da Coleção de Culturas de Fungos Fitopatogênicos da
940
Universidade Federal de Alagoas (COUFAL) e utilizados nos experimentos (Tabela 1). Estes
941
isolados foram identificados por meio de análise filogenética multi-locus baseada em
942
Inferência Bayesiana utilizando a região do espaçador interno transcrito ribossomal (ITS) e as
943
sequências parciais dos genes gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH) e β-tubulina
944
(TUB2).
945
946
3.2.2 Teste de sensibilidade micelial das espécies de Colletotrichum a fungicidas
947
948
Para determinar a sensibilidade das seis espécies de Colletotrichum aos fungicidas
949
foi avaliado o crescimento micelial em meio de cultura suplementado com fungicida. As
950
formulações comerciais dos fungicidas tiofanato metílico (Cercobin 700 WP, 700 g kg-1 de
951
ingrediente ativo (i.a.), Iharabras, São Paulo, Brasil), difenoconazole (Score EC, 250 gl-1 i.a.,
952
Syngenta, São Paulo, Brasil), tebuconazole (Folicur 200EC, 200gl-1 i.a., BAYER, São Paulo,
953
Brasil) e azoxistrobina (Amistar 500 WG, 500 g kg-1i.a., Syngenta, São Paulo, Brasil) foram
954
utilizadas nos testes in vitro. Cada fungicida foi testado individualmente, com exceção de
955
azoxistrobina que foi testado juntamente com tebuconazole, pois estudos tem demonstrado a
956
baixa eficiência deste fungicida no controle in vitro de espécies de Colletotrichum quando
957
usado isoladamente (Lima et al., 2015; Oliveira, 2018). Os fungicidas foram dissolvidos em
958
dimetilsulfóxido (DMSO) e adicionados ao meio de cultura sintético de batata dextrose ágar
959
(BDA) fundente (45°C), para alcançar as concentrações de 0.5, 1.0, 5.0 e 10.0 μg/ml-1de i.a. A
960
concentração final do DMSO no meio de cultura foi de 0.1% (v/v).
961
Em seguida, 20 mL do meio BDA sintético suplementado com fungicida foram
962
vertidos em placas de Petri. Placas de Petri contendo BDA sintético sem fungicidas foram
963
utilizadas como testemunhas. Discos de micélio (5 mm diâmetro) de cada isolado foram
57
964
removidos da margem de colônias com 7 dias de crescimento em meio BDA e transferidos
965
para o centro das placas de Petri contendo meio BDA sintético suplementado com os
966
fungicidas. As placas foram incubadas a 25 °C no escuro durante 7 dias. O delineamento
967
experimental foi inteiramente casualizado, com 96 tratamentos e cinco repetições em arranjo
968
fatorial triplo (6 espécies-isolado x 4 fungicidas x 4 concentrações).
969
Diariamente, o crescimento micelial de cada colônia foi mensurado em dois sentidos
970
perpendiculares para se obter o índice de crescimento micelial (ICM). O ICM foi determinado
971
pela fórmula ICM=[(C1/N1)+(C2/N2)+...+(Cn/Nn)], sendo C1, C2 e Cn o crescimento
972
micelial do fungo na primeira, segunda e última avaliação, respectivamente; e N1, N2, Nn é o
973
número de dias após a inoculação. Os dados foram submetidos à análise de variância
974
(ANOVA) (p<0,05) pelo Teste de Tukey e, quando significativos, à análise de regressão
975
utilizando o programa ASSISTAT 7.6 beta (Santos; Silva, 2013).
976
A EC50, concentração de ingrediente ativo capaz de inibir 50% do crescimento
977
micelial, também foi calculada. Após o cálculo da EC50, as espécies de Colletotrichum foram
978
classificadas em quatro categorias de sensibilidade, de acordo com a escala de Edgington et
979
al. (1971), em que: EC50: <1 μg/ml-1: alta sensibilidade (AS); EC50: 1-10 μg/ml-1: moderada
980
sensibilidade (MS); EC50: >10-50 μg/ml-1: baixa sensibilidade (I); EC50: >50 μg/ml-1:
981
insensibilidade (I).
982
983
3.3 RESULTADOS
984
985
3.3.1 Avaliação da sensibilidade micelial das espécies de Colletotrichum a fungicidas
986
987
Os resultados da análise da variância dos dados de índice de crescimento micelial
988
(ICM) indicaram que existe diferença significativa entre as interações dos três fatores:
989
fungicidas, concentrações e espécies de Colletotrichum.
990
Todos os fungicidas foram eficientes no controle in vitro das seis espécies de
991
Colletotrichum quando comparados à testemunha, com ICM’s: 6.99 cm (C. tropicale), 7.76
992
cm (C. siamense), 8.03 cm (C. fructicola), 6.93 cm (C. karstii), 7.40 (C. gloeosporioides) e
993
6.59 (C. orchidophilum), no entanto, induziram diferentes níveis de controle sobre as mesmas.
994
Os quatro fungicidas diferiram significativamente entre si para as espécies C. siamense, C.
995
gloeosporioides e C. karstii, enquanto que difenoconazole e tebuconazole não diferiram entre
58
996
si para C. fructicola e C. orchidophilum, sendo os mais eficientes no controle destas espécies
997
(Figura 1).
998
Difenoconazole e tebuconazole foram os mais eficientes no controle de todas as
999
espécies, porém, difenoconazole diferiu significativamente dos demais fungicidas para as
1000
espécies C. siamense, C. gloeosporioides e C. tropicale, induzindo as menores médias de
1001
ICM (2.58, 1.69 e 1.89, respectivamente) e tebuconazole para C. karstii, com ICM de 1.71
1002
cm. Para todas as espécies o fungicida tiofanato metílico foi o menos eficiente na inibição do
1003
crescimento
1004
estatisticamente de tiofanato metílico apenas para a espécie C. tropicale.
micelial,
seguido
por
azoxistrobina+tebuconazole
que
não
diferiu
1005
A espécie C. siamense apresentou as maiores médias de ICM (2.58 – 4.33 cm),
1006
diferindo significativamente das demais espécies para todos os fungicidas. Colletotrichum
1007
orchidophilum foi a espécie com maior inibição micelial para os fungicidas difenoconazole e
1008
tebuconazole, seguida por C. karstii para os fungicidas azoxistrobina+tebuconazole e
1009
tiofanato metílico. No entanto, C. karstii não diferiu de C. gloeosporioides para tiofanato
1010
metílico, que por sua vez não diferiu de C. fructicola.
1011
A interação entre fungicidas e concentrações evidenciou uma relação inversamente
1012
proporcional entre as médias de ICM e as concentrações, onde a medida que a concentração
1013
aumentava, diminuía-se o ICM. Assim, todos os fungicidas foram mais eficientes no controle
1014
in vitro das espécies de Colletotrichum na concentração de 10.0 µg/ml-1 do ingrediente ativo.
1015
As concentrações, 0.5 e 1.0 µg/ml-1 foram as que mais induziram variabilidade na
1016
sensibilidade micelial das espécies para todos os fungicidas. Na concentração 5.0 µg/ml-1 não
1017
houve diferença estatística significativa entre os fungicidas difenoconazole e tebuconazole,
1018
que foram mais eficientes no controle das espécies nesta concentração, apresentando uma
1019
média de ICM de 1.58 e 1.49 cm, respectivamente. Estes mesmos fungicidas diferiram
1020
estatisticamente dos fungicidas tiofanato metílico e azoxistrobina+tebuconazole, que por sua
1021
vez não diferiram entre si. Na concentração 10.0µg/ml-1 os fungicidas foram mais
1022
homogêneos no controle das espécies, com exceção de azoxistrobina+tebuconazole que foi
1023
menos eficiente na redução do ICM (Figura 2).
1024
A interação dos três fatores confirmou o mesmo padrão observado anteriormente,
1025
onde os menores ICM’s foram encontrados na concentração de 10.0 µg/ml-1 e os maiores
1026
ICM’s na concentração de 0.5 µg/ml-1 para todos os fungicidas. Adicionalmente, a resposta de
1027
sensibilidade micelial variou de acordo com o fungicida, a concentração e a espécie de
1028
Colletotrichum (Tabela 2). A espécie C. siamense apresentou os maiores valores de ICM para
59
1029
todos os fungicidas e concentrações, diferindo significativamente de todas as
demais
-1
1030
espécies, exceto de C. orchidophilum e C. tropicale na concentração 10.0 µg/ml de tiofanato
1031
metílico e C. tropicale nas concentrações 0.5, 1.0, 5.0 e
1032
azoxistrobina+tebuconazole. Apenas na concentração 5.0 µg/ml-1 de tiofanato metílico, a
1033
espécie C. orchidophilum apresentou ICM maior (3.19 cm) que as demais espécies. Os
1034
menores ICM (1.70 e 1.65 cm) da espécie C. siamense foram induzidos pelos fungicidas
1035
tebuconazole e tiofanato metílico, respectivamente, na concentração de 10 µg/ml-1.
10.0 µg/ml-1
em
1036
Colletotrichum orchidophilum apresentou valores de ICM menor que as demais
1037
espécies nas concentrações 0.5 e 1.0 µg/ml-1 para os fungicidas difenoconazole e
1038
tebuconazole. O mesmo comportamento foi observado na espécie C. karstii para os fungicidas
1039
azoxistrobina+tebuconazole nas mesmas concentrações e tiofanato metílico na concentração
1040
0.5 µg/ml-1. O melhor controle para C. orchidophilum ocorreu a 10.0 µg/ml-1 com os
1041
fungicidas tebuconazole e difenoconazole, que induziram a inibição total do crescimento
1042
micelial. Já para C. karstii o melhor controle ocorreu na concentração 5.0 e 10.0 µg/ml-1 de
1043
tebuconazole e 10.0 µg/ml-1 de tiofanato metílico.
1044
Na concentração mais efetiva do ingrediente ativo (10.0 µg/ml-1) no controle das
1045
espécies de Colletotrichum, os menores valores de ICM para a espécie C. tropicale foram
1046
encontrados nos fungicidas difenoconazole (1.32 cm) e tebuconazole (1.34 cm). Para a
1047
espécie
1048
azoxistrobina+tebuconazole (1.39 cm), tebuconazole (1.32 cm) e tiofanato metílico (1.31 cm)
1049
na mesma concentração e em difenoconazole (1.35 e 1.30 cm) nas concentrações de 5.0 e 10.0
1050
µg/ml-1.
C.
fructicola,
os
menores
valores
de
ICM
foram
obtidos
com
1051
Colletotrichum gloeosporioides obteve menores valores de ICM com difenoconazole
1052
(1.37 cm) na concentração de 10.0 µg/ml-1, tebuconazole (1.31 e 1.30 cm) e tiofanato metílico
1053
(1.30 cm) nas concentrações de 5.0 e 10.0 µg/ml-1. Nas concentrações 5.0 e 10.0 µg/ml-1 do
1054
fungicida tebuconazole, as espécies não diferiram entre si estatisticamente, onde apenas C.
1055
siamense diferiu significativamente das demais espécies. O mesmo comportamento foi
1056
observado na concentração 5.0 µg/ml-1 de azoxistobina+tebuconazole, onde C. siamense e
1057
C.tropicale diferiram das demais espécies, mas não diferiram entre si.
1058
Todas as espécies foram classificadas como altamente sensíveis (AS) aos fungicidas
1059
difenoconazole e tebuconazole, apresentando EC50 <1 µg/ml-1, variando de 0.000 a 0.885
1060
µg/ml-1 (Tabela 3). Moderada sensibilidade foi observada nas espécies C orchidophilum e C.
60
1061
siamense ao fungicida tiofanato metílico, e em C. tropicale aos fungicidas tiofanato metílico e
1062
azoxistrobina+tebuconazole, com EC50 entre 1,203 e 3,777 µg/ml -1.
1063
1064
3.4 DISCUSSÃO
1065
1066
Os resultados obtidos neste estudo demonstraram que as espécies de Colletotrichum
1067
oriundas de orquídeas no Nordeste do Brasil exibem diferentes respostas em relação a
1068
fungicidas. O fungicida azoxistrobina+tebuconazole seria mais efeciente no controle da
1069
antracnose se o agente causal fosse a espécie C. karstii e menos efetivo se a espécie fosse C.
1070
siamense. Este comportamento tem sido observado em estudos realizados com as espécies C.
1071
asianum, C. fioriniae, C. fructicola, C. karstii, C. nymphaeae, C. siamense, C. tropicale e C.
1072
truncatum obtidas de manga e pêssego no Brasil e EUA, onde os autores sugerem que a
1073
escolha do fungicida adequado para um controle efetivo da antracnose deve levar em
1074
consideração a espécie prevalente na área. É importante considerar também a aplicação de
1075
fungicidas em mistura, uma vez que, em condições de campo, mais de uma espécie está
1076
associada a doença (Lima et al., 2015; Chen et al., 2016).
1077
Esta variabilidade na sensibilidade pode ser observada até mesmo em isolados
1078
diferentes de uma mesma espécie como relatado por Lopes et al. (2015) e Ferreira et al.
1079
(2009) para a espécie C. gloeosporioides obtida de café (Coffea arabica L.), pera, caqui
1080
(Diospyrus kaki L.), soja (Glycine max (L.) Merr.), iuca (Yucca sp. L.), mandioca (Manihot
1081
esculenta Crantz.), antúrio (Anthurium andraeanum Linden.), dracena (Dracaena sp. L.), uva
1082
(Vitis vinifera L.) e tomate (Solanum lycopersicum L.) e por Gao et al. (2017) para C.
1083
acutatum obtida de pimenta (Capsicum sp. L.).
1084
Em seu estudo, Lopes et al. (2015) observaram que os isolados de caqui e iuca
1085
foram mais sensíveis aos fungicidas aplicados quando comparados com isolados obtidos de
1086
culturas com maior expressão econômica, como a soja. Segundo os autores este
1087
comportamento deve-se a menor pressão de seleção sobre populações resistentes de
1088
Colletotrichum, dado a menor quantidade de moléculas químicas registradas e de uso para
1089
controle da antracnose nestas culturas. Esta hipótese parece se aplicar aos isolados de
1090
Colletotrichum obtidos de orquídeas, que embora variaram na resposta aos fungicidas foram
1091
considerados alta e moderamente sensíveis pelo cálculo da EC50, provavelmente pelo fato de
1092
terem sido obtidos de coleções particulares onde aplicações de fungicidas são escassas ou
1093
nulas.
61
1094
Além da sensibilidade das espécies, as características dos fungicidas e seu modo de
1095
ação devem ser considerados. De modo geral, os fungicidas sistêmicos são mais eficientes que
1096
fungicidas protetores, ainda assim devem ser bem selecionados pois apresentam maiores
1097
chances de promover resistência devido sua especificidade (Amorim; Rezende; Bergamin
1098
Filho, 2011). Os principais fungicidas sistêmicos utilizados e avaliados no controle da
1099
antracnose em orquídeas pertencem aos seguintes grupos: Benzimidazois (tiofanato metílico e
1100
carbendazim); Inibidores da quinona oxidase - QoI (azoxistrobina, fenamidona); Inibidores de
1101
biossintese de esterois (bitertanol, difenoconazole e tebuconazole); Inibidores de oomicetos
1102
(cimoxanil) e Dicarboximidas (iprodione) (Fengli et al., 1990; Meera et al., 2016; Zanger,
1103
2018).
1104
Dentre estes fungicidas, os benzimidazois são os que apresentam alto risco de falhas,
1105
enquanto que os triazois apresentam baixo risco (Amorim; Rezende; Bergamin Filho, 2011).
1106
O fungicida tiofanato metílico foi o menos eficiente no controle das espécies de
1107
Colletotrichum neste estudo, principalmente para as espécies C. siamense e C. orchidophilum.
1108
Resultados semelhantes foram relatados por Lopes et al. (2015) para a espécie C.
1109
gloeosporioides, que apresentou valores altos de ICM na presença de tiofanato metílico, como
1110
também por Tavares; Souza (2005) que indicaram resistência cruzada para os isolados desta
1111
mesma espécie devido ao uso contínuo dos fungicidas tiofanato metílico e thiabendazol pelos
1112
produtores.
1113
Já os fungicidas do grupo químico dos triazois (difeconazole e tebuconazole) foram
1114
os mais eficientes na inibição do crescimento micelial in vitro das espécies avaliadas. A
1115
eficiência de fungicidas do grupo químico dos triazóis na inibição do crescimento micelial in
1116
vitro de Colletotrichum tem sido comprovada em outros estudos: testes com difeconazole
1117
induziram valores de EC50 abaixo de 1 µg/mL para C. acutatum (Gao et al., 2017); o
1118
crescimento micelial de C. gloeosporioides do mamão foi inibido em 100% a partir da
1119
concentração 10ppm dos fungicidas propiconazole e tebuconazole, sendo considerados
1120
altamente eficientes no controle desta espécie (Tavares; Souza, 2005); e dentre seis
1121
fungicidas do grupo químico dos triazóis testados sobre as espécies C. siamense, C.
1122
fructicola, C. fioriniae, C. nymphaeae e C. truncatum obtidas de pêssego, os fungicidas
1123
propiconazole e difeconazole apresentaram melhor eficiência no controle das mesmas, como
1124
também tebuconazole e metconazole, exceto para C. truncatum (Chen et al., 2016).
1125
A mistura de azoxistrobina+tebuconazole apresentou os maiores valores de ICM para
1126
todas as espécies depois de tiofanato metílico, exceto para espécie C. karstii. Provavelmente,
62
1127
esta eficiência sobre a espécie C. karstii seja atribuída ao fungicida tebuconazole, que
1128
diferente do observado para as outras espécies testadas, foi mais eficiente que o fungicida
1129
difeconazole. O fungicida azoxistrobina pertence ao grupo químico das estrobilurinas e desde
1130
seu lançamento no mercado foi amplamente utilizado por apresentar um amplo espectro de
1131
ação, atuando sobre vários patógenos, e por seus efeitos positivos na produtividade de
1132
algumas culturas, levando ao surgimento de muitos patógenos fúngicos resitentes. Estudos
1133
evidenciaram que mecanismos bioquímicos e genéticos estão envolvidos na resistência de
1134
fungos a fungicidas inibidores de quinona, como: alterações nos mecanismos de respiração
1135
dos fungos e a troca de aminoácidos, sendo a mutação no sítio G143A do citocromo-b a causa
1136
mais comum de resistência (Parreira; Neves; Zambolim, 2009; Amorim; Rezende; Bergamin
1137
Filho, 2011).
1138
Embora uma grande parte dos defensivos consumidos no mundo em diferentes
1139
culturas sejam de produtos formulados em misturas de estrobilurinas com triazois, neste
1140
trabalho a mistura de azoxistrobina+tebuconazole não pareceu otimizar a eficiência dos
1141
fungicidas contra a maioria das espécies testadas. A baixa eficiência de azoxistrobina no
1142
controle de espécis de Colletotrichum foi também demonstrada por Oliveira (2018) e Lima et
1143
al. (2015), onde azoxistrobina apresentou os menores valores de % de inibição micelial para a
1144
maioria das espécies, corroborando com nossos resultados e levantando indícios de uma
1145
resistência adquirida pelo patógeno para este fungicida. No entanto, C. karstii foi
1146
satisfatoriamente inibido por azoxistrobina no estudo de Oliveira (2018), reforçando a
1147
necessidade de se conhecer as espécies presentes em uma determinada área e suas interaçãos
1148
com os fungicidas para auxiliar na tomada de decisão.
1149
Segundo os resultados de Hu et al. (2015), onde avaliaram a resistência de isolados
1150
de C. siamense e C. fructicola obtidos de pêssego, morango (Fragaria vesca L.) e mirtilo
1151
(Vaccinium myrtillus L.) para azoxistrobina e tiofanato metilíco, C. fructicola foi sensível a
1152
ambos os fungicidas, enquanto que C. siamense apresentou isolados com diferentes níveis de
1153
resistência. Neste trabalho, as espécies C. siamense e C. tropicale apresetaram moderada
1154
sensibilidade a fungicidas. Estas espécies são frequentemente relatadas em culturas de
1155
importância econômica no nordeste do Brasil (LIMA et al., 2013; SILVA et al., 2017;
1156
SOUSA et al. 2018; VELOSO et al. 2018; VIEIRA et al., 2017), nas quais aplicações de
1157
fungicidas são utilizadas para o controle da antracnose. Isto sugere que a aplicação destes
1158
fungicidas em campo esteja favorecendo o estabelecimento de isolados resitentes destas
1159
espécies devido uma constante pressão de seleção.
63
1160
Ainda sobre a insensibilidade das espécies de Colletorichum a azoxistrobina, estudos
1161
apontam que esta resistência se deve pela alteração na rota de respiração do fungo, uma vez
1162
que após a adição do ácido salicilhidroxâmico (SHAM), conhecido como inibidor da enzima
1163
oxidase alternativa, o controle in vitro das espécies torna-se efetivo. Segundo os resultados de
1164
Oliveira (2018), onde avaliou os efeitos de azoxistrobina com e sem adição de SHAM sobre
1165
espécies de Colletotrichum de pinha e graiola, os tratamentos com adição de SHAM foram
1166
altamente eficientes no controle de todas as espécies testadas. Adicionamelnte, Gao et al.
1167
(2017) ao avaliar o efeito dos fungicidas picoxistrobina, piraclostrobina, azoxistrobina,
1168
difenoconazole, tiofanato metílico e mancozeb no controle de C. acutatum em pimenta,
1169
mostraram que os fungicidas do grupo das estrobilurinas, piraclostrobina e azoxistrobina, com
1170
adição de SHAM, foram mais eficientes na inibição do crescimento micelial e a germinação
1171
de conídios dos isolados, do que os fungicidas do grupo dos triazois.
1172
O uso destes fungicidas em programas de manejo da doença antracnose em orquídeas
1173
poderá ser recomendado, porém mais estudos devem ser realizados. Contudo, o presente
1174
estudo aponta para importância de observar as espécies prevalentes na área, o efeitos dos
1175
fungicidas sobre elas, as alterações de sensibilidade dos isolados no campo, a dose do produto
1176
recomendada e a aplicação alternada ou em mistura de fungicidas com diferentes modos de
1177
ação no controle da doença, sem esquecer do uso de técnicas integradas de manejo para evitar
1178
o desenvolvimento de resistência e garantir um controle mais efetivo (Parreira; Neves;
1179
Zambolim, 2009; Gao et al., 2017).
1180
1181
3.5 CONCLUSÕES
1182
1183
Os fungicidas azoxistrobina+ tebuconazole, difenoconazole, tebuconazole e tiofanato
1184
metílico são eficientes no controle in vitro das seis espécies de Colletotrichum associadas à
1185
antracnose em orquídeas.
1186
1187
1188
1189
A sensibilidade micelial de Colletotrichum spp. difere em relação ao ingrediente
ativo e suas concentrações.
Difenoconazole e tebuconazole são os fungicidas mais eficientes no controle das
espécies de Colletotrichum.
1190
As espécies são altamente sensíveis a todos os fungicidas, exceto C. siamense, C.
1191
tropicale e C. orchidophilum que são moderadamente sensíveis ao fungicida tiofanato
1192
metílico e C. tropicale ao fungicida Azoxistrobina+Tebuconazole.
64
1193
AGRADECIMENTOS
1194
1195
O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal
1196
de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001. Agradecemos também à
1197
Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Alagoas - FAPEAL.
1198
1199
REFERÊNCIAS
1200
1201
1202
1203
1204
AGROFIT/MAPA - SISTEMA DE AGROTÓXICOS FITOSSANITÁRIOS – Disponível em:
<http://agrofit.agricultura.gov.br/agrofit_cons/principal_agrofit_cons>. Acesso em: 15 jun.
2018.
1205
1206
1207
AMORIM, L.; REZENDE, J. A. M.; BERGAMIN FILHO, A. Manual de Fitopatologia:
Princípios e Conceitos. 4 ed. v.1. Piracicaba: Agronômica Ceres, 2011. 704p.
1208
1209
1210
1211
CHEN, S. N. et al. Sensitivy of Colletotrichum species, including C. fioriniae and C.
nymphaeae, from Peach to demethylation inhibitor fungicides. Plant Disease, v. 100, n. 12, p.
2434-2441, 2016.
1212
1213
1214
1215
1216
1217
DAMM, U. et al. The Colletotrichum dracaenophilum, C. magnum and C. orchidearum
species complexes. Studies in Mycology, v.92, p. 1-46, mar. 2019.
FARR D.F.; ROSSMAN A.Y. Fungal Databases, U.S. National Fungus Collections, ARS,
USDA. Disponível em: <https://nt.ars-grin.gov/fungaldatabases/>. Acesso em: 15 de Ago.
2018.
1218
1219
1220
FENGLI, J. et al. Disease Occurrence and Chemical Control of Orchid Anthracnose. Journal
of Zhejiang Forestry College, n. 1, p. 43-48, 1990.
1221
1222
1223
1224
FERREIRA, J. B. et al. Sensibilidade de Colletotrichum gloeosporioides (mancha manteigosa
do cafeeiro) a diferentes concentrações de fungicidas. Ciência e Agrotecnologia, v. 33, p.
2052-2058, 2009.
1225
1226
1227
1228
1229
1230
GAO, Y.Y. et al. Sensitivity of Colletotrichum acutatum to six fungicides and reduction in
incidence and severity of chili anthracnose using pyraclostrobin. Australasian Plant
Pathology, v. 46, n. 6, p. 521–528, 2017.
HU, M.J. et al. Resistance in Colletotrichum siamense from peach and blueberry to
tiophanate-methyl and azoxistrobin. Plant Disease, v. 99, n. 6, p. 806-814, 2015.
65
1231
1232
1233
1234
LIMA, N. B. et al. Comparative epidemiology of Colletotrichum species from mango in
northeastern Brazil. European Journal of Plant Pathology, v. 141, n. 4, p. 679-688, apr.
2015.
1235
1236
1237
LIMA, N.B. et al. Five Colletotrichum species are responsible for mangoanthracnose in
northeastern Brazil. Fungal Diversity, v.61, n. 1, p. 75–88, jul. 2013.
1238
1239
1240
LOPES, L. N. da S. et al. Sensibilidade de isolados de Colletotrichum gloeosporioides a
fungicidas. Multi-Science Journal, v. 1, n. 1, p. 106-114, 2015.
1241
1242
1243
MAFIA, R. G. et al. Antracnose em Paphiopedilum insigne (Orquidaceae) causada por
Colletotrichum gloeosporioides. Fitopatologia Brasileira, v. 30, n. 4, p. 436, jul-aug. 2005.
1244
1245
1246
1247
MEERA, T. M.;LOUIS, V.; BEENA, S. Diseases of Phalaenopsis: Symptoms, Etiology and
Management. International Journal of Agriculture Innovations and Research, v. 5, n. 2,
p. 296-300, nov. 2016.
1248
1249
1250
1251
OLIVEIRA, S. F. et al. Endophytic and mycorrhizal fungi associated with roots of
endangered native orchids from the Atlantic Forest, Brazil. Mycorrhiza, v. 24, n. 1, p. 55-64,
jan. 2014.
1252
1253
1254
1255
1256
OLIVEIRA, M. E. F. de S. Sensibilidade de espécies de Colletotrichum a fungicidas e
influência de períodos de permanência em câmara úmida sobre a severidade da antracnose em
anonáceas. Tese (Pós-Graduação em Proteção de Plantas) – Universidade Federal de Alagoas,
Rio Largo, AL, 2018.
1257
1258
1259
1260
PARREIRA, D. F.; NEVES, W. DOS S.; ZAMBOLIM, L. Resistência de Fungos a
Fungicidas Inibidores de Quinona. Revista Trópica: Ciências Agrárias e Biológicas,
v. 3, n. 2, p. 24, 2009.
1261
1262
1263
1264
PRAPAGDEE, B. et al. Efficacy of crude extract of antifungal compounds produced from
Bacillus subtilis on prevention of anthracnose disease in Dendrobium orchid. Environment
Asia, v.5, n. 1, p. 32-38, jan. 2012.
1265
1266
1267
SANTOS e SILVA, F. A. ASSISTAT 7.6 beta (pt). Departamento de Engenharia Agrícola do
CTRN – UFCG, Campina Grande, 2013.
1268
1269
1270
SILVA, J. R. A. et al. Molecular and morpho-cultural characterization of Colletotrichum spp.
associated with anthracnose on Capsicum spp. in northeastern Brazil. Tropical Plant
Pathology, v. 42, n. 4, p. 315-319, aug. 2017.
66
1271
1272
1273
1274
SOUSA, E. S. et al. Colletotrichum species causing anthracnose on lima bean in
Brazil.Tropical Plant Pathology, v. 43, n.1, p. 78-84, 2018.
1275
1276
1277
1278
TAVARES, G. M.; SOUZA, P. E. Efeito de fungicidas no controle in vitro de Colletotrichum
gloeosporioides, agente etiológico da antracnose do mamoeiro (Carica papaya L.). Ciência e
Agrotecnologia, v. 29, n. 1, p. 52-59, 2005.
1279
1280
1281
VELOSO, J. S. et al. Why species delimitation matters forfungal ecology: Colletotrichum
diversity on wild and cultivated cashew in Brazil. Fungal Biology, v. 122, p. 677-691, 2018.
1282
1283
1284
VIEIRA, W.A. et al. The impact of phenotypic and molecular data on the inference of
Colletotrichum diversity associated with Musa. Mycologia, v. 109, n. 6, p. 912-934, 2017.
1285
1286
ZAGER, M.Fungos e Bactérias nas Orquídeas. 2018. Disponível em:
<https://www.portaldoorquidofilo.com/fungos-e-bacterias> Acesso em: 12 de ago. 2018.
67
1287
1288
1289
1290
1291
1292
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1297
1298
1299
1300
1301
Tabela 1. Isolados de Colletotrichum obtidos de orquídeas no Nordeste do Brasil.
Código do isolado
Espécies
Localização
COUFAL0223
COUFAL0209
COUFAL0205
COUFAL0217
COUFAL0225
COUFAL0215
COUFAL0213
COUFAL0220
COUFAL0221
COUFAL0219
Colletotrichum siamense
C. siamense
Colletotrichum tropicale
C. tropicale
Colletotrichum fructicola
C. fructicola
Colletotrichum gloeosporioides
Colletotrichum karstii
C. karstii
Colletotrichum orchidophilum
Bezerros – PE
Maceió – AL
Maceió – AL
Maceió – AL
Maceió – AL
Maceió – AL
Maceió – AL
Paulo Afonso – BA
Maceió – AL
Maceió – AL
68
1302
1303
1304
Figura 1. Relação de interação entre os fungicidas azoxistrobina+tebuconazole, difenoconazole, tebuconazole e tiofanato metílico sobre as espécies de Colletotrichum
associadas a orquídeas.
9,00
1305
1306
1308
1309
1310
1311
1312
1313
8,00
Índice de Crescimento Micelial (cm)
1307
dA
dA
6,00
5,00
4,00
3,00
aB
aC
aD
bB
cB
bB
aE
cD bC
2,00
1,00
1315
0,00
1317
bcA
cdA
7,00
1314
1316
aA
abA
C. siamense
C. tropicale
Azoxistrobina+Tebuconazole
eC
cdD
cdD
dB
C. fructicola
Difenoconazole
deB
dC
dE
cD
C. gloeosporioides
Tebuconazole
fD bC
eB
cC
dE
C. karstii
Tiofanato Metílico
eD eD
C. orchidophilum
Testemunha
1318
1319
1320
1321
1322
1323
1324
Médias seguidas pelas letras minúsculas iguais não diferem entre si para as diferentes espécies de Colletotrichum sob um mesmo fungicida, e letras maiúsculas iguais não
diferem entre si para a mesma espécie de Colletotrichum sob os diferentes fungicidas pelo teste Tukey ao nível de 5% de probabilidade.
69
1325
1326
Figura 2. Relação de interação entre os fungicidas azoxistrobina+tebuconazole, difenoconazole, tebuconazole e tiofanato metílico e as concentrações testadas.
1327
1328
1330
1331
1332
1333
1334
1335
1336
1337
1338
1339
1340
1341
1342
1343
1344
1345
1346
5,00
Índice de Crescimento Micelial (cm)
1329
a
6,00
4,00
3,00
a
b
d
c
b
d
c
2,00
a
b
a
b
a
b
b
b
1,00
0,00
0,5 µg/ml
Azoxistrobina+Tebuconazole
1 µg/ml
Difenoconazole
5 µg/ml
10 µg/ml
Tebuconazole
Tiofanato Metílico
Médias seguidas das mesmas letras não diferem estatisticamente pelo teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade.
70
1347
1348
1349
Tabela 2. Efeitos das diferentes concentrações dos fungicidas azoxistrobina+tebuconazole, difenoconazole, tebuconazole e tiofanato metílico sobre o índice de crescimento
micelial (cm) das espécies de Colletotrichum obtidas de orquídeas.
Espécies
C. siamense
C. tropicale
C. fructicola
C. gloeosporioides
C. karstii
C. orchidophilum
0.5 µg/mL
-1
4.40a
4.21a
3.13c
3.24c
2.51d
3.78b
Azoxistrobina+Tebuconazole
1.0 µg/mL-1
5.0 µg/mL-1
10.0 µg/mL-1
3.71a
3.63a
2.37c
2.48c
2.02d
3.09b
2.53a
2.35a
1.50b
1.79b
1.62b
1.57b
1.99a
1.80ab
1.39c
1.58bc
1.37c
1.34c
0.5 µg/mL
-1
3.50a
2.54bc
2.40cd
2.22d
2.79b
1.85e
Difenoconazole
1.0 µg/mL-1
5.0 µg/mL-1
2.96a
2.16b
1.99bc
1.74cd
2.19b
1.55d
2.07a
1.54bc
1.35c
1.43c
1.74b
1.35c
10.0 µg/mL-1
1.81a
1.32bc
1.30c
1.37bc
1.61ab
1.30c
1350
1351
Espécies
C. siamense
C. tropicale
C. fructicola
C. gloeosporioides
C. karstii
C. orchidophilum
Tebuconazole
0.5 µg/mL
4.42a
3.52b
2.64c
2.85c
2.29d
1.79e
-1
1.0 µg/mL
3.74a
2.61b
1.99c
2.15c
1.94c
1.54d
-1
5.0 µg/mL
2.04a
1.52b
1.44b
1.31b
1.30b
1.33b
Tiofanato Metílico
-1
10.0 µg/mL
1.70a
1.34b
1.32b
1.30b
1.30b
1.30b
-1
0.5 µg/mL
7.29a
4.84c
4.95c
4.72c
3.73d
6.13b
-1
1.0 µg/mL-1
5.0 µg/mL-1
10.0 µg/mL-1
6.18a
3.59c
2.02e
2.53d
2.80d
5.46b
2.21b
1.58cd
1.68c
1.30d
1.43cd
3.19a
1.65a
1.50ab
1.31b
1.30b
1.31b
1.55ab
CV%
1352
1353
1354
1355
1356
1357
1358
1359
1360
Médias seguidas das mesmas letras na coluna não diferem estatisticamente pelo teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade.
7.01
71
1361
Tabela 3. Classificação da sensibilidade das espécies de Colletotrichum em relação aos fungicidas baseada nos valores da EC50.
Espécies
1362
1363
Azoxistrobina+Tebuconazole
EC50 (μg/ml-1)
Difenoconazole
Tebuconazole
Tiofanato Metílico
Sensibilidade
C. siamense
0.885
0.217
0.855
2.800*
AS/MS*
C. tropicale
1.203*
0.041
0.393
1.301*
AS/MS*
C. fructicola
0.079
0.005
0.013
0.479
AS
C. gloeosporioides
0.148
0.001
0.070
0.694
AS
C. karstii
0.023
0.052
0.014
0.549
AS
C. orchidophilum
0.816
0.002
0.000
3.777*
AS/MS*
Classificação em função da EC50, onde EC50 <1μg/ml-1: alta sensibilidade (AS); EC50= 1-10μg/ml-1 : moderada sensibilidade (MS); EC50= >10-50μg/ml-1: baixa
sensibilidade (BS); EC50= >50mg/ ml-1: insensibilidade (IS).
