Construção e caracterização de clones infecciosos dos Begomovírus Bean golden mosaic virus E Macroptilium yellow spot virus
Tese - Mayra Ferro.pdf
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE ALAGOAS
CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM
PROTEÇÃO DE PLANTAS
MAYRA MACHADO DE MEDEIROS FERRO
CONSTRUÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE CLONES INFECCIOSOS DOS
BEGOMOVÍRUS Bean golden mosaic virus E Macroptilium yellow spot virus
Rio Largo - AL
2019
MAYRA MACHADO DE MEDEIROS FERRO
CONSTRUÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE CLONES INFECCIOSOS DOS
BEGOMOVÍRUS Bean golden mosaic virus E Macroptilium yellow spot virus
Tese de Doutorado apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Proteção de Plantas do Centro
de Ciências Agrárias da Universidade Federal de
Alagoas como requisito parcial para obtenção do
grau de Doutora em Proteção de Plantas.
Orientadora: Prof. Dra. Iraildes Pereira Assunção
Coorientador: Dr. Roberto Ramos Sobrinho
Coorientador: Prof. Dr. Tatsuya Nagata
Rio Largo - AL
2019
AGRADECIMENTOS
A Deus, acima de tudo, por sempre me guiar em todos os momentos da minha trajetória e por
dar-me coragem para enfrentar todos os desafios;
Aos meus queridos pais, Benedito Ferro e Rosangela Ferro, pelo amor, incentivo e apoio em
todas as horas;
Aos meus irmãos Mayara Ferro e Madson Ferro por sempre estarem ao meu lado;
A todos familiares e amigos que contribuíram para meu crescimento;
Aos professores Drs. Iraildes Assunção e Gaus Silvestre pela oportunidade, confiança,
orientação, indentivos, paciência, pelo apoio durante toda minha jornada desde a graduação,
ensinamentos que foram fundamentais para minha formação. Serei sempre grata;
Ao Dr. Roberto Ramos pela amizade, pelos ensinamentos, orientação, por sempre acreditar na
minha capacidade, paciência e apoio durante minha trajetória no mestrado e doutorado. Serei
sempre grata;
Ao professor Dr. Tatsuya Nagata pelo acolhimento, oportunidade, ensinamentos, orientação,
pela paciência nas discussões, compreensão nas horas de dificuldade e pelo exemplo de
profissionalismo. Serei sempre grata;
A Dra. Sarah Cavalcanti pela amizade, confiança depositada em mim, apoio de sempre e pelos
ensinamentos. Serei sempre grata;
A todos os companheiros que fazem ou fizeram parte do Laboratório de Fitopatologia
Molecular e Virologia Vegetal pela amizade, ajuda mútua e ensinamentos durante todo esse
período;
A todos os companheiros do Departamento de Biologia Celular – UnB, pela receptividade, pela
amizade, ensinamentos, risos diários, amei conhecê-los;
A todos os professores do Programa de Pós-graduação em Proteção de Plantas CECA-UFAL
pelos conhecimentos passados, que contribuíram para a minha formação;
A todos os meus colegas do Programa de Pós-graduação em Proteção de Plantas do CECAUFAL;
À CAPES pela bolsa de doutorado concedida, o que me permitiu adquirir inúmeros
conhecimentos incluindo os fundamentais para a realização desse trabalho;
A todos aqueles que de alguma forma contribuíram para a realização deste trabalho.
Obrigada!
RESUMO GERAL
Os feijoeiros (Phaseolus spp.) são de grande importância socioeconômica em regiões tropicais
e subtropicais e estão entre os itens mais tradicionais da culinária brasileira, apresentando notável valor
nutricional. O gênero Begomovirus (família Geminiviridae) está entre o grupo de patógenos mais
prejudiciais que infectam essas culturas, sendo considerado fator limitante em áreas produtoras.
Os begomovírus possuem DNA circular de fita simples, são transmitidos por um complexo de
espécies crípticas da mosca-branca Bemisia tabaci, com hospedeiros não-cultivados atuando
como reservatórios desses vírus. Bean golden mosaic virus (BGMV) e Macroptilium yellow
spot virus (MaYSV) são as duas espécies de maior importância econômica infectando feijoeiros
no Brasil. Neste contexto, o presente estudo teve como objetivo a obtenção de clones
infecciosos a partir de isolados de BGMVe MaYSV usando a técnica de Gibson Assembly
(GA), e a determinação da gama de hospedeiros de MaYSV. Clones dos componentes DNA-A
e DNA-B de BGMV (173AL) e MaYSV (100AL) foram usados para aplicação da metodologia
de construção de clones infecciosos por GA. Alíquotas das reações de GA foram utilizadas para
transformar células eletrocompetentes de Escherichia coli DH10B, a ligação dos fragmentos
virais em vetor binário pJL-89 foi confirmada por digestão enzimática e sequenciamento. DNA
plasmidial das contruções confirmadas foi utilizado para transformação de Agrobacterium
tumefaciens (cepa GV3101), e a infectividade dos clones de cada espécie viral foi testada
individualmente via agroinoculação em plantas de feijão comum ‘cv. Pérola’, as quais foram
monitoradas por 30 dias para observação do aparecimento de sintomas. DNA total foi extraído
a partir de amostras foliares (infectadas sistemicamente) coletadas aos 15 e 30 dias após
agroinfiltração (daa), e utilizado como template para detecção viral utilizando primers espécieespecíficos. As plantas agroinoculadas com os clones infecciosos apresentaram sintomas de
mosaico amarelo severo 15 daa, enquanto as plantas controle (agroinoculadas com pJL-89 sem
insertos virais) foram assintomáticas. Ambos os componentes genômicos DNA-A e DNA-B de
BGMV e MaYSV foram detectados em folhas infectadas sistemicamente. Gibson Assembly
mostrou ser uma técnica rápida e útil para a construção de clones infecciosos de fitovírus com
DNA circular. Nos testes de gama de hospedeiros, dentre as espécies testadas, foi constatada a
infecção viral nas espécies P. vulgaris, N. benthamiana e S. lycopersicum. Sintomas de mosaico
e subdesenvolvimento foram observados apenas em feijão-comum.
Palavras-chave: Gibson Assembly, clone infeccioso, geminivírus.
ABSTRACT
Bean plants (Phaseolus spp.) are of great socioeconomic importance in tropical and subtropical
regions and are among the most traditional Brazilian culinary items, presenting remarkable
nutritional value. The genus Begomovirus (family Geminiviridae) is among the group of most
harmful pathogens that infect these crops, being considered a limiting factor in producing areas.
Begomoviruses have single-stranded circular DNA and are transmitted by a complex of cryptic
species of Bemisia tabaci, with noncultivated hosts acting as reservoirs of these viruses. Bean
golden mosaic virus (BGMV) and Macroptilium yellow spot virus (MaYSV) are the two most
economically important species infecting beans in Brazil. In this context, the present study
aimed to obtain infectious clones from BGMVe MaYSV isolates using the Gibson Assembly
(GA) technique, and to determine the host range of MaYSV. Clones of the DNA-A and B-DNA
components of BGMV (173AL) and MaYSV (100AL) were used to apply the methodology for
constructing infectious clones by GA. Aliquots of the GA reactions were used to transform
Escherichia coli DH10B electrocompetent cells, binding of the viral fragments into pJL-89
binary vector was confirmed by enzymatic digestion and sequencing. Plasmid DNA from the
confirmed constructs was used for transformation of Agrobacterium tumefaciens (strain
GV3101), and the infectivity of the clones of each viral species was tested individually via
agroinoculation in common bean 'cv. Pérola ', which were monitored for 30 days to observe the
appearance of symptoms. Total DNA was extracted from leaf samples (systemically infected)
collected at 15- and 30-days post agroinfiltration (dpa), and used as template for viral detection
using species-specific primers. Inoculated plants with infectious clones showed symptoms of
severe yellow mosaic 15 daa, whereas control plants (agroinoculated with pJL-89 without viral
inserts) were asymptomatic. Both genomic DNA-A and B-DNA components of BGMV and
MaYSV were detected in systemically infected leaves. GA has been shown to be a rapid and
useful technique for the construction of infectious clones of plant viruses with circular DNA.
For the host range experiments, among the analyzed species, viral infection was verified in the
species P. vulgaris, N. benthamiana and S. lycopersicum. Symptoms of mosaic and stunting
were observed only in common bean.
Key words: Gibson Assembly, infectious clone, geminiviruses.
LISTA DE FIGURAS
Revisão de literatura
Figura 1 – Organização genômica dos begomovírus................................................................ 15
Figura 2 - Etapas da reação de Gibson Assembly.................................................................... 17
Capítulo 1
Figura 1 - Strategy to construct dimeric agroinfectious clone of BGMV into pJL-89 binary
vector ........................................................................................................................................ 46
Figura 2 - Agroinoculation tests using infectious clone of BGMV.......................................... 47
Fugura suplementar 1 - PCR-GA approach for construction of infectious clones of circular
DNA plant viruses as begomoviruses…………………………………………………………48
Capítulo 2
Figura 1 - Estratégia para construção do clone agroinfeccioso dimérico de MaYSV em vetor
binário pJL-89. ......................................................................................................................... 62
Figura 2 - Padrão eletroforético das reações de digestão com BamHI (DNA-A) e SpeI (DNAB) dos clones de MaYSV...........................................................................................................63
Figura 3 - Teste de agroinoculação usando o clone infeccioso de MaYSV...............................63
Figura 4 - Sintomas observados em plantas de P. vulgaris agroinoculadas com o clone
infeccioso de MaYSV................................................................................................................64
Figura 5 - Padrão eletroforético da confirmação da infecção viral via PCR em plantas de N.
benthamiana..............................................................................................................................64
LISTA DE TABELAS
Capítulo 1
Table 1 - Primer sequences used for amplification of BGMV DNA-A and DNA-B genomic
components and pJL-89 binary vector………………………………………………………...44
Capítulo 2
Tabela 1 - Sequências de primers usados para amplificação dos componentes genômicos DNAA e DNA-B de MaYSV e do vetor binário pJL89......................................................................60
Tabela 2 - Avaliação da infecção de plantas agroinoculadas com clone infeccioso de
MaYSV.....................................................................................................................................61
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO GERAL ...................................................................................................... 9
2 REVISÃO DA LITERATURA ......................................................................................... 11
2.1 A cultura dos feijoeiros ...................................................................................................... 11
2.2 A família Geminiviridae ..................................................................................................... 12
2.3 O gênero Begomovirus.... ................................................................................................... 13
2.4 Métodos utilizados para identificação de espécies de begomovírus e construção de clones
infecciosos................................................................................................................................ 15
2.5 Organização genômica e papel desempenhado pelas proteínas dos Begomovirus............ 17
2.6 Diversidade de Begomovirus infectando feijoeiros e Macroptilium lathyroides................. 20
REFERÊNCIAS..................................................................................................................... 23
3 CAPÍTULO I: NEW APPROACH FOR THE CONSTRUCTION OF AN INFECTIOUS
CLONE OF A CIRCULAR DNA PLANT VIRUS USING GIBSON ASSEMBLY............... 35
ABSTRACT..............................................................................................................................37
MANUSCRIPT.........................................................................................................................38
REFERENCES..........................................................................................................................41
4 CAPÍTULO II: CONSTRUÇÃO DE CLONE INFECCIOSO E DETERMINAÇÃO DA
GAMA
DE
HOSPEDEIROS
DO
BEGOMOVÍRUS
Macroptilium
yellow
spot
virus...........................................................................................................................................49
RESUMO..................................................................................................................................50
ABSTRACT..............................................................................................................................51
4.1 INTRODUÇÃO................................................................................................................ 52
4.2 MATERIAL E MÉTODOS..............................................................................................53
4.2.1 Isolado viral e obtenção dos clones de MaYSV...............................................................53
4.2.2 Construção de clone infeccioso de MaYSV por Gibson Assembly..................................53
4.2.3 Ensaios de agroinfiltração do clone infeccioso de MaYSV..............................................54
4.2.4 Determinação da gama de hospedeiros de MaYSV..........................................................55
4.3 RESULTADOS ................................................................................................................. 55
4.3.1 Confirmação da construção do clone infeccioso de MaYSV por Gibson Assembly. ..... 55
4.3.2 Infectividade do clone infeccioso de MaYSV ................................................................. 56
4.3.3 Determinação da gama de hospedeiros de MaYSV ........................................................ 56
4.4 DISCUSSÃO ..................................................................................................................... 56
4.5 CONCLUSÃO................................................................................................................... 59
4.6 REFERÊNCIAS................................................................................................................ 65
9
1 INTRODUÇÃO GERAL
Phaseolus vulgaris (feijão comum) e P. lunatus (feijão-fava) são hortaliças pertencentes
à família Fabaceae, e apresentam elevada importância socioeconômica (CARNEIRO, 2005). O
Brasil é um importante produtor mundial de feijão. No ano de 2018, o país produziu cerca de
2,9 milhões de toneladas de feijão plantadas em uma área de 2,9 milhões de hectares, com a
região Nordeste produzindo cerca de 560 mil toneladas (IBGE, 2018). Dentre os fatores que
proporcionam a queda de produtividade na cultura do feijoeiro, destacam-se as begomoviroses,
as quais provocam perdas econômicas que podem variar de 40% a 100% (QUINTELA et al.,
2008).
A família Geminiviridae engloba vírus cujo genoma é constituído por DNA circular de
fita simples (ssDNA) encapsidado em partícula geminada de morfologia quasi-icosaédrica
(BROWN et al., 2012). A família é composta pelos gêneros Becurtovirus, Begomovirus,
Capulavirus,
Curtovirus,
Eragrovirus,
Grablovirus,
Mastrevirus,
Topocuvirus,
Turncurtovirus, separados por características como gama de hospedeiros, tipo de inseto vetor,
organização genômica e relacionamento filogenético (VARSANI et al, 2014; 2017). O gênero
Begomovirus possui um (monopartido) ou dois (bipartido) componentes genômicos conhecidos
como DNA-A e DNA-B, são transmitidos por um complexo de espécies crípticas da moscabranca Bemisia tabaci (BARBOSA et al., 2014; NAVAS-CASTILLO et al., 2011) e infectam
plantas dicotiledôneas. No DNA-A encontram-se os genes envolvidos na replicação e
encapsidação da progênie viral, enquanto no DNA-B encontram-se os genes responsáveis pelos
movimentos intra e intercelular (LAZAROWITZ, 1992). Geralmente, ambos os componentes
são requeridos para a infecção sistêmica do hospedeiro (BROWN et al., 2012; 2015).
Diversas espécies de begomovírus têm sido relatadas infectando hospedeiras
leguminosas cultivadas, sendo Bean golden mosaic virus (BGMV) e Macroptilium yellow spot
virus (MaYSV) os de maior importância econômica no Brasil (FAUQUET et al., 2008; LIMA
et al., 2013; RAMOS-SOBRINHO et al., 2014). Além de infectarem plantas cultivadas, os
begomovírus também infectam hospedeiras não-cultivadas pertencentes à família Fabaceae
como Macroptilium lathyroides (MORALES; ANDERSON, 2001). As espécies Macroptilium
yellow mosaic virus (MaYMV-[JM]), Macroptilium yellow mosaic Florida virus (MaYMFV),
Macroptilium mosaic Puerto Rico virus (MaMPRV) e MaYSV são vírus descritos a partir de
Macroptilium e são capazes de infectar sistemicamente plantas de feijão comum e feijão-fava
(AMARAKOON et al., 2008; IDRIS et al., 2003; LIMA et al., 2013; RAMOS-SOBRINHO et
al., 2014).
10
No Brasil, o BGMV foi inicialmente descrito em 1960 no Estado de São Paulo, não
sendo relatada importância econômica (COSTA, 1975). Posteriormente, este vírus foi
identificado como pertencente ao gênero Begomovirus, passando a ter grande relevância já na
década seguinte, sobretudo em função da forte expansão de lavouras de soja e populações do
inseto vetor (INOUE-NAGATA; LIMA; GILBERTSON, 2016). O BGMV foi considerado
durante muito tempo como o único begomovírus de importância econômica em feijoeiros no
Brasil, levando a aprovação do feijão comum transgênico Embrapa 5.1 resistente ao BGMV
(ARAGÃO et al., 2013). Entretanto, estudos sugerem a emergência do MaYSV como um dos
principais begomovírus em campos de cultivo no Nordeste do Brasil, indicando que BGMV já
não é mais o único begomovírus de relevância econômica para os feijoeiros (RAMOSSOBRINHO et al., 2014).
Devido à grande importância dos begomovírus descritos em feijoeiros, faz-se necessário
a realização de estudos adicionais para uma melhor compreensão da interação
vírus/hospedeiro/vetor. A obtenção de clones infecciosos tem se mostrado fundamental para
avaliação do processo infeccioso dos diferentes vírus isoladamente ou em infecções mistas.
Além disso, auxilia programas de melhoramento genético de plantas cultivadas visando
resistência. Portanto, o presente estudo teve como objetivo a obtenção de clone infeccioso a
partir de isolados de BGMV e MaYSV, usando a técnica de Gibson Assembly, e a determinação
da gama de hospedeiros de MaYSV.
11
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1 A cultura dos feijoeiros
A família Fabaceae possui cerca de 727 gêneros e 19.325 espécies amplamente
distribuídas em todo o mundo, principalmente nas regiões tropicais e subtropicais (LEWIS et
al., 2005). Com origem tanto nos Andes como na Mesoamérica, Phaseolus é um dos principais
gêneros dentro dessa família, sendo constituído por cerca de 55 espécies, das quais cinco são
cultivadas: Phaseolus vulgaris (feijão comum), P. lunatus (feijão-fava), P. coccineis (ayocate),
P. acutifolius (tepari) e P. polyanthus (petaco) (CARNEIRO, 2005). No Brasil, a espécie mais
amplamente cultivada é P. vulgaris, porém P. lunatus é também bastante utilizada na
alimentação humana e animal, fornecendo proteína vegetal e diminuindo a dependência quase
exclusiva dos feijões do grupo Carioca (VIEIRA, 1992; PEGADO et al., 2008).
Espécies do gênero Phaseolus fornecem componentes fundamentais na dieta humana
como proteínas (é a principal fonte deste nutriente em populações de baixa renda), ferro, cálcio,
magnésio, zinco, vitaminas (sobretudo do complexo B), carboidratos e fibras. Trata-se de um
dos mais tradicionais alimentos presentes na culinária brasileira, apresentando notável valor
nutricional e socioeconômico (MESQUITA et al., 2007).
A produção mundial de feijões situa-se em torno de 31,4 milhões de toneladas,
ocupando uma área de 36,4 milhões de hectares (FAO, 2017). Segundo dados do IBGE, no ano
de 2018, o Brasil produziu cerca de 2,9 milhões de toneladas de feijão, plantados em uma área
de 2,9 milhões de hectares, sendo os principais estados produtores Paraná, Minas Gerais e
Bahia. No mesmo ano, a região Nordeste produziu cerca de 560 mil toneladas (IBGE, 2018).
O rendimento médio da produção nacional de fava em grão, no ano de 2015, foi de 217 kg/ha
e na região Nordeste foi de 215 kg/ha (IBGE, 2015).
Existem diversos agentes fitopatogênicos que podem incidir na cultura dos feijoeiros e
provocar perdas na qualidade e rendimento. As begomoviroses, por exemplo, provocam perdas
econômicas que podem variar de 40% a 100%, dependendo da cultivar, estádio de infecção da
planta, população do vetor, presença de hospedeiros alternativos e condições ambientais
(MORALES, 2010; QUINTELA et al., 2008).
12
2.2 A família Geminiviridae
A família Geminiviridae é composta pelos gêneros Becurtovirus, Begomovirus,
Capulavirus,
Curtovirus,
Eragrovirus,
Grablovirus,
Mastrevirus,
Topocuvirus,
Turncurtovirus. Essa divisão é baseada em características como gama de hospedeiros, tipo de
inseto vetor, organização genômica e relacionamento filogenético (VARSANI et al, 2014;
2017; ZERBINI et al., 2017). Os geminivírus possuem genoma constituído por DNA circular
de fita simples (ssDNA), com tamanho variando entre 2,6 a 5,2 kb e encapsidados em partículas
geminadas de morfologia quasi-icosaédrica (BROWN et al., 2012; 2015). A maioria dos
gêneros da família é monopartido, com exceção do Begomovirus que pode possuir um ou dois
(bipartidos) componentes genômicos. Cada partícula geminada possui uma única molécula de
ssDNA e, no caso dos Begomovirus bipartidos, dois vírions contendo os diferentes
componentes genômicos (DNA-A e DNA-B) são necessários para o estabelecimento da
infecção sistêmica da planta hospedeira (BROWN et al., 2012; 2015).
Esta família de vírus infecta plantas mono e dicotiledôneas, sendo frequentemente
responsáveis por perdas de rendimento em culturas economicamente importantes (INOUENAGATA; LIMA; GILBERTSON, 2016), além de infectar plantas ornamentais e
daninhas/silvestres (HANLEY-BOWDOIN et al., 2013). Vários geminivírus causam impacto
econômico e social em diferentes continentes. Por exemplo, os begomovírus Bean golden
mosaic virus (BGMV) e Bean golden yellow mosaic virus (BGYMV) têm importância em
feijoeiros nas Américas; Beet curly top virus (BCTV; Curtovirus) em beterraba açucareira na
América do Norte e Oriente Médio; Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV; Begomovirus)
infecta tomateiros na Europa, África, Ásia, América Central, Caribe, Estados Unidos e
Austrália; African cassava mosaic virus (ACMV; Begomovirus) causa prejuízos em mandioca,
e Maize streak virus (MSV; Mastrevirus) em milho na África; Wheat dwarf virus (WDV;
Mastrevirus) em trigo na Europa; Cotton leaf curl virus (CLCuV; Begomovirus) em algodoeiro
na Ásia (HANLEY-BOWDOIN et al., 2013; SCHUBERT et al., 2014; INOUE-NAGATA;
LIMA; GILBERTSON, 2016), com algumas espécies sendo capazes de provocar perdas de até
100% (LEGG; FAUQUET, 2004; SHEPHERD et al., 2010; SATTAR et al., 2013).
Os geminivírus são transmitidos por insetos que se alimentam do floema, incluindo
diferentes espécies de cigarrinhas, moscas-brancas do complexo de espécies crípticas Bemisia
tabaci, membracídeos e afídeos (INOUE-NAGATA; LIMA; GILBERTSON, 2016). Os
gêneros Eragrovirus e Grablovirus são os únicos membros da família onde os vetores
permanecem desconhecidos (VARSANI et al., 2014; 2017). Os sintomas típicos de infecções
13
causados por geminivírus incluem deformação foliar, enrolamento, amarelecimento, nanismo,
mosaico e/ou estriações (VARSANI et al., 2017).
2.3 O gênero Begomovirus
Dentre os geminivírus, o gênero Begomovirus (espécie tipo Bean golden yellow
mosaic virus - BGYMV) é aquele que conta com o maior número de espécies (VARSANI et
al., 2014). Atualmente são reconhecidas 388 espécies pelo International Comitee on Taxonomy
of Viruses – ICTV (http://www.ictvonline.org/virusTaxonomy.asp), enfatizando assim a
importância desse gênero dentro da família (BROWN et al., 2015). Este gênero inclui os mais
importantes vírus nas regiões tropicais e subtropicais, são transmitidos por um complexo de
espécies crípticas de Bemisia tabaci (Homoptera: Aleyrodidae) (BROWN et al., 2012; 2015;
NAVAS-CASTILLO; FIALLO-OLIVÉ; SÁNCHEZ-CAMPOS, 2011) e infectam plantas
dicotiledôneas (STANLEY et al., 2005; FARIA et al., 2000).
Baseado na organização genômica, diversidade genética e distribuição geográfica, os
begomovírus são divididos em dois grupos: begomovírus do “Velho Mundo” (VM) (Europa,
África, Ásia e Austrália) e do “Novo Mundo” (NM) (Américas). Os begomovírus do VM
apresentam um ou dois componentes genômicos e frequentemente estão associados a moléculas
de ssDNA satélites denominados alfassatélites (anteriormente DNA-1) e betassatélites
(anteriormente DNA β) (FAUQUET; STANLEY, 2005; ZHOU et al., 2013; LOZANO et al.,
2016; ROSARIO et al., 2016) (Figura 1).
O primeiro begomovírus relatado em associação com um betassatélites foi o Ageratum
yellow vein virus (AYVV). Desde então, vários outros begomovírus têm sido reportados e,
devido ao número crescente de relatos de betassatélites, um sistema de classificação e
nomenclatura foi proposto para estes componentes (BRIDDON et al., 2008), no qual já se
observam listadas 61 espécies no ICTV. Nenhum betassatélite foi detectado em associação com
vírus nativos do NM, apesar das tentativas de detecção direcionadas especificamente para estas
moléculas enquanto se investigava alfassatélites (ROMAY et al., 2010; ROSARIO et al., 2016).
A maioria dos begomovírus encontrados no NM apresenta dois componentes genômicos
denominados DNA-A e DNA-B, com relatos de ocorrência de associação a alfassatélites
(PAPROTKA; METZLER; JESKE, 2010; ROMAY et al., 2010). Os poucos begomovírus
monopartidos nativos do NM são: Tomato leaf deformation virus (ToLDeV; SÁNCHEZCAMPOS et al., 2013; MELGAREJO et al., 2013), Tomato mottle leaf curl virus (ToMoLCV;
VU et al., 2015) e Tomato severe leaf curl virus (ToSLCV; GILBERTSON et al., 2015). No
14
início da década de 1990, o TYLCV, um begomovírus monopartido nativo do VM, foi
introduzido na República Dominicana e, atualmente encontra-se presente em toda América
Central, Caribe e Estados Unidos (NAHKLA et al., 1994; DUFFY; HOLMES, 2007).
Alfassatélites foram identificados no Brasil e na Venezuela associados aos begomovírus
bipartidos Cleome leaf crumple virus (ClLCrV), Euphorbia mosaic virus (EuMV) e Melon
chlorotic mosaic virus (MeCMV), sendo esses os primeiros relatos de alfassatélites associados
a begomovírus ocorrendo naturalmente no NM (PAPROTKA; METZLER; JESKE, 2010;
ROMAY et al., 2010). Recentemente, DNAs satélites foram detectados em mosca-branca com
a abordagem VEM (vector enabled metagenomics) na Guatemala e em Porto Rico, sendo
demonstradas associações entre begomovírus e alfassatélites, o que sugere que a distribuição
destas moléculas está bem difundida pelo continente americano (ROSARIO et al., 2016).
Moléculas de DNAs satélites associadas a begomovírus monopartidos do VM foram
relatadas interferindo na replicação do vírus auxiliar, na maioria das vezes atenuando os
sintomas, porém em alguns casos, induzindo a manifestação de sintomas mais severos
(ROOSSINCK; SLEAT; PALUKAITIS, 1992). Briddon; Stanley (2006) afirmam que as
funções dos satélites ainda não são claras, pois variam dependendo do vírus auxiliar. Entretanto
parecem estar associados à virulência do patógeno, exercendo função na supressão do
silenciamento gênico da planta, com a proteína βC1, codificada pelo betassatélite, sendo
responsável por essa função (CUI et al., 2005). Foi demonstrado ainda que begomovírus
distintos quando interagem com um mesmo DNA satélite produzem os mesmos sintomas nas
plantas infectadas (MANSOOR et al., 2003), indicando que os satélites de DNA podem atuar
como fatores de patogenicidade. A associação de alfassatélites com begomovírus (com ou sem
betassatélites) não apresenta uma relação direta com o desenvolvimento de sintomas na planta
hospedeira, porém, em alguns casos pode resultar na atenuação dos sintomas (ZHOU et al.,
2013).
Uma nova classe de DNAs satélites foi descrita associada a begomovírus bipartidos do
NM infectando plantas não-cultivadas (família Malvaceae) em Cuba (FIALLO-OLIVÉ et al.,
2012). Moléculas semelhantes foram detectadas em adultos de mosca-branca ultilizando a
abordagem VEM no sul da Flórida (WfVEM-Sat) (NG et al., 2011), porém a estrutura do
genoma não foi descrita em detalhes (FIALLO-OLIVÉ et al., 2012). O nome proposto para a
classe foi deltassatélites (LOZANO et al., 2016) que inclui ToLCV-Sat, primeiro DNA satélite
associado ao begomovírus Tomato leaf curl virus (DRY et al., 1997), os satélites relatados em
Cuba (que juntamente com os satélites da Flórida são chamados de deltassatélites do NM)
15
(FIALLO-OLIVÉ et al., 2016) e os DNAs satélites associados a sweepovírus infectando
convovuláceas na Espanha e Venezuela (LOZANO et al., 2016; FIALLO-OLIVÉ et al., 2016).
Os begomovírus causam sintomas extremamente variáveis, dependendo principalmente
da espécie viral, da planta hospedeira e da fase da cultura em que a infecção se estabeleceu
(PICÓ; DIAZ; NUEZ, 1996). Porém, frequentemente observa-se nanismo, deformação foliar,
uma combinação de mosaico/mosqueado de verde-claro a amerelo-dourado, amarelecimento
venal ou intervenal, e pontos amarelos nas folhas (INOUE-NAGATA; LIMA; GILBERTSON,
2016).
Figura 1. (a) Organização genômica dos begomovírus encontrados no VM e NM. (b) DNAs
satélites associados a begomovírus. Fonte: SATTAR et al., 2013; FIALLO-OLIVÉ et al., 2016.
2.4 Métodos utilizados para identificação de espécies de begomovírus e construção de
clones infecciosos
O método mais seguro para identificação de espécies de begomovírus tem sido a
determinação da sequência completa de nucleotídeos do DNA-A. Critérios para demarcação de
espécies dentro do gênero Begomovirus foram revisados (BROWN et al., 2015), ficando
estabelecido o limiar (para demarcação de espécies) de ≥91% de identidade para sequências
nucleotídicas do DNA-A em comparações pareadas utilizando-se o programa Sequence
16
Demarcation Tool (SDT; MUHIRE; VARSANI; MARTIN, 2014). Em 2004, Inoue-Nagata e
colaboradores desenvolveram um método simples para clonagem de genomas completos de
begomovírus baseado na amplificação dos componentes genômicos por círculo rolante (rollingcircle amplification - RCA) seguido por digestão com enzima de restrição e ligação ao vetor
plasmidial. Este método tem facilitado os procedimentos de clonagem e rápido de
sequenciamento de um grande número de isolados (MAR et al. 2017; RAMOS-SOBRINHO et
al., 2014; ROCHA et al., 2013; SILVA et al., 2012).
Por outro lado, na investigação da biologia viral, tem sido utilizada a tecnologia de
clones infecciosos, uma ferramenta poderosa que facilita estudos de diferentes viroses
isoladamente ou em infecções mistas controladas, e uma melhor compreensão da interação
vírus/hospedeiro/vetor (BREWER et al., 2018). Clones infecciosos de vírus de plantas têm uma
ampla gama de aplicabilidade e a utilização dessas técnicas tem permitido a realização de
estudos de variabilidade genética, epidemiologia molecular, além de fornecer suporte a
programas de melhoramento genético de espécies cultivadas.
Uma abordagem mais convencional para obtenção de clones diméricos de begomovírus
leva em consideração as técnicas de DNA recombinante e restrição enzimática
(BURAGOHAIN et al., 1994), gerando construções correspondentes a 1,5 cópias do genoma,
contendo duas origens (ori) de replicação. A ori duplicada permite a liberação do genoma
completo na célula e a recuperação do genoma viral intacto (NAGATA; INOUE-NAGATA,
2015).
Em 2008, Ferreira e colaboradores descreveram um procedimento mais simples para
construir clones agro-infecciosos de isolados de begomovírus, o qual baseia-se na geração de
duas unidades do genoma por digestão enzimática parcial dos concatâmetos produzidos pela
reação da DNA polimerase phi-29. Esse método é amplamente utilizado (FERREIRA et al.,
2008; WU et al., 2008; NAGATA; INOUE-NAGATA, 2014; BANG et al., 2014), no entanto,
a digestão enzimática parcial requer ajustes adicionais na concentração adequada da enzima e
do DNA alvo, exigindo um maior tempo de execução e, em muitos casos, não sendo bemsucedida.
Recentente, foi empregada a técnica de Gibson Assembly (GA) para construção de clone
infeccioso de BGMV, em vetor binário pJL-89, capaz de infectar eficientemente Phaseolus
vulgaris (FERRO et al., 2019). GA é um método de clonagem molecular usado para montar
eficientemente moléculas de DNA em uma única reação isotérmica, pela ação combinada de
três enzimas: uma T5 exonuclease, uma DNA polimerase de alta fidelidade e uma DNA ligase
(GIBSON et al., 2009) (Figura 2). Essa abordagem pode ser mais eficiente que a clonagem
17
convencional e acelerar o desenvolvimento de clones infecciosos de muitos begomovírus num
vetor binário.
Figura 2. Etapas da reação de Gibson Assembly. Fonte: Gibson Assembly® Cloning Kit, NEW
ENGLAND BIOLABS.
2.5 Organização genômica e papel desempenhado pelas proteínas dos Begomovirus
O genoma da maioria dos Begomovirus descritos no NM apresenta dois componentes
denominados DNA-A e DNA-B. Cada componente é encapsidado separadamente em partículas
geminadas sendo necessárias as duas moléculas de DNA para que a infecção ocorra. Ambos
apresentam um comprimento semelhante de aproximadamente 2,6 kb, não apresentando
homologia de sequência, exceto por uma região intergênica com cerca de 200 pb, a região
comum (RC). A RC é altamente conservada entre dois componentes de uma determinada
espécie viral (acima de 90% de identidade). A partir desta região, os genes virais divergem nos
sentidos virais e complementar (LAZAROWITZ, 1992; PILARTZ; JESKE, 2003) e nela está
localizada uma sequência de nove nucleotídeos (5’-TAATATT↓AC-3’) conservada entre todos
os geminivírus, onde se encontra o domínio funcional da origem de replicação (OROZCO;
HANLEY-BOWDOIN, 1996), além de promotores da síntese dos mRNAs virais
(LAZAROWITZ, 1992; LAZAROWITZ et al., 1992; FONTES et al., 1994). Entretanto, vale
salientar que um nonanucleotídeo não usual (5’-TAGTATTAC-3’) foi relatado no begomovírus
Malvaviscus yellow mosaic virus (MYMV), obtido a partir de hospedeiros ornamentais da
18
família Malvaceae (LIMA et al., 2011). Este nonanucleotídeo é clivado durante o início da
replicação viral e se localiza num contexto de 30 nucleotídeos capazes de formar uma estrutura
em forma de grampo. Embora a sequência de 30 nucleotídeos varie entre espécies de
geminivírus, a estrutura em forma de grampo está sempre presente, sendo considerado um
elemento conservado estruturalmente (FARIA; ZERBINI, 2000).
A transcrição é bidirecional tanto no DNA-A, que possui genes envolvidos na replicação
e encapsidação viral, quanto no DNA-B, que possui genes envolvidos na movimentação do
vírus na planta (TIMMERMANS; DAS; MESSING, 1994; BROWN, 1997; FARIA et al.,
2000) (Figura 1).
No componente DNA-A, um gene é transcrito no sentido viral denominado CP (Coat
Protein) que codifica para a proteína da capa proteica, e quatro no sentido complementar Rep,
TrAP, Ren e C4, que codificam, respectivamente para a proteína associada à replicação
(Replication associated Protein - Rep), a proteína da transcrição (Trans-Acting Protein - TrAP),
uma proteína que aumenta a replicação do genoma viral (Replication Enhancer - REn) e uma
proteína envolvida na supressão do silenciamento gênico (C4) (FARIA; ZERBINI, 2000).
A função da CP está relacionada com a proteção do genoma contra degradação,
aquisição do vírus e transmissão pelo inseto vetor, infectividade e movimento sistêmico. Nos
begomovírus monopartidos, a CP também tem a função de transportar o DNA viral do núcleo
para o citoplasma e do citoplasma para o núcleo (LIU et al., 1999), função exercida pela NSP
nos begomovírus bipartidos (NOUEIRY; LUCAS; GILBERTSON, 1994). Essa proteína é
determinante da especificidade da transmissão do vírus e na interação entre o vírus e a planta
hospedeira, parece ainda estar associada com o desenvolvimento de sintomas (GARDINER et
al., 1998). A CP dos begomovírus se liga à proteína GroEL (sintetizada por endossimbiontes
no intestino das moscas-brancas vetoras) e à proteína codificada pela própria mosca-branca
HSP16 (heat shock protein 16; OHNESORGE; BEJARANO, 2009; RANA et al., 2012). Estas
interações podem estabilizar o vírion durante a passagem pelo intestino e/ou facilitar sua
transferência através do epitélio do intestino para a hemolinfa (HANLEY-BOWDOIN et al.,
2013). As duas hipóteses são compatíveis com dados que mostram que diferentes isoformas de
GroEL, sintetizadas por diferentes endossimbiontes, afetam a eficiência de transmissão
(GOTTLIEB et al., 2010; HANLEY-BOWDOIN et al., 2013). Foi experimentalmente
demonstrado que a troca do gene CP do African cassava mosaic virus (ACMV), um
begomovírus transmitido por mosca-branca, pelo correspondente do Beet curly top virus
(BCTV), um curtovírus transmitido por cigarrinha, resultou na alteração da especificidade do
inseto vetor (BRIDDON et al., 1990). Uma outra proteína sintetizada no sentido viral é a
19
AV2/V2, que em begomovírus monopartidos do VM funciona como proteína do movimento
(POORNIMA-PRIYADARSHINI et al., 2011), além de atuar supressora de silenciamento
gênico (CHOWDA-REDDY et al., 2008; ZHANG et al., 2012).
O produto do gene Rep é uma enzima com propriedades de ligação a ácidos nucléicos,
de endonucleases e absolutamente necessária para a replicação. A função da proteína Rep é de
se ligar ao sítio de iniciação da replicação viral (5’-TAATATT//AC-3’) e cortar uma das fitas
de DNA iniciando a replicação por círculo rolante (rolling circle replication – RCR) (FONTES;
LUCKOW; HANLEY-BOWDOIN, 1992). A fita de ssDNA circular recém-sintetizada pode
ser convertida em dsDNA para entrar num novo ciclo de replicação ou encapsidada em vírions
após a síntese da proteína capsidial (HANLEY-BOWDOIN et al., 2013). A Rep ainda está
ligada à regulação gênica, uma vez que sua ligação à origem de replicação reprime a expressão
de genes no sentido complementar (incluindo sua própria expressão) (EAGLE; OROZCO;
HANLEY-BOWDOIN, 1994), mas aparentemente não reprime a expressão de genes no sentido
viral (SHIVAPRASAD et al., 2005).
A proteína TrAP, codificada pelo gene trap, é um fator de transcrição, que atua nos
promotores de genes de sentido viral (CP e NSP) em begomovírus bipartidos. Portanto, os
transcritos correspondentes a estes genes só são observados na célula após a expressão de trap
(SUNTER; BISARO, 1992). Outra função pode ser a de interagir e inativar Kinases, como
adenosina kinase (ADK) e SNF1, enzimas envolvidas na defesa do hospedeiro (SUNTER;
SUNTER; BISARO, 2001). A TrAP ainda está envolvida na supressão de silenciamento gênico
transcricional (TGS) e pós-transcricional (PTGS) (VANITHARANI et al., 2004; WANG et al.,
2005; RAJA et al, 2008).
A proteína REn, codificada pelo gene REn, é um fator de amplificação da replicação
viral. Embora não seja essencial para que a replicação ocorra, o acúmulo de DNA viral é muito
maior quando esta proteína está presente (ZERBINI; CARVALHO; MACIEL-ZAMBOLIM,
2002). Estudos envolvendo mutações nesta proteína têm mostrado retardamento e atenuação de
sintomas (ELMER et al., 1988; ETESSAMI et al., 1991). Há a possibilidade de que a REn
direcione a Rep para o domínio de ligação Rep/DNA viral no local de clivagem no início da
replicação (LAZAROWITZ et al., 1999).
A C4 é responsável por suprimir a resposta do hospedeiro à ação da Rep (ROJAS et al,
2005; STANLEY et al, 2005), além disso é um importante fator na determinação dos sintomas,
estando comprometida no controle do ciclo celular, podendo se envolver com outras proteínas
virais e interagir com proteínas relacionadas com o processo de ubiquitinação pelo hospedeiro
na tentativa de garantir o avanço da infeção (CASTILLO et al., 2004; EINI et al., 2009;
20
LOZANO-DURAN; BEJARANO, 2011; LOZANO-DURÁN et al., 2011; SÁNCHEZDURÁN et al., 2011; ZHANG et al., 2011). Em begomovírus monopartidos atua no movimento
célula-à-célula em conjunto com outras proteínas como CP e V2 (ROJAS et al., 1998; ROJAS
et al., 2001).
A C5 codifica uma proteína que aparentemente não tem papel essencial no ciclo da
infecção viral para alguns begomovírus ou isolados virais (KHEYR-POUR et al., 2000;
FONTENELLE et al., 2007; MELGAREJO et al., 2013), mas sua ausência em mutantes
ocasionou sintomas menos severos (MELGAREJO et al., 2013). Um estudo mais detalhado
com o Mungbean yellow mosaic India virus (MYMIV; LI et al., 2015) revelou o papel
multifuncional desta proteína, que pode atuar no desenvolvimento de sintomas, na supressão
do TGS e do PTGS, e na indução de uma resposta similar a de hipersensibilidade
(hipersensitive-like response – HLR).
No componente DNA-B, no sentido viral, o gene NSP codifica uma proteína que realiza
o transporte do DNA através do envelope nuclear (Nuclear Shuttle Protein - NSP). A NSP se
liga ao DNA viral formando o complexo NSP-ss/dsDNA, que é transportado para o citoplasma,
onde interage com a MP, que direciona o complexo para a periferia da célula vegetal para ser
transportado
à
célula
adjacente
(SANDERFOOT;
LAZAROWITZ,
1995;
1996;
SANDERFOOT; INGHAM; LAZAROWITZ, 1996). No sentido complementar, o gene MP
(Moviment Protein - MP) tem funções de movimento célula-a-célula através do mecanismo de
aumento do limite de exclusão dos plasmodesmas (NOUEIRY; LUCAS; GILBERTSON,
1994). A MP de Squash leaf curl virus (SqLCV) interage com o retículo endoplasmático de
células procambiais (células vasculares imaturas) para formar túbulos que conectam uma célula
a outra, sugerindo que o complexo NSP-ssDNA viral pode ser transportado através de tais
estruturas (WARD et al., 1997).
2.6 Diversidade de Begomovirus infectando feijoeiros e Macroptilium lathyroides
Os begomovírus têm emergido como um dos principais fitopatógenos, particularmente
nas regiões tropicais e subtropicais do mundo (MORALES, 2010), prejudicado importantes
culturas como feijão (Phaseolus vulgaris), mandioca (Manihot esculenta), algodão (Gossypium
sp.), tabaco (Nicotiana tabacum) e tomate (GRAHAM; MARTIN; ROYE, 2010). No Brasil, o
feijoeiro e tomateiro são as culturas mais severamente afetadas (FARIA; MAXWELL, 1999;
ZERBINI et al., 2005).
21
Begomovírus que infectam feijoeiros (Phaseolus spp.) são distribuídos através das
Américas e considerados fator limitante para a produtividade dessa cultura (MORALES, 2010).
Diversas espécies já foram relatadas naturalmente infectando esses hospedeiros: Bean calico
mosaic virus (BCaMV), Bean dwarf mosaic virus (BDMV), Bean golden yellow mosaic virus
(BGYMV), Sida micrantha mosaic virus (SiMMV), Tobacco leaf curl Cuba virus (TbLCCuV),
Sida golden mosaic virus (SiGMV), Common bean severe mosaic virus (CBSMV), Common
bean mottle virus (CBMoV), Bean golden mosaic virus (BGMV) e Macroptilium yellow spot
virus (MaYSV), sendo os dois últimos de maior importância econômica no Brasil (FAUQUET
et al., 2008; FERNANDES-ACIOLI et al., 2011; SILVA et al., 2012; LIMA et al., 2013;
RAMOS-SOBRINHO et al., 2014; LEYVA et al., 2016; DURHAM et al., 2010; CHANGSIDORCHUK et al., 2017).
O primeiro begomovírus relatado no Brasil, o BGMV, foi observado infectando P.
vulgaris na década de 1960 (COSTA, 1975). O mosaico dourado do feijoeiro foi a primeira
doença causada por esse grupo de vírus que atingiu níveis epidêmicos no NM, os quais foram
associadas ao aumento das populações de mosca-branca que se desenvolveram em áreas com
plantio de soja (INOUE-NAGATA; LIMA; GILBERTSON, 2016). Surtos epidêmicos do
BGMV em plantios de feijoeiros foram, durante muito tempo, impulsionados por populações
nativas da mosca-branca B. tabaci espécie New World (NW, antigo biótipo A). Após introdução
da B. tabaci espécie Middle East-Asia Minor 1 [MEAM1, nativa do Velho Mundo (antigo
biótipo B)] no país, mesmo com o deslocamento da espécie NW, surtos de BGMV continuaram
a ser relatados, indicando que ambas espécies crípticas de B. tabaci são vetores eficientes na
transmissão do BGMV (INOUE-NAGATA; LIMA; GILBERTSON, 2016).
Além de plantas cultivadas, muitas espécies de plantas silvestres/daninhas têm sido
relatadas como hospedeiras de Begomovirus (IDRIS et al., 2003; JOVEL et al., 2004; FIALLOOLIVE et al., 2013; MUBIN et al., 2010), principalmente dentro das famílias Malvaceae,
Euphorbiaceae e Fabaceae (MORALES; ANDERSON, 2001; ASSUNÇÃO, 2006; TAVARES
et al.. 2012; SILVA et al., 2011, 2012; FIALLO-OLIVÉ; ZERBINI; NAVAS-CASTILLO,
2015). Alguns begomovírus descritos a partir Macroptilium lathyroides (espécie silvestre
leguminosa comumente encontrada em associação com campos de cultivo de feijoeiros) como
Macroptilium yellow mosaic virus (MaYMV-[JM]), Macroptilium yellow mosaic Florida virus
(MaYMFV), Macroptilium mosaic Puerto Rico virus (MaMPRV) e MaYSV são capazes de
infectar sistemicamente plantas de feijão comum e feijão-fava (AMARAKOON et al., 2008;
IDRIS et al., 2003; LIMA et al., 2013; RAMOS-SOBRINHO et al., 2014). O primeiro relato
de MaYSV ocorreu em 2009, infectando Macroptilium lathyroides, nos estados de Sergipe e
22
Paraíba (SILVA et al., 2012). Este mesmo vírus já foi descrito em outras hospedeiras
leguminosas não-cultivadas como Calopogonium mucunoides, Canavalia sp. (SILVA et al.,
2012) e, mais recentemente, em Desmodium glabrum (FONTENELE et al., 2016). É também
conhecido que M. lathyroides pode servir como hospedeiro alternativo para BGMV e BGYMV,
begomovírus de grande importância econômica na cultura dos feijoeiros (BRACERO;
RIVERA; BEAVER, 2003; RAMOS-SOBRINHO et al., 2014). No Brasil, outros begomovírus
infectando M. lathyroides foram relatados como Soybean chlorotic spot virus (SoCSV, COCO
et al., 2013), vírus inicialmente descrito em soja, Macroptilium yellow net virus (MaYNV) e
Macroptilium yellow vein virus (MaYVV) (SILVA et al., 2012; RAMOS-SOBRINHO et al.,
2014).
Análises de populações brasileiras de BGMV e MaYSV mostraram que a variação
genética entre os isolados de cada uma das espécies de begomovírus é similar em ambos
hospedeiros cultivados (P. vulgaris e P. lunatus) e não-cultivados (M. lathyroides), indicando
que os hospedeiros (a priori) não afetam a variabilidade genética desses vírus. Por outro lado,
resultados sugerem que a distribuição geográfica dos hospedeiros influencia na estrutura
genética de subpopulações do BGMV, mas não de MaYSV (RAMOS-SOBRINHO et al.,
2014). O alto grau de variabilidade genética nas populações de MaYSV, em comparação com
as populações de BGMV, foi atribuído aos numerosos eventos de recombinação em MaYSV.
Finalmente, MaYSV foi o begomovírus mais frequentemente encontrado em hospedeiras
leguminosas cultivadas no estado Alagoas em 2011, indicando uma possível substituição de
BGMV por MaYSV (RAMOS-SOBRINHO et al., 2014).
Acreditava-se que BGMV era o único begomovírus de importância econômica em
feijoeiros no Brasil, levando a aprovação do feijão comum transgênico Embrapa 5.1 resistente
ao BGMV, no qual resistência é devido ao silenciamento de RNA (BONFIM et al., 2007;
ARAGÃO et al., 2013). Entretanto, resultados mais recentes sugerem a emergência do MaYSV
como um dos principais begomovírus em campos de cultivo no Nordeste do Brasil, indicando
que BGMV já não é mais o único begomovírus de relevância econômica para os feijoeiros. É
importante salientar que a utilização da cultivar transgênica representa apenas uma estratégia
para o manejo de infecções por BGMV, não sendo resistente a outros vírus que infectam feijão,
incluindo Cowpea mild mottle virus (carlavírus transmitido por mosca-branca) e,
possivelmente, MaYSV e SiMMV (INOUE-NAGATA; LIMA; GILBERTSON, 2016). Esses
surtos contínuos de begomovírus demonstram que o manejo eficaz da doença continua sendo
um desafio.
23
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35
3 CAPÍTULO I:
NEW APPROACH FOR THE CONSTRUCTION OF INFECTIOUS CLONES OF A
CIRCULAR DNA PLANT VIRUS USING GIBSON ASSEMBLY
PUBLICADO - JOURNAL OF VIROLOGICAL METHODS
36
1
New approach for the construction of infectious clones of a circular DNA plant virus using
2
Gibson Assembly
3
4
Ferro, M.M.M.1, Ramos-Sobrinho, R.2*, Xavier, C.A.D.3, Zerbini, F.M.3, Lima, G.S.A.1,
5
Nagata, T.2, Assunção, I.P.1
6
7
1
8
Largo, AL, 57100-000, Brazil
9
2
Setor de Fitossanidade/Centro de Ciências Agrárias, Universidade Federal de Alagoas, Rio
Departamento de Biologia Celular, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade de Brasília,
10
Brasília, DF, 70910-900, Brazil
11
3
12
36570-900, Brazil
Departamento de Fitopatologia/BIOAGRO, Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, MG,
13
14
*Corresponding authors: R. Ramos-Sobrinho, e-mail: robertorsobrinho@gmail.com
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
Declarations of interest: none.
37
26
ABSTRACT
27
Viruses belonging to the genus Begomovirus (family Geminiviridae) have circular single-strand
28
DNA genome encapsidated into quasi-icosahedral particles, being transmitted by whiteflies of
29
the Bemisia tabaci complex. Biological and molecular properties of begomoviruses have been
30
studied efficiently with infectious clones, with dimeric constructions of genome components
31
being required for clone infectivity. However, current approaches employing enzymatic
32
digestion and ligation to binary vectors are laborious, mostly due to many cloning steps or
33
partial digestion by restriction enzyme. Here, an infectious clone of the bipartite begomovirus
34
Bean golden mosaic virus (BGMV) was obtained using PCR and Gibson Assembly (GA).
35
Common bean (Phaseolus vulgaris) seedlings displayed severe yellow mosaic and stunt
36
symptoms 15 days after agroinoculation with DNA-A and DNA-B of BGMV. The approach
37
based on PCR-GA protocol is a fast and useful tool to obtain infectious clones of a circular
38
DNA plant virus.
39
40
Keywords: Geminiviridae, seamless cloning, Gibson Assembly, begomovirus, infectious
41
clones
42
43
44
45
46
47
48
49
50
38
51
Viruses belonging to the genus Begomovirus (family Geminiviridae) infect cultivated
52
and wild plants in tropical and subtropical regions, causing serious economic losses (Navas-
53
Castillo et al., 2011; Rojas et al., 2018). Bipartite begomoviruses have two genomic
54
components known as DNA-A and DNA-B, while the genomes of monopartite begomoviruses
55
resemble the DNA-A segment. Both mono and bipartite are transmitted by whitefly cryptic
56
species into the sibling group Bemisia tabaci (Homoptera: Aleyrodidae) (Zerbini et al., 2017).
57
Bean golden mosaic virus (BGMV) is among the main begomoviruses infecting leguminous
58
plants, being considered the most important constraints to crops into the genus Phaseolus in
59
Brazil (Rojas et al., 2018).
60
The conventional approach to construct infectious clones of begomoviruses employs
61
restriction enzymes to generate more than one copy of the viral genome which contain two
62
replication origins (v-ori) (Buragohain et al., 1994; Bang et al., 2014; Nagata and Inoue-Nagata,
63
2015). The duplicated v-ori allow the release of the full-length viral genome, improving the
64
infectivity of the genomic components after agroinoculation (Stenger et al., 1991; Nagata and
65
Inoue-Nagata, 2015). A method based on rolling circle amplification (RCA) of viral genomes
66
followed by partial digestion with endonucleases has been described and largely used to obtain
67
infectious clones into the genus Begomovirus (Ferreira et al., 2008; Wu et al., 2008; Bang et
68
al., 2014; Nagata and Inoue-Nagata, 2015). Unfortunately, the partial enzymatic digestion
69
requires a laborious process of adjustments in conditions of the target DNA and enzyme
70
concentrations. Here, a new and simple approach to obtain infectious clones of begomoviruses
71
employing PCR-Gibson Assembly (GA) is described.
72
For this study, DNA-A and DNA-B genomic components of the begomovirus BGMV
73
isolate 173 AL (GenBank accession KJ939749 for DNA-A, MH925107 for DNA-B; Ramos-
74
Sobrinho et al., 2014), previously cloned into pBluescript KS+plasmid vectors were used as
75
PCR templates.
39
76
For geminivirus infectious clone assembly, it is necessary dimeric constructions
77
(containing at least two replication origins) for each genome segment. For this purpose, primers
78
were designated to amplify two slightly different units (1 and 2) with 20-22 nucleotides (nt)
79
overlap region between units 1 and 2, and 20 nt overlap between genome segments and plasmid
80
(Fig. 1, Table 1). Primer pairs BGMV-A-U1-For/BGMV-A-U1-Rev or BGMV-A-U2-
81
For/BGMV-A-U2-Rev were used to amplify units 1 and 2 of the BGMV DNA-A (Fig. 1a),
82
respectively, while BGMV-B-U1-For/BGMV-B-U1-Rev or BGMV-B-U2-For/BGMV-B-U2-
83
Rev were used for BGMV DNA-B (Fig. 1b). Primer pair pJL89-Nos-For/pJL89-no35S-Rev
84
was used to amplify the pJL-89 binary vector (Lindbo, 2007) excluding the 35S region of the
85
vector. DNA-A and DNA-B components were individually amplified using the Q5® High-
86
Fidelity DNA Polymerase (New England BioLabs, Ipswich, USA). Amplified fragments were
87
analyzed by electrophoresis using agarose gel (1%), individually purified using Gel Band
88
Purification Kit (GE Healthcare, Uppsala, Sweden), and treated with DpnI restriction enzyme
89
for degradation of methylated plasmid DNA used as template. Dimers of DNA-A and DNA-B
90
were assembled using Gibson Assembly® Cloning Master Mix (New England BioLabs)
91
following the manufacturer´s protocol. Briefly, 2.5 µL of pJL-89 amplified product (40 ng/µL),
92
2.2 µL of units 1 and 2 (DNA-A or DNA-B; 50 ng/µL), 1.0 µL of 10X CutSmart buffer, 1.1 µL
93
of ultrapure H2O, and 1.0 µL of DpnI were mixed and incubated at 37 ºC for 1 h, and then 10.0
94
µL of GA master mix was added and incubated at 50 ºC during 1h (an illustration for the PCR-
95
GA approach is shown in Supplementary Fig. 1). Finally, GA products were dialyzed during
96
15 min using VSWP 0.025 µm cellulose membrane (Merck-Millipore, Darmstadt, Germany),
97
and used to transform electrocompetent cells of Escherichia coli DH10B strain.
98
Colonies of transformed E. coli DH10B were grown on Luria-Bertani (LB) medium at
99
37 ºC for 18 h, and plasmid DNA was extract using the Wizard® Plus SV Minipreps DNA
100
Purification System (Promega, Madison, USA). In order to confirm the cloning process,
40
101
assembled plasmid DNA were individually digested with BamHI (DNA-A) or SpeI (DNA-B)
102
(Fig. 1). For DNA-A, fragments of about 3.0 and 6.9 kb, corresponding to the second copy of
103
the viral genome (unit 2) plus part of the binary vector (~0.4 kb) and the first copy of the viral
104
insert (unit 1) plus vector (~4.3 kb) were obtained. For DNA-B, fragments of 9.9 kb
105
corresponding to the linearized plasmid containing two copies (units 1 and 2) of the genomic
106
component plus the pJL-89 were obtained. Restriction enzyme sites used for cloning are shown
107
in Fig. 1. Viral inserts were sequenced at Macrogen Inc., and nucleotide sequences were
108
analyzed using the Geneious program (Kearse et al., 2012).
109
Constructions of DNA-A and DNA-B clones of BGMV (confirmed by enzymatic
110
digestion and sequencing) were used to transform Agrobacterium tumefaciens GV3101:pMP90
111
strain (background C58; pTiC58DT-DNA), and infectivity was tested by agroinfiltration
112
according to the protocol described in Hou et al. (1998). For agroinoculation of both viral
113
components, DNA-A and DNA-B A. tumefaciens GV3101 cultures were adjusted to an OD of
114
0.5 and mixed in equal volumes. Then, 0.5 mL of these mixed cultures were used to
115
agroinoculate 10 day-old seedlings of common bean (Phaseolus vulgaris L.) cv. ‘Pérola’ at four
116
sites approximately 1 cm below the shoot apex. Control plants were agroinoculated with A.
117
tumefaciens GV3101 containing empty pJL-89 vector. Inoculated plants were kept into
118
whitefly-proof cages at 25 ± 2 oC and photoperiod of 12 h during 30 days post agroinfiltration
119
(dpa). Symptoms of severe yellow mosaic and stunting were observed in inoculated plants 15
120
dpa (Fig. 2a). No symptoms were observed in the control plants (Fig. 2b).
121
In order to confirm viral infection, systemically infected leaf samples were collected at
122
15 and 30 dpa. Total DNA was extracted from each sample according to Doyle and Doyle
123
(1987), and used as templates for BGMV detection using the primer pairs BGMV-A-U2-
124
For/BGMV-A-U2-Rev or BGMV-B-U1-For/BGMV-B-U1-Rev, specific to the DNA-A and
41
125
DNA-B, respectively (Table 1). Expected fragments of about 2.6 kb (DNA-A or DNA-B) were
126
observed only from symptomatic plants in both sampling times (Fig. 2c and d).
127
Although the construction of infectious clones is a laborious process, this procedure has
128
been successfully used to better-understand the biological and molecular characteristics of
129
viruses and their interactions with plant hosts, with the single-step GA being a method used to
130
easy assembly of DNA molecules into an isothermal reaction (Gibson et al., 2009). Here, it has
131
been shown that this approach can be used to construct infectious clones of circular DNA plant
132
viruses as begomoviruses.
133
134
Acknowledgments
135
The authors wish to thank Dr. Alice Inoue-Nagata (Embrapa) for the support during plant
136
inoculation assays. M.M.M.F. was a CAPES doctoral fellowship. G.S.A.L. was supported by
137
CNPq grants (431109/2016-8). T.N. is research fellow of CNPq (CNPq 306377/2014-4). I.P.A.
138
was supported by CAPES/FAPEAL grants (60030000022/2014).
139
140
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186
187
188
189
190
191
192
193
194
195
196
197
44
198
Table 1. Primer sequences used for amplification of BGMV DNA-A and DNA-B genomic
199
components and pJL-89 binary vector.
200
201
202
203
204
205
206
207
208
209
210
211
212
213
214
215
216
Name
BGMV-A-U1-For
BGMV-A-U1-Rev
Sequence (5’ – 3’)
AACATGGTGGAGCACGACACTCTACGTTGTACATCTTGAA
AACGTAGAGGATCCACTTCACACAACGACC
BGMV-A-U2-For
BGMV-A-U2-Rev
TGTGAAGTGGATCCTCTACGTTGTACATCT
GAACGATCGGGGAAATTCGAACTTCACACAACGACCAGAA
DNA-A
BGMV-B-U1-For
BGMV-B-U1-Rev
AACATGGTGGAGCACGACACTGAGCGTGTTTTTGAAATCC
AACACGCTCAACTAGTTGCGGAACTGAAAT
DNA-B
BGMV-B-U2-For
BGMV-B-U2-Rev
GTTCCGCAACTAGTTGAGCGTGTTTTTGAA
GAACGATCGGGGAAATTCGATGCGGAACTGAAATAGACGG
DNA-B
pJL89-Nos-For
pJL89-no35S-Rev
TCGAATTTCCCCGATCGTTC
GTGTCGTGCTCCACCATGTT
pJL-89
Target
DNA-A
45
217
List of figures
218
Fig. 1. Strategy to construct dimeric agroinfectious clone of BGMV into pJL-89 binary vector.
219
(a) DNA-A genomic component; viral inserts (first and second units) are represented by grey
220
rectangles; primer-pairs containing overlap sequences are indicated by grey arrows. (b) DNA-
221
B genomic component; viral inserts (first and second units) are represented by grey rectangles;
222
primer-pairs containing overlap sequences are indicated by grey arrows. BamHI (DNA-A) and
223
SpeI (DNA-B) restriction sites are represented by dotted rectangles.
224
225
Fig. 2. Agroinoculation tests using infectious clone of BGMV. (a) common bean cv. ‘Pérola’
226
displaying yellow mosaic symptoms; (b) symptomless control plant; (c) BGMV DNA-A
227
detection from symptomatic plants 15 dpa (lanes 1-5) and 30 dpa (lanes 6-10); no amplification
228
fragment was observed from control plants (lanes 11 and 12); (d) BGMV DNA-B detection
229
from symptomatic plants 15 dpa (lanes 1-5) and 30 dpa (lanes 6-10); no amplification fragment
230
was observed from control plants (lanes 11 and 12).
231
232
Supplementary Fig. 1. PCR-GA approach for construction of infectious clones of circular
233
DNA plant viruses as begomoviruses. Grey color represents the plasmid vector where a full-
234
length copy of the viral genomic component (indicated in green) was inserted; binary plasmid
235
vector is represented by dark color; blue and yellow represent the two slightly different viral
236
units (amplified from the monomeric clone) containing overlapping regions required for GA.
237
238
239
240
241
46
242
243
244
245
246
247
248
Fig. 1.
47
249
250
251
252
253
254
255
256
257
258
259
260
Fig. 2.
48
261
262
263
Supplementary Fig. 1.
49
4 CAPÍTULO II
CONSTRUÇÃO DE CLONE INFECCIOSO E DETERMINAÇÃO DA GAMA DE
HOSPEDEIROS DO BEGOMOVÍRUS Macroptilium yellow spot virus
50
1
Construção de clone infeccioso e determinação da gama de hospedeiros do begomovírus
2
Macroptilium yellow spot virus
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
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25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
RESUMO
O gênero Begomovirus (família Geminiviridae) inclui vírus com genoma composto por uma ou
duas moléculas de DNA fita simples, são transmitidos por um complexo de espécies crípticas
de Bemisia tabaci e infectam plantas dicotoledôneas. Dentre os principais problemas
fitossanitários que afetam a cultura dos feijoeiros, destacam-se as begomoviroses, que podem
causar até 100% de perdas. No Brasil, Bean golden mosaic virus (BGMV) e Macroptilium
yellow spot virus (MaYSV) são os begomovírus de maior importância econômica para os
feijoeiros. A emergência do MaYSV como um dos principais begomovírus em campos de
cultivo de feijoeiros no Nordeste do Brasil ressalta a importância de melhor compreender a
biologia desta espécie viral. Portanto, o objetivo do presente estudo foi a obtenção de clone
infeccioso de MaYSV, utilizando-se o método PCR-GA, e a determinação da sua gama de
hospedeiros. Clones dos componentes DNA-A e DNA-B de MaYSV (isolado 100AL) foram
utilizados para construção de clones infecciosos via Gibson Assembly (GA). Alíquotas das
reações de GA foram utilizadas para transformar células eletrocompetentes de Escherichia coli
DH10B, e a ligação dos fragmentos virais em vetor binário pJL-89 foi confirmada por digestão
enzimática e sequenciamento. DNA plasmidial das contruções confirmadas foi utilizado para
transformação de Agrobacterium tumefaciens (cepa GV3101), e a infectividade dos clones foi
testada via agroinoculação em plantas de feijão comum ‘cv. Pérola’. DNA total foi extraído a
partir de amostras foliares (infectadas sistemicamente) coletadas aos 15 e 30 dias após
agroinfiltração (daa), e utilizado como template para detecção viral utilizando primers espécieespecíficos. As plantas agroinfiltradas com o clone infeccioso apresentaram sintomas de
mosaico amarelo severo 15 daa, enquanto as plantas controle (pJL-89 sem insertos virais) foram
assintomáticas. Ambos os componentes genômicos DNA-A e DNA-B de MaYSV foram
detectados em folhas infectadas sistemicamente. Este é o primeiro relato da construção de um
clone agroinfeccioso do begomovírus Macroptilium yellow spot virus usando Gibson
Assembly. Nos testes de gama de hospedeiros, o clone infeccioso de MaYSV, foi capaz de
infectar sistemicamente e causar sintomas de mosaico e subdesenvolvimento em P. vulgaris.
Palavras-chave: Geminivírus, Macroptilium lathyroides, Gibson Assembly, MaYSV.
51
41
42
ABSTRACT
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
61
62
63
64
65
66
67
The genus Begomovirus (family Geminiviridae) includes viruses with a genome composed of
one or two single-stranded DNA molecules, are transmitted by a complex of cryptic Bemisia
tabaci species and infect dicotyledonous plants. Among the major phytosanitary problems that
affect bean culture, begomoviruses stand out, which can cause up to 100% losses. In Brazil,
Bean golden mosaic virus (BGMV) and Macroptilium yellow spot virus (MaYSV) are the
begomovirus of major economic importance for the leguminous. The emergence of MaYSV as
one of the main begomoviruses in bean fields in Northeast Brazil highlights the importance of
better understanding the biology of this viral species. Therefore, the objective of the present
study was to obtain an infectious clone of MaYSV, using the PCR-GA method, and the
determination of its host range. Clones of the DNA-A and DNA-B components of MaYSV
(isolated 100AL) were used to construct infectious clones by Gibson Assembly (GA). Aliquots
of the GA reactions were used to transform Escherichia coli DH10B electrocompetent cells,
and binding of the viral fragments into pJL-89 binary vector was confirmed by enzymatic
digestion and sequencing. Plasmid DNA from the confirmed constructs was used for
transformation of Agrobacterium tumefaciens (strain GV3101), and the infectivity of the clones
was tested by agroinoculation in common bean 'cv. Pérola'. Total DNA was extracted from leaf
samples (systemically infected) collected at 15- and 30-days post agroinfiltration (dpa), and
used as template for viral detection using species-specific primers. Inoculated plants with the
infectious clone showed symptoms of severe yellow mosaic and stunting 15 dpa, whereas
control plants (pJL-89 without viral inserts) were asymptomatic. Both genomic DNA-A and BDNA components of MaYSV were detected in systemically infected leaves. This is the first
report of the construction of an agroinfectious clone of begomovirus Macroptilium yellow spot
virus using Gibson Assembly. For the host range experiments, the MaYSV infectious clone
was able to infect systemically and cause mosaic and stunting symptoms in P. vulgaris.
68
Keywords: Geminiviruses, Macroptilium lathyroides, Gibson Assembly, MaYSV.
69
70
71
72
73
74
75
76
77
78
52
79
4.1 INTRODUÇÃO
80
81
A família Geminiviridae possui vírus com genoma de DNA circular de fita simples
82
encapsidados em partículas geminadas de morfologia quasi-icosaédrica, e inclui nove gêneros
83
estabelecidos com base na organização genômica, filogenia, inseto-vetor e gama de hospedeiros
84
(VARSANI et al., 2014, 2017; ZERBINI et al., 2017). O gênero Begomovirus é considerado o
85
mais importante economicamente e maior em número de espécies, as quais possuem genomas
86
monopartidos ou bipartidos, conhecidos como DNA-A e DNA-B, e são transmitidas por um
87
complexo de espécies crípticas de Bemisia tabaci (BROWN et al., 2015; NAVAS-CASTILLO
88
et al., 2011; ROJAS et al., 2005).
89
Dentre as espécies de begomovírus que infectam leguminosas, Bean golden mosaic
90
virus (BGMV) e Macroptilium yellow spot virus (MaYSV) são consideradas as mais
91
importantes no Brasil (RAMOS-SOBRINHO et al., 2014). Além de plantas cultivadas,
92
Macroptilium lathyroides, planta não-cultivada encontrada comumente em associação com
93
feijoeiros, tem sido relatada como hospedeira dos begomovírus Macroptilium yellow mosaic
94
virus, Macroptilium yellow mosaic Florida virus, Macroptilium mosaic Puerto Rico virus e
95
MaYSV, os quais são capazes de infectar sistemicamente plantas de feijão comum (Phaseolus
96
vulgaris) e feijão-fava (P. lunatus) (AMARAKOON et al., 2008; IDRIS et al., 2003; SILVA et
97
al., 2012; LIMA et al., 2013; RAMOS-SOBRINHO et al., 2014). É também conhecido que M.
98
lathyroides pode servir como hospedeiro alternativo para Bean golden yellow mosaic virus e
99
BGMV, begomovírus de grande importância econômica na cultura dos feijoeiros nas américas
100
(BRACERO; RIVERA; BEAVER, 2003; RAMOS-SOBRINHO et al., 2014). Dada a
101
emergência do MaYSV como um dos principais begomovírus em campos de cultivo de
102
feijoeiros no Nordeste do Brasil, é crucial o melhor entendimento da biologia desta espécie
103
viral.
104
A técnica de construção de clones infecciosos permite a elucidação de vários aspectos
105
da replicação viral e interação vírus/hospedeiro/vetor, bem como auxiliar no screening de
106
variedades resistentes em programas de melhoramento genético de espécies cultivadas.
107
Diversas estratégias para a construção de clones infeciosos de begomovírus têm sido relatadas
108
(BURAGOHAIN et al., 1994; FERREIRA et al., 2008; NAGATA; INOUE-NAGATA, 2015;
109
STENGER et al., 1991), sendo recentemente descrita uma abordagem rápida empregando PCR
110
e Gibson Assembly (PCR-GA) (FERRO et al., 2019). No presente trabalho, um clone
111
infeccioso de MaYSV foi obtido através de PCR-GA, o qual foi infectivo em plantas de
112
Phaseolus vulgaris cv. ‘Pérola’.
53
113
4.2 MATERIAL E MÉTODOS
114
4.2.1 Isolado viral e obtenção dos clones de MaYSV
115
116
Os componentes genômicos DNA-A e DNA-B de MaYSV (isolado 100AL; número de
117
acesso GenBank KJ939861), previamente clonados em vetor plasmidial pBluescript KS+
118
(RAMOS-SOBRINHO et al., 2014), foram utilizados para construção de clones infecciosos via
119
PCR-GA (FERRO et al., 2019).
120
121
4.2.2 Construção de clone infeccioso de MaYSV por Gibson Assembly
122
123
Para a construção de clone infeccioso de geminivírus, é necessário clonar duas unidades
124
(dímero) de cada segmento do genoma (no mínimo duas origens de replicação) no mesmo
125
plasmídeo. Para isto, primers foram desenvolvidos para amplificar duas unidades do genoma
126
(1 e 2) com 20-22 nucleotídeos (nt) de sobreposição entre as unidades 1 e 2, e 20 nt sobrepostos
127
entre os segmentos genômicos e o vetor plasmidial (Figura 1; Tabela 1). Os pares de primers
128
MaYSV_A-U1_For/MaYSV_A-U1_Rev e MaYSV_A-U2_For/MaYSV_A-U2_Rev foram
129
utilizados para amplificar as unidades 1 e 2 do DNA-A de MaYSV, respectivamente, enquanto
130
MaYSV-B-U1-For/MaYSV-B-U1-Rev
131
ultilizados para o DNA-B de MaYSV (Tabela 1). O vetor binário pJL-89 (LINDBO, 2007) foi
132
amplificado com os primers pJL89_Nos_For/pJL89_no35S_Rev (Tabela 1).
e
MaYSV-B-U2-For/MaYSV-B-U2-Rev
foram
133
Clones do DNA-A e DNA-B foram utilizados, individualmente, como molde para as
134
reações de amplificação com a enzima Q5® High-Fidelity DNA Polymerase (New England
135
BioLabs, Ipswich, USA). Os fragmentos amplificados foram analisados em gel de agarose a
136
1%, individualmente purificados usando Gel Band Purification Kit (GE Healthcare, Uppsala,
137
Sweden) e tratados com a enzima DpnI para degradação do DNA plasmidial metilado usado
138
como molde. Posteriormente, os dímeros do DNA-A e DNA-B foram montados usando Gibson
139
Assembly® Cloning Master Mix (New England BioLabs) segundo o protocolo descrito pelo
140
fabricante. Resumidamente, 2,5 µL do vetor pJL-89 purificado em gel (40 ng\µL), 2,2 µL das
141
unidades 1 e 2 do genoma viral purificados em gel (DNA-A ou DNA-B; 50 ng\µL), 1 µL do
142
Tampão 10X CutSmart, 1,1 µL de H2O ultrapura, e 1,0 µL de DpnI foram misturados e
143
incubados a 37ºC por 1h. Aos 10 µL totais da reação foram adicionados 10 µL do mix GA
144
(volume total de 20 µL) e incubados a 50ºC por 1 h. Após a incubação, a reação foi dialisada,
145
por 15 minutos, utilizando uma membrana de celulose (VSWP, 0.025 µm) (Merck-Millipore,
146
Darmstadt, Germany).
54
147
Alíquotas das reações de GA (2 µL) foram usadas para transformação de células
148
eletrocompetentes de E. coli (cepa DH10B). Colônias bacterianas foram repicadas para meio
149
Luria-Bertani (LB) líquido e incubadas a 37ºC por 18 horas. Após incubação, as culturas foram
150
submetidas à extração de DNA plasmidial com KIT Wizard® Plus SV Minipreps DNA
151
Purification System (Promega, Madison, USA). Para a confirmação do processo de clonagem,
152
DNA plasmidial foi digerido com as enzimas BamHI (DNA-A) e SpeI (DNA-B), e também
153
sequenciados na Macrogen, Inc. (Seul, Coréia do Sul). As sequências nucleotídicas dos
154
possíveis clones infecciosos foram analisadas utilizando o software Geneious (KEARSE et al.,
155
2012).
156
157
4.2.3 Ensaios de agroinfiltração do clone infeccioso de MaYSV
158
159
As construções dos clones do DNA-A e DNA-B de MaYSV (confirmadas por digestão
160
enzimática e sequenciamento) foram usadas para transformação de Agrobacterium tumefaciens
161
cepa GV3101:pMP90 (background C58; pTiC58DT-DNA), e a infectividade testada por
162
agroinfiltração de acordo com o protocolo descrito em Hou et al. (1998). Os ensaios foram
163
realizados em casa de vegetação no Centro de Ciências Agrárias da Universidade Federal de
164
Alagoas (CECA/UFAL). Para a agroinoculação de ambos os componentes virais, as culturas
165
de A. tumefaciens GV3101 do DNA-A e DNA-B foram ajustadas para uma OD600 de 0,5 e
166
misturadas em volumes iguais. Em seguida, 0,5 mL dessas culturas em mistura foram utilizadas
167
para agroinocular mudas de feijoeiro (Phaseolus vulgaris L.) cv. ‘Pérola’, com 10 dias de idade,
168
em quatro locais aproximadamente 1 cm abaixo do ápice da parte aérea. Plantas controle foram
169
agroinfiltradas com A. tumefaciens GV310 contendo vetor pJL-89 vazio (sem inserto viral). As
170
plantas agroinfiltradas foram mantidas em gaiolas com proteção de tela anti-mosca-branca a 25
171
± 2 oC e fotoperíodo de 12 h.
172
DNA total foi individualmente extraído a partir amostras foliares coletadas aos 15 e 30
173
dias após agroinfiltração (daa) (DOYLE; DOYLE, 1987), e utilizado como molde para detecção
174
de MaYSV usando os pares de primers específicos MaYSV-Det_1137_For/MaYSV-
175
Det_1427_Rev (DNA-A) ou MaYSV-B_Det_1311_For/MaYSV-B_Det_1640_Rev (DNA-B)
176
(Tabela 1). As reações de PCR foram realizadas em um volume final de 15 µL, contendo 1,5
177
µL de tampão 10X PCR, 1,2 µL da mistura de dNTPs a 10 mM, 1 µL de cada oligonucleotídeo
178
a 10 μM, 10 ng do DNA molde, e uma unidade de Taq DNA Polymerase, completando-se o
179
volume com H2O ultrapura. As condições de termociclagem consistiram em uma desnaturação
180
inicial de 94ºC por 3 minutos e 35 ciclos de desnaturação a 94ºC por 45 segundos, anelamento
55
181
a 55ºC por 30 segundos e extensão a 72ºC por 90 segundos, seguindo de uma extensão final a
182
72ºC por 10 minutos. Os produtos amplificados foram analisados em gel de agarose a 1% sob
183
luz UV.
184
185
4.2.4 Determinação da gama de hospedeiros de MaYSV
186
187
O clone infeccioso dos componentes DNA-A e DNA-B de MaYSV foi agroinoculado
188
pelo método de punção com agulha (HOU et al., , 1998) em plantas das famílias Solanaceae
189
(Solanum lycopersicum ‘Cruz Cada Paulista’, Capsicum annuum ‘Casca Dura Ikeda’ e
190
Nicotiana benthamiana) e Fabaceae (Glycine max ‘Davis’, Phaseolus vulgaris ‘Pérola’, P.
191
lunatus ‘G51’ e Macroptilium lathyroides). Em Nicotiana benthamiana, três folhas jovens
192
foram agroinfiltradas na face abaxial com seringas sem agulhas. As culturas de A. tumefaciens
193
GV3101 do DNA-A e DNA-B foram ajustadas para uma OD600 de 0,5, misturadas em volumes
194
iguais e, em seguida, 0,5 mL da solução foi utilizada para agroinocular cinco mudas de cada
195
espécie testada. Plantas controle foram agroinoculadas com culturas de A. tumefaciens (cepa
196
GV3101) contendo vetor pJL-89 vazio (sem DNA viral). As plantas foram mantidas em gaiolas
197
com proteção de tela anti-mosca-branca, com o surgimento de sintomas sendo monitorado por
198
30 daa, e a infecção viral confirmada via PCR usando primers específicos (Tabela 1).
199
200
4.3 RESULTADOS
201
202
4.3.1 Confirmação da construção do clone infeccioso de MaYSV por Gibson Assembly
203
204
Dímeros com aproxidamente 9,9 kb em comprimento (2,6 kb para cada unidade
205
genômica viral e 4,7 kb para o vetor pJL-89) foram obtidos para ambos componentes DNA-A
206
e DNA-B de MaYSV (isolado 100AL) utilizando a abordagem de Gibson Assembly (Figura 1a
207
e b). Digestão das construções para o componente DNA-A com a endonuclease BamHI mostrou
208
a presença de dois fragmentos, um de 3,0 kb, correspondente a unidade 2 do genoma viral (2,6
209
kb) mais 0,4 kb do vetor pJL-89, e outro de aproximadamente 6,9 kb, correspondente a unidade
210
1 do genoma viral (2,6 kb) mais 4,3 kb do vetor binário pJL-89. Para o componente DNA-B,
211
após digestão com SpeI, foi observada a presença de um fragmento com aproximadamente 9,9
212
kb, correspondente à soma das unidades 1 e 2 do genoma viral (2,6 kb cada) e o vetor binário
213
pJL89 (4,7 kb) (Figura 2a e b). Adicionalmente, construções foram confirmadas através de
214
sequenciamento Sanger do DNA plasmidial.
56
215
4.3.2 Avaliação da infectividade do clone de MaYSV
216
217
As plantas de feijão-comum cv. ‘Pérola’ agroinoculadas com as construções diméricas
218
de MaYSV apresentaram sintomas de mosaico dourado 15 daa, enquanto plantas agroinfiltradas
219
com Agrobacterium contendo apenas vetor pJL-89 vazio (sem inserto viral) não demonstraram
220
sintomas de infecção viral 30 daa (Figura 3a e b). Folhas sistêmicas (não inoculadas), a partir
221
de plantas sintomáticas, foram PCR positivas para ambos componentes genômicos DNA-A
222
(840 pb) e DNA-B (320 pb) aos 15 e 30 daa. As plantas controle foram PCR negativas em
223
ambos tempos de amostragem (Figura 3c e d).
224
225
4.3.3 Determinação da gama de hospedeiros de MaYSV
226
227
Sintomas de infecção viral como mosaico e subdesenvolvimento foram observados em
228
plantas de feijão-comum (Figura 4). O componente genômico DNA-A foi detectado, via PCR,
229
em folhas de feijão-comum infectadas sistemicamente (não inoculadas) a partir de quatro das
230
cinco plantas inoculadas. Já o DNA-B foi detectado em três das cinco plantas inoculadas.
231
Apesar de assintomáticas, DNA-A e DNA-B foram detectados em cinco e quatro das cinco
232
plantas de N. benthamiana inoculadas, respectivamente (Figura 6). Em S. lycopersicum, foi
233
detectado apenas o componente genômico DNA-A em uma das cinco plantas inoculadas, sem
234
sintoma sendo observado. As plantas de G. max, P. lunatus, M. lathyroides e C. annuum não
235
apresentaram sintomas de infecção viral, e testaram negativas para ambos componentes
236
genômicos (Tabela 2).
237
238
4.4 DISCUSSÃO
239
240
No Brasil, desde a década de 1970, o Bean golden mosaic virus (BGMV) tem sido um
241
importante patógeno infectando Phaseolus spp. (COSTA, 1976; FARIA e MAXWELL, 1999;
242
FARIA et al., 2000), causando perdas de produção entre 40 e 100% (MORALES, 2010). Além
243
do BGMV, outras espécies de begomovírus como MaYSV e Sida micrantha mosaic virus
244
(SimMV) foram relatadas infectando feijoeiros e hospedeiras leguminosas não-cultivadas no
245
Brasil (FERNANDES-ACIOLI et al., 2011; SILVA et al., 2012; RAMOS-SOBRINHO et al,
246
2014; INOUE-NAGATA; LIMA; GILBERTSON, 2016). O primeiro relato de MaYSV ocorreu
247
em 2009, infectando Macroptilium lathyroides, nos estados de Sergipe e Paraíba (SILVA et al.,
248
2012), sendo posteriormente descrito em outras hospedeiras leguminosas cultivadas e não-
57
249
cultivadas nos estados de Alagoas e Pernambuco (FONTENELE et al. 2016; RAMOS-
250
SOBRINHO et al. 2014). Em 2011, MaYSV foi o begomovírus mais frequentemente
251
encontrado em hospedeiras leguminosas cultivadas no estado Alagoas, indicando uma possível
252
substituição do BGMV como principal begomovírus em feijoeiros (RAMOS-SOBRINHO et
253
al., 2014). Esta situação pode já estar consolidada para o estado de Alagoas e, provavelmente,
254
para outros estados da região Nordeste. Em contraste, MaYSV não foi descrito em lavouras de
255
feijão-comum em áreas produtoras situadas nas regiões Centro-Oeste e Sudeste, onde BGMV
256
foi o begomovírus prevalente (RAMOS-SOBRINHO et al. 2014).
257
A construção de clones infecciosos dos begomovírus que ocorrem em feijoeiros no
258
Brasil é fundamental para ampliar as pesquisas de caracterização molecular e biológica,
259
identificar a gama de hospedeiros desses patógenos, além de auxiliar programas de
260
melhoramento genético visando resistência contra infecção viral. Para o gênero Begomovirus,
261
a obtenção de clones infecciosos tem sido comumente realizada pela abordagem de RCA
262
(rolling circle amplification) e posterior digestão enzimática (FERREIRA et al., 2008; WU et
263
al., 2008; NAGATA; INOUE-NAGATA, 2015; BANG et al., 2014). Entretanto, um método
264
rápido e eficiente baseado em PCR e Gibson Assembly (PCR-GA) foi recentemente publicado
265
(FERRO et al., 2019), o qual foi empregado para a construção do clone agroinfeccioso de
266
MaYSV relatado no presente estudo.
267
GA combina a ação de três enzimas em uma única reação: T5 exonuclease, DNA
268
polimerase e DNA ligase termoestáveis (GIBSON et al., 2009). Esse método de clonagem foi
269
utilizado com sucesso para montar o genoma de Mycoplasma genitalium (GIBSON et al.,
270
2009), o genoma mitocondrial de camundongo (GIBSON et al., 2010), e produzir diferentes
271
construções para análise de genes em Trypanosoma brucei (McALLASTER et al., 2016). A
272
técnica foi ainda aplicada para montar os genomas do Dengue virus (DENV), West nile
273
virus (WNV)
274
(SIRIDECHADILOK et al., 2013; VANDERGAAST et al., 2014; SUHARDIMAN et al.,
275
2015).
e
Porcine
reproductive
and
respiratory
syndrome
virus (PRRSV)
276
O procedimento de clonagem GA também tem sido utilizado para a construção de clones
277
infecciosos de vírus de plantas com genoma de RNA. Bordat et al. (2015) utilizaram GA para
278
construir um clone infeccioso a partir do cDNA do potivírus Lettuce mosaic virus (LMV). A
279
mesma estratégia foi empregada na obtenção de clones infecciosos do Tomato blistering mosaic
280
virus (Tymovirus, BLAWID; NAGATA, 2015), Bean rugose mosaic virus (Comovirus,
281
BIJORA et al., 2017), Cowpea mild mottle virus (CPMMV; CARVALHO et al., 2017) e do
282
polerovírus Beet chlorosis virus (WETZEL et al., 2018).
58
283
A infectividade das construções diméricas do MaYSV (isolado 100AL) foi confirmada
284
em plantas de feijão-comum cv. ‘Pérola’, com sintomas sendo semelhante aos observados em
285
condições de campo (RAMOS-SOBRINHO et al., 2014). Além disso, MaYSV foi capaz de
286
infectar sistemicamente plantas de tomate e N. benthamiana. Em feijão-comum, os sintomas
287
ocorreram apenas em plantas onde foram detectados DNA-A e DNA-B, ressaltando a
288
importância da presença de ambos os componentes genômicos para o estabelecimento da
289
infecção sistêmica na planta hospedeira (BROWN et al., 2012; 2015). Por outro lado, estudos
290
demonstraram que o isolado do begomovírus bipartido Tomato chlolorotic mottle virus
291
[ToCMV-(MG-Bt1)] foi capaz de infectar sistemicamente e induzir sintomas em N.
292
benthamiana e tomateiro na ausência do DNA-B (GALVÃO et al., 2003; FONTENELLE et
293
al., 2007). Curiosamente, o clone infeccioso do MaYSV não foi capaz de infectar P. lunatus,
294
planta hospedeira original do isolado 100AL, e Macroptilium lathyroides, reservatório natural
295
dessa virose (SILVA et al., 2012; LIMA et al., 2013; RAMOS-SOBRINHO et al., 2014). Estes
296
dados indicam uma melhor adaptação do MaYSV em P. vulgaris, podendo ser responsável pela
297
predominância do MaYSV em plantações de feijoeiros no Nordeste do Brasil. Resultados
298
similares foram observados para o begomvírus Soybean chlorotic spot virus (SoCSV), o qual
299
foi descrito inicialmente em soja, porém induz sintomas mais severos em P. vulgaris que em
300
Glycine max, sua planta hospedeira natural (COCO et al., 2013). O BGMV provoca sintomas
301
devastadores em feijoeiros (seus hospedeiros naturais), porém sintomas mais leves em soja, não
302
comprometendo a produtividade desta cultura (FERNANDES et al., 2009).
303
Os componentes genômicos DNA-A e DNA-B foram detectados na maioria das plantas
304
de N. benthamiana agroinoculadas, porém não foram observados sintomas de infecção durante
305
o período de avaliação. Já em S. lycopersicum, foi detectado apenas o componente genômico
306
DNA-A em uma das plantas testadas, não sendo observado nenhum sintoma de infecção viral.
307
Estes dados sugerem que a gama de hospedeiros de MaYSV seja restrita a membros da família
308
Fabaceae, já que essa virose foi descrita apenas em leguminosas (SILVA et al., 2012; RAMOS-
309
SOBRINHO et al., 2014; FONTENELE et al., 2016). Resultados similares foram observados
310
para o begomovírus Tomato rugose mosaic virus (ToRMV), o qual apresenta a gama de
311
hospedeiros restrita a plantas da família Solanaceae (FERNANDES et al., 2006). Foi também
312
demonstrada a capacidade de outros begomovírus infectarem mais de uma família botânica
313
como Tomato yellow spot virus (ToYSV), Tomato chlorotic mottle virus (ToCMoV),
314
Passionfruit severe leaf distortion virus (PSLDV) e SoCSV (CALEGARIO et al., 2007;
315
RIBEIRO et al., 2007; FERREIRA et al., 2010; COCO et al., 2013). No teste de gama de
316
hospedeiros, observou-se ainda uma baixa taxa de infectividade do agroclone de MaYSV em
59
317
hospedeiras leguminosas como Macroptilium lathyroides e P. lunatus, sendo necessária a
318
utilização de outros métdos de inoculação antes de uma conclusão definitiva sobre a
319
infectividade de MaYSV nessas hospedeiras. Finalmente, o clone infeccioso descrito no
320
presente estudo pode ser útil para estudos de interações vírus-planta-vetor, e caracterização de
321
genes virais.
322
323
4.5 CONCLUSÕES
324
325
Este é o primeiro relato da construção de um clone agroinfeccioso do begomovírus
326
Macroptilium yellow spot virus, o qual é biologicamente ativo em plantas de feijão-comum (P.
327
vulgaris), N. benthamiana e tomate (S. lycopersicum). O isolado 100AL de MaYSV apresentou
328
melhor adaptação em P. vulgaris, onde foram observados sintomas e infecção sistêmica, que
329
em M. lathyroides e P. lunatus, consideradas reservatórios naturais dessa espécie viral.
330
Entretanto, os testes de gama de hospedeiros devem ser repetidos antes de uma conclusão
331
definitiva.
332
333
334
335
336
337
338
339
340
341
342
343
344
345
346
347
348
349
60
350
Tabela 1. Sequências de primers usadas para para amplificação dos componentes genômicos
351
DNA-A e DNA-B de MaYSV e do vetor binário pJL89.
352
353
Nome
MaYSV_A-U1_For
MaYSV_A-U1_Rev
Sequência (5’ – 3’)
AACATGGTGGAGCACGACACTCTACGTTGTACATCTTGAA
AACGTAGAGGATCCACTTCACACAACGACC
DNA-A
MaYSV_A-U2_For
MaYSV_A-U2_Rev
TGTGAAGTGGATCCTCTACGTTGTACATCT
GAACGATCGGGGAAATTCGAACTTCACACAACGACCAGAA
DNA-A
MaYSV-B_U1_For
MaYSV-B_U1_Rev
AACATGGTGGAGCACGACACTGAGCGTGTTTTTGAAATCC
AACACGCTCAACTAGTTGCGGAACTGAAAT
DNA-B
MaYSV_B-U2_For
MaYSV-B_U2_Rev
GTTCCGCAACTAGTTGAGCGTGTTTTTGAA
GAACGATCGGGGAAATTCGATGCGGAACTGAAATAGACGG
DNA-B
pJL89_Nos_For
pJL89_no35S_Rev
TCGAATTTCCCCGATCGTTC
GTG TCG TGC TCC ACC ATG TT
pJL-89
MaYSV_A_Det_308_For
MaYSV_A_Det_1149_Rev
GGAGGTGGAGGTCCAAAAA
TCTGGGACGACATATTTAGT
DNA-A
MaYSV-B_Det_1311_For
MaYSV-B_Det_1640_Rev
GTTGTTTATTATTTCCAAGCATTG
TCTATAGGAGTCAGCTCAAAT
DNA-B
Alvo
61
354
Tabela 2. Avaliação da infecção de plantas agroinoculadas com clone infeccioso de MaYSV.
355
Espécie, ‘cultivar’
Phaseolus vulgaris ‘Pérola’
356
357
358
359
360
361
362
363
364
365
366
367
368
369
370
371
MaYSV (DNA-A)
Plantas
infectadas/agroinoculadas
4/5
Glycine max ‘Davis’
0/5
Macroptilium lathyroides
0/5
P. lunatus ‘G51’
0/4
Nicotiana benthamiana
5/5
Solanum lycopersicum ‘Cruz Kada Paulista’
1/5
Capsicum annuum ‘Casca Dura Ikeda’
0/5
* DNA-A (detecção com primer para o DNA-A);
DNA-B (detecção com primer para o DNA-B);
Controle (plantas agroinoculadas somente com o vetor pJL-89).
MaYSV (DNA-B)
Plantas
infectadas/agroinoculadas
3/5
Controle (DNA-A e B)
Plantas
infectadas/agroinoculadas
0/5
0/5
0/5
0/4
4/5
0/5
0/5
0/5
0/5
0/4
0/5
0/5
0/5
Sintomas
Mosaico e
subdesenvolvimento
Sem sintomas aparentes
-
62
372
373
Figura 1. Estratégia para construção do clone agroinfeccioso dimérico de MaYSV em vetor
374
binário pJL-89. (a) componente genômico DNA-A; inserções virais (primeira e segunda
375
unidades) são representadas por retângulos cinzas; pares de iniciadores contendo sequências de
376
sobreposição são indicados por setas cinzas. (b) componente genômico DNA-B; inserções
377
virais (primeira e segunda unidades) são representadas por retângulos cinzas; pares de
378
iniciadores contendo sequências de sobreposição são indicados por setas cinzas. Os sítios de
379
restrição de BamHI (DNA-A) e SpeI (DNA-B) são representados por retângulos tracejados.
63
380
381
Figura 2. Padrão eletroforético das reações de digestão para confirmação da clonagem. (a)
382
Perfil da digestão do clone com BamHI para o componente DNA-A de MaYSV (b) Perfil da
383
digestão do clone com SpeI para o componente DNA-B de MaYSV.
384
385
386
387
Figura 3. Teste de agroinfiltração usando o clone infeccioso de MaYSV. (a) feijão comum cv.
388
‘Pérola’ exibindo sintomas de mosaico dourado; (b) planta controle assintomática; (c) detecção
389
do DNA-A de MaYSV a partir de plantas sintomáticas 15 daa (linhas 1-4) e 30 daa (linhas 5-
390
8); nenhum fragmento de amplificação foi observado nas plantas controle (linhas 9 e 10); (d)
391
detecção do DNA-B de MaYSV a partir de plantas sintomáticas 15 daa (linhas 1-4) e 30 daa
392
(linhas 5-8); nenhum fragmento de amplificação foi observado nas plantas controle (linhas 9 e
393
10).
64
394
395
396
Figura 4. Sintomas observados em plantas de P. vulgaris agroinoculadas com o clone
397
infeccioso de MaYSV. (a) feijão comum cv. ‘Pérola’ exibindo sintomas de mosaico e
398
subdesenvolvimento; (b) planta controle assintomática.
399
400
401
402
Figura 5. Padrão eletroforético em gel de agarose (1%) da confirmação da infecção viral via
403
PCR em plantas de N. benthamiana. M, marcador de comprimento (“1Kb plus DNA ladder”);
404
(a) 1-5, detecção do DNA-A de MaYSV; 6-10, plantas controle (pJL-89); (+), controle positivo;
405
(-), controle H2O; (b) 1-5, detecção do DNA-B de MaYSV; 6-10, plantas controle (pJL-89);
406
(+), controle positivo; (-), controle H2O.
407
408
409
410
411
412
413
414
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