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                    UNIVERSIDADE FEDERAL DE ALAGOAS
CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PROTEÇÃO DE PLANTAS

TIAGO JORGE DE ARAUJO BARBOSA

IDENTIFICAÇÃO DE ESPÉCIES DE BOTRYOSPHAERIACEAE E DE
Neopestalotiopsis ASSOCIADAS A DOENÇAS FOLIARES DO COQUEIRO

RIO LARGO-AL
2019

TIAGO JORGE DE ARAUJO BARBOSA

IDENTIFICAÇÃO DE ESPÉCIES DE BOTRYOSPHAERIACEAE E DE
Neopestalotiopsis ASSOCIADAS A DOENÇAS FOLIARES DO COQUEIRO

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em
Proteção de Plantas da Universidade Federal de
Alagoas, como requisito parcial para obtenção do
título de Doutor em Proteção de Plantas.

Orientação: Prof. Dr. Gaus Silvestre de Andrade Lima

RIO LARGO-AL
2019

À minha amada esposa, Willyane dos Santos Barbosa,
por ser o porto seguro e a principal incentivadora desse projeto;

Aos meus filhos, Tiago Vinicius dos Santos Barbosa e Davi Felipe dos Santos Barbosa,
pela inspiração, incentivo e motivação para superar os obstáculos;

Aos meus pais, José Ferreira Barbosa e Severina de Araujo Barbosa,
pelos ensinamentos e pelo incondicional incentivo à educação.

Dedico

AGRADECIMENTOS

Ao meu bom Deus pelo dom da vida e por colocar em meu caminho, pessoas maravilhosas
que me deram amor e me ajudaram nas horas que mais precisei.
À Universidade Federal de Alagoas, por meio do Programa de Pós-Graduação em Proteção
de Plantas, pela oportunidade a mim concedida para a realização desse sonho.
Ao Instituto Federal de Alagoas, em especial ao Campus Maragogi – IFAL Maragogi (meu
local de trabalho), por oportunizar este servidor a qualificação.
Em especial à Prof Dr. Gaus Silvestre de Andrade Lima, pela oportunidade, orientação e
ensinamentos a mim dedicado.
Ao Pós-Doutorando Dr. Frederico Monteiro Feijó, que Coorientou esse trabalho e contribuiu
de forma significativa com a execução.
Aos colegas e professores do curso de Agroecologia do IFAL- Maragogi: André Sueldo,
Francisco Xavier, Jailso Alves, Marcelo Cavalcante, Mônica Porto e Orcar Rafle, por
assumirem minhas disciplinas e me proporcionarem o afastamento.
Aos companheiros e companheiras que também me ajudaram na execução deste trabalho:
Antônio Duarte, Mayara Lima, Mayra Ferro e Nayana Bruschi.
Aos colegas do Laboratório Fitopatologia Molecular, pelo companheirismo, convivência e
aprendizado.
A Coordenadora do Programa de Pós-Graduação em Proteção de Plantas Profª. Drª. Iraildes
Pereira Assunção.
As Professoras: Drª Maria de Fátima Muniz, Drª Sônia Maria Fortti Broglio e Drª Elineide
Barbosa de Souza, não só pelo exemplo como professores, mas pelos ensinamentos a mim
transmitidos.
Aos componentes da Banca examinadora: Profª. Drª. Maria de Fátima Muniz, Profª. Drª.
Sarah Jacqueline Cavalcanti da Silva e Drª. Joseani Castro da Silva, pelas considerações
relevantes a este trabalho.
Aos secretários do Programa de Pós-Graduação em Proteção de Plantas Gustavo e Maxsuel
por toda dedicação e apoio.
Ao Professor do IFAL – Maceió, Me. Antônio Carlos de Lima Santos, pelo apoio e incentivo.
A todos os Professores, funcionários, colegas de curso, amigos e familiares que direta ou
indiretamente, contribuíram para realização deste projeto e para o meu crescimento como
pessoa, MUITO OBRIGADO!

RESUMO GERAL
O cultivo do coqueiro (Cocos nucifera L.) é realizado em vários países. No Brasil, a cultura é
amplamente cultivada, sendo considerada uma frutífera de grande importância econômica.
Nos últimos anos deixou de ser produzido apenas nas zonas costeiras e vem se expandindo
para regiões mais centrais do país. Com o aumento na produção houve o favorecimento da
disseminação de doenças fúngicas, sobretudo as foliares, responsáveis por redução do
potencial de produção. A queima das folhas é considerada a doença foliar mais importante em
coqueiro. A doença está associada a espécies de Lasiodiplodia spp., porém, se faz necessário
revisar se o gênero Lasiodiplodia é o único membro da família Botryosphaeriaceae a causar
queima das folhas do coqueiro. Outra doença foliar importante é a mancha de pestalotia do
coqueiro. Essa doença tem como agente etiológico, fungos pertencentes ao complexo
Pestalotioid, que estão amplamente distribuídos na natureza. Entretanto, existem poucas
informações sobre a real identificação desses patógenos. Diante disso, se torna importante a
busca por informações sobre esses patógenos foliares, fazendo-se necessário uma
identificação precisa das espécies associadas a essas doenças. Assim, este trabalho teve como
objetivos: identificar filogenetica e morfologicamente espécies de Botryosphaeriaceae
associadas a queima das folhas do coqueiro no nordeste do Brasil e identificar e caracterizar
espécies do complexo Pestalotioid associadas a mancha de pestalotia na cultura do coqueiro.
No primeiro capítulo, foram obtidos 28 isolados patogênicos de Botryosphaeriaceae, oriundos
de plantios comerciais nos Estados de Alagoas e Sergipe. As análises morfológicas e
moleculares permitiram a identificação de duas espécies pertencentes a dois gêneros distintos
de Botryosphaeriaceae associadas à queima das folhas do coqueiro, L. theobromae e
Neodeightonia alagoensis sp. nov. No segundo capítulo foram obtidos 10 isolados
patogênicos de lesões típicas de mancha de pestalotia do coqueiro. De acordo com as análises
morfológicas e moleculares, identificou-se três espécies pertencentes ao gênero
Neopestalotipsis: N. foedans, N. ellipsospora e Neopestalotiopsis sp. associadas à mancha de
pestalotia do coqueiro no Brasil.
Palavras-chave: Cocos nucifera, Neodeightonia, complexo Pestalotioid, filogenia multilocus.

ABSTRACT
Coconut cultivation (Cocos nucifera L.) is carried out in several countries. In Brazil, the
culture is widely cultivated, being considered a fruit of great economic importance. In recent
years it has ceased to be produced only in coastal areas and has been expanding to more
central regions of the country. With the increase in production, there was favoring the spread
of fungal diseases, especially foliar diseases, responsible for the reduction of production
potential. Leaf burning is considered the most important foliar disease in coconut. The disease
is associated with species of Lasiodiplodia spp., However, it is necessary to review if the
genus Lasiodiplodia is the only member of the family Botryosphaeriaceae to cause burning of
the leaves of the coconut. Another important leaf disease is the spot of coconut palm
pestalotia. This disease has as etiological agent, fungi belonging to the Pestalotioid complex,
which are widely distributed in nature. However, there is little information on the actual
identification of these pathogens. Therefore, it is important to search for information on these
foliar pathogens, making it necessary to accurately identify the species associated with these
diseases. The objective of this work was to identify phylogenetically and morphologically
Botryosphaeriaceae species associated with the burning of coconut palm leaves in the
northeast of Brazil and to identify and characterize species of the Pestalotioid complex
associated to the spot of pestalotia in the coconut palm crop. In the first chapter, 28
pathogenic isolates of Botryosphaeriaceae were obtained from commercial plantations in the
States of Alagoas and Sergipe. Morphological and molecular analyzes allowed the
identification of two species belonging to two distinct genera of Botryosphaeriaceae
associated to the burning of the coconut leaves, L. theobromae and Neodeightonia alagoensis
sp. nov. In the second chapter 10 pathogenic isolates were obtained from lesions typical of
coconut pestalotia spot. According to the morphological and molecular analyzes, three species
belonging to the genus Neopestalotipsis were identified: N. foedans, N. ellipsospora and
Neopestalotiopsis sp. associated with coconut pestalotia spot in Brazil.
Key words: Cocos nucifera, Neodeightonia, Pestalotioid complex, multilocus phylogeny.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1

Árvore filogenética de inferência Bayesiana com base nas sequências
combinadas das regiões ITS, TEF1-α e LSU. Spencermatinsia
viticola foi utilizado como outgroup. Isolados caracterizados neste
estudo estão destacadas em negrito........................................................ 49

Figura 2

Sintomas de queima das folhas do coqueiro e aspectos culturais,
morfológicos e patogênicos de Neodeightonia alagoensis. Sintoma
em “V” invertido, típico da doença no campo (A); Sintomas
visualizados em folha e raque nos testes de patogenicidade (B-C);
Colônia em BDA com 10 dias (D); Picnídio sobre acícula de pinheiro
(E); Ascas maduras e imaturas (F); Células conidiogênicas sem
presença de paráfises (G-H); e conídios de N. alagoensis (I).............. 51

Figura 3

Árvore filogenética de inferência Bayesiana com base nas sequências
concatenadas das regiões ITS, β-tub e TEF1-α. Pestalotiopsis
trachicarpicola foi utilizado como outgroup. Isolados caracterizados
neste estudo estão destacadas em negrito.............................................. 71

Figura 4

Sintomas de Neopestalotiopsis em folíolos de Cocos nucifera
oriundos de plantios comerciais (AI e AII); Detalhe das lesões após o
teste de patogenicidade (AIII); Colônias em meio BDA, corpos de
frutificação e conídios maduros de N. foedans (B), N. ellipsospora
(C) e Neopestalotiopsis sp. (D).............................................................. 73

LISTA DE TABELAS

Tabela 1

Descrição dos primers utilizados para identificação dos gêneros
fúngicos de Botryosphaeriaceae............................................................... 44

Tabela 2

Números de acesso GenBank das sequências de Botryospheriaceae
utilizadas nas análises filogenéticas......................................................... 45

Tabela 3

Isolados coletados de plantios comerciais nos estados de Alagoas e
Sergipe...................................................................................................... 48

Tabela 4

Características morfológicas da espécie de Neodeightonia encontrada
neste estudo e das espécies já descritas.................................................... 51

Tabela 5

Descrição dos primers usados para identificação de espécies
pertencentes ao gênero Neopestalotiopsis................................................ 66

Tabela 6

Números de acessos GenBank das sequências utilizadas em análises
filogenéticas defungos do complexo Pestalotioid.................................... 67

SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO GERAL .................................................................................................... 12
2 REVISÃO DE LITERATURA ........................................................................................... 15
2.1 A cultura do coqueiro...................................................................................................... 15
2.1.1 Coqueiro-anão ......................................................................................................... 15
2.1.2 Importância econômica da cultura ........................................................................... 16
2.2 Doenças foliares do coqueiro ......................................................................................... 17
2.2.1 Queima das folhas do coqueiro ............................................................................... 17
2.2.1.1 Família Botryosphaeriaceae ............................................................................. 18
2.2.1.2 Aspectos filogenéticos da família Botryoasphaeriaceae ................................... 19
2.2.1.3 Gênero Lasiodiplodia ....................................................................................... 21
2.2.1.4 Gênero Neodeightonia ...................................................................................... 22
2.2.2 Mancha de Pestalotia ............................................................................................... 23
2.2.2.1 Complexo Pestalotioid ...................................................................................... 24
2.2.2.2 Aspectos filogenéticos do complexo Pestalotioid ............................................ 25
2.2.2.3 Gênero Neopestalotiopsis ................................................................................. 26
REFERÊNCIAS...................................................................................................................... 26
3 CAPÍTULO I: IDENTIFICAÇÃO DE ESPÉCIES DE BOTRYOSPHAERIACEAE
ASSOCIADAS A QUEIMA DAS FOLHAS DO COQUEIRO NOS ESTADOS DE
ALAGOAS E SERGIPE ........................................................................................................ 38
RESUMO ................................................................................................................................. 39
ABSTRACT. ............................................................................................................................ 40
3.1 Introdução ....................................................................................................................... 41
3.2 Material e Métodos ......................................................................................................... 42
3.2.1 Obtenção e preservação dos isolados ...................................................................... 42
3.2.2 Teste de patogenicidade ........................................................................................... 43
3.2.3 Caracterização molecular ........................................................................................ 43
3.2.3.1 Extração, amplificação e sequenciamento de DNA ......................................... 43
3.2.3.2 Análises filogenéticas ....................................................................................... 44
3.2.4 Caracterização cultural e morfológica ..................................................................... 46

3.3 Resultados e Discussão ................................................................................................... 47
3.3.1 Resultados................................................................................................................ 47
3.3.1.1 Obtenção dos isolados ...................................................................................... 47
3.3.1.2 Teste de patogenicidade .................................................................................... 48
3.3.1.3 Análise filogenética .......................................................................................... 48
Taxonomia .................................................................................................................... 50
3.3.2 Discussão ................................................................................................................. 52
3.4 Conclusões ...................................................................................................................... 55
REFERÊNCIAS...................................................................................................................... 56
4 CAPÍTULO II: IDENTIFICAÇÃO DE ESPÉCIES DE Neopestalotiopsis
ASSOCIADAS À MANCHA DE PESTALOTIA DO COQUEIRO.................................. 61
RESUMO ................................................................................................................................. 62
ABSTRACT ............................................................................................................................ 63
4.1 Introdução ....................................................................................................................... 64
4.2 Material e Métodos ......................................................................................................... 65
4.2.1 Origem, obtenção e preservação dos isolados ......................................................... 65
4.2.2 Teste de patogenicidade ........................................................................................... 65
3.2.3 Caracterização molecular ........................................................................................ 66
4.2.2 Caracterização morfológica e cultural ..................................................................... 68
4.3 Resultados e Discussão ................................................................................................... 69
4.3.1 Resultados................................................................................................................ 69
4.3.1.1 Obtenção dos isolados ...................................................................................... 69
4.3.1.2 Teste de patogenicidade .................................................................................... 69
4.3.1.3 Análise filogenética .......................................................................................... 70
4.3.1.4 Caracterização morfológica e cultural .............................................................. 72
4.3.2 Discussão ................................................................................................................. 73
4.4 Conclusões ...................................................................................................................... 77
REFERÊNCIAS...................................................................................................................... 78

12

1 INTRODUÇÃO GERAL
O coqueiro (Cocos nucifera L.), monocotiledônea pertencente à família Arecaceae, é
amplamente cultivado em todo o mundo, sendo considerada uma das mais importantes
espécies tropicais utilizadas pelo homem. É uma espécie perene, com viabilidade econômica
de 30 a 70 anos, de acordo com a variedade cultivada. Originário do sudeste asiático, o
coqueiro abrange terras intertropicais de mais de 90 países com cerca de 12 milhões de
hectares plantados, caracterizando-se por ser uma cultura de muitas aplicações (CINTRA,
2009; JESUS-JUNIOR et al., 2015).
No Brasil, a cocoicultura vem se destacando nos últimos anos. Em 1990 o país
ocupava a 10° posição no ranking mundial, com uma produção ao redor de 477 mil toneladas
de coco. Atualmente o país é o quarto maior produtor mundial com uma produção aproximada
de 2,9 milhões de toneladas, em uma área colhida de mais de 250 mil ha de coqueiros
beneficiando diretamente mais de 220 mil produtores (FAOSTAT, 2016; BRAINER, 2017).
Atualmente a região Nordeste é a principal produtora do país com aproximadamente
75% da produção de coco, e o principal motivo para isso são as condições edafoclimáticas
favoráveis ao cultivo. A crescente na produção, verificada nessa região nos últimos anos, se
deve ao aumento da área plantada e dos financiamentos públicos e investimentos privados em
plantios de coqueiro (JESUS-JUNIOR et al., 2015; IBGE, 2017). Contudo, com o incremento
da produção muitos problemas fitossanitários começaram a ser observados, podendo ser
ocasionados por fatores abióticos, insetos-pragas, ácaros e fitopatógenos, principalmente, as
doenças causadas por fungos, como a queima das folhas do coqueiro e a mancha de pestalotia
(FONTES; WANDERLEY, 2006).
A queima das folhas destaca-se por afetar negativamente a produção, uma vez que
provoca abscisão prematura das folhas inferiores, reduzindo a área fotossintética em até 50%
e deixando os cachos sem sustentação, consequentemente, os frutos caem antes do ponto de
colheita (SOUSA FILHO et al., 1979; PUNITHALINGAM, 1980; MARIANO; SILVEIRA,
2005; MARIANO et al., 2016). Por muito tempo a doença foi atribuída à espécie
Lasiodiplodia theobromae (SOUSA FILHO et al., 1979; MARIANO; SILVEIRA, 2005;
COUTINHO et al., 2017) mas, estudos recentes identificaram mais três espécies associadas a
queima das folhas do coqueiro, L. euphorbicula (COUTINHO et al., 2017), L. brasiliense e L.
pseudotheobromae (SANTOS, 2017).
Lasiodiplodia é um dos 23 gêneros que compõem a família Botryosphaeriaceae. Essa
família é constituída por complexos de espécies “crípticas”, ou seja, indivíduos semelhantes
morfologicamente, mas que se diferem geneticamente (BICKFORD et al., 2006; ALVES et

13

al., 2007; SLLIPERS et al., 2017). Por esse motivo, a identificação das espécies passou a ser
resolvida através de uma análise filogenética robusta com a combinação de pelo menos três
regiões gênicas, nas quais, os genes do fator de elongamento da tradução 1 α (TEF1-α) e da
β-tubulina (β-tub) e a região do espaço interno transcrito (ITS) são as mais indicadas
(PHILLIPS et al., 2013; MARQUES et al., 2013; SLIPPERS et al., 2014; MACHADO et al.,
2014; ROSADO et al., 2016). Os membros dessa família são considerados importantes
fitopatógenos e já foram detectados na maioria das áreas geográficas do mundo, causando
doenças em muitas frutíferas e em culturas nativas, exóticas e de importância econômica para
países tropicais e subtropicais (PHILLIPS et al., 2013; SLLIPERS et al., 2017).
A mancha de pestalotia do coqueiro, caracteriza-se por apresentar manchas elípticas
com coloração parda-escura, de tamanhos variados, resultantes da coalescência das lesões
menores (CARDOSO et al., 2003). A doença é atribuída a fungos do complexo Pestalotioid,
que

é

formado

por

três

gêneros

distintos:

Pestalotiopsis,

Neopestalotiopsis

e

Pseudopestalotiopsis (MAHARACHCHIKUMBURA et al., 2014). Os fungos desse
complexo eram considerados de importância secundária, entretanto, tem ocasionado
significativas perdas econômicas em uma ampla gama de hospedeiros (ÚRBEZ-TORRES et
al., 2012; MAHARACHCHIKUMBURA et al., 2014; JAYAWARDENA et al., 2016;
MAHARACHCHIKUMBURA et al., 2016, ISMAIL, et al., 2017).
Segundo Maharachchikumbura et al. (2014), os gêneros podem ser distinguidos com
base na morfologia dos conídios, especificamente com relação à pigmentação das três células
medianas. As espécies do gênero Pestalotiopsis distinguem-se dos demais por apresentarem
conídios fusiformes, com cinco células, sendo as três células medianas concolor marromclaras, com extremidade hialina. Por outro lado, Pseudopestalotiopsis possui células medianas
concolor marrom-escuras. Já Neopestalotiopsis apresenta conídios fusiformes, com cinco
células, com células medianas versicolor (MAHARACHCHIKUMBURA et al., 2014;
JAYAWARDENA et al., 2016). Contudo, devido à similaridade morfológica entre espécies do
complexo Pestalotioid, a identificação passou a ser realizada por meio do sequenciamento de
DNA, com o uso de regiões genômicas especificas como, ITS, TEF1-α e β-tub (CROUS;
HAWKSWORTH; WINGFIELD, 2015).
Estudos relacionados à etiologia da queima das folhas e da mancha de pestalotia são
necessárias para estabelecer medidas fitossanitárias de controle e futuros programas de
melhoramento de plantas. Assim, os objetivos deste trabalho foram: identificar e caracterizar
espécies de Botryosphaeriaceae associadas à queima das folhas do coqueiro no nordeste do

14

Brasil e identificar e caracterizar espécies do complexo Pestalotioid associados à mancha de
pestalotia na cultura do coqueiro.

15

2 REVISÃO DE LITERATURA

2.1 A cultura do coqueiro
O coqueiro (Cocos nucifera L.), da classe Monocotyledoneae, pertence à família
Arecaceae. É uma cultura de grande importância mundial, devido à geração de empregos e
renda em vários países. Seu cultivo contribui para a fixação do homem no campo, dada a
variedade de produtos que oferece e a diversidade de uso, além de permitir a consorciação
com cultivos de subsistência e até mesmo com criação de animais. Além dos frutos, todos os
órgãos da planta são aproveitáveis como a raiz, o estipe, a inflorescência e as folhas que
geram diversos subprodutos ou derivados de interesse econômico, sendo a planta também
utilizada no paisagismo (FERREIRA; GRATTAPAGLIA, 1998; BRAINER, 2017).
No Brasil é conhecido como coco-da-baía, pois a introdução da cultura no país teria
ocorrido pelo estado da Bahia. Atualmente são cultivados em quase todos os estados
brasileiros, nos mais diversos solos, climas e condições de manejo. Assim, a cocoicultura
passou a representar grande importância na sustentabilidade dos agroecossistemas das regiões
tropicais costeiras (SIQUEIRA et al., 2002; IBGE, 2017).

2.1.1 Coqueiro-anão
O gênero Cocos, constituído apenas pela espécie C. nucifera, apresenta duas
variedades principais, a gigante (var. typica) e a anã (var. nana), conhecido também como
coqueiro-anão. O coqueiro-anão se divide em três subvariedades: verde, amarela e vermelha.
Além disso, existem diversos híbridos resultantes do cruzamento entre essas duas variedades
(MARIANO et al., 2016).
O coqueiro-anão é essencialmente tropical e apresenta produção escalonada durante
todo o ano com grande adaptabilidade a amplas variações climáticas. Em razão da sua
precocidade, melhor sabor da água e menor porte, a variedade anã é a mais recomendada para
exploração comercial de água de coco (OHLER, 1984; SIQUEIRA et al., 2002).
A área de plantio da variedade coqueiro-anão verde é a que mais cresce, pois, tal
variedade mostra maior aceitação, bem como vantagens sob os aspectos de produtividade e
precocidade. Esta variedade começa a produzir entre três e quatro anos, enquanto o coqueiro
gigante leva cerca de sete anos para o início da produção. Além disso, produz maior número
de frutos/planta/ano e apresenta menor altura da planta, favorecendo a colheita (CASTRO,
2009; BRAINER, 2017).

16

2.1.2 Importância econômica da cultura
O coco é produzido em cerca de 90 países que destinam o fruto, principalmente, para a
produção de copra e óleo, principais derivados comercializados no mercado internacional. A
Indonésia, Filipinas e Índia, principais produtores mundiais, detêm juntos 72,4% de área
cultivada e 72,5% da produção mundial. O Brasil encontra-se em quarta colocação com
apenas 2,6% de área cultivada, mas participa com 15,3% da produção mundial em virtude de
sua elevada produtividade comparada aos três principais produtores (FAOSTAT, 2016).
A concorrência do Brasil com os países Asiáticos, maiores produtores da cultura, é de
certa forma desigual, tendo em vista o subsídio que os governos desses países oferecem aos
seus produtores. Sem citar que, na maioria dos países produtores, o coco é utilizado para a
produção de óleo, enquanto no Brasil, talvez um dos únicos que exploram a cultura como
fruteira e também como oleaginosa. Do coqueiro se aproveita tudo, desde o estipe para
fabricação de móveis até as folhas que são utilizadas na confecção de produtos artesanais,
além de servirem como cobertura de casas rústicas. Mas o fruto é o principal produto, tanto
verde, para o consumo da água, muito apreciada em todo Brasil e também no exterior, quanto
seco, de onde se extrai a copra (albúmen sólido) utilizada na fabricação de diversos produtos
como óleo de coco, coco ralado, leite de coco, manteiga, cosméticos, entre outros (FONTES,
2013; EMBRAPA, 2016).
O coqueiro é cultivado em quase todo território nacional, com uma área de mais de
241,0 mil hectares com produção de de cerca de 1,7 milhões de toneladas de frutos. Ao
contrário da produção mundial, que entre os anos de 2007 a 2014 registraram decréscimo na
produção, o Brasil tem aumentado seus rendimentos, cujo crescimento no período, elevou a
produção (IBGE, 2017; FAOSTAT, 2016). Este acréscimo ocorre em consequência da
expansão do coqueiro para outras regiões, a qual se deu em função de uma crescente demanda
por água de coco e consequente elevação de seu preço. Esse episódio gerou uma grande
mudança na cultura do coqueiro no Brasil, a partir da modernização do seu processo
produtivo, com utilização intensiva de insumos, de tecnologia, implantação de grandes
projetos em perímetros irrigados e utilização da variedade de coqueiro anão verde (FONTES;
WANDERLEY, 2006; CAVALCANTE, 2015).
A Região Nordeste é a principal produtora nacional de coco, cuja posição foi
conquistada desde a introdução do coqueiro no País e que ainda vem se mantendo, devido às
condições edafoclimáticas favoráveis nas zonas litorâneas. Nessa Região concentram-se
83,2% da área colhida de coco do Brasil e 74,5% de sua produção (IBGE, 2017).

17

Mesmo sendo a região com maior produção, a produtividade ainda é baixa se
comparado ao potencial da cultura. O rendimento médio na região Nordeste é de 6,6 mil
toneladas de frutos por hectare, sendo que em alguns estados, como Pernambuco, esse
rendimento chega a 25 mil toneladas de frutos por hectare (IBGE, 2017). Um dos fatores que
podem explicar a baixa produtividade é que em muitos locais ainda predomina, o sistema de
cultivo semiextrativista em áreas litorâneas, sem adoção de práticas de manejo cultural
(BRAINER, 2017). Além disso, com o aumento da área plantada e uma maior distribuição da
cultura, não apenas no nordeste, mas em todo país, o cultivo do coqueiro tem sofrido com o
ataque de doenças, as quais podem comprometer o potencial de rendimento da cultura,
principalmente na variedade anão, devido a sua uniformidade genética, ao espaçamento
utilizado (menor do que o coqueiro-gigante) e pela exploração intensiva (CARON, 2012).

2.2 Doenças foliares do coqueiro
A cultura do coqueiro sofre interferência severa de alguns patógenos. Entre as
principais doenças que afetam a cocoicultura brasileira, destacam-se as doenças fúngicas
foliares: queima das folhas, causada por Lasiodiplodia theobromae (Pat.) Griffon & Maubl,
lixa-pequena causada por Camarotella torrendiella (Batista) Bezerra & Vitória e lixa-grande
causada por C. acrocomiae (Montagne) Hyde & Cannon que, favorecidas pelas condições
climáticas, ocorrem de forma generalizada em praticamente todos os coqueirais do país, além
de doenças que podem ser consideradas emergentes, como a mancha de pestalotia
(WARWICK; LEAL, 2003; SILVEIRA et al., 2004; MARIANO; SILVEIRA, 2005; VITÓRIA
et al., 2008).
2.2.1 Queima das folhas do coqueiro
Dentre as doenças foliares citadas, a queima das folhas destaca-se por afetar
negativamente a produção. Conhecida também como fogo do coqueiro, ocorre de forma
epidêmica nos estados de Alagoas, Bahia, Paraíba, Pará, Rio Grande do Norte e Sergipe,
causando sérios prejuízos a cocoicultura, reduzindo a produção de coco em mais de 50%
(MARIANO et al., 2016).
A infecção ocorre principalmente nas folhas inferiores e, portanto, mais velhas. As
lesões internas na raque progridem do ápice para a base, podendo atingir a bainha e o estipe,
resultando na exsudação de resina nas áreas necrosadas da base dos folíolos e, abaxialmente,
em rachaduras da raque lesionada e bainha. A invasão sistêmica e descendente na raque causa
morte dos tecidos foliares e resulta na seca dos folíolos e de toda a folha, acarretando um

18

sintoma conhecido como empardecimento em “V”, que é característico da doença
(TALAMINI et al., 2013; MARIANO et al., 2016).
A queima das folhas ainda acarreta perda da área fotossintética ocasionando morte
prematura das folhas mais velhas, e como consequência deixa os cachos sem sustentação
física e fisiológica, provocando atraso no crescimento, redução do número de folhas
funcionais e consequentemente, queda dos frutos antes do ponto de colheita (SOUSA FILHO
et al., 1979; MARIANO et al., 2016).
A doença é policíclica e as plantas infectadas, ou seus restos culturais no solo,
constituem as principais fontes de inóculo. Os primeiros sintomas são observados em plantas
com idade acima de um ano e meio (RAM, 1989), no entanto, pode ocorrer em qualquer idade
da planta (SOUZA FILHO et al.,1979; CORREIA; COSTA, 2005) e durante todo o ano,
sendo as maiores intensidades dessa doença observadas nos meses onde ocorrem temperaturas
mais elevadas e baixa umidade relativa do ar e precipitação (RAM, 1989).
A queima das folhas foi relatada pela primeira vez no Brasil por Sousa Filho em 1975,
no estado de Sergipe (SOUSA FILHO et al., 1979). Até então, L. theobromae era considerada
a única espécie responsável por causar os sintomas da doença em coqueiro. Recentemente,
Coutinho et al. (2017) analisando a diversidade do gênero fúngico em fruteiras tropicais e
Santos (2017) coletando amostras em coqueiros com sintomas da doença, relataram L.
euphorbicola, L. brasiliense e L. pseudotheobromae, associadas a queima das folhas.

2.2.1.1 Família Botryosphaeriaceae
Todas as espécies encontradas, associadas a queima das folhas do coqueiro, pertencem
ao gênero Lasiodiplodia que é um membro da família Botryosphaeriaceae, a qual se destaca
por compor diversos gêneros/espécies de importância para fruticultura do Nordeste, causando
declínios na produção, em grandes e pequenos pomares (FREIRE et al., 2011; MARQUES et
al., 2013; NETTO et al., 2014; CORREIA et al., 2016; COUTINHO et al., 2017).
Taxonomicamente, a família Botryosphaeriaceae pertence ao Reino Fungi; Filo
Ascomycota; Classe Dothideomycetes e Ordem Botryosphaeriales (SCHOCH et al., 2006).
Espécies de Botryosphaeriaceae são responsáveis por diversas doenças, provocando sintomas
como, morte descendente e seca de ramos, exsudação de resinose pelos hospedeiros, lesões
necróticas e cancros em ramos, caules e tubérculos, morte progressiva de plantas jovens,
adultas e porta-enxetos, além de atuarem como patógenos de sementes e podridões
pedunculares e pós-colheita em frutos (CARDOSO et al., 2009; MARQUES et al., 2013;
NETTO et al., 2014; ZHAI et al., 2014; LAWRENCE et al., 2017).

19

Essa família é constituída por complexos de espécies crípticas, ou seja, indivíduos
morfologicamente idênticos, mas que apresentam trajetória evolutiva e reprodutiva total ou
parcialmente distintas (BICKFORD et al.,2006), o que torna complicada a identificação
destes fungos ao nível de espécie, uma vez que os teleomorfos dificilmente são encontrados
na natureza e os anamorfos possuem uma grande diversidade morfológica (JACOBS;
REHNER, 1998; ZHOU et al.,

2001; LUQUE et al., 2005; PHILLIPS et al., 2005;

SLIPPERS et al., 2007). Por esta razão, as espécies eram identificadas por caracteres
morfológicos do anamorfo, que é a forma mais comum encontrada na natureza (DENMAN et
al., 2000; JACOBS; REHNER, 1998). Esses caracteres incluem: tamanho, forma, cor,
septação, espessura da parede e textura dos conídios, bem como detalhes da conidiogênese
(JACOBS; REHNER, 1998; ZHOU; STANOSZ, 2001; SLIPPERS et al., 2004b). Porém, a
identificação de espécies, utilizando caracteres exclusivamente morfológicos, torna-se uma
tarefa subjetiva, que podem ter levado a confusões taxonômicas durante anos e a
subestimação da biodiversidade em torno dos indivíduos dessa família (COUTINHO et al.,
2017).
Diante da diversidade fenotípica que os membros da família Botryosphaeriaceae
possuem, estudiosos afirmam que, apesar das características morfológicas e culturais terem
sido amplamente utilizadas para identificação das espécies, o uso apenas desses caracteres,
torna-se uma tarefa difícil e não confiável. Dessa forma, torna-se necessário usar ferramentas
que possam fornecer identificações mais precisas e reprodutíveis, como o uso de métodos de
moleculares, principalmente técnicas baseadas em PCR, tem fornecido importantes
contribuições nesta área (ALVES et al., 2007; PHILLIPS et al., 2008).

2.2.1.2 Aspectos filogenéticos da família Botryoasphaeriaceae
O método de caracterização mais utilizado para delimitar espécies da família
Botryosphaeriaceae é o molecular, por meio do sequenciamento de regiões do DNA
(DEANMAN et al., 2000; PHILLIPS et al., 2013; SLIPPERS et al., 2014). No entanto, para a
delimitação de uma filogenia fidedigna desses microrganismos bem como a descrição de
novas espécies, devem atender as regras do Código Internacional de Nomenclatura para algas,
fungos e plantas (ICN). As regras que regem o ICN, são o uso conjunto de caracteres
morfológicos, biológicos, ecológicos e patogênicos, que visam o embasamento do
desenvolvimento dos microrganismos e das hipóteses evolucionárias pré-ditas por dados
moleculares (DEANMAN et al., 2000; WILL; RUBINOFF, 2004; PHILLIPS et al., 2013;
SLIPPERS et al., 2014).

20

Para caracterização de diversidade genética de fitopatógenos, onde características
morfológicas são ausentes ou incapazes de diferenciação de isolados, são utilizados
marcadores moleculares (SHARMA at al., 1999; SHARMA et al., 2005). Estudos sobre a
taxonomia de Botryosphaeriaceae têm empregado métodos moleculares para revelar relações
filogenéticas entre as espécies (PHILLIPS et al., 2013; SLIPPERS et al., 2013; WIKEE et al.,
2013) e para ajudar a resolver complexo de espécies (SMITH et al. 2001; PHILLIPS et al.
2002; DENMAN, et al. 2003; ALVES et al. 2004; SLIPPERS et al. 2004a; BEGOUDE et al.
2010; SAKALIDIS et al. 2011).
Os marcadores moleculares são capazes de mapear regiões especificas do DNA e
possuem alto valor filogenético. Para este fim, genes de algumas regiões são bastante
utilizadas e comprovadamente eficazes na delimitação filogenética de Botryosphaeriaceae tais
como: regiões codificadoras de proteínas, como o fator de elongamento da tradução 1 α
(TEF1-α) e da β-tubulina (β-tub); a segunda maior subunidade da RNA polimerase II (RPB2);
as regiões dos espaços internos transcritos (ITS); a pequena subunidade do rDNA (SSU) e; a
grande subunidade do rDNA (LSU) (PHILLIPS et al., 2013).
Jacobs; Rehner (1998) foram os primeiros a usar as sequências de rDNA em análises
filogenéticas de Botryosphaeria e mostrar que havia alguma congruência entre caracteres
morfológicos, culturais e as sequências de rDNA, pelo menos para alguns táxons. Mas, apesar
do impacto que os dados de sequências de nucleotídeos da região ITS apresentaram sobre a
taxonomia e filogenia de espécies de Botryosphaeria, o uso apenas desse gene pode
subestimar a verdadeira diversidade especialmente entre espécies estreitamente relacionadas
ou crípticas (TAYLOR et al., 2000). Assim, os dados de sequências de nucleotídeos do gene
ITS associados a outros genes têm sido aplicados com sucesso para discriminar espécies
crípticas e elucidar as relações filogenéticas em Botryosphaeriaceae e anamorfos associados
como verificado em inúmeros trabalhos (DE WET et al., 2003; SLIPPERS et al., 2004a;
PHILLIPS et al., 2008; INDERBITZIN et al., 2010; URBEZ-TORRES et al., 2012; NETTO
et al., 2014).
Em um amplo estudo filogenético, Crous et al., (2006) avaliaram dados de sequência
da região 28S do rDNA de 113 isolados, representando a maioria das variações morfológicas
atualmente reconhecidos em Botryosphaeriaceae. As análises revelaram 10 linhagens em
Botryosphaeriaceae e neste estudo novos gêneros foram descritos.
Posteriormente,

Phillips

et

al.,

(2013)

aceitaram

17

gêneros

na

família

Botryosphaeriaceae. Esses gêneros foram caracterizados com base em 17 linhagens em uma
filogenia multilocus. Embora a região ITS sozinha tenha sido suficiente para separar as

21

espécies dentro de cada gênero de Botryosphaeriaceae, a inclusão do TEF1-α resultou em uma
separação mais robusta, e foi considerada essencial para alguns gêneros, como Diplodia,
Lasiodiplodia e Neofusicoccum.
Recentemente, Slippers et al., (2017) através de análise multilocus, relataram haver 23
gêneros descritos para esta família: Allanphillipsia Crous & M.J. Wingf., Bahusutrabeeja
Subram. & Bhat, Barriopsis Abdollahzadeh, Zare & A.J.L. Phillips, Botryobambusa R.
Phookamsak, J.K. Liu & K.D. Hyde, Botryosphaeria Ces. & De Not., Cophinforma Doilom,
J.K. Liu & K.D. Hyde, Diplodia Fr, Dothiorella Sacc., Eutiarosporella Crous, Lasiodiplodia
Ellis & Everh, Macrophomina Petr., Marasasiomyces Crous, Mucoharknessia Crous et al.,
Neodeightonia C. Booth, Neofusicoccum Crous et al., Neoscytalidium Crous & Slippers,
Oblongocollomyces Tao Yang & Crous, Otthia Nitschke ex Fuckel, Phaeobotryon Theiss. &
Syd., Sakireeta Subram. & K. Ramakr, Sardiniella Linaldeddu et al., Sphaeropsis Sacc. e
Tiarosporella Hohn.
Estudos apontam que dependendo do complexo de espécies investigado, para a
obtenção de uma análise filogenética robusta se faz necessário a combinação de sequências de
pelo menos duas regiões gênicas, nas quais ITS, TEF1-α e β-tub são as mais indicadas para
Botryosphaeriaceae (PHILLIPS et al., 2013; MARQUES et al., 2013; SLIPPERS et al., 2014;
MACHADO et al., 2014; ROSADO et al., 2016).
O atual aumento no número de espécies é reconhecido em grande parte devido à
utilização de dados moleculares, mas este aumento ocorre também devido à amostragem, em
regiões até então pouco exploradas, incluindo Venezuela (BURGESS et al. 2006), Austrália
(PAVLIC et al. 2008), Irã (ABDOLLAHZADEH et al. 2010), Egito (ISMAIL et al. 2012),
Tailândia (TRAKUNYINGCHAROEN et al. 2015) e Brasil (MARQUES et al., 2013;
MACHADO et al., 2014; CORREIA et al., 2016; COUTINHO et al. 2017). Dos gêneros
descritos para Botryosphaeriaceae, Lasiodiplodia é o que apresenta o maior número de
espécies descritas (SLLIPERS et al., 2017).

2.2.1.3 Gênero Lasiodiplodia
O gênero Lasiodiplodia, introduzido por Ellis; Everh em 1896, possui como espécie
tipo L. theobromae (Pat.) Griffin; Maublanc, 1909. Até o ano de 2004, L. theobromae era a
única espécie do gênero, porém, por meio de análises filogenética multilocus de DNA, cerca
de 39 espécies foram identificadas, porém apenas 28 estão disponíveis para análises
filogéneticas e todas estas são espécies recém descritas e possuem sequências de DNA
depositadas em banco de dados, como por exemplo, o GenBank (PHILLIPS et al., 2013;

22

SLLIPERS et al., 2017).
No Brasil, já foram relatadas cerca de 15 espécies de Lasiodiplodia, em associação
com diversas doenças: morte descendente e podridão peduncular em mangueira (MARQUES
et al., 2013), morte descendente dos ramos da videira, cajueiro e outras frutíferas tropicais
(CORREIA et al., 2016; COUTINHO et al., 2017), podridão do colo e radicular em pinhão
manso e mandioca (MACHADO et al., 2014), gomose em cajueiro (NETTO et al., 2016),
podridão peduncular em mamoeiro (NETTO et al., 2014) e podridão do fruto (ROSADO et
al., 2016) e queima das folhas (COUTINHO et al., 2017; SANTOS, 2017) em coqueiro.
Dessas 15 espécies, oito foram descritas pela primeira vez no Brasil: L. brasiliense
(NETTO et al., 2014), L. marypalme (=L. euphorbicula), L. jatrophicola, L. subglobosa e L.
macrospora (MACHADO et al., 2014), L. gravistriata (NETTO et al., 2016), L. caatinguensis
e L. pontae (COUTINHO et al., 2017), indicando grande diversidade desse gênero associados
as diferentes culturas, inclusive no coqueiro.
Lasiodiplodia theobromae é a espécie mais importante do gênero. É um fungo
cosmopolita, polífago e oportunista, com pouca especialização patogênica, além de ser
geralmente associado a processos patogênicos em plantas estressadas e submetidas a
ferimentos (TAVARES, 2002; PEREIRA et al., 2006). Essa espécie já foi relatada em cerca de
500 hospedeiros (DAMM; CROUS; FOURIE, 2007; URBEZ-TORRES et al., 2008; DUGAN
et al., 2015; VIEIRA et al., 2018).
Em cultura pura, em meio de BDA, as colônias de L. theobromae são acinzentadas a
negras, com abundante micélio aéreo e no reverso da cultura em placa de Petri são foscas ou
negras. Formam picnídios frequentemente agregados, escuros, estomáticos, ostiolados, com
formato ligeiramente ovoide. Os conidióforos são curtos e simples, contendo na extremidade
um único conídio. Os conídios apresentam morfologias diferentes dependendo do nível de
maturidade destes. Os imaturos são sub-hialinos, unicelulares, ovoides e apresentam parede
dupla, enquanto os maturos tornam-se marrom-escuro, bicelulares, medindo entre 23-29 μm
de comprimento por 13-15 μm de largura com parede apresentando estrias longitudinais e
com um septo transversal (SANTOS, 2017).

2.2.1.4 Gênero Neodeightonia
O gênero Neodeightonia C. Booth foi estabelecido por Punithalingam (1969), com a
espécie tipo N. subglobosa, entretanto, Von Arx; Müller (1975), considerando que os
ascosporos nessa espécie poderiam ser marrons, transferiram a espécie tipo N. subglobosa
para o gênero Botryosphaeria. No entanto, Phillips et al. (2008) restabeleceu novamente o

23

gênero Neodeightonia, visto que este se distingue morfologicamente (baseado nos ascósporos
escuros e septados) e filogeneticamente do gênero Botryosphaeria.
Punithalingam (1969) fez referências a fendas germinativas nos conídios. Crous et al.
(2006) sugeriram que estas eram de fato estriações na parede do conídio, e que mais do que
uma estria poderia ocorrer por conídio, característica esta que foi confirmada por Phillips et
al. (2008). Morfologicamente Neodeightonia é um gênero que se assemelha a Diplodia e
Lasiodiplodia. Pode ser distinguido de Lasiodiplodia pela ausência de paráfises hifais que se
formam entre as células conidiogênicas e de Diplodia pela presença de estrias conidiais
(PHILLIPS et al., 2008; 2013). Filogeneticamente, o sequenciamento multilocus de ITS,
TEF1-α, LSU, SSU e β-tub têm sido utilizados para identificação de espécies desse gênero
(LIU et al., 2012; PHILLIPS et al., 2013), sendo os quatro primeiros os mais informativos ou
mais utilizados (KONTA et al., 2016).
Atualmente são reconhecidas sete espécies dentro do gênero Neodeightonia: N.
subglobosa (PHLLIPS et al., 2008), N. microspora (DAI et al., 2016), N. palmicola (LIU et
al., 2010), N. phenicum (PHILLIPS et al., 2008), N. licuriensis (ADAMČÍK et al., 2015), N.
rattanica e N. rattanicola (KONTA et al., 2016). Além dessas, há uma espécie disponível
como Neodeightonia sp. com depósito de sequências de ITS, TEF1-α no banco de dados do
GenBank, porém ainda não identificada (ELLIOT et al., 2018).
A espécie-tipo de Neodeightonia foi encontrada em Bambusa (PUNITHALINGAM,
1969), gênero de plantas conhecidas como bambus, enquanto as outras espécies encontradas,
foram isoladas de plantas da família das Arecacea, como Arenga westerhoutii, Phoenix sp.,
Caryota urens, Syagrus coronata e Calamus sp. (PHLLIPS et al., 2008; DAI et al., 2016; LIU
et al., 2010; ADAMČÍK et al., 2015; KONTA et al., 2016; ELLIOT et al., 2018).

2.2.2 Mancha de Pestalotia
A mancha de pestalotia, relatada por Anjos; Charchar; Ramos (2000), foi observada
em folhas de coqueiro no Distrito Federal. Nesse trabalho os autores identificaram
Pestalotiopsis guepinii como agente etiológico da doença. Os sintomas são manchas
irregulares de tamanhos variados nas folhas, com coloração castanho escuro no centro das
lesões que são circundadas por um halo amarelo. Em seguida, Cardoso et al. (2003)
observaram com frequência os sintomas em folhas de coqueiro no estado da Paraíba, a partir
dos quais foi isolada uma espécie de Pestalotiopsis associada a doença.
Os sintomas também já foram relatados em outros países produtores da cultura, como
Indonésia, China e Tailândia, onde a doença é conhecida como ferrugem do coqueiro, a qual

24

também é atribuída a fungos Pestalotioid. Nesses países, várias espécies já foram identificadas
causando sintomas da doença, sendo P. meneziana, Neopestalotiopsis sp., N. piceana, N.
javaensis e N. cocoes (MAHACHCHIKUMBURA et al., 2014; NIU et al., 2015; HYDE et
al., 2016).

2.2.2.1 Complexo Pestalotioid
O complexo de Pestalotioid é composto por fungos que possuem conídios semelhantes
a Pestalotiopsis, com cinco células, sendo as das extremidades hialinas e as medianas
pigmentadas (MAHARACHCHIKUMBURA et al., 2014). Engloba indivíduos saprofíticos,
endofíticos e patogênicos (SURYANARAYANAN et al., 2011; XU et al., 2014), e são
regularmente

encontrados

em

ecossistemas

tropicais

e

subtropicais

(MAHARACHCHIKUMBURA et al., 2011; KRUSCHEWSKY et al., 2014).
Os fungos desse complexo eram considerados de importância secundária e iniciavam o
processo infeccioso a partir de aberturas naturais e/ou de ferimentos ocasionados por insetos,
pesticidas ou danos provocados pelo sol (HOPKINS; MCQUILKEN, 2000; AGRIOS, 2005).
Entretanto, esses fungos têm ocasionado significativas perdas econômicas em ampla gama de
hospedeiros

(ÚRBEZ-TORRES

MAHARACHCHIKUMBURA

et

et

al.,

al.,

2012;

2014;

ARZANLOU

et

al.,

2013;

JAYAWARDENA

et

al.,

2015;

MAHARACHCHIKUMBURA et al., 2016).
A patogenicidade desses fungos tem sido comprovada em diversas culturas.
(JAYAWARDENE et al., 2015; MAHARACHCHIKUMBURA et al., 2016). Em C. nucifera,
espécies de Pestalotioid já foram relatadas, como endofíticas e também patogênicas
(CARDOSO et al, 2003; MAHARACHCHIKUMBURA et al., 2014; ROSADO et al., 2015).
Cardoso et al. (2003) avaliando a etiologia e o progresso da mancha de pestalotia do coqueiro,
no estado da Paraíba, constataram que um fungo do gênero Pestalotiopsis era patogênico em
folhas daquela cultura. Isso indica que muitas espécies fúngicas podem se comportar de
formas distintas em função das condições do hospedeiro (HYDE et al., 2014).
O gênero Pestalotiopsis foi proposto por Steyaert (1949), que também propôs
alterações taxonômicas com base nas formas dos conídios. O mesmo autor sugeriu três
gêneros de fungos, sendo Pestalotia, Pestalotiopsis e Truncatella. Posteriormente, o mesmo
autor subdividiu o gênero Pestalotiopsis e agrupou as espécies com base no número de
apêndices apicais e coloração das células medianas em versicolor e concolor. Mas, as
alterações propostas por ele não foram aceitas por Moreau (1949), Guba (1956, 1961) e Dube;
Bilgrami (1965).

25

Posteriormente, uma nova classificação foi proposta por Guba (1961), na qual se
considerava o número de células, a cor das células medianas e a morfologia dos apêndices
apical e basal. Desta forma, mediante esses critérios, foram descritas diferentes categorias e
seções do gênero Pestalotia. Mais adiante, Sutton (1980) apoiou a nova divisão, porém
dificuldades, complexidade e conflitos técnicos na taxonomia de Pestalotiopsis foram
reconhecidos.
Nag Raj (1985, 1993) concordou com a ideia da redistribuição das espécies de
Pestalotia para outros gêneros, porém, entendia que o gênero Pestalotiopsis também teria que
englobar as espécies de conídio com três células. Jeewon et al. (2003) verificaram que apenas
caracteres como pigmentação das células medianas e apêndices apicais seriam confiáveis para
separar as espécies do gênero Pestalotiopsis, mas foi sugerido que análises moleculares
deveriam ser associadas para obter a correta identificação das espécies.
Revisões do gênero Pestalotiopsis têm sido realizadas mediante análises moleculares e
morfológicas,

as

quais

têm

propiciado

novas

alterações

taxonômicas

(MAHARACHCHIKUMBURA et al., 2014; MAHARACH-CHIKUMBURA et al., 2016).
Maharachchikumbura et al. (2014) combinando dados morfológicos e moleculares
contribuíram para uma grande revisão dos táxons tipo de Pestalotiopsis e estabeleceram dois
novos gêneros, Neopestalotiopsis e Pseudopestalotiopsis, pertencentes à ordem Xylariales.
Com base em evidências morfológicas e filogenéticas, Crous; Hawksworth; Wingfield
(2015) inseriram os gêneros Pestalotiopsis, Neopestalotiopsis e Pseudopestalotiopsis em uma
nova família, a Pestalotiopsidaceae Maharachch. & K. D. Hyde, perfazendo a acomodação na
subclasse Xylariomycetidae O. E. Erikss e Winka e ordem Amphisphaeriales D. Hawksw. &
O. E. Erikss. A nova família Pestalotiopsidaceae acomoda os gêneros Ciliochorella Syd.,
Neopestalotiopsis Maharachch., Pestalotiopsis Steyaert., Pseudopestalotiopsis Maharachch. e
Seiridium Nees.

2.2.2.2 Aspectos filogenéticos do complexo Pestalotioid
Por haver similaridade morfológica entre espécies dos gêneros fúngicos, a
identificação passou a ser mais bem-sucedida por meio do sequenciamento de DNA (CROUS;
HAWKSWORTH; WINGFIELD, 2015). Foi devido a utilização de sequenciamento de
regiões gênicas que modificações taxonômicas foram realizadas, e dessa forma, espécies de
Pestalotiopsis

passaram

a

ser

compreendidas

por

complexo

Pestalotioid

(MAHARACHCHIKUMBURA et al., 2014).
A revisão molecular dos gêneros e de espécies do complexo Pestalotioid, tem

26

propiciado mudanças muito significativas na identificação dos taxons e que ainda estão em
andamento. Maharachchikumbura et al. (2012) realizaram o sequenciamento de dez regiões
gênicas diferentes , sendo, o espaçador interno transcrito (ITS), β-tubulina (β-tub), fator de
alongamento 1-α, (TEF1-α), a grande subunidade do gene do RNA ribossômico nuclear
(LSU), a pequena subunidade do gene do RNA ribossômico nuclear (SSU), actina (ACT),
glutamina sintase (GS), gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GPDH), RNA polimerase II
(RPB1) e calmodulina (CAL), para reavaliar as espécies do complexo Pestalotioid. Eles
concluíram, com ajuda de dados morfológicos, que o sequenciamento da região ITS e dos
genes codificadores da β-tub e o TEF1-α poderiam fornecer resultados mais acurados para tal
fim. Sequências concatenadas dessas regiões resultaram em clados fortemente suportados
(MAHARACHCHIKUMBURA et al., 2014).
A região ITS, pode resolver a identificação em gênero e espécie dos fungos do
complexo Pestalotioid e desde o desenho dos oligonucleotídeos por White et al. (1990),
tornou-se a mais empregada em estudos filogenéticos. Porém, essa região associada com os
genes TEF1-α e β-tub, fortalecem os ramos e colaboram para uma melhor separação de
espécies (MAHARACHCHIKUMBURA et al., 2014; HYDE et al., 2014).

2.2.2.3 Gênero Neopestalotiopsis
O gênero Neopestalotiopsis é facilmente distinguido de Pseudopestalotiopsis e
Pestalotiopsis por suas células medianas versicoladas (MAHARACHCHIKUMBURA et al.,
2014). Espécies com células medianas obscuras-escamosas com apêndices apicais foram
definidas como Pseudopestalotiopsis (MAHARACHCHIKUMBURA et al., 2014). Desde a
monografia de MAHARACHCHIKUMBURA et al. (2014), várias novas espécies de
Pestalotioid também foram introduzidas (ARIYAWANSA et al., 2015; HYDE et al., 2016;
JAYAWARDERA et al., 2016; MAHARACHCHIKUMBURA et al., 2016a, b).
O gênero Neopestalotiopsis foi separado de Pestalotiopsis com base em análise
filogenética e diferenças morfológicas e já são mais de 25 espécies descritas para o gênero. A
espécie tipo do gênero é N. protearum (Crous & L. Swart) Maharachch., K.D. Hyde & Crous
(MAHARACHCHIKUMBURA et al., 2014; SOLARTE et al., 2018).

27

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Lasiodiplodia from Iran. Persoonia, v.25, p.1-10, 2010.
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3 CAPÍTULO I:
IDENTIFICAÇÃO DE ESPÉCIES DE BOTRYOSPHAERIACEAE ASSOCIADAS A
QUEIMA DAS FOLHAS DO COQUEIRO NOS ESTADOS DE ALAGOAS E
SERGIPE

39

IDENTIFICAÇÃO DE ESPÉCIES DE BOTRYOSPHAERIACEAE ASSOCIADAS A
QUEIMA DAS FOLHAS DO COQUEIRO NOS ESTADO DE ALAGOAS E SERGIPE

RESUMO: O coqueiro (Cocos nucifera L.) é uma cultura de grande importância econômica
no Brasil. Atualmente, o país é o maior produtor do continente americano e o quarto maior
produtor mundial. A queima das folhas é a principal doença foliar da cultura e sua presença
pode causar perdas significativas, limitando seu potencial produtivo. A doença está associada
a espécies de Lasiodiplodia spp., porém, se faz necessário revisar se o gênero Lasiodiplodia é
o único membro da família Botryosphaeriaceae a causar queima das folhas do coqueiro.
Nesse contexto, o objetivo deste trabalho foi identificar e caracterizar espécies de
Botryosphaeriaceae associadas à queima das folhas do coqueiro nos estados de Alagoas e
Sergipe. Para isso, foram realizadas análises morfológicas e moleculares, com o uso de
filogenia baseada em sequências nucleotídicas parciais dos genes do fator de elongamento da
tradução 1 α (TEF1-α), a grande subunidade do RNA ribossômico nuclear (LSU) e a região
do espaço interno transcrito (ITS), para o correto posicionamento taxonômico dos isolados de
Botryosphaeriaceae. Duas espécies pertencentes a dois gêneros foram identificadas causando
sintomas de queima das folhas em coqueiro, L. theobromae e Neodeightonia alagoensis sp.
nov. Este é o primeiro relato do gênero Neodeightonia causando doença em C. nucifera.
Palavras-chave: Arecaceae, Neodeightonia, Lasiodiplodia theobromae, filogenia multilocus.

40

IDENTIFICATION OF SPECIES OF BOTRYOSPHAERIACEAE ASSOCIATED
WITH BURNING OF COQUEIRO LEAVES IN THE STATE OF ALAGOAS AND
SERGIPE

ABSTRACT: Coconut palm (Cocos nucifera L.) is a culture of great economic importance in
Brazil. Currently, the country is the largest producer in the Americas and the fourth largest
producer in the world. The burning of leaves is the main foliar disease of the crop and its
presence can cause significant losses, limiting its productive potential. The disease is
associated with species of Lasiodiplodia spp., however, it is necessary to review if the genus
Lasiodiplodia is the only member of the family Botryosphaeriaceae to cause burning of the
leaves of the coconut. In this context, the objective of this study was to identify and
characterize Botryosphaeriaceae species associated with the burning of coconut leaves in the
states of Alagoas and Sergipe. For this, morphological and molecular analyzes were
performed using phylogeny based on partial nucleotide sequences of the translation
elongation factor 1-α (TEF1-α), the nuclear ribosomal RNA large subunit (LSU) and internal
transcribed spacer region (ITS) for the correct taxonomic positioning of the isolates of
Botryosphaeriaceae. Two species belonging to two genera were identified causing symptoms
of leaf burning in coconut, L. theobromae and Neodeightonia alagoensis sp. nov. This is the
first report of the genus Neodeightonia causing disease in C. nucifera.
Key words: Arecaceae, Neodeightonia, Lasiodiplodia theobromae, multilocus phylogen.

41

3.1 Introdução
O coqueiro (Cocos nucifera L.) é membro da família Arecaceae e uma das espécies
perenes de maior relevância do mundo. O seu provável centro de origem remonta ao Sudeste
da Ásia visto que, nesta região, a espécie apresenta ampla diversidade morfológica
(PURSEGLOVE, 1972; PERSLEY, 1992).
A Ásia é o continente com maior produção, cerca de 49.016.693 toneladas de frutos do
coqueiro, e onde são encontrados os três maiores produtores mundiais, Indonésia, Filipinas e
Índia. O Brasil é o maior produtor das Américas e o quarto maior produtor de coco do mundo.
Em 2016, o país produziu mais de 2.649.246 toneladas de frutos, em uma área de
aproximadamente 234 mil ha (FAOSTAT, 2016). A região nordeste é a principal produtora
nacional. Nessa região concentram-se 83,2% da área colhida de coco e 76,7% de sua
produção, onde os estados da Bahia (31%), Ceará (15%) e Sergipe (13%) são os maiores
produtores do país (IBGE, 2017).
A produção de coco está diretamente relacionada ao número de folhas sadias por
planta, no entanto, doenças como a queima das folhas, considerada a principal doença da
cultura no Brasil, podem causar diminuição da área foliar do coqueiro e consequentemente
redução da produtividade (MONTEIRO et al. 2013; BRAINER, 2017). O sintoma inicial da
doença é conhecido como empardecimento em “V”, conforme evolui provoca abscisão das
folhas inferiores, deixando os cachos sem sustentação, assim, os frutos caem prematuramente
antes de atingirem o ponto de colheita (FONTES; WANDERLEY 2006).
O fungo Lasiodiplodia theobromae (Pat.) Griffon & Maubl. é a principal espécie
associada a esta doença e até pouco tempo era a única (TALAMINI; FERREIRA; RAMOS,
2013; SANTOS, 2017). Hoje, além de L. theobromae (RAM, 1989), outras três espécies já
foram relatadas como agentes causais da queima das folhas do coqueiro: L. euphorbicola
(COUTINHO et al., 2017), L. pseudotheobromae e L. brasiliense (SANTOS, 2017).
Todas as espécies relatadas pertencem à família Botryosphaeriaceae. Essa família
contém inúmeras espécies “crípticas” com distribuição cosmopolita que ocorrem em uma
grande variedade de hospedeiros de plantas cultivadas (MARQUES et al., 2013; MACHADO
et al., 2014; ROSADO et al., 2016; COUTINHO et al., 2017). Os membros dessa família
apresentam diversidade fenotípica e apesar das características morfológicas e culturais terem
sido amplamente utilizadas, não são confiáveis para estabelecer a correta identificação,
necessitando de ferramentas que possam fornecer dados mais precisos e confiáveis (ALVES
et al., 2007; PHILLIPS et al., 2008; SLLIPERS et al., 2017).

42

Assim, estudos sobre a taxonomia de Botryosphaeriaceae empregando métodos
moleculares, tornaram-se de extrema importância para revelar relações filogenéticas entre as
espécies (PHILLIPS et al., 2013; SLIPPERS et al., 2013; DISSANAYAKE et al., 2016) e
para ajudar a resolver complexo de espécies (SMITH et al. 2001; PHILLIPS et al. 2002;
DENMAN, et al. 2003; ALVES et al. 2004; BEGOUDE et al. 2010; SAKALIDIS et al.
2011).
Diante dessas informações, o objetivo deste trabalho foi identificar e caracterizar, por
meio de análises filogenéticas e morfológicas, espécies de Botryosphaeriaceae associadas à
queima das folhas do coqueiro a fim de buscar um melhor entendimento sobre a etiologia da
doença.

3.2 Material e Métodos
O trabalho foi conduzido no Laboratório de Fitopatologia Molecular do Centro de
Ciências Agrárias (CECA) da Universidade Federal de Alagoas (UFAL), localizado no
município de Rio Largo, zona da mata alagoana.

3.2.1 Obtenção e preservação dos isolados
Isolados de Botryosphaeriaceae foram obtidos a partir de raques e folhas do coqueiro
que apresentavam sintomas de queima das folhas, provenientes de três áreas de plantios
comerciais, localizadas nos Estados de Alagoas e Sergipe.
No Laboratório, as folhas e raques foram lavadas e secas naturalmente. Em seguida
realizou-se o isolamento indireto, onde fragmentos foram retirados de tecido sintomático da
interface entre o tecido necrótico e o aparentemente não infectado, os quais foram
desinfestados com soluções de álcool 70% por 30 segundos e depois hipoclorito de sódio a
1% por 1 minuto. Após ser lavado por duas vezes com água destilada e esterilizada durante
30s, o material foi então seco em papel de filtro esterilizado e em seguida, fragmentos de 5
mm foram transferidos para placas de Petri contendo meio Batata-Dextrose-Ágar (BDA).
Após a formação das colônias foram retirados fragmentos das bordas das placas e transferidos
para novas placas de Petri contendo meio BDA.
Após a obtenção das culturas puras, pela excisão de pontas da hifa nas bordas da colônia
em BDA, as quais foram incubadas a 25ºC no escuro, os isolados foram preservados utilizando

três métodos: tubos de ensaio contendo meio de cultura BDA, Castellani e em papel filtro
autoclavado.

43

3.2.2 Teste de patogenicidade
A patogenicidade dos isolados foi testada em fragmentos de raques e folíolos foliares
sadios de coqueiro da variedade anão-verde. Os fragmentos foram desinfestados com solução
de hipoclorito de sódio a 1% por 3 minutos e, posteriormente lavadas duas vezes em ADE por
1 minuto de cada vez. Raques e folíolos foram secos ao ar em toalhas de papel esterilizadas.
Após a secagem, ferimentos foram realizados em três posições equidistantes da face adaxial
de cada fragmento foliar, para isso, utilizou-se uma agulha previamente flambada.
Os fragmentos de raques e folíolos foram inoculados na região perfurada, sendo
colocado um disco de 5 mm de meio de BDA com estruturas do fungo (cultivados por 7 dias)
e para o tratamento controle foi depositado um disco de BDA sem crescimento fúngico.
Foram utilizados três fragmentos para cada isolado e para testemunha. Após as inoculações,
raques e folíolos foram colocadas em caixas do tipo gerbox, forradas com papel filtro
umedecidos para proceder a câmara úmida de 48 horas. Em seguida foram incubadas a uma
temperatura de 25 ± 1 ºC, fotoperíodo de 12 horas. Os tamanhos das lesões foram medidos
sete dias após a inoculação.

3.2.3 Caracterização molecular

3.2.3.1 Extração, amplificação e sequenciamento de DNA
Para a extração e amplificação do DNA, utilizou a massa micelial de cada isolado,
obtida a partir do cultivo em meio liquido de L-Asparagina durante cinco dias em erlenmeyer
de 50mL e incubados à temperatura ambiente (25 ± 1 ºC) e fotoperíodo de 12 horas. Após
esse período, a massa micelial foi retirada do meio de cultura e posta para secar à temperatura
ambiente. O protocolo de extração utilizado foi o CTAB adaptado de Doyle; Doyle (1987).
A amplificação de fragmentos do DNA foi feita por Reação da Cadeia da
Polimerase (PCR). Inicialmente, todos os isolados foram amplificados para região espaçadora
interna transcrita (ITS), usando os primers ITS1 e ITS4 (WHITE et al., 1990). Após a
identificação das espécies pela região ITS, os produtos de PCR do gene do fator de
alongamento 1-α (TEF1-α) e a grande subunidade do RNA ribossômico nuclear (LSU),
amplificados usando os primers 728F e 986R (CARBONE; KOHN, 1999) e LR0R e LR5
(VILGALYS; HESTER, 1990), respectivamente,

foram sequenciados para confirmar a

identidade dos haplótipos representativos dentro de cada espécie (Tabela 1).

44

Tabela 1. Descrição dos primers utilizados para identificação dos gêneros fúngicos de
Botryospheriaceae.
Gene

Primer

Sequência (5’ – 3’)

Referência

ITS

ITS1

TCCGTAGGTGAACCTGCGG

WHITE et al.,1990

ITS4

TCCTCCGCTTATTGATATGC

728F

CATCGAGAAGTTCGAGAAGG

986R

TACTTGAAGGAACCCTTACC

LR0R

ACCCGCTGAACTTAAGC

LR5

TCCTGAGGGAAACTTCG

TEF1-α

LSU

CARBONE; KOHN (1999)

VILGALYS; HESTER, 1990

As PCRs foram realizadas em termociclador Applied Biosystems (2720 Thermal
Cycler) nas seguintes condições: para a região ITS, a desnaturação inicial foi de 95°C por 2
min, seguidos por 38 ciclos de desnaturação a 95°C por 1 min, anelamento a 55°C por 30s,
extensão a 72°C por 45s e uma extensão final a 72°C por 10 min; para TEF1-α a desnaturação
inicial foi de 94°C por 5 min, seguido por 35 ciclos de desnaturação a 94°C por 60s,
anelamento a 55°C por 60s, extensão a 72°C por 60s e uma extensão final a 72°C por 10 min;
e para LSU a desnaturação inicial foi de 94°C por 3 min, seguido por 35 ciclos de
desnaturação a 94°C por 30s, anelamento a 55°C por 50s, extensão a 72°C por 60s e uma
extensão final a 72°C por 10 min. Os produtos da PCR foram separados por eletroforese em
gel de agarose a 1,0% com Tris Borato EDTA 1X, corado com brometo de etídio (5 mg. mL-1)
e visualizado em transiluminador UV.
Após a confirmação das amplificações nos géis de agarose, alíquotas de 25 μL do
produto de PCR de cada amostra foram enviadas para a empresa Macrogen Inc., na Corea do
Sul, para purificação e sequenciamento do produto oriundo de cada par de iniciadores.

3.2.3.2 Análises filogenéticas
As sequências de nucleotídeos de cada isolado foram montadas com o software Codon
Code Aligner v. 6.0.2 (www.codoncode.com) (Codon Code Corporation, Dedham,
Massachusetts, USA). O arranjo dos nucleotídeos em posições ambíguas, foram corrigidos
por comparação das sequências senso e anti-senso. Sequências parciais obtidas para os genes
ITS, TEF1-α e LSU foram inicialmente analisadas com o algoritmo BLASTn e o banco de
dados de nucleotídeos não-redundante do GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank) para
determinar as espécies com as quais compartilharam maior identidade de sequência.
Alinhamentos múltiplos das sequências nucleotídicas foram realizadas utilizando a

45

ferramenta MUSCLE (EDGAR, 2004), implementado pelo programa MEGA v.6 (TAMURA
et al., 2013). Sequências de espécie de Botryosphaeriaceae oriundas de estudos anteriores,
disponíveis no GenBank, (Tabela 2), foram incluídas nas análises.

Tabela 2. Números de acesso GenBank das sequências de Botryosphaeriaceae utilizadas nas
análises filogenéticas.
Espécies
Diplodia corticola
D. corticola
D. mutila
D. mutila
D. scrobiculata
D. scrobiculata
D. seriata
D. seriata
Lasiodiplodia bruguierae
L. bruguierae
L. caatinguensis
L. caatinguensis
L. crassispora
L. crassispora
L. exigua
L. gilanensis
L. gilanensis
L. gonubiensis
L. gonubiensis
L. mahajangana
L. mahajangana
L. margaritacea
L. margaritacea
L. missouriana
L. missouriana
L. parva
L. parva
L. plurivora
L. pseudotheobromae
L. pseudotheobromae
L. theobromae
L. theobromae
L. theobromae
L. theobromae
L. viticola
L. viticola
Neodeightonia alagoensis
N. alagoensis

Isolados
CBS 112549
CBS 112546
CBS 112553
CBS 230.30
CBS 109944
CBS 113423
CBS 112555
CBS 119049
CMW41470
CMW42480
IBL366
IBL381
CBS 110492
CBS 118741
BL 104
IRAN1501C
IRAN1523C
CBS 115812
CBS 116355
CMW27801
CMW27818
CBS122519
CBS122065
UCD2193MO
UCD2199MO
CBS 356.59
CBS 494.78
STEU5803
CBS116459
CBS447.62
CBS 164.96
CBS124.13
COUFAL0102
COUFAL0103
UCD2553AR
UCD2604MO
COUFAL0165
COUFAL0171

ITS
AY259100
AY259090
AY259093
DQ458886
DQ458899
DQ458900
AY259094
DQ458889
KP860833
KP860832
KT154760
KT154757
EF622086
DQ103550
KJ638317
GU945352
GU945351
DQ458892
AY639594
MH057188
FJ900596
EU144050
EU144051
HQ288225
HQ288226
EF622082
EF622084
EF445362
EF622077
EF622081
AY640255
DQ458890
MK792506
MK792507
HQ288227
HQ288228
MK792508
MK792509

TEF1-α
AY573227
EU673310
AY573219
DQ458869
DQ458884
DQ458885
AY573220
DQ458874
KP860678
KP860677
KT008006
KT154751
EF622066
EU673303
KJ638336
GU945341
GU945342
DQ377902
DQ103567
MH102251
FJ900642
EU144065
EU144066
HQ288267
HQ288268
EF622062
EF622064
EF44539
EF622057
EF622060
AY640258
DQ458875
MK792505
MK792504
HQ288269
HQ288270
MK792523
MK792524

LSU
AY928051
EU673262
AY928049
EU673265
EU673268
EU673267
AY928050
EU673266
EU673251
DQ377901
DQ458877
EU673252
EU673257
EU673258
EU673256
EU673255
EU673253
AY928054
MK792514
MK792515

46

Tabela 2. (Continuação)
Espécies
N. alagoensis
N. alagoensis
N. alagoensis
N. alagoensis
N. licuriensis
N. microspora
N. microspora
N. palmicola
N. palmicola
N. phoenicum
N. phoenicum
N. phoenicum
N. rattanica
N. rattanica
N. rattanicola
Neodeightonia sp.
Neodeightonia sp.
N. subglobosa
Spencermartinsia viticula

Isolados
COUFAL0173
COUFAL0231
COUFAL0232
COUFAL0233
COAD1780
MFLUCC 11-0483
MFLUCC 11-0504
MFLUCC 10-0822
MFLUCC10-0823
CBS 122528
CBS 123168
CBS 169.34
MFLUCC 15-0712
MFLUCC 15-0313
MFLUCC 15-0319
PLM-367
PLM-610
CBS 448.91
CBS 117009

ITS
MK792510
MK792511
MK792512
MK792513
KP165429
KU940110
KU940111
HQ199221
HQ199224
KF766198
EU673339
EU673338
KX646357
KX646358
KX646359
MG321231
MG321232
KF766199
AY905554

TEF1-α
MK792525
MK792520
MK792521
MK792522
KP165430
EU673309
EU673308
EU673307
KX646360
KX646361
KX646362
MG309739
MG309740
EU673306
AY905559

LSU
MK792516
MK792517
MK792518
MK792519
KU863099
KU863100
HQ199222
HQ199225
EU673261
EU673260
EU673259
KX646352
KX646353
KX646354
DQ377866
DQ377873

ITS = Internal transcribed spacer; TEF1-α = Translation elongation factor 1-α; LSU= Nuclear ribosomal RNA
large subunit (LSU). Isolados obtidos neste estudo estão destacados em negrito.

As relações filogenéticas foram inferidas pelo método de inferência Bayesiana (IB)
utilizando o método de Cadeia de Markov de Monte Carlo (MCMC). Os conjuntos de dados
ITS, TEF1-α e LSU (individuais e concatenados) foram reconstruídas no portal CIPRES
(MILLER et al., 2010) usando MrBayes v. 3.2.3 (RONQUIST et al., 2012). O melhor modelo
de substituição de nucleotídeos foi determinado para cada região genômica usando
MrModeltest v. 2.3 (POSADA; BUCKLEY, 2004). Análises foram rodadas por 10 milhões de
gerações usando quatro cadeias e amostrando a cada 1.000 gerações, para um total de 10.000
árvores. As árvores filogenéticas geradas foram visualizadas e editadas nos programas
FigTree v. 1.4 (ztree.bio.ed.ac.uk/software/figtree) e Inkscape (https://inkscape.org/pt/).

3.2.4 Caracterização cultural e morfológica
Para avaliar o crescimento e coloração das colônias, foi retirado da borda de cada
isolado (cultivados por sete dias), um disco de meio de cultura contendo estruturas do
patógeno, e em seguida transferidos para o centro de placas de Petri contendo meio BDA. As
placas foram incubadas a 25 ± 1 ºC com fotoperíodo de 12 horas. As medições do diâmetro do
reverso das colônias em duas direções ortogonais, foram realizadas diariamente e concluída

47

quando o primeiro isolado atingiu a borda da placa, determinando-se assim, o Índice de
Velocidade de Crescimento Micelial (IVCM) do fungo (mm.dia-1), que foi calculada com a
seguinte fórmula: IVCM = Σ(D-Da)/N, sendo: D = diâmetro médio atual da colônia; Da =
diâmetro médio da colônia do dia anterior e N = número de dias após a inoculação. Por fim,
aos 10 dias após a incubação determinou-se a coloração das colônias, utilizando-se uma
escala descritiva reportada por Lima et. al. (2013). O delineamento experimental utilizado foi
o inteiramente casualizado (DIC) com oito tratamentos e cinco repetições, em que cada placa
de Petri constituiu uma unidade experimental.
Na caracterização morfológica dos esporos, foi retirado da borda de cada isolado
(cultivados por sete dias), um disco de meio de cultura contendo estruturas do patógeno, que
foram transferidos para o centro de placas de Petri contendo meio Agar-Água (AA) onde,
foram depositadas acículas de pinheiros autoclavadas. As placas foram incubadas a 25 ± 1 ºC,
sob luz negra. As dimensões dos conídios (comprimento e largura) foram avaliadas após
esporulação utilizando microscopia de luz. Dessa forma, imagens foram capturadas por
câmera digital (Olympus IX2-SLP) acoplada ao microscópio com aumento de 400x através do
software Cellsenses Standard (SAMSUNG SDC-415®). Foram avaliados 50 conídios por
isolado.

3.3 Resultados e Discussão

3.3.1 Resultados

3.3.1.1 Obtenção dos isolados
Foram obtidos 28 isolados de Botryosphaeriaceae. Destes, cinco isolados do município
de Coruripe, litoral sul de Alagoas, 14 isolados do município de Satuba, zona da mata
alagoana e nove isolados do município de Neópolis, localizado no leste do estado de Sergipe.
Esses municípios foram escolhidos por apresentarem plantios comerciais de coco e por serem
geograficamente distantes, além de pertencerem a microrregiões diferentes (Tabela 3). As
culturas obtidas foram depositadas na Coleção de Culturas de Fungos Fitopatogênicos da
Universidade Federal de Alagoas (COUFAL).

48

Tabela 3. Isolados coletados de plantios comerciais nos estados de Alagoas e Sergipe.
Município/UF

Parte da
planta

Isolados

Coruripe-AL

Raque

Satuba-AL

Raque

Neópolis-SE

Folíolo

FC-9, FC-13 (COUFAL0171), FC-16 (COUFAL0173),
FC-22, FC-29
FS-3 (COUFAL0165), FS-4, FS-4.1, FS-5, FS-6, FS-9.1, FS10 (COUFAL0103), FS-11, FS-11.1, FS-12, FS-12.1
(COUFAL0102), FS-14, FS-15, FS-15.1
NFO18 (COUFAL0231), NFO21, NFO30 (COUFAL0232),
NFO35, NFO40, NFO47 (COUFAL0233)
NRA9, NRA16, NRA39

Raque

3.3.1.2 Teste de patogenicidade
Todos os isolados foram patogênicos em raques e folhas de coqueiro, com sintomas
iniciando 72 horas após as inoculações, onde observou-se o escurecimento dos vasos e
posteriormente, necrose na região onde foram inoculadas (Figura 3B-C). Não foram
observadas lesões nas folhas e raques do tratamento controle. As respectivas espécies foram
reisoladas dos tecidos doentes, cumprindo assim os postulados de Koch.

3.3.1.3 Análise filogenética
Na reconstrução filogenética de inferência Bayesiana para os conjuntos de dados
concatenados, foram utilizados os seguintes modelos evolutivos: HKY+I+G (ITS e TEF1-α) e
GTR+I+G (LSU) para os alinhamentos de sequências nucleotídicas. Spencermartinsia viticula
(CBS117009) foi utilizado como outgroup.
As análises filogenéticas revelaram dois gêneros distintos de Botryosphaeriaceae,
dentre os 28 isolados obtidos causando queima das folhas do coqueiro: Lasiodiplodia e
Neodeightonia. Após uma análise prévia utilizando a região ITS, foram verificados nove
haplótipos pertencentes ao gênero Lasiodiplodia e 19 haplótipos ao gênero Neodeightonia,
onde separou-se dois e seis isolados representativos, respectivamente, para compor a
filogenia. Na árvore de Inferência Bayesiana para o conjunto de dados concatenados (ITS,
TEF1-α e LSU) observou-se que as espécies identificadas formaram grupos bem suportados.
No gênero Lasiodiplodia, os isolados agruparam com a espécie Lasiodiplodia theobromae
(COUFAL0102 e COUFAL0103). Entretanto, os isolados COUFAL0165, COUFAL0171,
COUFAL0173, COUFAL0231, COUFAL0232 e COUFAL0233 pertencentes ao gênero
Neodeightonia, formaram um clado com uma espécie ainda não relatada Neodeightonia sp. e,
portanto, foram considerados como pertencentes a uma nova espécie: Neodeightonia

49

alagoensis sp. nov (Figura 1).

Figura 1. Árvore filogenética de inferência Bayesiana com base nas sequências combinadas
das regiões ITS, TEF1-α e LSU. Spencermatinsia viticola foi utilizado como outgroup.
Isolados caracterizados neste estudo estão destacadas em negrito.

50

Taxonomia
Neodeightonia alagoensis T.J.A. Barbosa & G.S.A. Lima, sp. nov.
Posição sistemática: Ascomycota, Pezizomycotina, Dothideomycetes, Botryosphaeriales,
Botryosphaeriaceae.
Etimologia: O nome é referente ao local onde o fungo foi encontrado, Estado de Alagoas,
Brasil.
Colônias crescidas em acículas de pinheiro sobre meio de cultura AA expostas a luz negra
produziram picnídios pretos e ásperos (Figura 2E). O teleomorfo produziu ascas hialinas com
presença de oito ascósporos revestidos por uma bainha mucilaginosa (Figura 2F). O
anamorfo apresenta célula conidiogênica hialina e alongada, com presença de gútulas nos
esporos em formação e ausência de paráfises (Figura 2G-H). Conídios hialinos quando jovem,
granular, elipsóide, sendo mais largo no terço mediano, e quando maduros são hialinos,
asseptados e alongados (Figura 2I) variando de 24,5-30,9 x 10,8-14,4 μm (Tabela 4).
Características da cultura: Em meio BDA sintético, as colônias apresentaram inicialmente
coloração branca e após dez dias a coloração variou de cinza claro a cinza escuro, com
presença de micélio aéreo nas extremidades da placa. O reverso teve coloração variando de
marrom claro a escuro e halos cinza-claro (Figura 2D). As colônias apresentaram taxa de
crescimento micelial de 28,6 mm.dia-1, a 25º C e fotoperíodo de 12 horas.
Habitat: Em folhas e raque foliar de Cocos nucifera.
Distribuição conhecida: Estado de Alagoas e Sergipe, Brasil e estado da Flórida, USA.
Tipo: Brasil, Alagoas, municípios de Coruripe e Satuba, Sergipe, município de Neópolis, em
folíolos e raque foliar de Cocos nucifera, 2017, coletado por T.J.A. Barbosa, Holótipe URM
XXXX, cultura seca em acículas de pinheiro e cultivada em meio de cultura, ex-type cultura
URM XXXX.
Notas: Neodeightonia alagoensis agrupou em um clado com Neodeightonia sp. demostrando
100% de similaridade nas sequências. Apresentou maior proximidade com N. palmicola com
diferenças nas duas regiões genômicas disponíveis no banco de dados, sendo 66 nucleotídeos
em ITS e 5 nucleotídeos em LSU. Com a espécie tipo, N. subglobosa, as diferenças
filogenéticas foram nas três regiões genômicas, sendo 46 nucleotídeos em ITS, 60
nucleotídeos em TEF1-α e 17 nucleotídeos em LSU.

51

Figura 2. Sintomas de queima das folhas do coqueiro e aspectos culturais, morfológicos e patogênicos
de Neodeightonia alagoensis. Sintoma em “V” invertido, típico da doença no campo (A); Sintomas
visualizados em folha e raque nos testes de patogenicidade (B-C); Colônia em BDA com 10 dias (D);
Picnídio sobre acícula de pinheiro (E); Ascas maduras e imaturas (F); Células conidiogênicas sem
presença de paráfises (G-H); e conídios de N. alagoensis (I). Fonte: Autor.
Tabela 4. Características morfológicas da espécie de Neodeightonia encontrada neste estudo e das
espécies já descritas.
Nome da espécie
Neodeghtonia alagoensis

Conídio
µm
25,0-31,6 x 12,7-14,4

Número
de septo
Asseptado

Neodeightonia rattanica

19-22 x 7-9

Asseptado

Neodeightonia rattanicola

13-20 x 7-8

Asseptado

Neodeightonia phenicum

14,5-24 x 9-14

1

Neodeightonia palmicola

17,5-24,5 x 9,5-12,5

1

Neodeightonia microspora

-*

Neodeightonia licuriensis

14.6-20,5 × 8,3-11,4

Até 3

Neodeightonia subglobosa
(espécie tipo)

11-13,5 x 8-10,5

1

-

Crescimento
micelial
Em 4 dias, 9 cm em
BDA a 25ºC
Em 2 semanas 7-8,5
cm em MEA a 25ºC
Em 2 semanas 7-8,5
cm em MEA a 25ºC
Não informado
Em 4 dias, 5 cm em
BDA
Em uma semana, 5
cm em BDA a 28ºC
Em 10 dias, 9 cm em
BDA 25ºC
Em 5 dias, 5 cm a
28ºC

*Em trabalho de Dai et al. (2016), não foi encontrado o morfo sexual da espécie.

Referência
Neste estudo
Konta et al., 2016
Konta et al., 2016
Phillips et al.,
2008, 2013
Liu et al., 2010
Daí et al., 2016
Adamčík et al.,
2015
Phillips et al.,
2008, 2013; Liu et
al., 2010; Daí et
al., 2016

52

Na caracterização morfocultural de Lasiodiplodia theobromae, o índice de crescimento
micelial médio foi de 52,0 mm.dia-1, com variação de 39,3 e 64,8 mm entre os isolados desta
espécie. Em relação à morfologia das colônias, essa espécie apresentou coloração variando de
cinza claro a escuro, com reverso em tom escuro, quase preto, sendo que, algumas colônias
com o centro do reverso escuro e bordas de cor cinza. Essas colônias produziram picnídios
sobre o meio de cultura a partir da terceira semana e apresentaram conídios com dimensão
média de 24,8 x 14,2 µm, variando entre 19,6-31,3 x 11,2-17,4 µm.

3.3.2 Discussão
Esse é o primeiro estudo que visa a identificação de espécies de Botryosphaeriaceae
associadas a queima das folhas do coqueiro nos Estados de Alagoas e Sergipe. Os resultados
demonstram que a queima das folhas não é causada apenas por espécies do gênero
Lasiodiplodia, mas também pelo gênero Neodeightonia, indicando que assim como a
podridão dos frutos (ROSADO et al., 2016), a queima das folhas está associada à um
complexo de espécies (SANTOS, 2017). Além disso, este é o primeiro relato do gênero
Neodeightonia causando doença em Cocos nucifera.
Entre os gêneros de Botryosphaeriaceae, Lasiodiplodia é o que apresenta o maior
número de espécies descritas, cerca de 38 (SLLIPERS et al., 2017). Essas espécies são
comumente encontradas nas regiões tropicais e subtropicais, causando muitas doenças em
uma ampla gama de hospedeiros (PUNITHALINGAM, 1980; MACHADO et al, 2014;
CORREIA et al., 2015; COUTINHO et al., 2017). Em coqueiro, espécies de Lasiodiplodia
spp. já foram relatadas por diversos autores causando podridão dos frutos e principalmente,
queima das folhas, que é considerada uma das principais doenças do coqueiro no Brasil
(RAM, 1989; ROSADO et al., 2016; COUTINHO et al. 2017; SANTOS, 2017).
A espécie L. theobromae, identificada no presente estudo, é o principal agente
etiológico da queima das folhas e até pouco tempo era tida como a única espécie responsável
pela doença (SOUSA FILHO et al., 1979; MARIANO; SILVEIRA, 2005; COUTINHO et al.,
2017). Porém, estudos recentes detectaram mais três espécies associadas a essa doença, L.
euphorbicula (COUTINHO et al., 2017), L. pseudotheobromae e L. brasiliense (SANTOS,
2017). Os resultados obtidos por estes autores deixam claro que, a queima da folhas até então
era especificamente causada por espécies do gênero Lasiodiplodia. Contudo, este estudo
demonstra que o gênero Neodeightonia também está associado a doença, além disso, ela é a
espécie que predomina causando a doença nas áreas amostradas dos estados de Alagoas e
Sergipe.

53

O gênero Neodeightonia foi introduzido por Booth (PUNITHALINGAM, 1969) e
atualmente

são

reconhecidas

sete

espécies,

N.

subglobosa

(espécie

tipo)

(PUNITHALINGAM, 1969; PHILLIPS et al., 2008; LIU et al., 2010; DAI et al., 2016), N.
palmicola (LIU et al., 2010), N. microspora (DAI et al., 2016), N. phoenicum (PHILLIPS et
al., 2008), N. licuriensis (ADAMČÍK et al., 2015), N. rattanica e N. rattanicola (KONTA et
al., 2016). Destas, apenas N. licuriensis foi relatada no Brasil causando doença em licuri
(Syagrus coronata), que é uma palmeira nativa do Bioma Caatinga (ADAMČÍK et al., 2015).
No passado, o gênero Neodeightonia era sinonimizado como Botryosphaeria (VON
ARX; MÜLLER, 1975), no entanto, com base em estudos morfológicos e filogenéticos,
Phillips et al. (2008) reintroduziram o gênero. De acordo com estes autores, esse gênero
assemelha-se aos gêneros Diplodia e Lasiodiplodia, morfologicamente. Podendo ser
distinguido de Diplodia apenas pela presença de estrias conidiais e de Lasiodiplodia pela
ausência de paráfises hifais, que são hifas estéreis que se formam entre as células
conidiogênicas (PHILLIPS et al., 2008; 2013).
Filogeneticamente, o sequenciamento multilocus de ITS, TEF1-α, LSU, SSU e β-tub
têm sido eficientes para identificação de espécies desse gênero, sendo os quatro primeiros os
mais utilizados (LIU et al., 2012; PHILLIPS et al., 2013; KONTA et al., 2016). No entanto,
Phillips et al. (2013), demonstraram que apenas a região ITS foi suficiente para separar as
espécies de Neodeightonia. Resultado este, observado no presente estudo, quando está região
(ITS) separou não só as espécies relatas do gênero mais também a espécie aqui identificada.
Porém, quando adicionamos TEF1-α e LSU observamos uma filogenia mais robusta, com
clados bem suportados, comprovando a importância do uso de mais de uma região genômicas
para a identificação precisa das espécies desse gênero. Konta et al. (2016) também relataram
ramos bem definidos para as espécies de Neodeightonia quando utilizaram quatro regiões
genômicas (ITS, TEF1-α, LSU e SSU).
Neste estudo, introduzimos uma nova espécie de Neodeightonia, N. alagoensis. Esta
espécie foi isolada de folhas e raque de C. nucifera e com base em análises morfológicas e
filogenéticas diferenciou-se das demais espécies descritas para o gênero (PUNITHALINGAM
1969; PHILLIPS et al., 2008, 2013; LIU et al., 2010; DAI et al., 2016; ADAMČÍK et al.,
2015; KONTA et al., 2016). Porém, agrupou com sequências de ITS, TEF1-α depositadas no
banco de dados “Genbank”, com uma espécie ainda não descrita, Neodeightonia sp. Os
referidos isolados foram obtidos de Washingtonia robusta, uma Arecacea ornamental bem
típica na cidade da Flórida, nos Estados Unidos. Para esses isolados não foram realizadas

54

nenhuma caracterização morfológica e nem cultural (ELIOTT; MORALES; DES JARDIN,
2018).
Em relação às caracteristicas morfologicas, N. alagoensis apresentou conídios
asseptados, largos, alongados e em formato elipsóide, se constituindo nas maiores dimensões
de conidios do gênero. Diferencia-se de N. subglobosa (espécie tipo), que possui conídios
mais curtos e ovóide e presença de septo nos conídios (PHILLIPS et al., 2008; LIU et al.,
2010; DAI et al., 2016). Diferencia-se ainda de N. palmicola e N. licuriensis que também
apresentam septação nos conídios e assemelha-se as espécies N. rattanica, N. rattanicola e N.
phenicum quanto a ausência de septos nos conídios (ADAMČÍK et al., 2015; KONTA et al.,
2016). Além disso, observou-se a fase sexuada de N. alagoensis, fase esta, relatada na maioria
das espécies de Neodeightonia, exceto em N. licuriensis e N. phenicum
Em relação ao crescimento micelial, N. alagoensis, colonizou toda a placa de Petri
em apenas quatro dias. Entre as espécies descritas para o gênero, foi a que obteve o
crescimento mais rápido (ADAMČÍK et al., 2015; KONTA et al., 2016). Quanto à coloração
das colônias, assemelha-se com a coloração encontrada para a espécie N. licuriensis, N.
rattanica e N. rattanicola, as quais apresentaram coloração branco a ligeiramente cinzento na
maturidade (ADAMČÍK et al., 2015; KONTA et al., 2016).
Já a espécie L. theobromae apresentou taxa de crescimento micelial, em meio BDA,
de 3,93 a 6,48 cm.dia-1, corroborando com os encontrados por outros autores (LIMA et al.,
2013; MARQUES et al., 2013). Os dados da variação na coloração das colônias se
assemelham aos parâmetros encontrados para Botryosphaeriaceae (LIMA et al., 2014;
SANTOS, 2017; OSORIO et al., 2017). As características dos conídios de L. theobromae,
identificado no presente estudo, estão de acordo com resultados observados por outros autores
(ALVES et al., 2008; MACHADO et al., 2014; ROSADO et al., 2016).
No presente estudo foram obtidos 28 isolados, destes, 19 no estado de Alagoas e
nove no estado de Sergipe (Tabela 3). No estado de Alagoas as duas espécies identificadas
estavam presentes nos locais de coleta. No município de Coruripe, 60% dos isolado obtidos
eram de N. alagoensis e 40% de L. theobromae, e no município de Satuba, 50% de N.
alagoensis e 50% de L. theobromae. No Estado de Sergipe, 100% dos isolados foram de N.
alagoensis. Esses resultados demonstram que a espécie N. alagoensis é o principal agente
etiológico da queima das folhas do coqueiro, nas áreas amostradas. Até então, nesses estados
só havia relatos de L. theobromae como agente etiológico da queima das folhas do coqueiro
(SOUZA FILHO et al., 1979; FONTES; FERREIRA; SIQUEIRA, 2002).

55

Podemos observar ainda que a capacidade patogênica das espécies relatadas
pertencentes ao gênero Neodeightonia, incluindo a espécie aqui identificada, é quase
exclusivamente específica de plantas da família Arecaceae como, Arenga westerhoutii,
Calamus sp., Caryota urens, Phoenix sp., Syagrus coronata, Washingtonia robusta
(PHILLIPS et al., 2008; LIU et al., 2010; DAI et al., 2016; ADAMČÍK et al., 2015; KONTA
et al., 2016; ELIOTT; MORALES; DES JARDIN, 2018) e Cocos nucifera, com exceção da
espécie tipo (N. subglobosa) que foi relatada em Bambusa, gênero botânico pertencente à
família Poaceae, em uma espécie popularmente conhecidas como bambu (DAÍ et al., 2016)
Neste estudo demonstramos que a queima das folhas é causada por mais de um
gênero da família Botryosphaeriaceae, pois até então, apenas espécies de Lasiodiplodia
estavam associados à doença. Assim, podemos incluir também a espécie N. alagoensis como
agente etiológico da doença. Os resultados representam uma importante contribuição para a
etiologia e epidemiologia da queima das folhas do coqueiro no Nordeste do Brasil. Contudo,
novas amostragens precisam ser realizadas antes de uma conclusão definitiva sobre a real
diversidade de Botryosphaeriaceae associadas à queima das folhas do coqueiro.

3.4 Conclusões
- No estado de Alagoas as espécies Lasiodiplodia theobromae e Neodeightonia
alagoensis estão associadas à queima das folhas do coqueiro e no estado de Sergipe apenas a
espécie N. alagoensis está associada a doença;
- Este é o primeiro relato do gênero Neodeightonia causando doença em coqueiro.

56

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61

4 CAPÍTULO II:
IDENTIFICAÇÃO DE ESPÉCIES DE Neopestalotiopsis ASSOCIADAS À MANCHA
DE PESTALOTIA DO COQUEIRO.

62

IDENTIFICAÇÃO DE ESPÉCIES DE Neopestalotiopsis ASSOCIADAS À MANCHA
DE PESTALOTIA DO COQUEIRO

RESUMO: No Brasil, o cultivo do coqueiro (Cocos nucifera L.) vem se expandindo nos
últimos anos, gerando emprego e renda a muitos produtores. Com o aumento na exploração
da cultura muitas doenças de origem fúngicas passaram a ser observadas. A mancha de
pestalotia é uma destas doenças e se caracteriza por apresentar manchas irregulares nas folhas
do coqueiro, essas manchas diminuem a área fotossintética da planta e consequentemente, a
produção. A espécie Pestalotiopsis guepiini, até então, é o único agente etiológico da doença
no Brasil. Contudo, este estudo precisa ser revisto, uma vez que a espécie foi identificada
apenas com base na morfologia, podendo levar a erros no processo de identificação. Além
disso, o gênero Pestalotiopsis foi desmembrado em mais dois gêneros Neopestalotiopsis e
Pseudopestalotiopsis, passando a ser chamado de complexo Pestalotioid. Assim, o objetivo
deste estudo foi identificar e caracterizar espécies pertencentes ao complexo Pestalotioid
associadas a mancha de pestalotia do coqueiro. Foram obtidos 10 isolados patogênicos de
folhas de coqueiro com sintomas da doença oriundos de plantio comercial no município
Neópolis, Estado de Sergipe. As análises morfológicas e moleculares, realizadas por meio de
filogenia multilocus, fator de elongamento da tradução 1 α (TEF1-α), beta tubulina (β-tub) e a
região espaçadora interna transcrita (ITS), agruparam os isolados no gênero
Neopestalotiopsis, identificando três espécies causando mancha de pestalotia do coqueiro:
Neopestalotiopsis foedans, N. ellipsospora e Neopestalotiopsis sp. Esse é o primeiro relato
dessas espécies causando doenças em coqueiro (C. nucifera) no mundo.
Palavras-chave: Cocos nucifera, complexo Pestalotioid, filogenia multilocus.

63

IDENTIFICATION OF SPECIES OF Neopestalotiopsis ASSOCIATED WITH
PESTALOTIA SPOT OF COCONUT

ABSTRACT: In Brazil, coconut palm cultivation (Cocos nucifera L.) has been expanding in
recent years, generating jobs and income for many producers. With the increase in the
exploitation of the culture many diseases of fungal origin happened to be observed. The spot
of pestalotia is one of these diseases and is characterized by irregular spots on the leaves of
the coconut, these spots diminish the photosynthetic area of the plant and consequently, the
production. The species Pestalotiopsis guepiini until then is the only etiological agent of the
disease in Brazil. However, this study needs to be reviewed, since the species was identified
only on the basis of morphology, which could lead to errors in the identification process. In
addition, the genus Pestalotiopsis was dismembered in two genera Neopestalotiopsis and
Pseudopestalotiopsis, to be called the Pestalotioid complex. Like this, the objective of this
study was to identify and characterize species belonging to the Pestalotioid complex
associated with pestalotia spot of coconut. Ten pathogenic isolates of coconut leaves with
symptoms of the disease from commercial plantations were obtained in Neópolis, State of
Sergipe. The morphological and molecular analysis, using multilocus phylogeny, translation
elongation factor 1α (TEF-1α), beta tubulin (β-tub) and internal transcribed spacer region
(ITS), grouped the isolates in the genus Neopestalotiopsis, identifying three species causing
spot of pestalotia in coconut palms: Neopestalotiopsis foedans, N. ellipsospora and
Neopestalotiopsis sp. This is the first report of these species causing coconut disease (C.
nucifera) in the world.
Key words: Cocos nucifera, Pestalotioid complex, multilocus phylogeny.

64

4.1 Introdução
Originário do sudeste asiático, o coqueiro (Cocos nucifera L.) abrange terras
intertropicais em mais de 90 países com cerca de 12 milhões de hectares plantados,
caracterizando-se por ser uma cultura com diferentes aplicações. No Brasil, a cocoicultura
vem ganhando importância nos últimos anos, passando a ser o quarto maior produtor mundial,
com uma produção aproximada de 2,9 milhões de toneladas, em uma área colhida de mais de
250 mil ha de coqueiros, beneficiando diretamente mais de 220 mil produtores (JESUSJUNIOR et al., 2015; IBGE, 2017; FAOSTAT, 2016).
Com o aumento na exploração da cultura, muitos problemas fitossanitários passaram a
ser observados, como doenças foliares causadas por fungos do complexo Pestalotiod
(FONTES; WANDERLEY, 2006; SILVA et al., 2017; MAHARACHCHIKUMBURA et al.,
2014). Fungos deste complexo eram considerados de importância secundária até pouco tempo
e iniciavam o processo infeccioso a partir de aberturas naturais e/ou de ferimentos
ocasionados por insetos, pesticidas ou danos provocados pelo sol (HOPKINS; MCQUILKEN,
2000; AGRIOS, 2005). Entretanto, têm ocasionado significativas perdas econômicas em
ampla gama de hospedeiros (ÚRBEZ-TORRES et al., 2012; MAHARACHCHIKUMBURA
et al., 2014; JAYAWARDENA et al., 2014; MAHARACHCHIKUMBURA et al., 2016,
ISMAIL et al., 2017).
No Brasil, a principal doença do coqueiro causada por espécies do complexo
Pestalotiod é a mancha de pestalotia, que caracteriza-se por apresentar manchas irregulares de
tamanhos variados nas folhas, com coloração castanho escuro no centro das lesões que são
circundadas por um halo amarelo (ANJOS; CHARCHAR; RAMOS, 2000; CARDOSO et al.
2003; NIU et al., 2015). A doença está associada a espécie Pestalotiopsis guepinii (ANJOS;
CHARCHAR; RAMOS, 2000; CARDOSO et al. (2003), no entanto, a caracterização da
espécie foi realizada apenas por morfologia, caractere considerado insuficiente para a
identificação a nível de espécie dentro do gênero Pestalotiopsis.
Atualmente, a identificação de espécies desse gênero é realizada com base em estudos
moleculares, permitindo, dessa forma, que o gênero Pestalotiopsis fosse desmembrado em
mais dois novos gêneros, Neopestalotiopsis e Pseudopestalotiopsis, dando origem ao
complexo de Pestalotioid (MAHARACHCHIKUMBURA et al., 2014). Com isso, uso de
análises filogenéticas multilocus, se tornaram indispensáveis para identificar precisamente as
espécies pertencentes a esse complexo, sendo a região espaçadora interna transcrita (ITS),
associada com os genes β-tubulina (β-tub) e fator de alongamento da tradução 1-α (TEF1-α),
as mais precisas (HYDE et al., 2014).

65

Diante do exposto e considerando que trabalhos relacionados a mancha de pestalotia
são escassos ou inexistentes no Brasil, objetivou-se com este estudo, identificar e caracterizar
as espécies do complexo Pestalotioid associados a mancha de pestalotia na cultura do
coqueiro.

4.2 Material e Métodos
O trabalho foi conduzido no Laboratório de Fitopatologia Molecular e Virologia
Vegetal do Centro de Ciências Agrárias (CECA) da Universidade Federal de Alagoas (UFAL),
localizado no município de Rio Largo, zona da mata alagoana.

4.2.1 Origem, obtenção e preservação dos isolados
Amostras de folhas com sintomas de mancha de pestalotia (Figura 4 AI-AIII)
provenientes do coqueiro foram coletadas em cultivo comercial do município de Neópolis,
principal polo produtor de frutas do Estado de Sergipe e um dos principais do Nordeste. Nessa
região a maior parte do plantio de coco é da variedade anão-verde. O material coletado foi
levado ao laboratório, onde foram lavadas e secas naturalmente. Em seguida foram realizados
isolamentos indiretos, retirando fragmentos da área de transição entre o tecido sadio e o
doente, os quais foram desinfestados com soluções de álcool 70% por 30 segundos,
hipoclorito de sódio 1% por 1 minuto, lavados em água destilada esterilizada (ADE) por duas
vezes, postos para secar em papel de filtro e posteriormente transferidos para placas de Petri
contendo meio de cultura BDA (Batata-Dextrose-Ágar). Após a formação das colônias, discos
do meio de cultura contendo o crescimento micelial do patógeno, foram retirados das bordas
das colônias e transferidos para novas placas de Petri contendo meio BDA que foram
mantidos à temperatura de 25 ± 1ºC até o surgimento das estruturas de reprodução do fungo
para posterior identificação e obtenção das culturas monospóricas. Em seguida, os isolados
foram preservados utilizando três métodos: tubos de ensaio contendo meio de cultura BDA,
Castellani e em papel filtro autoclavado.

4.2.2 Teste de patogenicidade
A patogenicidade dos isolados foi testada em fragmentos de folíolos sadios de
coqueiro, da variedade anão-verde. Os folíolos foram desinfetados por imersão em solução de
hipoclorito de sódio a 1% por 3 minutos e, posteriormente lavadas duas vezes em ADE. Os
fragmentos foram secos ao ar em toalhas de papel esterilizadas. Após a secagem, ferimentos
foram realizados em três posições equidistantes da face adaxial de cada fragmento foliar, para

66

isso, utilizou-se uma agulha previamente flambada.
Os folíolos foram inoculados na região perfurada, sendo depositandos discos de 5 mm
de BDA contendo estrutura do patógeno com sete dias de idade e na testemunha foi
depositado discos de BDA, sem crescimento fúngico. Em cada fragmento de folíolo foram
colocados três discos de BDA contendo estruturas do patógeno. Foram utilizados três
fragmentos para cada isolado e para testemunha. Em seguida as folhas foram acondicionadas
em caixas do tipo gerbox contendo papel filtro umedecido para manter a umidade a 100%. O
experimento foi mantido a uma temperatura de 25 ± 1 ºC, fotoperíodo de 12 horas. Os
tamanhos das lesões foram medidos sete dias após a inoculação.

3.2.3 Caracterização molecular
Para caracterização molecular, realizou-se a extração e amplificação do DNA, obtida
da massa micelial de cada isolado, a partir de colônias crescidas em meio líquido de LAsparagina durante cinco dias em erlenmeyer de 50mL e incubados à temperatura ambiente
(25 ± 1 ºC) e fotoperíodo de 12 horas. O protocolo de extração utilizado foi o CTAB,
adaptado de Doyle; Doyle (1987).
A amplificação de fragmentos do DNA foi realizada por Reação da Cadeia da
Polimerase (PCR). Foram utilizados os primers que codificam para as regiões genômicas ITS,
β-tub e TEF1-α (Tabela 5). Em seguida, os produtos de PCRs foram enviados para purificação
e sequenciamento diretamente na empresa Macrogen, em Seul, na Coreia do Sul.

Tabela 5. Descrição dos primers usados para identificação de espécies pertencentes ao gênero
Neopestalotiopsis.
Gene
ITS
β-tub

TEF1-α

Primer

Sequências (5' - 3')

Referências

ITS1

TCCGTAGGTCAACCTGCGG

ITS4

TCCTCCGCTTATTGATATGC

Bt2a

AACATGCGTGAGATTGTAAGT

O'Donnell; Cigelnik,

Bt2b

TAGTGACCCTTGGCCCAGTTG

1997

526F

GTCGTYGTYATYGGHCAYGT

1567R

ACHGTRCCRATACCACCRATCTT

White et al., 1990

Rehner, 2001

67

As sequências de nucleotídeos obtidas, foram alinhadas com o software Codon Code
Aligner v. 6.0.2 e avaliadas visualmente para obter uma sequência de consenso das regiões
amplificadas para todos os isolados. As análises das sequências foram feitas com o algoritmo
BLASTn (ALTSCHUL et al., 1990) e o banco de dados não-redundante do GenBank.
Sequências de referência para várias espécies do gênero Neopestalotiopsis, anteriormente
referidas por Maharachchikumbura et al. (2014), Jayawardena et al. (2016) e Solarte et al
(2018), foram recuperadas a partir do GenBank (Tabela 6) e utilizadas para reconstrução da
árvore filogenética.

Tabela 6. Números de acessos GenBank das sequências utilizadas em análises filogenéticas
de fungos do complexo Pestalotioid.
Epécies
Neopestalotiopsis aotearoa
N. asiatica
N. australis
N. chrysea
N. chrysea
N. clavispora
N. clavispora
N. cubana
N. egyptiaca
N. ellipsospora
N. ellipsospora
N. ellipsospora
N. ellipsospora
N. eucalypticola
N. foedans
N. foedans
N. foedans
N. foedans
N. foedans
N. foedans
N. foedans
N. foedans
N. foedans
N. foedans
N. formicarum
N. formicarum
N. honoluluana
N. honoluluana
N. iranensis
N. javaensis
N. magna

Código da cultura
CBS 367.54
MFLUCC 12-0286
CBS 114159
MFLUCC 12-0261
MFLUCC 12-0262
MFLUCC 12-0281
MFLUCC 12-0280
CBS 600.96
PEST1
MFLUCC 12-0283
CBS 115113
CZCC-15-0087
COUFAO0234
CBS 264.37
CGMCC 3.9123
CGMCC 3.9178
CGMCC 3.9202
COUFAO0235
COUFAO0238
COUFAO0240
COUFAO0241
COUFAO0242
COUFAO0243
COUFAO0244
CBS 115.83
CBS 362.72
CBS 114495
CBS 111535
P814
CBS 257.31
SSN-2013a

Nº de acesso no GenBank
ITS
MH857366
JX398983
KM199348
JX398985
JX398986
JX398979
JX398978
KM199347
KP943747
JX398980
KM199343
KU500019

β-tub
KM199454
JX399018
KM199432
JX399020
JX399021
JX399014
JX399013
KM199438
KP943746
JX399016
KM199450
KU500012

TEF1-α
KM199526
JX399049
KM199537
JX399051
JX399052
JX399045
JX399044
KM199521
KP943748
JX399047
KM199544
KU500015

KM199376
JX398987
JX398989
JX398988

KM199431
JX399022
JX399024
JX399023

KM199551
JX399053
JX399055
JX399054

KM199344
KM199358
KM199364
KM199363
KM074045
KM199357
KF582795

KM199444
KM199455
KM199457
KM199461
KM074056
KM199437
KF582793

KM199519
KM199517
KM199548
KM199546
KM07405
KM199543
KF582791

68

Tabela 6. (Continuação)
Espécie
N. mesopotamica
N. mesopotâmica
N. natalensis
N. piceana
N. piceana
N. piceana
N. protearum
N. rosae
N. rosae
N. samarangensis
N. saprophytica
N. saprophytica
Neopestalotiopsis sp.
Neopestalotiopsis sp.
Neopestalotiopsis sp.
Neopestalotiopsis sp.
Neopestalotiopsis sp.
Neopestalotiopsis sp.
Neopestalotiopsis sp.
Neopestalotiopsis sp.
N. steyaertii
N. surinamensis
N. umberspora
Pestalotiopsis trachicarpicola

Código da cultura
CBS 336.86
CBS 299.74
CBS 138.41
CBS 394.48
CBS 254.32
CBS 225.30
CBS 114178
CBS 101057
CBS 124745
CBS 115451
MFLUCC 12.0282
CBS 115452
CBS 664.94
CBS 322.76
CBS 110.20
CBS 360.61
CBS 119.75
CBS 164.42
COUFAO0236
COUFAO0239
IMI 192475
CBS 450.74
MFLUCC12-0285
OP068

ITS
KM199362
KM199361
KM199377
KM199368
KM199372
KM199371
LT853103
KM199359
KM199360
KM199430
JX398982
KM199345
KM199349
KM199366
KM199342
KM199346
KM199356
KM199367

β-tub
KM199441
KM199435
KM19946
KM199453
KM199452
KM199451
KM199463
KM199429
KM199430
KM199447
JX399017
KM199433
KM199459
KM19944
KM19944
KM199440
KM199439
KM199434

TEF1-α
KM199555
KM199541
KM199552
KM199527
KM199529
KM199535
KM199542
KM199523
KM199524
KM199556
JX399048
KM199538
KM199547
KM199536
KM199540
KM199522
KM199531
KM199520

KF582796
KM199351
JX398984
JQ84594

KF582794
KM199465
JX399019
JQ845945

KF582792
KM199518
JX39905
JQ845946

Alinhamentos múltiplos para sequências nucleotídicas foram obtidos usando o
algoritmo MUSCLE (EDGAR, 2004) no programa MEGA v. 6 (TAMURA et al., 2013). As
filogenias de Inferência Bayesiana (BI) para os dados de sequências de ITS, β-tub e TEF1-α,
foram construídas individualmente no portal CIPRES (MILLER et al., 2010) usando MrBayes
v. 3.2.3 (RONQUIST et al., 2012). O melhor modelo de substituição de nucleotídeos foi
determinado para cada região genômica usando MrModeltest v. 2.3 (POSADA; BUCKLEY,
2004) de acordo com o Akaike Information Criterion (AIC). As árvores foram visualizadas e
editadas nos programas FigTree v. 1.4 (ztree.bio.ed.ac.uk/software/figtree) e Inkscape
(https://inkscape.org/pt/).

4.2.2 Caracterização morfológica e cultural
As espécies identificadas molecularmente foram caracterizadas morfologicamente
quanto às características das colônias (coloração da colônia, taxa de crescimento) e
morfologia dos conídios (comprimento e largura, septação e coloração de células centrais e

69

número de apêndices apical e basal).
Para determinar a taxa de crescimento, os isolados foram cultivados em placas de
Petri de 90 mm contendo BDA (batata 2%) em delineamento experimental inteiramente
casualizado (DIC) com quatro repetições. Discos de 5mm de diâmetro foram retirados da
borda das colônias com sete dias de idade e colocados no centro de placas de Petri com o
micélio em contato direto com o meio BDA. As placas foram incubadas a 25 ± 1 ºC com
fotoperíodo de 12 h, por sete dias e o crescimento radial foi medido diariamente. Os dados
obtidos foram utilizados para calcular o índice de crescimento micelial – ICM, determinandose assim, a velocidade média de crescimento do fungo (mm.dia -1). A coloração predominante
da colônia foi observada no sétimo dia de incubação.
Para determinar as dimensões, considerando comprimento e largura dos conídios,
septação, coloração de células conidiais e a quantidade de apêndices, 50 conídios foram
obtidos de cada espécie. As imagens foram capturadas por câmera digital (Olympus IX2-SLP)
acoplada ao microscópio e as medições foram feitas com ampliação de 400x através do
software Cellsenses Standard (SAMSUNG SDC-415®).

4.3 Resultados e Discussão

4.3.1 Resultados

4.3.1.1 Obtenção dos isolados
Foram obtidos dez isolados (COUFAL0234, COUFAL0235, COUFAL0236,
COUFAL0237,

COUFAL0238,

COUFAL0242,

COUFAL0243

e

COUFAL0239,

COUFAL0240,

COUFAL0244)

com

características

COUFAL0241,
morfológicas

semelhantes a fungos pertencentes ao complexo Pestalotioid. As culturas obtidas foram
depositadas na Coleção de Fungos Fitopatogênicos da Universidade Federal de Alagoas.

4.3.1.2 Teste de patogenicidade
Todos os isolados obtidos foram patogênicos, apresentando sintomas cinco dias após
as inoculações. Os sintomas observados foram de lesões necróticas na região onde foram
inoculados (Figura 4 AIII). Não foram observadas lesões nas folhas do tratamento controle.
Após serem avaliados os isolados foram reisolados dos tecidos doentes, cumprindo o
Postulado de Koch.

70

4.3.1.3 Análise filogenética
A análise filogenética foi realizada por Inferência Bayesiana onde foi reconstruída
uma árvore com a região ITS e os genes β-tub e TEF1-α de maneira concatenada. Os modelos
evolutivos foram selecionados de acordo com o Critério de Informação de Akaike (AIC),
sendo GTR+I+G para ITS e TEF1-α e GTR+G para β-tub. A árvore foi enraizada com
Pestalotiopsis trachicarpicola.
A análise das sequências permitiu o agrupamento dos isolados em um único gênero
pertencente ao complexo Pestalotioid: Neopestalotiopsis. Os resultados mostraram que os
isolados deste estudo se agruparam em três clados distintos, onde: COUFAL0235,
COUFAO0238,

COUFAO0240,

COUFAL0241,

COUFAL0242,

COUFAL0243

e

COUFAL0244 agruparam com a espécie Neopestalotiopsis foedans; o isolado COUFAL0234
se agrupou com N. ellipsospora e os isolados COUFAL0236 e COUFAL0239 não se
agruparam com nenhuma sequência de referência, sendo possivelmente uma nova espécie de
Neopestalotiopsis, contudo, foi aqui denominada de Neopestalotiopsis sp. (Figura 3).

71

Figura 3. Árvore filogenética de inferência Bayesiana com base nas sequências concatenadas
das regiões ITS, β-tub e TEF1-α. Pestalotiopsis trachicarpicola foi utilizado como outgroup.
Isolados caracterizados neste estudo estão destacadas em negrito.

72

4.3.1.4 Caracterização morfológica e cultural
A espécie N. foedans apresentou ICM de 11,0 mm/dia. Aos sete dias as colônias
apresentaram bordas regulares, micélio aéreo esbranquiçado na superfície, com corpos
frutíferos negros; e no reverso, coloração branca a laranja pálido (Figura 4 BI-II). As colônias
de N. ellipsospora tiveram crescimento de 10 mm/dia. Aos sete dias as colônias desse isolado
apresentaram bordas regulares, com micélio aéreo esbranquiçado formando anéis
concêntricos, com corpos de frutificação negros na região central da colônia; com o reverso
da cultura com colaração laranja pálido (Figura 4 CI-II). Para Neopestalotiopsis sp. o
crescimento foi de 9,9 mm/dia. Após sete dias, as colônias dessa espécie apresentaram bordas
regulares, com micélio formado por anéis concêntricos de coloração marrom-escuro, marromclaro, amarelo e branco (do centro para borda), com corpos frutíferos negros mais
concentrados na região central da colônia; o reverso com mesma coloração (Figura 4 DI-II).
Todas as espécies apresentaram conídios com formato fusiformes, sendo reto a
ligeiramente curvado com cinco células, onde as três medianas são do tipo versicolor, ou seja,
células com coloração diferente, e as células apical e basal, hialinas. O número de apêndices
apicais por conídio variou de dois a quatro, raramente quatro; a maioria dos isolados
apresentando conídios com três apêndices apicais e um basal (Figura 4 BIII, CIII e DIII). Para
a espécie de N. foedans, os valores de comprimento e largura de conídios variaram de 20,0227,82 x 5,37-7,50 μm. Já para espécie N. ellipsospora, os valores de comprimento e largura de
conídios variaram de 19,37-26,99 x 5,24-7,97 μm e Neopestalotiopsis sp. apresentou conídios
com comprimento variando de 22,40 a 28,80 e largura de 6,61 e 8,61 μm.

73

Figura 4. Sintomas de Neopestalotiopsis em folíolos de Cocos nucifera oriundos de plantios
comerciais (AI e AII); Detalhe das lesões após o teste de patogenicidade (AIII); Colônias em
meio BDA, corpos de frutificação e conídios maduros de N. foedans (B), N. ellipsospora (C)
e Neopestalotiopsis sp. (D). Fonte: Autor.
4.3.2 Discussão
A caracterização de espécies fúngicas pertencentes ao complexo Pestalotioid
(Neopestalotiopsis, Pestalotiopsis e Pseudopestalotiopsis) baseada apenas em dados
morfológicos pode acarretar em equívocos e imprecisão no processo de identificação. De
acordo com Maharachchikumbura et al. (2014), essas características podem separar apenas a
nível de gênero onde, Pestalotiopsis distinguem-se dos demais gêneros por apresentar
conídios

com

células

medianas

concolor

marrom-claras,

diferentemente

de

Pseudopestalotiopsis que possui células medianas concolor marrom-escuras, já o gênero
Neopestalotiopsis apresenta conídios com células medianas versicolor. Contudo, o uso de
ferramentas moleculares com a amplificação e sequenciamento das regiões genômicas ITS,
β-tub e TEF1-α são fundamentais para o correto posicionamento taxonômico dos diferentes
isolados/espécies pertencentes a esse complexo. MAHARACHCHIKUMBURA et al., 2014;

74

MAHARACHCHIKUMBURA et al., 2016a; CHEN et al., 2018; SOLARTE et al., 2018).
No presente trabalho, foram utilizados dados morfológicos e moleculares que
permitiram identificar três espécies do complexo Pestalotioid, todas pertencentes ao gênero
Neopestalotipsis associados a mancha de pestalotia do coqueiro no Brasil: N. foedans, N.
ellipsospora e Neopestalotiopsis sp. Este é o primeiro relato dessas espécies infectando Cocos
nucifera.
O gênero Neopestalotiopsis possui cerca de 25 espécies descritas ou reclassificadas
que já foram relatadas em mais de 40 hospedeiros, causando doenças em diferentes culturas
de importância no mundo, como, Vitis vinifera (China e França), Psidium guajava (Colômbia)
e

Cocos

nucifera,

(Indonésia

e

Thailândia)

(FARR;

ROSSMAN,

2019;

MAHARACHCHIKUMBURA et al., 2016a; JAYWARDENA et al. 2016; SOLARTE et al.,
2018; MAHARACHCHIKUMBURA et al., 2014; HYDE et al., 2016). No Brasil, foi
observado em árvore de mata atlântica (Virmia guianensis), em palma óleo (Elaeis
guineenses), em jambeiro (Syzygins samaranguense), em acácia negra (Acacia mearnsii) e
goiabeira (Psidium guajava) (SILVÉRIO et al., 2016; QUADROS et al., 2015; LEITE et al.,
2017; DUIN et al., 2017; SOUZA, 2017).
A espécie N. foedans, desde que foi relatada pela primeira vez em 1881 e identificada
como Pestalotia foedans Sacc. & Ellis (SACCARDO, 1882), já foi encontrada em cerca de 40
hospedeiros, sendo em muitos deles como endofítica e em espécies botânicas típicas dos
países asiáticos (FARR, D. F.; ROSMAN, A.Y., 2019). Mais tarde, foi reclassificada como
Neopestalotiopsis foedans (Sacc. & Ellis) Maharachch., K.D. Hyde & Crous, sendo relatado
em Calliandra haematocephala, Neodypsis decaryi e Rhizophora mangle, culturas
características da China, em Thuja occidentalis, um pinheiro ornamental da região de New
Jersey-USA, e em material coletado em frutos de goiaba (Psidium guajava), na Colômbia
(MAHARACHCHICUMBURA et al., 2014; SOLARTE et al., 2018).
A espécie N. ellipsospora, foi inicialmente descrita como Pestalotiopsis ellipsospora
Maharachch. & K.D. Hyde, isolada de uma planta conhecida como baga de natal (Ardisia
crenata),

sendo posteriormente

(Maharachch.

&

K.D.

reclassificado como

Hyde)

Maharachch.,

Neopestalotiopsis ellipsospora
K.D.

Hyde

&

Crous

(MAHARACHCHICUMBURA et al., 2012; 2014). Desde seu primeiro relato, a espécie foi
encontrada em Acanthopanax divaricatus, na Korea, em A. crenata, na China e em batatadoce (Ipomoea batatas), também na China (YUN.; AHN; KIM, 2015; CHEN et al., 2018;
MAHARACHCHICUMBURA et al., 2016b).

75

A espécie aqui identificada como Neopestalotiopsis sp. não se agrupou com
nenhuma

sequência

de

referência

na

árvore filogenética.

Outros autores como

Maharachchikumbura et al. (2014) denominaram de Neopestalotiopsis sp., sete clados com
espécies ainda não identificadas, oriundas de diferentes hospedeiros, como videira, crotalária
e coqueiro (China, França, India e Indonésia). Solarte et al. (2018) também identificou como
Neopestalotiopsis sp., 8 isolados obtidos de folhas e frutos da goiabeira com sintomas de
sarna, na Colômbia. No Brasil, Medeiros (2015) e Souza (2017) identificaram como
Neopestalotiopsis sp. os isolados coletados em ingazeiro e goiabeira, respectivamente. Porém,
nenhuma dessas sequências apresentam características genéticas iguais as dos isolados
identificados no presente estudo.
No coqueiro, muitas espécies pertencentes ao complexo Pestalotioid já foram relatadas
em países do continente asiático, como: Pestalotiopsis meneziana (China), P. palmarum
(Índia), Neopestalotiopsis sp., N. piceana, N. javaensis (Indonésia) e N. cocoes (Tailândia)
(MAHACHCHIKUMBURA et al., 2014; NIU et al., 2015; HYDE et al., 2016). Nesses países
a doença é conhecida como ferrugem do coqueiro e possui a mesma sintomatologia da doença
mancha de pestalotia do coqueiro (como é conhecida no Brasil) sendo possível que se trate da
mesma doença. Além disso, outra evidência é que as duas doenças são causadas por membros
do complexo Pestalotiod.
No Brasil, A mancha de pestalotia do coqueiro foi inicialmente relatada por Anjos;
Charchar; Ramos (2000), no Distrito Federal, onde os sintomas foram caracterizados como
manchas irregulares de tamanhos variados nas folhas, com coloração castanho escuro no
centro das lesões que são circundadas por um halo amarelo. Além disso, identificaram
Pestalotiopsis guepinii como agente etiológico da doença. Posteriormente, a doença foi
observada por Cardoso et al. (2003), no estado Paraíba, onde o agente causal foi identificado
como Pestalotiopsis sp. mas, segundo os autores, as características morfológicas do isolado
eram similares as da espécie P. guepinii.
No entanto, a identificação desses isolados baseou-se apenas em dados morfológicos,
o que pode ter gerado erros na identificação. Além disso, são utilizados atualmente análises
moleculares e morfológicas, que têm propiciado novas alterações taxonômicas dentro do que
hoje conhecemos como complexo Pestalotioid (NAG RAJ, 1993; JEEWON et al., 2003;
MAHARACHCHIKUMBURA

et

al.,

2014).

Complexo

este,

proposto

por

Maharachchikumbura et al. (2014), que ao combinar dados morfológicos e moleculares,
contribuíram para uma grande revisão dos táxons tipo de Pestalotiopsis e estabeleceram dois
novos gêneros, Neopestalotiopsis e Pseudopestalotiopsis. Mesmo com a existência de

76

similaridade morfológica entre espécies dos gêneros, essa separação de espécies só foi
possível por meio de sequenciamento de DNA, através da combinação de regiões multilocus.
(MAHARACHCHIKUMBURA et al., 2016; CHEN et al., 2018; SOLARTE et al., 2018).
Em relação as análises morfológicas as espécies N. foedans e N. ellipsospora
apresentaram

características

compatíveis

com

as

descritas

para

as

espécies

(MAHARACHCHIKUMBURA et al., 2012; MAHARACHCHIKUMBURA et al., 2016b;
SOLARTE et al., 2018). As colônias, mesmo com variações de coloração e crescimento, se
mantiveram

dentro

dos

padrões

sugeridos

para

o

gênero

Neopestalotiopsis

(MAHARACHCHIKUMBURA et al., 2014; JAYAWARDENA et al., 2014; SOLARTE et
al., 2018). Jeewon et al. (2003), Tejesvi et al. (2007) e Maharachchikumbura et al. (2011)
sugerem que as características morfológicas da colônia são variáveis e não padronizadas.
Neopestalotiopsis sp. apresentou comprimento e largura de conídios dentro dos limites
descritos para o gênero, porém as características das colônias não são compatíveis com os
descritos

para

o

gênero

(MAHARACHCHIKUMBURA

et

al.,

2014;

2016;

JAYAWARDENA et al., 2014; SOLARTE et al., 2018), sugerindo que pode se tratar de uma
coloração rara dentro de Neopestalotiopsis. Situação semelhante foi observada para a espécie
Pestalotiopsis

rosea,

que

apresentou

coloração

da

colônia

avermelhada

(MAHARACHCHIKUMBURA et al., 2012).
Como podemos observar, as espécies N. foedans e N. ellipsospora, não são muito
comuns fora do continente asiático, pois a maioria dos hospedeiros onde foram relatadas são
desse continente. Com exceção dos hospedeiros T. occidentalis, nos Estados Unidos
(MAHARACHCHICUMBURA et al., 2014), e em frutos da goiabeira, na Colômbia
(SOLARTE et al., 2018), ambos identificados como N. foedans. Isso nos sugere que esses
táxons tenham sua origem geográfica naquele continente, ou então, os levantamentos e
amostragens voltadas para fungos deste complexo, ainda não são tão eficientes em outros
continentes.
As espécies do complexo Pestalotioid são importantes como fitopatógenos
(MAHARACHCHIKUMBURA et al. 2012). Muitas espécies foram nomeadas de acordo com
sua associação com o hospedeiro e apenas um pequeno número de caracteres está disponível
para distingui-los de forma confiável (MAHARACHCHIKUMBURA et al. 2011;
MAHARACHCHIKUMBURA et al. 2013). Portanto, a identificação correta dos fungos
fitopatogênicos do complexo Pestalotioid é relevante para os fitopatologistas e agricultores,
uma vez que, traz novos conhecimentos sobre a epidemiologia e interação fungo-planta, além
de representar importante ferramenta no controle eficaz dos fitopatógenos.

77

Nossas descobertas representam uma importante contribuição para a etiologia e
epidemiologia da mancha de pestalotia do coqueiro no Brasil, pois nós fornecemos evidências
para a diversidade de espécies associados a doença, além disso, nosso estudo facilita o
desenvolvimento de futuras pesquisas epidemiológicas em coqueiro e oferece informações
relevantes para o desenvolvimento de estratégias para os programas de manejo de doenças.
Por fim, outras espécies podem está associadas a mancha de pestalotia do coqueiro, para isso
é necessário uma amostragem maior.

4.4 Conclusões
- Este é o primeiro relato do gênero Neopestalotiopsis causando mancha de pestalotia
do coqueiro no Brasil.
- Este é o primeiro relato das espécies N. foedans, N. ellipsospora e Neospestaltiopsis
sp. associadas a mancha de pestalotia do coqueiro.

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