Romel duarte Vilela
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE ALAGOAS - UFAL
CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS - CECA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AGRONOMIA
ROMEL DUARTE VILELA
ALTERAÇÕES FISIOLÓGICAS E BIOQUÍMICAS DE DUAS VARIEDADES DE CANADE-AÇÚCAR SOB ESTRESSE HÍDRICO
RIO LARGO - AL
2011
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ROMEL DUARTE VILELA
ALTERAÇÕES FISIOLÓGICAS E BIOQUÍMICAS DE DUAS VARIEDADES DE CANADE-AÇÚCAR SOB ESTRESSE HÍDRICO
Dissertação apresentada ao Programa de PósGraduação em Agronomia, Centro de Ciências
Agrárias. Universidade Federal de Alagoas,
como requisito para obtenção do título de
Mestre
em
AGRONOMIA,
área
de
concentração em Produção Vegetal.
Orientador: Prof. Laurício Endres
RIO LARGO - AL
2011
xi
xii
TERMO DE APROVAÇÃO
ROMEL DUARTE VILELA
ALTERAÇÕES FISIOLÓGICAS E BIOQUÍMICAS DE DUAS VARIEDADES DE CANA-DEAÇÚCAR SOB ESTRESSE HÍDRICO
Dissertação submetida ao Programa de Pós-Graduação em Agronomia da Universidade
Federal de Alagoas e aprovada em 27 de junho de 2011.
Banca examinadora:
xiii
Aos meus pais, Ronaldo Vilela Rodrigues (in memorian) e Tereza Cristina Duarte Vilela, por todo amor e
carinho durante toda minha vida, fundamental na construção da base para que eu chegasse até esse
momento e para que ainda continue na longa caminhada da vida...
Aos meus irmãos, Rildo e Rômulo Vilela, meus grandes amigos, pela força e presença sempre constante...
Ao companheirismo, carinho, amor, dedicação e incentivo de minha noiva, Gláucia Marinho, durante esses
mais de 3 anos de cumplicidade em todos os momentos.
DEDICO
xiv
AGRADECIMENTOS
Ao Deus todo poderoso, por me proporcionar a vida,
A Universidade Federal de Alagoas, pela oportunidade de fazer o curso de mestrado e ser
minha segunda casa,
Ao professor Laurício Endres, pela orientação e ensinamentos, muito importantes na minha
formação,
Aos colegas do Laboratório de Fisiologia Vegetal da UFAL, Eduardo, Breno, Simério,
Sihélio, Débora, Laís, Poliana, Regina, Janaína, Israel, Felipe, Freds, Benigno, Manoel Vitor,
Manoel Messias, Renan, Pedro, Tibola, Valtair, Cristiano, Tadeu, Freds, Diogo, Antonio e
Weverton, pelos momentos de descontração e por toda a ajuda na realização deste trabalho,
A todos os colegas do mestrado, Adriano, Wellington, Carlos Jorge, Tatiana, Vanessa,
Valdelane, Clênio, Ana Cristina, Wagner e os que não foram citados, por compartilhar os
momentos de luta durante as disciplinas,
Ao Programa de Melhoramento Genético da Cana-de-açúcar - PMGCA da UFAL, pela
concessão dos rebolos de cana para a realização da pesquisa,
Ao professor Marcelo Loureiro da Universidade Federal de Viçosa - UFV, por ter me
recebido no Laboratório de Fisiologia Molecular Plantas da UFV e cedido tempo e espaço
para a realização de parte deste estudo,
Aos colegas, Flancer, Danilo, Caroline, Eduardo, Bárbara, Solange e aos demais da UFV,
pelos ensinamentos e pela ajuda nas análises,
Aos técnicos administrativos da UFAL, em especial Geraldo, Marcos, Michele e Rinaldo pelo
apoio durante o curso de mestrado,
Aos professores da Pós-Graduação em Agronomia, Vilma Marques, Gilson Moura, Paulo
Vanderlei, Mauro Wagner, pelos ensinamentos durante as disciplinas,
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPQ, pela bolsa
concedida durante o curso de mestrado.
xv
RESUMO
O presente estudo teve por objetivo, caracterizar fisiologicamente as respostas à seca de duas
variedades de cana-de-açúcar (Saccharum spp.), afim de contribuir com informações para o
estudo dos processos fisiológicos envolvidos na adaptação das plantas ao déficit hídrico. Para
tanto, instalou-se um experimento em delineamento inteiramente ao acaso, em casa de
vegetação no Laboratório de Fisiologia Vegetal do Centro de Ciências Agrárias da
Universidade Federal de Alagoas, localizado no município de Rio Largo - AL (9° 28’ S, 35°
49’ W, a 127 m de altitude), onde as variedades RB855536 e RB867515 com respostas
contrastantes à seca, foram submetidas a dois, quatro, seis e oito dias de estresse hídrico e
posterior reidratação. As variáveis fisiológicas e bioquímicas analisadas foram, potencial
hídrico foliar (w), potencial de solutos (s), fluorescência da clorofila a (Fv/Fm e ФPSII),
açúcares solúveis (glicose, frutose, sacarose) e amido, e atividade de enzimas antioxidantes,
catalase (CAT), superóxido dismutase (SOD) e ascorbato peroxidase (APX). O estresse
hídrico ocasionou em redução significativa no w e s nas duas variedades estudadas, as
quais não suportaram um período de seca superior a seis dias. Após a reidratação, as
variedades pesquisadas, mostraram capacidade de restabelecimento do w e s. A RB867515
teve maior decréscimo no w e s em relação a RB855536. Ambas as variedades pesquisadas
apresentaram fotoinibição crônica e dinâmica gradativa com o aumento do tempo de estresse
hídrico além de forte redução na eficiência quântica potencial (Fv/Fm) e efetiva (ΦPSII). A
variedade RB867515 mostrou maior capacidade de recuperação do ΦPSII e de reparação aos
efeitos da fotoinibição. O déficit hídrico causou a diminuição dos teores de sacarose e amido
nas duas variedades, com maior nível de redução de sacarose e amido em relação ao controle,
apresentado pela RB867515. Incrementos nos níveis de glicose e frutose também foram
observados nas duas variedades sob restrição hídrica. As mudanças nos níveis de açúcares,
indicam que a elevação nos níveis de glicose e frutose se deu através da degradação de
sacarose e amido, provavelmente, no sentido de realizar o ajuste osmótico. A variedade
RB867515 mostrou maior atividade de CAT e APX, em relação a RB855536, além de
atividade crescente da SOD com aumento do tempo de seca. No presente trabalho, a
variedade RB867515 revelou maior eficiência na ativação de mecanismos de tolerância ao
estresse hídrico.
Palavras-chave: Saccharum spp. Tolerância à seca. Fluorescência da clorofila a. Açúcares
solúveis. Resposta antioxidativa.
xvi
ABSTRACT
This study aimed to characterize the physiological responses to drought of two sugarcane
(Saccharum spp.) varieties in order to contribute information to study the physiological
processes involved in plant adaptation to drought. To this end, an experiment was installed in
a completely randomized design in a greenhouse at the Laboratory of Plant Physiology of the
Center for Agrarian Sciences, Federal University of Alagoas, located in Rio Largo - AL (9°
28’ S, 35° 49’ W, with 127 m of altitude), and where the varieties RB855536 and RB867515
with contrasting responses to drought, were subjected to two, four, six and eight days of water
stress and rehydration. The physiological and biochemical variables were analyzed, leaf water
potential (w), solute potential (s), chlorophyll fluorescence (Fv/Fm and ФPSII), soluble sugars
(glucose, fructose, sucrose) and starch and antioxidant enzymes, catalase (CAT), superoxide
dismutase (SOD) and ascorbate peroxidase (APX). Water stress resulted in significant
reduction in the w and s in two varieties studied, which did not support a drought of more
than six days. After rehydration, the varieties studied, showed the ability to restore in the w
and s. The RB867515 had greater reductions in the w and s in relation to RB855536. Both
varieties studied presented chronic and dynamic photoinhibition gradually with the increase in
time of drought stress and a strong reduction in the quantum potential efficiency (Fv/Fm) and
effective (ΦPSII). The variety RB867515 showed higher capacity of recovery of the ΦPSII and
rapair the effects of photoinhibition. The drought caused the decrease in the levels of sucrose
and starch in two varieties, with greater reduction of recovery sucrose and starch compared to
control, presented by RB867515. Increases in the levels of glucose and fructose were also
observed in both varieties under water restriction. Changes in levels of sugars, indicating that
rising levels of glucose and fructose occurred through the degradation of sucrose and starch,
likely to hold the osmotic adjustment. The variety RB867515 showed higher activity of CAT
and APX, in relation to RB855536, and SOD activity increased with increasing time of
drought. In this work, the variety RB867515 showed greater efficiency in the activation of
mechanisms of tolerance to drought stress.
Keywords: Saccharum spp. Drought tolerance. Chlorophyll fluorescence, Soluble sugars.
Antoxidative response.
xvii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Ciclo da sacarose em cana-de-açúcar e enzimas e metabólitos envolvidos. (SPS =
sacarose fosfato sintase, SS = sacarose sintase, SAI = invertase ácida solúvel, NI =
invertase neutra, PGI = fosfoglicoisomerase, UDPG-PPase = UDPglicose
pirofosforilase ................................................................................................................. 22
Figura 2 Dados diários de temperatura mínima (T Min), média (T Med), máxima (T Max)
(A), radiação fotossinteticamente ativa (B), registradas dentro da casa de vegetação
durante o período experimental, e dados diários de (T Min, T Med e T Max) (C) e
(PAR) (D) observadas durante o período de coleta das amostras. .................................. 25
Figura 3 Vista parcial do stand experimental com as variedades RB855536 e RB867515,
cultivadas em casa-de-vegetação aos 56 dias após o plantio .......................................... 26
Figura 4 Teor de umidade do solo, cultivado com duas variedades de cana-de-açúcar
submetidas a estresse hídrico e reidratação, em casa de vegetação aos 121 após o
plantio ............................................................................................................................. 32
Figura 5 Potencial hídrico foliar w antemanhã - 4h (A e B) e potencial de solutos s
antemanhã - 4h (C e D) de duas variedades de cana-de-açúcar RB855536 (A e C) e
RB867515 (B e D) submetidas a estresse hídrico e reidratação, cultivadas em casa
de vegetação aos 121 dias após o plantio........................................................................ 33
Figura 6 Máximo rendimento quântico do PSII (Fv/Fm) - 4h (A e B) e 11h (C e D) e
rendimento quântico efetivo do PSII (ΦPSII) (E e F) das variedades de cana-deaçúcar RB855536 (A, C e E) e RB867515 (B, D e F) submetidas a estresse hídrico
e reidratação, cultivadas em casa de vegetação aos 121 dias após o plantio. ................. 38
Figura 7 Teores de amido (A e B), sacarose (C e D), glicose (E e F), e frutose (G e H) das
variedades de cana-de-açúcar RB855536 (A, C, E e G) e RB867515 (B, D, F e H)
submetidas a estresse hídrico e reidratação, cultivadas em casa de vegetação aos
121 dias após o plantio .................................................................................................... 42
Figura 8 Atividade de enzimas antioxidantes: catalase (A e B), ascorbato peroxidase (C e D) e
superóxido dismutase (E e F) das variedades de cana-de-açúcar RB855536 (A, C e
E) e RB867515 (B, D e F) submetidas a estresse hídrico e reidratação, cultivadas
em casa de vegetação aos 121 dias após o plantio .......................................................... 45
xviii
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Máximo rendimento quântico do PSII (Fv/Fm) - 4h e 11h e rendimento quântico
efetivo do PSII (ΦPSII) das variedades de cana-de-açúcar RB855536 e RB867515,
submetidas a estresse hídrico e reidratação, cultivadas em casa de vegetação aos
121 dias após o plantio .................................................................................................... 39
Tabela 2 Teores de glicose, frutose, sacarose e amido das variedades de cana-de-açúcar
RB855536 e RB867515, submetidas a estresse hídrico e reidratação, cultivadas em
casa de vegetação aos 121 dias após o plantio ................................................................ 43
Tabela 3 Atividade de enzimas antioxidantes: catalase (CAT), ascorbato peroxidase (APX) e
superóxido dismutase (SOD) das variedades de cana-de-açúcar RB855536 e
RB867515, submetidas a estresse hídrico e reidratação, cultivadas em casa de
vegetação aos 121 dias após o plantio ............................................................................ 46
xix
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ............................................................................................................................ 11
2 REVISÃO DE LITERATURA .................................................................................................... 13
2.1 A Cana-de-açúcar .................................................................................................................... 13
2.2 O estresse hídrico ..................................................................................................................... 14
2.3 Estresse oxidativo e enzimas antioxidantes ........................................................................... 16
2.3.1 Superóxido dismutase (SOD) ................................................................................................. 17
2.3.2 Ascorbato peroxidase (APX) .................................................................................................. 18
2.3.3 Catalase (CAT) ....................................................................................................................... 18
2.4 Fluorescência da clorofila a .................................................................................................... 19
2.5 Metabolismo de carboidratos em plantas .............................................................................. 21
3 MATERIAL E MÉTODOS ....................................................................................................... 24
3.1 Material vegetal ....................................................................................................................... 24
3.2 Condições de cultivo ................................................................................................................ 24
3.3 Delineamento experimental e análise estatística ................................................................... 26
3.4 Análises fisiológicas ................................................................................................................. 26
3.4.1 Avaliação da eficiência fotoquímica ...................................................................................... 26
3.4.2 Potencial hídrico foliar (w) ................................................................................................... 27
3.4.3 Potencial de solutos (s) ......................................................................................................... 27
3.5 Coleta do material vegetal ...................................................................................................... 27
3.6 Avaliação de carboidratos....................................................................................................... 27
3.6.1 Sacarose, glicose, frutose e amido .......................................................................................... 27
3.7 Enzimas antioxidantes ............................................................................................................. 29
3.7.1 Catalase (CAT) ....................................................................................................................... 29
3.7.2 Superóxido dismutase (SOD) ................................................................................................. 29
xx
3.7.3 Ascorbato peroxidase (APX) .................................................................................................. 30
3.7.4 Proteínas solúveis ................................................................................................................... 30
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................................... 32
4.1 Condições meteorológicas e teor de umidade do solo........................................................... 32
4.2 Potencial hídrico e potencial de solutos ................................................................................. 32
4.3 Avaliação da eficiência fotoquímica ...................................................................................... 36
4.4 Avaliação de carboidratos....................................................................................................... 40
4.5 Atividade de enzimas antioxidantes ....................................................................................... 44
5 CONCLUSÕES........................................................................................................................... 49
REFERÊNCIAS .............................................................................................................................. 50
APÊNDICES ................................................................................................................................... 58
Apêndice A Dados diários de déficit de pressão de vapor (DPV) registradas dentro da casa de
vegetação durante o período experimental. ................................................................ 58
Apêndice B Curva característica de retenção de água no solo, utilizado no cultivo das
variedades RB855536 e RB867515 ........................................................................... 59
Apêndice C Análise de variância (valores de F) para máximo rendimento quântico do PSII
(Fv/Fm) - 4h e 11h e rendimento quântico efetivo do PSII (ΦPSII) das variedades
de cana-de-açúcar RB855536 e RB867515, submetidas a estresse hídrico e
reidratação, cultivadas em casa de vegetação aos 121 dias após o plantio ................ 59
Apêndice D Análise de variância (valores de F) para teores de glicose, frutose, sacarose e
amido das variedades de cana-de-açúcar RB855536 e RB867515, submetidas a
estresse hídrico e reidratação, cultivadas em casa de vegetação aos 121 dias após
o plantio ...................................................................................................................... 60
Apêndice E Análise de variância (valores de F) para enzimas antioxidantes catalase (CAT),
ascorbato peroxidase (APX) e superóxido dismutase (SOD) das variedades de
cana-de-açúcar RB855536 e RB867515, submetidas a estresse hídrico e
reidratação, cultivadas em casa de vegetação aos 121 dias após o plantio ................ 60
Apêndice F Análise química do solo, utilizado como substrato para o cultivo das variedades
de cana-de-açúcar RB855536 e RB867515, submetidas ao estresse hídrico e
reidratação .................................................................................................................. 60
11
1 INTRODUÇÃO
A cana-de-açúcar (Saccharum spp.) possui grande importância econômica devido a sua
utilização como matéria prima agroindustrial na produção de açúcar e álcool. O Brasil é o
maior produtor mundial de cana, e têm se destacado devido ao avanço no desenvolvimento de
tecnologias para a produção de etanol, produto reconhecido atualmente por seus benefícios ao
meio ambiente, sendo fonte alternativa viável aos combustíveis fósseis. Com uma demanda
crescente, o setor sucroenergético deverá ampliar a capacidade de produção tanto pelo
aumento de produtividade decorrente do fornecimento de variedades melhoradas, bem como
pela expansão da área plantada com cana-de-açúcar (APTA, 2007). Planta de metabolismo C4,
a cana encontra em regiões de clima tropical como o Brasil, condições ideais para o seu
desenvolvimento. Contudo, a escassez de água em períodos sazonais, afeta o seu crescimento
e desenvolvimento (ENDRES et al. 2010).
A deficiência hídrica é um dos fatores mais limitantes para o crescimento,
desenvolvimento e produtividade das culturas agrícolas. O estresse hídrico, desencadeia um
conjunto de respostas fisiológicas, bioquímicas e moleculares nas plantas, que desenvolvem
mecanismos de adaptação às circunstâncias ambientais limitantes, variando de acordo com a
intensidade, com o tempo de estresse, com a interação com outros tipos de estresse, com o
estádio de desenvolvimento e o genótipo (BRAY, 1997; MENESES et al. 2006). A síntese de
moléculas osmoprotetoras, proteínas de defesa entre outras envolvidas no transporte de água
também são características de um metabolismo celular cuja disponibilidade de água é limitada
(RODRIGUES, 2008).
Estudos em diferentes culturas como café, soja, feijão, arroz (DA MATTA et al. 1997;
RIBAS-CARBO et al. 2005; MIYASHITA et al. 2005; SHINOZAKI, K. & YAMAGUCHISHINOZAKI, 2007), têm-se buscado entender as respostas de adaptação das plantas à seca.
As perdas de produtividade ocasionadas pela escassez de água, ultrapassam 80% em diversas
culturas agrícolas. Na cana-de-açúcar, os danos causados pela deficiência hídrica são mais
expressivos, principalmente, no estádio inicial do desenvolvimento da planta. Somado a isto,
observa-se diminuição na produtividade e mortalidade das soqueiras. As características
correlacionadas com a tolerância à seca são indicadores adequados para a seleção de
genótipos tolerantes em programas de melhoramento genético, com o objetivo de reduzir o
impacto do déficit hídrico sobre o rendimento das culturas (SILVA et al. 2008). Desta forma,
a busca para se entender as diferentes respostas das plantas aos estresses ambientais, tem
levado a estudos de diversas áreas das ciências agronômicas e biológicas, na busca pelo
12
conhecimento dos efeitos da deficiência hídrica sobre o metabolismo das plantas, e a
identificação de características morfofisiológicas, bioquímicas e moleculares, observadas
durante o processo da adaptação das plantas aos estresses tem auxiliado na produção de
variedades mais tolerantes (MULLET & WHITSITT, 1996)
Apesar da necessidade do desenvolvimento de genótipos mais tolerantes a déficits
hídricos, o melhoramento convencional não obteve até o momento variedades com alta
tolerância. Em contrapartida, plantas geneticamente modificadas com tolerância a seca, têm
sido obtidas em várias culturas e, portanto a engenharia genética se apresenta teoricamente
como uma opção viável para o desenvolvimento de variedades de cana-de-açúcar tolerantes a
estresse hídrico (APTA, 2007).
A comparação de genótipos tolerantes e sensíveis ao déficit hídrico pode mostrar
diferenças nas respostas fisiológicas e bioquímicas, e assim auxiliar a compreensão dos
mecanismos de tolerância à seca em plantas.
O presente estudo teve o objetivo de caracterizar fisiologicamente a respostas à seca de
duas variedades de cana-de-açúcar tolerante e sensível ao estresse hídrico, afim de contribuir
com informações que possam ser importantes no estudo dos processos fisiológicos envolvidos
na tolerância das plantas ao estresse hídrico.
13
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 A cana-de-açúcar
De origem asiática, as primeiras mudas de cana-de-açúcar chegaram ao Brasil no
início de sua colonização. Inicialmente no Nordeste brasileiro o cultivo da cana se
multiplicou. Até o século XVII, o Brasil era o maior produtor e fornecedor mundial de açúcar
(PRADO JR, 1976).
Atualmente o Brasil é o maior produtor mundial de açúcar e álcool derivados da cana.
Até dezembro de 2010 a previsão para a produção de cana-de-açúcar no país correspondeu a
624.991 mil toneladas, distribuídos em 8.033,6 mil hectares, com uma produtividade média
estimada em 77.798 kg/hectare com tendência ascendente para a próxima safra (CONAB,
2011).
A sacarose da cana hoje é usada para açúcar (45%) e etanol (55%), mas há importantes
atividades iniciando diversificação. Dos resíduos, 50% são usados com baixa eficiência para
energia; e mais 25% (palha) são recuperáveis a custo compatível com usos energéticos. O
etanol a partir da cana-de-açúcar tem ganho grande importância mundial por ser fonte de
energia renovável, auxiliando desta forma, a redução da poluição pela diminuição da
utilização de combustíveis fósseis. Graças também, a co-geração de energia decorrente do
aproveitamento da palha e do bagaço que sobram nas moendas utilizadas também como
energia no processo de produção de açúcar e álcool pelas usinas de cana. Além disso, o etanol
obtido da cana-de-açúcar garante mais energia para uso final por unidade energética gasta em
obtê-la do que qualquer outra fonte renovável atual (UNICA, 2005).
Planta monocotiledônea, alógama e perene, pertencente à Família Poaceae, gênero
Saccharum spp. (DEER, 1911), esta gramínea, perfilha de maneira abundante, na fase inicial
do desenvolvimento. Quando se estabelece como cultura, o autosombreamento induz a
inibição do perfilhamento, culminando na aceleração do colmo principal (RODRIGUES,
1995).
O metabolismo fotossintético da cana é do tipo C4, o que permite que ela seja muito
bem adaptada à produção de biomassa em regiões tropicais. No entanto, isso depende de
condições ambientais favoráveis para mostrar seu potencial máximo de produção, entre eles, a
disponibilidade adequada de água durante todo o ciclo vegetativo (ENDRES et al. 2010).
Uma situação de déficit hídrico durante a fase vegetativa destas plantas, diminui a
biomassa e consequentemente o crescimento dos colmos, reduzindo drasticamente a
produtividade. É sabido que existem variações nas respostas de genótipos de cana em relação
14
ao estresse hídrico (INMAN-BAMBER & SMITH 2005). Muitos pesquisadores têm
investigado a cana em condições de deficiência hídrica, no sentido de desvendar as alterações
fisiológicas, bioquímicas e moleculares apresentadas sob condições de seca severa
(HEMEPRABHA et al. 2004; ZHANG et al. 2006; GRAÇA et al. 2010).
Assim, um dos principais objetivos das pesquisas com cana-de-açúcar é a obtenção de
cultivares tolerantes ao déficit hídrico, o que poderá se configurar num importante cenário de
expansão do cultivo, visto que grande parte das terras disponíveis para cultivo de cana está
localizada em regiões sujeitas à seca (PAPINI-TERZI et al. 2009).
2.2 O estresse hídrico
As plantas são muitas vezes sujeitas a períodos de déficit hídrico durante o seu ciclo
de vida. A freqüência de tais fenômenos tende a aumentar no futuro mesmo fora das regiões
áridas e semi-áridas. As respostas das plantas à escassez de água são complexas, envolvendo
mudanças adaptativas de natureza morfológicas e fisiológicas. Sob condições de campo estas
respostas podem ser sinérgicas ou antagonicamente modificadas pela sobreposição de outras
tensões. Essa complexidade é observada em espécies lenhosas e herbáceas na maior parte dos
ecossistemas, com estratégias que vão desde o escape a seca, à resistência ao estresse
(CHAVES et al. 2002).
A capacidade da planta em responder e sobreviver ao déficit hídrico depende dos
mecanismos expressados pela planta inteira. As respostas ao déficit hídrico pode ocorrer
dentro de poucos segundos, como uma mudança no estado de fosforilação de uma proteína,
ou dentro de minutos e/ou horas, como uma mudança na expressão gênica (BRAY, 1997),
variando de acordo com a espécie, genótipo, duração e gravidade do estresse, da idade e
estágio de desenvolvimento da planta (MULLET & WHITSITT, 1996).
De acordo com Taiz (2009), o déficit hídrico pode ser definido como todo o conteúdo
de água de um tecido ou célula situado abaixo do conteúdo de água mais alto exibido no
estado de maior hidratação.
Para Larcher (2004), durante o estresse, o organismo passa por uma sucessão de fases.
A fase percepção é o início do distúrbio, ocorrendo perda da estabilidade de proteínas e
biomembranas, e inicia como uma resposta ao estresse. Já na fase de recuperação, ocorrem
processos de reparo, como a síntese protéica e “de novo” de substâncias de proteção, levando
a fase de tolerância, caracterizada pelo aumento na resistência por parte do organismo. Por
fim uma melhora na estabilidade ocorre mesmo sob estresse contínuo, configurando na fase
15
de adaptação, porém se o estresse é muito demorado e a intensidade aumenta, um estado de
exaustão pode ocorrer na fase final, com a morte da planta.
Em adição, Hoekstra et al. (2001) distingue a tolerância à desidratação de duas formas,
tolerância à seca, considerada como a tolerância a desidratação moderada até um teor de
umidade, no qual não há água presente na massa citoplasmática [~ 23% de água base de peso
fresco ou ~ 0,3 (g de H2O) (g massa seca -1)], e a tolerância à dessecação, que se refere a
tolerância à desidratação quando o reservatório de hidratação das moléculas é gradualmente
perdido, o que também inclui a capacidade das células de manterem-se hidratadas.
A primeira reação ao déficit hídrico é a diminuição da condutância estômática,
minimizando a perda de água pela transpiração. No entanto, o fechamento dos estômatos têm
consequencias complexas, exigindo ajustes a nível de fotossíntese e respiração, nutrientes e
fluxo de água, além da alteração na distribuição de carbono e nitrogênio (BOHNERT &
JENSEN, 1996).
Outro efeito bastante visível da restrição hídrica nas plantas é a redução no
crescimento, causado principalmente pela inibição do alongamento de haste e folhas quando o
potencial hídrico é reduzido a um ponto crítico, apresentando variação de respostas em
diferentes espécies (HSIAO & XU, 2000). No entanto, os órgãos que não estão em
crescimento, como folhas maduras, são também fortemente afetados por uma inibição das
trocas gasosas, fotossíntese e modificações metabólicas, freqüentemente associada à
osmorregulação. Em adição a isto, o fechamento estomático parece ser a principal causa da
diminuição na taxa fotossintética, porém o próprio aparato fotossintético tem se mostrado
muito resistente à desidratação, não só em plantas C3, mas também em C4 (PELLESCHI et al.
1997).
O primeiro passo na regulação da resposta ao déficit hídrico é o reconhecimento do
estresse. A perda de água é percebida na célula, provocando a transdução do sinal celular.
Desta forma, o estresse físico pode ser convertido em uma resposta bioquímica (BRAY,
1997).
A adaptação de plantas a estresses ambientais é dependente da ativação de cascatas de
redes moleculares envolvidas na percepção, transdução de sinal e expressão de genes e
metabólitos específicos relacionados ao estresse (VINOCUR & ALTMAN, 2005).
Smit & Singles (2005) apontam que existe uma variação em genótipos de cana-deaçúcar em relação ao estresse hídrico e que faltam informações para a maioria das cultivares,
e que existe a necessidade de uma melhor compreensão das respostas de cana à seca. Inman-
16
Bamber & Smit (2005), verificaram mecanismos distintos de resposta a seca, com destaque
para o controle estomático, enrolamento foliar, tamanho e distribuição do sistema radicular.
2.3 Estresse oxidativo e enzimas antioxidantes
A evolução dos processos metabólicos aeróbios tais como a respiração e a
fotossíntese, inevitavelmente, leva à produção de espécies reativas de oxigênio (EROs) em
mitocôndrias, cloroplastos e peroxissomos. Uma característica comum entre os diferentes
tipos EROs é a sua capacidade de causar danos oxidativos a proteínas, DNA e lipídios. Essas
propriedades citotóxicas de EROs explicam a evolução de matrizes complexas de mecanismos
enzimáticos e não enzimáticos de desintoxicação em plantas (APEL & HIRT, 2004;
PITZSCHKE et al. 2006).
Plantas e outros organismos aeróbios requerem oxigênio para a produção eficiente de
energia. Durante a redução do O2 a H2O, espécies reativas de oxigênio (EROs) são formadas
(ALLEN, 1995). Inicialmente a reação em cadeia necessita da entrada de energia, onde as
etapas subseqüentes são exotérmicas e pode ocorrer espontaneamente, catalisada ou não. A
aceitação de energia em excesso, reduz o O2 através de quatro etapas (BREUSEGEM et al.,
2001) (Eq. 1), levando a formação de oxigênio singleto (1O2), uma molécula altamente reativa
quando comparada com o (O2) (MITTLER, 2002; APEL & HIRT, 2004).
O 1O2, pode transferir sua energia de excitação para outras moléculas biológicas ou
reagir com elas, formando assim endoperóxidos ou hidroperoxidos. O 1O2 é moderadamente
reativo, de curta duração, com uma meia-vida de 2-4 μs, além disso, não atravessam
membranas biológicas, sendo dismutado facilmente a H2O2 (DAT et al. 2000).
.
.Já os radicais hidroperoxil (OH ), são formados a partir de O2 pela protonação em
soluções aquosas, podendo atravessar membranas biológicas e subtrair os átomos de
hidrogênio a partir de ácidos graxos polinsaturados e hidroperóxidos de lipídios. Já o peróxido
de hidrogênio, H2O2 é uma molécula moderadamente reativa, e de relativa vida longa,
podendo difundir-se a algumas distâncias a partir de seu local de produção. A toxicidade do
H2O2 é reforçada pela presença de catalisadores metálicos pela reação de Haber-Weiss ou
.
Fenton (VRANOVÁ & BREUSEGEM, 2002) (Eq. 2). O OH pode reagir potencialmente
com moléculas biológicas e sua produção em excesso pode levar a morte celular
(BREUSEGEM et al. 2001).
..
O2 → (H)O2 → H2O2 → OH + H2O → 2H2O
Eq. (1)
17
.O2 + Fe 3+ → Fe2+ + O2
.
H2O2 + Fe2+ → Fe3+ + OH + OH
..
Eq. geral: H2O2 + O2 → OH + OH + O2
Eq. (2)
Como resposta, as plantas desenvolveram um complexo sistema antioxidante para se
protegerem contra danos oxidativos, que inclui enzimas e substratos moleculares que limpam
espécies radicais e não radicais de oxigênio (BILGIN, 2010).
Os principais mecanismos de eliminação de EROs de plantas incluem superóxido
dismutase SOD (EC 1.15.1.1), ascorbato peroxidase APX (EC 1.11.1.11) e catalase CAT (EC
1.11.1.6). O equilíbrio entre as atividades da SOD, APX e CAT nas células é fundamental
para a determinação do nível de estado estacionário (steady-state) de radicais superóxido e
peróxido de hidrogênio (APEL & HIRT, 2004)
A SOD é encontrada em quase todos os compartimentos celulares, no ciclo da água
nos cloroplastos, no ciclo da ascorbato-glutationa nos cloroplastos, nas mitocôndrias, citosol e
peroxissomos. Por outro lado, a CAT está presente somente nos peroxissomos, sendo
indispensável na desintoxicação quando níveis elevados de EROs são produzidos durante o
estresse (MITTLER, 2002). A APX participa do ciclo da ascorbato-glutationa encontrada na
maioria dos compartimentos celulares. A alta afinidade da APX por H2O2, sugere que esta
desempenhe um papel crucial no controle dos níveis de EROs (SHIGEOKA et al. 2002).
O ciclo da água em água, também é um mecanismo que realiza a eliminação de EROs
em cloroplastos, dissipando efetivamente a energia de excitação em excesso sob condições de
estresse, realizando uma proteção contra a fotoinibição (ASADA, 1999).
A habilidade das plantas para eliminar radicais de oxigênio em condições de estresse
hídrico, é provavelmente, o requisito mais crítico para a tolerancia das mesmas a tais
condições (BOHNERT & JENSEN, 1996).
2.3.1 Superóxido dismutase (SOD)
A família das superóxido dismutases (EC 1.15.1.1), é composta por metaloproteínas
-
que catalisam a dismutação dos radicais livres superóxido (O2 ) para o O2 e H202. Constitui a
primeira linha de defesa contra as EROs, sendo produzido em qualquer local onde a cadeia de
transporte de elétrons está presente e, portanto, sua ativação pode ocorrer em qualquer
compartimento celular, incluindo mitocondrias, cloroplastos, microssomos, glioxissomos,
18
apoplastos e no citosol. Como os fosfolipídeos de membrana são impermeáveis a moléculas
-
-
carregadas de (O2 ), a presença da SOD é crucial na remoção de (O2 ) e nos compartimentos
onde são formados (GIANNOPOLITS & RIES, 1977).
A reação da SOD é a seguinte:
.2H+ + 2O2 → H2O2 + O2
Eq. (3)
O peróxido de hidrogênio produzido é em seguida desintoxicado pela catalase ou peroxidase
(CHEN & PAN, 1996).
2.3.2 Ascorbato peroxidase (APX)
A APX (EC 1.11.1.11) é uma enzima específica na eliminação do peróxido de
hidrogênio em plantas, catalisa a oxidação dos componentes celulares por peróxido de
hidrogênio ou hidroperóxidos orgânicos, sendo indispensável na proteção dos cloroplastos e
outros componentes de células contra danos provocados pelo peróxido de hidrogênio e
radicais hidroxila produzidos (ASADA, 1992).
AH2 + H2O2 (ROOH) → A + 2 H2O (ROH + H2O)
Eq. (4)
De acordo com Shigeoka et al. (2002) o fato de o ascorbato (AsA) ser um redutor de
H2O2 nos cloroplastos, juntamente com a ocorrência de APX nas plantas, nos mostra que o
AsA é um substrato muito importante na desintoxicação de H2O2 em folhas sob estresse. A
APX utiliza AsA como doador de elétrons específico para reduzir H2O2 a água, com a geração
concomitante de monodehidroascorbato (MDAsA), um oxidante univalente do AsA. MDAsA
é diretamente reduzido a AsA pela ação da NAD(P)H-dependente MDAsA redutase. A DAsA
redutase utiliza glutationa (GSH) para sua redução e assim regenerar o AsA. A GSH oxidada
é então regenerada pela GSH redutase, utilizando redutores equivalentes de NAD(P)H.
Assim, APX em combinação com as funções efetivas do ciclo de AsA-GSH evitam a
acumulação de H2O2 a níveis tóxicos em organismos fotossintéticos.
2.3.3 Catalase (CAT)
A catalase (H2O2:H2O2 oxidoredutase), (EC 1.11.1.6) foi a primeira enzima
antioxidante a ser descoberta e caracterizada. É uma proteína tetramérica porfirina de ferro,
que catalisa a dismutação do H2O2 em água e oxigênio. Foi a primeira enzima antioxidante
19
descoberta e caracterizada. Nenhum organismo multicelular foi encontrado que não possua
alguma atividade da catalase (McCLUNG, 1997). A reação de catalase típica é a dismutação
de duas moléculas de H2O2 para água e O2. A Eq. 5 mostra o esquema simplificado do
mecanismo catalítico da catalase (MHAMDI et al. 2010).
H2O2 → 2 H2O
2e
-
H2O2 → O2
Eq. (5)
A CAT representa um dos principais mecanismos enzimáticos empregado por
organismos aeróbicos para decompor o peróxido de hidrogênio (H2O2). Esta enzima é
particularmente abundante nos glioxissomos de plântulas, onde ela destrói o H2O2 gerado pela
oxidação da flavina, e nos peroxissomos de folhas verdes,
destruindo também o H2O2
decorrente da oxidação do glicolato fotorrespiratório (HAVIR & McHALE, 1987). A CAT é
uma enzima notadamente distinta das outras, pois não necessita de um redutor para catalisar
uma reação de dismutação. Juntamente com APX, a catalase distingue-se de outros peróxidosmetabolizadores por sua alta especificidade para H2O2, contudo, possui fraca atividade contra
os peróxidos orgânicos (MHAMDI et al. 2010).
2.4 Fluorescência da clorofila a
As moléculas de clorofila absorvem a energia luminosa (fótons) alterando
temporariamente suas configurações eletrônicas. Os pigmentos fotossintéticos passam do
estado basal (Chl a) para o estado excitado (nível de energia mais alto), denominado de
-8
singlet1 (Chl a*). O estado excitado é muito instável e de vida muito curta (≈10 s), de forma
que essa energia proveniente da luz e captada pela clorofila é rapidamente dissipada através
de três vias de dissipação: A fotoquímica (Ph), primeira via, utiliza a energia luminosa nos
processos fotoquímicos da fotossíntese (doação do elétron proveniente da molécula de água
para um aceptor denominado NADP+ (Nicotinamida adenina dinucleotídio fosfato). Este
processo é a base da fotossíntese. Esta energia dissipada é usada para a formação do poder
redutor e da molécula de ATP (Trifosfato de adenosina), os quais serão utilizados na fase
bioquímica do processo fotossintético. Esta dissipação de energia é representada pelo
quenching fotoquímico (qP) (dissipador fotoquímico). A segunda via é a fluorescência (F),
caracterizada pela emissão de radiação na região do visível (vermelho e vermelho distante). A
20
terceira via é a dissipação não-fotoquímica (D), é a produção de calor na forma de radiação
infravermelha. Esta dissipação de energia é representada pelo quenching não-fotoquímico
(qN) (dissipador não-fotoquímico) (MAXWELL & JOHNSON, 2000; CAMPOSTRINI,
2001).
Em temperatura ambiente, 20 a 25°C, a fluorescência é uma luz emitida que exibe um
ponto máximo de emissão na faixa de 682 nm e outro ponto menos pronunciado em 740 nm.
A fluorescência da clorofila a, em sua maioria, é emitida pelo PSII e pelo sistema coletor de
luz do PSII. Os três processos de dissipação da energia luminosa pelas moléculas de clorofilas
(Ph+F+D) são competitivos entre si, ou seja, alterações nas taxas fotossintéticas e na
dissipação de calor causarão alterações complementares na emissão da fluorescência
(CAMPOSTRINI, 2001).
Quando uma folha é mantida no escuro, a quinona A (QA) torna-se oxidada e os
centros de reação de PSII são referidos como "abertos", ou seja, capaz da realizar a redução
fotoquímica da QA. A exposição de uma folha adaptada ao escuro, a um feixe de luz fraca
intensidade (0,1 μmol m-2 s-1) resulta em um nível mínimo de fluorescência, F0 (ROHÁČEK,
2002). A intensidade do feixe de luz deve ser não actínica, para garantir que a QA continue
oxidada. Em seguida, um pulso de luz vermelho-extremo fraco, que excita preferencialmente
o fotossistema I (PSI) e remove elétrons da QA, deverá ser aplicado antes da medição da F0.
Se depois de atingir a F0, a folha for exposta a um pulso actínico curto de alta intensidade (>
2500μmol m-2 s-1 em menos de 1 s), a F0 é reduzida, e a máxima fluorescência Fm, é
observada. A diferença entre a Fm e a F0 é a fluorescência variável, Fv. A razão Fv/Fm pode ser
usada para estimar o máximo rendimento quântico de redução da QA (CAMPOSTRINI, 2001;
BAKER & ROSENQVIST, 2004; BAKER, 2008).
A QA é maximamente reduzida quando, folhas adaptadas à luz, são expostas a um
breve pulso saturante de luz. Com o pulso de luz, obtêm-se variações nos níveis de
fluorescência, que passa a ser denominada de F’m. [Desta maneira, denomina-se Fm – F’m
(quenching não fotoquímico) e F’m – F (quenching fotoquímico)]. Outro parâmetro da
fluorescência é o rendimento quântico efetivo do fotossistema II (Φ PSII) que representa a
eficiência de captura da excitação pelos centros de reação abertos do PSII e está relacionado à
dissipação da energia termal no complexo antena (CAMPOSTRINI, 2001; BAKER, 2008).
De acordo com (MAXWELL & JOHNSON, 2000), este parâmetro mede a percentagem de
luz absorvida pela clorofila associados ao PSII que é usado no processo fotoquímico.
21
Em particular, o estudo da fluorescência tem dado grandes contribuições ao
conhecimento de plantas sob estresse ambientais, na medida em que essas tensões têm
prejudicado o aparato fotossintético.
Atualmente,
essas
informações
são
amplamente
utilizadas em estudos de fisiologia de plantas sob condições de estresses ambientais
(KRAUSE & WEISS, 1991). Com o advento e refinamento dos fluorômetros portáteis, tem-se
observado um grande aumento com pesquisas que realizam medições de fluorescência da
clorofila em condições de campo e casa-de-vegetação. Um aspecto importante é que a
medição é rápida e não destrutiva. Medições realizadas durante o turno diurno
podem render informações relativas ao quenching não fotoquímico, as taxas de transporte de
elétrons, a eficiência quântica, e o grau de fotoinibição em resposta à luz, temperatura e outros
tipos de estresses ambientais únicos ou combinados (BILGER et al. 1995; MAXWELL &
JOHNSON, 2000).
O conhecimento da variação nas características da fluorescência entre plantas
cultivadas sob condições de estresse ou não, e da relação entre essas características, bem
como do rendimento do fóton em plantas, têm ganho uma importância considerável
(BJÖRKMAN & DEMMIG, 1987), principalmente no estudo das respostas de adaptação das
plantas a seca.
2.5 Metabolismo de carboidratos em plantas
Amido e sacarose são os principais produtos finais da fotossíntese. Durante o dia a
planta acumula sacarose e realiza a exportação para o resto da planta. À noite, a sacarose e o
amido armazenados são remobilizados, mantendo a exportação de sacarose para os drenos e
tecidos, afim de sustentar o gasto de energia realizado durante a respiração foliar (LUNN &
HATCH, 1995). O carbono fixado durante a fotossíntese ou é retido no cloroplasto e
convertido em amido, ou translocado para o citosol sob a forma de triose fosfatos,
principalmente dihidroxiacetona-fosfato (DHAP) e convertido em sacarose. O amido
desempenha um papel importante no metabolismo da planta como uma forma de reserva
temporária de carbono reduzido, já a sacarose desempenha um papel central na translocação
como também na forma de transporte do carbono reduzido. A sacarose sintetizada no citosol
pode ser translocado da folha ou temporariamente armazenadas dentro da folha (SINGH &
MALHOTRA, 2000).
Ao chegar nas células de armazenamento, o metabolismo da sacarose é realizado por
diversas enzimas que realizam reações diversas e operam em paralelo. As enzimas
22
simplásticas diretamente envolvidas e relacionadas à síntese de sacarose são, sacarose-fosfato
sintase (SPS) em conjunto com a sacarose-fosfato fosfatase (SPP) e a sacarose sintase (SS).
Em relação a repartição de sacarose tem-se: invertase ácida solúvel (SAI), invertase neutra
(NI) e sacarose sintase (SS). Os produtos da reação, a glicose, frutose e UDP-glicose podem
ser recicladas para os precursores da síntese de sacarose novamente pela hexoquinase,
fosfoglicoisomerase (IGP) e UDPglicose pirofosforilase (UDPG-PPase) (Fig.2). Todas essas
enzimas supostamente são citosólicas com exceção da invertase ácida solúvel, que é vacuolar
(KOMOR, 2000).
Figura 1 Ciclo da sacarose em cana-de-açúcar e enzimas e metabólitos envolvidos. (SPS = sacarose fosfato
sintase, SS = sacarose sintase, SAI = invertase ácida solúvel, NI = invertase neutra, PGI = fosfoglicoisomerase,
UDPG-PPase = UDPglicose pirofosforilase (KOMOR, 2000).
O metabolismo de assimilados é necessário para evitar o acúmulo de produtos e a
inibição da assimilação. Mudanças consideráveis podem ocorrer nas concentrações de
carboidratos e aminoácidos sob baixo conteúdo relativo de água (CRA). Como a assimilação
diminui com a redução do CRA, a quantidade de assimilados disponíveis para a exportação de
triosefosfato do cloroplasto para citosol diminui, e a síntese de sacarose também. O teor de
sacarose nas folhas estressadas cai rapidamente sob CRA menor que 80%, causado pela baixa
assimilação e respiração contínua, além de síntese de aminoácidos (LAWLOR & CORNIC,
2002).
A concentração de sacarose foliar é determinada por vários fatores, incluindo a taxa de
fotossíntese, a compartimentação de carbono pela fotossíntese entre o amido e sacarose, a taxa
de hidrólise da sacarose e a taxa de exportação de sacarose (WINTER & HUBER, 2000).
Variando em função da idade da planta e do ambiente em que está crescendo. Qualquer efeito
da seca sobre estes processos pode modificar a concentração de sacarose da folha (ZHU et al.
1997).
23
Modificações nos níveis de carboidratos durante a seca também têm sido atribuídas a
alterações nas atividades enzimáticas. Os principais carboidratos como, amido, açúcares
redutores e não redutores sofrem importantes mudanças sob eventos de seca, e vem sendo
investigado por vários pesquisadores em culturas de grande importância economica como
feijão, soja e milho (CASTRILLO, 1992; PELLESCHI et al. 1997; LIU et al. 2004).
Em guandu (Cajanus cajan), por exemplo, Keller & Ludlow (1993), relataram uma
rápida diminuição da concentração foliar de amido e sacarose sob estresse hídrico, enquanto
que as concentrações de glicose e frutose aumentaram significativamente, associando isto, à
um aumento da atividade de hidrolise do amido e enzimas sacarose sintase. Liu et al. (2004),
também observaram decréscimos nos teores de sacarose e amido foliar em virtude da seca,
juntamente com acúmulo de glicose e frutose, contudo a seca não afetou a atividade da
invertase solúvel das folhas.
Castrillo (1992) mencionou a influência do estresse hídrico na diminuição de 1,8 para
0,4 μg m-2 de amido/sacarose e aumento de 5,0 para 8,0 μg m-2 de glicose/frutose totais
(valores aproximados), o autor também observou modificações na atividade da sacarose
sintase e invertase de folhas de feijão, onde a percentagem de ativação da enzima sacarose
sintase aumentou 143% com oito dias de restrição hídrica.
Segundo Papini-Terzi et al. (2009), compreender as diferenças nos mecanismos
ligados direta ou indiretamente ao acúmulo de sacarose em diferentes cultivares é uma etapa
importante na melhoria do rendimento de açúcar na cana-de-açúcar, assim como, o impacto
de estresses ambientais no acúmulo de sacarose e nos demais meios de sinalização do estresse
expressados pela cana-de-açúcar.
Em adição, McCormick et al. (2008) comenta que para a cana-de-açúcar, o
metabolismo de carboidratos em folhas submetidas ao estresse hídrico ainda é pouco
compreendido e requer mais estudos, no sentido de desvendar os efeitos da seca sobre as
respostas fisiológicas das plantas. Uma melhor compreensão dos mecanismos de sinalização
sobre a atividade fotossintética e seus produtos, irá apoiar os esforços biotecnológicos na
investigação sobre o acúmulo de carbono na cana-de-açúcar em condições ambientais
adversas.
24
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Material vegetal
O experimento foi conduzido em casa de vegetação pertencente ao Laboratório de
Fisiologia Vegetal do Centro de Ciências Agrárias da Universidade Federal de Alagoas,
localizado no município de Rio Largo - AL (9°28’ S, 35°49’ W, a 127m de altitude) no
período de 12/11/2009 a 12/03/2010. Foram utilizadas duas variedades de cana-de-açúcar
(Saccharum spp.) provenientes do Programa de Melhoramento Genético da cana-de-açúcar
(PMGCA/CECA/UFAL), com respostas contrastantes à seca, onde a variedade RB867515 é
considerada tolerante e a RB855536 é considerada sensível ao estresse hídrico.
3.2 Condições de cultivo
As plantas foram originadas de rebolos de cana com uma única gema, onde foram
semeados quatro rebolos por vaso. Os vasos foram preenchidos com 22,0 kg de solo, o qual
foi destorroado e peneirado. Após 22 dias de plantio, foi realizado o desbaste, selecionando as
duas plantas que se apresentavam mais bem desenvolvidas, a fim de manter a uniformidade e
homogeneidade das plantas dos vasos. Até o início da imposição dos tratamentos, o solo foi
mantido próximo a capacidade de campo, determinada por um método gravimétrico direto,
conforme descrito por (SOUZA et al. 2002).
A aplicação dos tratamentos se de deu através da supressão da rega aos 109 dias de
plantio. Os tratamentos foram divididos em quatro grupos:
Grupos:
Subgrupos:
Grupo 1
Controle
2 dias de estresse hídrico
Reidratação após 2 dias de estresse hídrico
Grupo 2
Controle
4 dias de estresse hídrico
Reidratação após 4 dias de estresse hídrico
Grupo 3
Controle
6 dias de estresse hídrico
Reidratação após 6 dias de estresse hídrico
Grupo 4
Controle
8 dias de estresse hídrico
Reidratação após 8 dias de estresse hídrico
25
Os tratamentos reidratados foram avaliados dois dias após a reidratação em cada
tempo de estresse hídrico, afim de se observar a recuperação das plantas.
Durante as avaliações foram realizadas três leituras da umidade do solo por vaso,
numa profundidade de cinco centímetros, utilizando-se um sensor de umidade modelo
SM200, acoplado a um medidor de umidade modelo HH2 ambos do fabricante (DELTA-T
Devices, Cambridge - England).
As temperaturas máxima, média e mínima, radiação fotossinteticamente ativa (PAR) e
déficit de pressão de vapor (DPV), foram registrados diariamente por uma estação
meteorológica automática (Weather Station) modelo WS - GP1 AT (DELTA-T Devices,
Cambridge - England), instalada no interior da casa de vegetação.
A
B
Temperatura do ar (C°)
45
T Min
T Med
T Max
40
35
30
25
20
C
D
MJ m-2 dia-1
15
10
5
PAR
0
0
20
40
60
Dias
80
100
120
0
2
4
6
8
10
12
Dias
Figura 2 Dados diários de temperatura mínima (T Min), média (T Med), máxima (T Max) (A), radiação
fotossinteticamente ativa (B), registradas dentro da casa de vegetação durante o período experimental, e
dados diários de (T Min, T Med e T Max) (C) e (PAR) (D) observadas durante o período de coleta das
amostras.
26
3.3 Delineamento experimental e análise estatística
O experimento foi conduzido em delineamento inteiramente ao acaso com arranjo em
esquema fatorial com 2 (variedades) x 3 (estados hídricos) x 4 (tempos de estresse hídrico)
com 4 repetições, considerando a planta como unidade experimental. Para as análises de
fluorescência da clorofila a, açúcares solúveis, enzimas antioxidantes, potencial hídrico e
potencial de solutos foliar foram utilizadas quatro repetições. Os dados foram submetidos à
análise de variância e as médias comparadas pelo teste de Tukey (P < 0,05).
Figura 3 Vista parcial do stand experimental com as variedades RB855536 e RB867515, cultivadas
em casa-de-vegetação aos 56 dias após o plantio.
3.4 Análises fisiológicas
3.4.1 Avaliação da eficiência fotoquímica
Para medidas de fluorescência da clorofila a, utilizou-se um fluorômetro portátil de luz
modulada (Opti-Sciences, modelo OS1-FL, Hudson, USA), pelo qual se obteve a
fluorescência inicial (F0), a fluorescência máxima (Fm), a fluorescência variável (Fv) e o
rendimento quântico máximo do FSII (Fv/Fm), obtidos após a adaptação da folha +1 ao escuro
por (≈ 20 min) com a utilização de presilhas plásticas. As medições ocorreram nos horários
entre 4 - 5 horas (antemanhã) e 11 - 12 horas (meio-dia), para quantificação do grau de
fotoinibição do fotossistema II (PSII) provocado pelo estresse hídrico. O rendimento quântico
27
efetivo do PSII (Yield) foi determinado às 10:00 horas da manhã sob luz ambiente. Foram
realizadas duas leituras do terço médio foliar da folha +1 de todas as plantas.
3.4.2 Potencial hídrico foliar (w)
O potencial hídrico foliar foi medido por uma bomba de pressão de Scholander (Soil
Moisture, Equipament Corporation, Santa Barbara, USA) às 4:30h (antemanhã), utilizando a
folha +2. As folhas foram seccionadas na lígula, separadas em sacos plásticos e
acondicionadas em caixa térmica com gelo (sem contato com o gelo) afim de minimizar a
perda de umidade. Imediatamente após a coleta, as amostras foram levadas ao laboratório para
realização das leituras.
3.4.3 Potencial de solutos (s)
Para a determinação da osmolalidade total do tecido foliar, coletou-se amostras do
terço médio da mesma folha utilizada na determinação do w (folha +2), às 4:30h
(antemanhã), de onde se extraiu o suco celular por prensagem, transferindo-o para tubos de
1,5 mL, sendo posteriormente armazenada em -20 °C. Um osmômetro de pressão de vapor
VAPRO 5520 (Wescor Inc. Logan, UT, USA), foi utilizado para obtenção dos valores de s.
Para cada leitura foram utilizadas alíquotas de 10 μL de suco celular e os valores expressos
em MPa.
3.5 Coleta do material vegetal
A coleta do material vegetal foi realizada às 12:30h em cada subgrupo já descrito
anteriormente. O terço médio da folha +1 foi cuidadosamente recortado com tesoura,
acondicionado em tubos de 15 e 50 mL, e mantido em nitrogênio líquido e armazenado em
ultra-freezer -80°C para posteriores análises.
3.6 Avaliação de carboidratos
3.6.1 Sacarose, glicose, frutose e amido
As análises metabólicas foram realizadas no Laboratório de Fisiologia Molecular de
Plantas do Departamento de Biologia Vegetal da Universidade Federal de Viçosa, Viçosa MG. A extração de açúcares foi feita de acordo com Trethewey et al. (1998). Inicialmente,
cerca de 50 mg de tecido foliar liofilizado (massa seca), foi macerado por 1 min e 30s em um
Mini-beadbeater - 96 (Biospec Products, Inc. Bartlesville, USA) em tubo de 2 mL com
28
auxílio de 4 esferas de aço. Em seguida cerca de 10 mg da amostra, foram transferidos para
um tubo de 2 ml, onde se adicionou 1000 μL de metanol 100%, e as amostras foram mantidas
em Thermomixer comfort (Eppendorf, Brasil) a 70°C por 1 hora a 950 rpm. O homogenato
foi centrifugado por 10 min a 11.000 g em temperatura ambiente 25°C. Posteriormente 600
μL do sobrenadante foram transferidos para outro tubo de 2 mL. O sedimento da extração de
açúcares foi utilizado para a extração do amido e armazenado em ambiente refrigerado. Ao
sobrenadante foi adicionado 500 μL de clorofórmio 100% (CHCl3), depois adicionou-se 800
μL de água deionizada. Logo após, as amostras foram agitadas em vortex por 10s e
centrifugadas por 15 min a 2.200 g. Coletou-se 1000 μL da fase polar (superior) e transferiuse para tubos de 1,5 mL. Em seguida amostras foram levadas a Concentrator plus a vácuo
(Eppendorf, Brasil) overnight a 30°C e armazenadas à -20°C.
O sedimento da extração de açúcares, foi lavado três vezes em etanol 80%, e
posteriormente, hidrolisado com 400 μL de KOH 0,2 M por 1 hora a 90°C com agitação a 950
rpm em Thermomixer. Em seguida foram acrescentados 70 μL de ácido acético 1 M, agitado
no vortex e centrifugado por 10 min a 13.000 g. A fração solúvel correspondeu ao amido
presente na amostra, o qual foi armazenado em -20°C.
Para a extração do amido não foram utilizadas luvas, devido às mesmas possuírem
amido, de modo a evitar interferências nos resultados das análises.
A determinação de glicose, frutose e sacarose, foi feita conforme Stitt et. al. (1989).
Resumidamente uma alíquota do extrato etanólico foi usada em “Tampão Imidazol” (Imidazol
100 mM (pH 6,9); NAD+ 2 mM; ATP 1 mM e H2O), contendo, ainda, 2 U mL-1 de
desidrogenase da glicose-6-fosfato, em volume final de 300 μL. Em seguida adicionou-se na
placa de ELISA (135 μL de H2O; 150 μL de Tampão Imidazol e 5 μL da amostra). A reação
foi registrada continuamente em leitor de ELISA (ELISA Versamax, Molecular Devices,
Sunnyvalle, Califórnia, EUA), a 340 nm, por cerca de 5 min sendo então acrescentado 0,5 U
reação-1 de hexocinase (EC 2.7.1.1), para a determinação da glicose. Depois de estabilizadas
as leituras, foi adicionado 0,5 U reação-1 fosfoglicoisomerase (PGI) (EC 5.3.1.9), para
determinação da frutose. Por último, a essa reação foram acrescentados 2 U de invertase (βfrutosidase) (EC 3.2.1.26), para determinação dos teores de sacarose.
Para determinação dos teores de amido, uma alíquota do extrato de amido foi incubada
por 60 min a 55°C com 30 μL de tampão citrato 300 mM (pH 4,6), 2 U reação -1 de
amiloglicosidase (EC 3.2.1.3) e H2O, num volume final de 300 μL. Após a digestão do amido
adicionou-se na placa de ELISA (150 μL de Tampão Imidazol, 100 μL da amostra e 40 μL de
29
H2O) A reação foi registrada continuamente em leitor de ELISA (ELISA Versamax,
Molecular Devices, Sunnyvalle, Califórnia, EUA), a 340 nm, até a estabilização, sendo então
acrescentado 0,5 U reação-1 de hexocinase, para a determinação do amido.
3.7 Enzimas antioxidantes
3.7.1 Catalase (CAT)
A análise da atividade da CAT foi realizada no Laboratório de Fisiologia Vegetal do
Centro de Ciências Agrárias da Universidade Federal de Alagoas, Rio Largo - AL. Para
extração e determinação da CAT foi usado o método descrito por Havir et al. (1987).
Aproximadamente 30 mg de material foliar fresco foram macerados (cadinho e pistilo) em 2
mL de “Tampão TFK” (Tampão Fosfato de Potássio 50 mM (pH 7,5); EDTA 2 mM;
Ascorbato 20 mM; Triton X 100 0,1%, PVPP 1% (p/v) e H2O deionizada), em seguida
transferidas para tubo de 2 mL e centrifugadas por 15 min a 14000 g a 4°C. O sobrenadante
foi coletado e transferido para novo tubo de 2 mL e mantido a -80°C até a análise.
Na determinação da CAT as amostras foram descongeladas e mantidas a 4°C. A
reação foi registrada em espectrofotômetro (Thermo Scientific Genesys 10, Madison, USA)
durante 1 min a 240 nm em cubeta de quartzo. Foi usado meio de reação (Tampão TFK 50
mM (pH 7,5); H2O2 12,5 mM; H2O deionizada), (mantidos a 30°C em banho maria) e 20 μL
de extrato num volume final de 1000 μL. Durante a reação observou-se o decréscimo da
concentração de H2O2. Para os cálculos da atividade da CAT usou-se o coeficiente de
extinção 36 mM-1 cm-1. Os valores foram expressos em unidades de CAT min-1 mg-1 de
proteína.
3.7.2 Superóxido Dismutase (SOD)
A determinação da atividade da SOD foi realizada no Laboratório de Fisiologia
Molecular de Plantas do Departamento de Biologia Vegetal da Universidade Federal de
Viçosa, Viçosa - MG. Para extração e determinação da SOD usou-se o método descrito por
Giannopolitis & Ries (1977) com modificações. Aproximadamente 50 mg da amostra foram
maceradas por 1 min e 30s em um Mini-beadbeater - 96 (Biospec Products, Inc. Bartlesville,
USA) em tubo de 2 mL com auxílio de 1 esfera de vidro após banho de N2 líquido. Em
seguida os tubos foram transferidos para um recipiente com gelo a uma temperatura de + 4°C,
onde foram adicionados 1,5 mL de tampão de extração (TFK 100 mM (pH 6,8), EDTA 0,1
mM, DTT 1,0 mM, Triton X 100 0,1%, PMSF 1,0 mM, PVPP 1% (p/v) e H2O deionizada),
30
agitados no vortex e centrifugadas por 15 min a 14000 g a 4°C. O sobrenadante foi coletado e
transferido para tubo novo de 1,5 mL e mantido a -80°C até a análise. A determinação da
SOD foi realizada usando-se meio de reação (TFK 50 mM (pH 7,8), Metionina 13,0 mM,
NBT 75,0 μM, EDTA 0,1 mM, Riboflavina 2,0 μM, H2O deionizada), e 10 μL do extrato
enzimático, num volume final de 297 μL. A reação foi conduzida em placa de ELISA disposta
em câmara de reação a 25°C, sob iluminação de lâmpada fluorescente de 45 W. Após 7,5
minutos de exposição à luz, a iluminação foi interrompida e a formazana azul, produzida pela
fotorredução do NBT, medida na absorbância a 560 nm. A absorbância a 560 nm de um meio
de reação exatamente igual ao anterior, mas mantido no escuro por igual período, serviu de
branco e foi subtraído da leitura da amostra que recebeu iluminação (GIANNOPOLITIS &
RIES, 1977). Uma unidade de SOD foi definida como a quantidade de enzima necessária para
inibir em 50% a fotorredução do NBT (BEAUCHAMP & FRIDOVICH, 1971).
3.7.3 Ascorbato Peroxidase (APX)
A determinação da APX foi realizada conforme Nakano & Asada (1981). O extrato
enzimático utilizado para a APX foi o mesmo da extração da CAT. Na determinação da APX
o extrato foi descongelado e mantido a 4°C. A reação se deu em espectrofotômetro (Thermo
Scientific Genesys 10, Madison, USA) durante 1 min a 290 nm em cubeta de quartzo. O meio
de reação usado na análise foi composto por (Tampão TFK 50 mM (pH 7,5); H2O2 0,1 mM;
ascorbato de sódio 0,5 mM; H2O deionizada), (mantidos a 25°C em banho maria) e 25 μL do
extrato com um volume final de 1,0 mL. Durante a reação observou-se o decréscimo da
concentração do ascorbato de sódio. Para os cálculos da atividade da APX usou-se o
coeficiente de extinção 2,8 mM-1 cm-1. Os valores foram expressos em unidades de APX min1
mg-1 de proteína.
3.7.4 Proteínas solúveis das enzimas antioxidantes
Para a determinação dos teores de proteínas solúveis foi usado uma fração de 50 µL do
extrato enzimático descrito anteriormente (não tratado com ácido tricloroacético), e
completado para 1 mL com reagente Coomassie (Bradford, 1976), o qual, foi preparado,
dissolvendo-se 111,0 mg de (Coomassie Brilliant Blue G-250), em 50 mL de etanol 95% com
agitação constante, sem aquecimento, durante uma hora. Adicionou-se 100 mL de ácido
fosfórico (H3PO4) 85% e o volume completado com água deionizada até 1000 mL. Em
seguida realizaram-se duas filtrações em papel de filtro qualitativo e o reagente foi mantido
em frasco escuro sob ambiente refrigerado. As proteínas solúveis foram estimadas pelas
31
medidas de absorbância a 595 nm, utilizando como branco a mistura de 50 µL do tampão de
extração e 950 µL do reagente de Bradford. Como padrão foi usada a albumina sérica bovina
(Sigma Chemical Company). Os resultados foram expressos em mg g-1 MF. Cada amostra foi
representada por um extrato simples dosado em triplicata.
32
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Condições meteorológicas e teor de umidade do solo
Durante o período experimental a temperatura média foi de aproximadamente 28 ºC,
no entanto, durante a coleta, realizada na primeira quinzena de março de 2010, detectou-se um
leve aumento na temperatura média, apresentando (+ 30 ºC), e uma forte elevação na
temperatura máxima (+ 43 ºC) (figura 2). Após a suspensão da rega, uma queda pronunciada
no teor de água do solo é observada até seis dias de seca nas duas variedades, em seguida
mostrando uma pequena variação até o décimo dia de restrição hídrica (figura 4).
RB867515
0,18
0,16
0,14
0,12
0,10
0,08
0,06
0,04
0,02
0,00
m-3.m-3
m-3.m-3
RB855536
2
4
6
8
controle
Estresse hídrico
0,18
0,16
0,14
0,12
0,10
0,08
0,06
0,04
0,02
0,00
10
Tempo (dias)
2
4
6
8
10
Tempo (dias)
Figura 4 Teor de umidade do solo, cultivado com duas variedades de cana-de-açúcar submetidas a
estresse hídrico e reidratação, em casa de vegetação aos 121 após o plantio. As barras representam o erro
padrão da média (n = 6).
4.2 Potencial hídrico (ψw) e Potencial de solutos (ψs)
A suspensão da irrigação provocou decréscimos no potencial hídrico foliar e osmótico
nas duas variedades (figura 5). O ψw da variedade RB855536, apresentou uma leve redução
sob estresse (-0,23 MPa), em relação ao controle (-0,13 MPa) (figura 5 A). Após seis dias de
restrição hídrica, não foram observadas leituras do potencial hídrico foliar nas duas
variedades, atribui-se a tal fato, o elevado nível de desidratação apresentado pelas folhas +2
das plantas em virtude da seca, somado ao efeito das altas temperaturas registradas dentro da
casa de vegetação durante o experimento (figura 3). Após a reidratação, houve recuperação do
potencial hídrico, o qual diferiu significativamente do controle quando submetido por mais de
seis dias de seca.
33
A
4
6
8
10
0
0,0
-0,1
-0,1
-0,2
-0,2
-0,3
-0,3
-0,4
-0,5
-0,6
-0,8
4
6
Controle
Estresse hídrico
Reidratação
RB855536
4
6
8
10
-0,4
-0,5
-0,7
-0,8
8
D
Ψs MPa
2
0,0
-0,1
-0,2
-0,3
-0,4
-0,5
-0,6
-0,7
-0,8
-0,9
-1,0
2
-0,6
Controle
Estresse hídrico
Reidratação
-0,7
Ψs MPa
2
Tempo (dias)
0,0
Ψw MPa
Ψw MPa
0
C
B
Tempo (dias)
2
4
6
8
0,0
-0,1
-0,2
-0,3
-0,4
-0,5
-0,6
-0,7
-0,8
-0,9
-1,0
RB867515
Figura 5 Potencial hídrico foliar w antemanhã - 4h (A e B) e potencial de solutos s antemanhã - 4h
(C e D) de duas variedades de cana-de-açúcar RB855536 (A e C) e RB867515 (B e D) submetidas a
estresse hídrico e reidratação, cultivadas em casa de vegetação aos 121 dias após o plantio.
A RB867515 (figura 5 B), também apresentou ligeira redução no ψw foliar até quatro
dias de restrição hídrica. Porém, após a reidratação, detectou-se uma grande diminuição do ψw
nesta variedade (-0,74 e -0,49 MPa) em comparação com o controle (-0,10 e -0,08 MPa) aos
seis e oito dias de estresse respectivamente. Após a reidratação a variedade RB867515 sofreu
uma maior redução no ψw foliar aos seis e oito dias de déficit hídrico (-0,74 e -0,49 MPa)
respectivamente, em relação a RB855536 (-0,29 e -0,40 MPa) nas mesmas condições. Esses
resultados mostram que as plantas apresentaram capacidade de recuperação quando
submetidas a oito dias de seca, entretanto, não conseguindo restabelecer o seu status hídrico
ao nível das plantas controle.
Segundo Bergonci et al. (2000), o potencial hídrico foliar de base corresponde a
medição feita na antemanhã, antes do sol nascer. Assim, uma das grandes vantagens deste
teste, quando comparado com outras variáveis que descrevem o estado hídrico da planta, é sua
independência em relação às condições ambientais diurnas. Como no presente estudo as
medições dos tratamentos reidratados foram feitas dois dias após a reidratação, mesmo
34
mantendo os vasos próximos a capacidade de campo, as plantas ficaram exposta às variações
ambientais (altas temperaturas) durante o dia nesse intervalo de tempo. Provavelmente, tais
fatores, podem ter influenciado os baixos potenciais hídricos apresentados pelas variedades
nas medidas de ψw, principalmente na RB867515. Outro fator que possivelmente contribuiu
com esses resultados, foi a presença de iluminação noturna próxima ao local do experimento,
fazendo com que as plantas transpirassem neste período. Snyder et al. (2003), comparando
diversas espécies C3 e C4, relataram condutância estomática e transpiração noturna em 11 das
14 espécies estudadas dentre elas gramíneas. Porém uma hipótese a se considerar seria a de
que, a maior redução ψw pode ser uma estratégia da variedade RB867515 no sentido de
manter a absorção de água pelas raízes, e assim atender a demanda hídrica da planta após ter
passado por um tempo de estresse.
Barbosa (2010), comparando variedades de cana sensíveis e tolerantes ao estresse
hídrico, em campo, notou decréscimo significativo do ψw antemanhã na variedade RB867515
-0,93 MPa em relação a RB855536 -0,30 MPa sob cultivo sequeiro e -0,45 e -0,30 MPa no
controle respectivamente. O resultado obtido por este autor assemelha-se ao apresentado neste
trabalho quanto às variedades RB855536 e RB867515.
Em adição, Inman-Bamber & Smith (2005), pesquisando cana-de-açúcar também em
condições de campo, observaram potenciais hídricos antemanhã em torno de -0,05 MPa sob
condições irrigadas, e -0,2 MPa em condições de sequeiro. Enquanto Silva et al. (2001),
relataram reduções no potencial hídrico foliar de três espécies de gramíneas cultivadas em
casa de vegetação, em valores próximos de (-1,5 MPa) aos sete dias de seca e valores
constantes de (-0,3 MPa) nas plantas controle. Os níveis de ψw observados por (SILVA et al.
2001) foram bem abaixo dos apresentados pelo presente estudo.
Já Gonçalves et al. (2010), trabalhando com quatro variedades de cana-de-açúcar em
casa de vegetação, constataram valores de potencial hídrico antemanhã em torno de (-0,10
MPa) em plantas controle e (-0,19 MPa) sob estresse severo. Silva (2010), também
comparando variedades e clones de cana-de-açúcar, observou potenciais hídricos próximos de
(-0,12 MPa) nos tratamentos controle, e variações de (-0,15 e -0,24 MPa) em condições de
estresse hídrico severo. Levando-se em conta os resultados observados por estes autores,
podemos sugerir que as variedades analisadas nesta pesquisa já apresentavam valores de ψw
correspondentes a estresse severo já a partir do quarto dia de seca.
Saliendra & Meinzer (1991), relatam um limite no potencial hídrico foliar de -0,8 a
-0,9 MPa) em que o crescimento de folhas e a abertura estomática começam a declinar, e de
-1,3 a -1,7 MPa em que ambos são completamente inibidos. Por outro lado, Boyer (1970),
35
constatou inibição da expansão foliar em girassol, milho e soja pela diminuição do potencial
hídrico, com valores críticos entre -0,4 e -0,5 MPa, e índices máximos de expansão em torno
de -0,15 e -0,25 MPa.
O potencial de solutos (s) expressado pela variedade RB855536 (figura 5 C),
apresentou diferença significativa apenas entre o controle (-0,46 MPa) e a reidratação (-0,94
MPa) depois de oito dias de estresse hídrico. Nesta variedade, o controle permaneceu
constante, mostrando s em torno de -0,55 MPa. Até o quarto dia de estresse hídrico,
observou-se uma leve redução nos valores de s (-0,67 MPa), no entanto, sem diferir
significativamente do controle. A partir do sexto dia, não foram detectadas leituras nos
tratamentos estressados. O que indica que as plantas não suportaram a escassez hídrica e a alta
temperatura (+ 42°C) durante este período, não conseguindo assim, realizar o ajustamento
osmótico. Após a reidratação, com seis dias de seca a planta ajustou o s ao mesmo nível do
controle. De acordo com Blum et al. (1996), o ajustamento osmótico envolve a acumulação
líquida de solutos nas células em resposta a uma queda do potencial hídrico. Como
conseqüência desse acúmulo líquido, o potencial osmótico da célula é reduzido, atraindo por
sua vez, a água para dentro da célula de modo a manter a turgescência.
Na variedade RB867515 (figura 5 D), não houve diferença no s do tratamento
estressado (-0,68 MPa) em relação ao controle (-0,55 MPa) até o quarto dia de seca. A
variedade RB867515 ainda apresentou resultados semelhantes aos da RB855536, onde não se
observaram leituras a partir de seis dias de restrição hídrica. O s da RB867515 decaiu após a
reidratação, mantendo uma queda nesse parâmetro com o aumento do tempo de restrição
hídrica.
Molinari et al. (2007), observaram em cana-de-açúcar cultivada em casa de vegetação,
e submetida aos seis e nove dias de seca, potenciais de solutos em torno de -2,33 e -2,82 MPa
em plantas controle não transformadas, e -2,17 e -2,86 MPa em plantas transformadas,
concluindo que a redução do potencial hídrico foi acompanhada por uma diminuição do
potencial osmótico. Corroborando com os dados observados no presente estudo, os quais
mostraram reduções no potencial hídrico, acompanhadas de decréscimos no potencial
osmótico em condições de seca.
Clifford et al. (1998), relataram declínio no potencial hídrico (-0,5 e -1,4 MPa) e
osmótico (-1,7 e -2,2 MPa) no tratamento controle e estresse respectivamente de folhas de
Ziziphus mauritiana em resposta a uma diminuição de 14 %, no conteúdo relativo de água.
36
Barbosa (2010), constatou em variedades de cana-de-açúcar sensíveis e tolerantes à
seca em condições de campo, que o s da variedade RB867515 sob cultivo de sequeiro, não
diferiu do apresentado pela RB855536.
4.3 Avaliação da eficiência fotoquímica
A diminuição no conteúdo de água do solo (figura 4), ocasionada pelo estresse hídrico,
provocou redução na eficiência fotoquímica nas duas variedades de cana-de-açúcar (figura 6,
tabela 4).
A relação Fv/Fm da variedade RB855536, aferido às 4h, diminuiu após quatro dias de
estresse hídrico (figura 6A). Na variedade RB867515, essa diferença já foi observada com
dois dias após o estresse (figura 6B), indicando que as duas variedades sofreram fotoinibição
crônica. No entanto, a RB867515 apresentou fotoinibição crônica mais intensa durante todo
período de estresse. A fotoinibição crônica, ocorre quando a luz absorvida em excesso gera
uma série de espécies reativas de oxigênio podendo causar danos ao aparelho fotossintético
(MORAES et al. 2010), o mesmo ocorre quando a proteólise da proteína D1, localizada no
centro de reação, excede a taxa de reparo, ocasionando em danos à integridade funcional do
centro de reação do PSII (OSMOND citado por LEMOS-FILHO & ISAÍAS, 2004). Além
disso, o fotossistema não consegue se recuperar de um dia para o outro.
Segundo Baker (2008), quando as plantas são expostas a estresses abióticos como
estresse hídrico e temperatura, diminuições na relação Fv/Fm frequentemente são observadas,
juntamente com a inativação dos centros de reação do PSII, podendo levar a oxidação, danos
e perdas dos centros de reação.
Biheler & Fock (1996), investigando o processo fotoquímico em trigo, observaram
que a atividade do PSII diminuiu 11,7% sob estresse hídrico.
Quando as duas variedades analisadas foram reidratadas, ambas se recuperaram da
fotoinibição crônica quando submetidas até quatro dias após o estresse. A RB867515 mostrou
uma resposta muito parecida quando comparada com a RB855536. O aumento do tempo de
estresse hídrico, implicou em dano irreversível ao PSII das duas variedades, as quais não
apresentaram restabelecimento do Fv/Fm ao nível do controle.
Souza et al. (2004), por outro lado, observaram recuperação no Fv/Fm de plantas
reidratadas de Vigna unguiculata ao nível de controle após terem sofrido estresse hídrico.
Aro et al. (1994) por outro lado, mencionaram aumento da taxa de degradação de
proteínas D1 em folhas fotoinibidas de ervilha, em relação as não fotoinibidas, e que esse
37
processo garantiu a restauração da função do PSII em diferentes irradiâncias, sendo
diretamente relacionado com a capacidade das folhas em degradar proteínas D1 danificadas
em condições de recuperação.
Em ambas as variedades também foram observadas uma redução do Fv/Fm às 11 h
caracterizando fotoinibição dinâmica. A variedade RB855536 começou a apresentar
fotoinibição dinâmica após quatro dias de estresse hídrico (figura 6 C). Por outro lado, a
RB867515 começa a sofrer fotoinibição já a partir do segundo dia de déficit de água (figura 6
D). A maior redução no Fv/Fm do PSII às 11h, comparado com o observado às 4h 0,40 e 0,66
na RB855536 e 0,48 e 0,60 na RB867515 respectivamente (figura 6 C e D) é resultado da
deficiência hídrica, somado ao efeito de temperaturas e irradiâncias elevadas observadas às
11h, podendo causar maiores danos aos tilacóides e prejuízos ao aparelho fotossintético.
A variedade RB855536 apresentou uma queda abrupta no Fv/Fm após quatro dias de
seca, chegando a um Fv/Fm de 0,40, enquanto que na RB867515 a redução foi mais gradual,
não reduzindo tanto, chegando a um Fv/Fm de 0,48 após oito dias de estresse. Do mesmo
modo Subrahmanyam et al. (2006) mencionaram um efeito redutor mais pronunciado no
Fv/Fm de variedades de trigo suscetíveis à seca.
De acordo com Baker & Rosenqvist (2004), a inativação do PSII e desorganização dos
tilacóides são consideradas as maiores características do estresse a altas temperaturas. Uma
folha com aparato fotoquímico intacto apresenta um Fv/Fm em torno de 0,75 e 0,85
(BOLHÀR–NORDENKAMPF et al. 1989), enquanto que uma redução nesses valores pode
indicar fotoinibição.
A resposta das duas variedades ao estresse hídrico, observada às 11h, confirma o
resultado apresentado na análise feita às 4h, a qual mostrou que após a reidratação, a
RB867515 e a RB855536 tem capacidade similar de reparação dos danos provocados pela
restrição hídrica ao aparato fotossintético (tabela 2). Já após a reidratação, a RB867515 não
diferiu do controle com oito dias de seca.
38
A
0,85
ns
0,80
+
++
ns
0,80
Fv/Fm - 4h
0,75
*
0,70
RB867515
0,85
ns
ns
0,75
Fv/Fm - 4h
B
RB855536
0,65
**
0,60
*
0,65
*
controle
Estresse hídrico
Reidratação
2
4
6
8
10
0
2
Tempo (dias)
C
D
RB855536
6
8
10
+
ns
RB867515
0,90
ns
0,80
ns
+
ns
0,80
++
ns
0,70
0,60
ns
Fv/Fm - 11h
0,70
Fv/Fm - 11h
4
Tempo (dias)
0,90
**
0,50
**
0,40
**
0,60
*
0,50
**
0,40
0,30
*
0,30
*
0,20
0
2
4
6
8
0,20
10
0
2
Tempo (dias)
E
F
ns
ns
0,70
4
6
8
10
Tempo (dias)
RB855536
0,80
+
RB867515
0,80
++
ns
0,70
ns
ns
ns
0,60
*
0,50
Φ PSII - 10h
0,60
Φ PSII - 10h
*
0,50
0
+
0,70
0,55
0,50
+
*
0,60
**
0,55
ns
*
0,40
**
0,50
0,40
**
0,30
0,30
0,20
**
0,10
0
2
4
6
Tempo (dias)
0,20
**
8
**
0,10
10
0
2
4
6
**
8
10
Tempo (dias)
Figura 6 Máximo rendimento quântico do PSII (Fv/Fm) - 4h (A e B) e 11h (C e D) e rendimento quântico
efetivo do PSII (ΦPSII) (E e F) das variedades de cana-de-açúcar RB855536 (A, C e E) e RB867515 (B, D e
F) submetidas a estresse hídrico e reidratação, cultivadas em casa de vegetação aos 121 dias após o plantio.
** e * comparam controle e estresse hídrico; ++ e + comparam controle e reidratação P < 0,01 e P < 0,05
pelo teste de t respectivamente. ns - não significativo.
39
Diminuições na eficiência fotossintética também foram observadas após sete dias de
seca em feijão (MIYASHITA et al. 2005), gramíneas forrageiras (SILVA et al. 2006), e canade-açúcar (SILVA et al. 2007; GONÇALVES et al. 2010). Já Queiroz et al. (2002),
mencionaram que não houve redução no Fv/Fm de aroeira-do-sertão, exposta a 14 dias de seca,
mesmo havendo queda na taxa aparente de transporte de elétrons (ETR). Hao et al. (1999),
relataram que o PSII foi principal local afetado pelo estresse hídrico em folhas de milho,
atribuindo a perda funcional do PSII à degradação da proteína D1.
Segundo Zlatev & Yordanov (2004), a inibição da fotossíntese das plantas em relação
à seca, é causada não apenas por lesões nas membranas dos tilacóides e transporte de elétrons,
mas é resultado de distúrbios do ciclo de Calvin, atrasos na reoxidação da Q A- induzidos por
baixa regulação do PSII, o que causa uma diminuição linear no transporte de elétrons, e
consequentemente fotoinibição.
Tabela 1 Máximo rendimento quântico do PSII (Fv/Fm) - 4h e 11h e rendimento quântico
efetivo do PSII (ΦPSII) das variedades de cana-de-açúcar RB855536 e RB867515, submetidas
a estresse hídrico e reidratação, cultivadas em casa de vegetação aos 121 dias após o plantio.
Médias de variedades, estado hídrico e tempo com letras iguais em colunas no mesmo atributo não diferem
significativamente entre si P < 0,05 pelo teste de Tukey.
Fator
Variedades
RB855536
RB867515
Estado hídrico
Controle
Estresse
Reidratado
Tempo de estresse (dias)
2 (dois)
4 (quatro)
6 (seis)
8 (oito)
FvFm 4h
0,716 a
0,734 a
Médias dos Fatores (µmol m-2 s-1)
FvFm 11h
ΦPSII
0,674 a
0,558 a
0,674 a
0,515 b
0,784 a
0,669 c
0,721 b
0,740 a
0,591 c
0,692 b
0,636 a
0,395 c
0,579 b
0,788 a
0,750 a
0,701 b
0,660 c
0,726 a
0,695 a
0,644 b
0,633 b
0,607 a
0,594 a
0,475 b
0,470 b
O ΦPSII (figura 6 E e F), apresentou redução significativa nas duas variedades
analisadas em condições de estresse hídrico. A variedade RB855536 mostrou uma queda
acentuada do ΦPSII após quatro dias de estresse. Por outro lado, na RB867515 o declínio neste
parâmetro ocorreu já a partir do segundo dia de seca. Após a reidratação, a variedade
RB855536, recuperou a eficiência fotoquímica no mesmo patamar do controle, decaindo logo
em seguida, com o aumento do estresse. Já a RB867515, apresentou recuperação do ΦPSII até
o oitavo dia de déficit hídrico. Este resultado indica que a variedade RB867515 possua maior
40
capacidade de recuperação do ΦPSII que a RB855536 após sofrer estresse hídrico. Segundo
Lemos-Filho (2000), as plantas frequentemente apresentam um marcante efeito fotoinibitório
sob estresse hídrico severo, caracterizado por um decréscimo no rendimento quântico efetivo,
isto em combinação com altos níveis de irradiância, pode causar uma significativa redução na
eficiência fotossintética. Este mesmo autor observou em espécies do cerrado (Annona
crassifolia, Eugenia dysenterica e Campomanesia adamantium), diminuição do rendimento
quântico efetivo do PSII durante a estação seca. Já Liberato et al. (2006) relataram queda na
Fv/Fm e ΦPSII em acariquara sob estresse hídrico. Constataram ainda que a Fv/Fm foi
restabelecida quatro dias após a reidratação no entanto o ΦPSII só atingiu valores semelhantes
às plantas controle no sexto dia após a reidratação.
4.4 Avaliação de carboidratos
A variedade RB867515 teve 17% mais amido nas folhas do que a variedade
RB855536 em condições normais de cultivo (Figura 7 A e B). Quando sob estresse hídrico a
variedade RB867515 apresentou uma grande alteração na composição do amido no início do
estresse, que foi menos intenso na RB855536.
Paralelo à diminuição nos teores de sacarose e aumento de hexoses nas duas
variedades, constatam-se menores teores de amido no quarto e sexto dia de seca na
RB855536. Já a variedade RB867515, apresentou menores quantidades de amido aos dois e
quatro dias de estresse. Diminuições nos níveis de amido e sacarose em condições de estresse
também foram observadas em soja (HUBER et al. 1984), assim como aumento de sacarose e
amido após a reidratação. Este mesmo autor relata que durante a seca também houve aumento
nos teores de glicose e frutose.
Já o teor de sacarose foi 32% maior na variedade RB855536 nas plantas em condições
normais de cultivo (Figura 7 C e D). Em condições de estresse, a concentração de sacarose
nas folhas diminuiu drasticamente nas duas variedades, com tendência de recuperação do
conteúdo original quando colocado sob reidratação.
Uma diminuição da concentração de sacarose foi observada nas duas variedades a
partir do segundo dia de estresse hídrico (figuras 7 C e D). A RB867515 apresentou
decréscimo mais expressivo em torno de 42% a partir do quarto dia de seca (tabela 3). O
controle apresentou os maiores níveis de sacarose nas duas variedades, seguido da reidratação
e do estresse, que revelou os menores valores. Neste caso, sugere-se a ação da enzima
invertase como fator chave na redução do teor de sacarose, e sua atividade tem sido muito
41
relatada em condição de estresse por vários pesquisadores (CHAVES, 1991; GOLDCHMIDT
& HUBER, 1992; CATRILLO, 1992; LAWLOR & CORNIC, 2002). A invertase ácida
solúvel (SAI) é composta pelo somatório das invertases do espaço externo (parede celular e
vacúolo), quebrando a sacarose em hexoses, e assim, disponibilizando às células, carbono e
energia para o processo de respiração e outras atividades metabólicas (LEITE et al. 2009).
As mudanças na atividade da enzima invertase induzidas pelo estresse hídrico geram
modificações na relação invertase/hexoses e por conseguinte, conseqüências no conteúdo de
carboidratos foliar, deste modo, o teor de sacarose da folha resulta do equilíbrio entre síntese,
degradação e exportação, e a interpretação de sua variação ainda é complexa (PELLESCHI et
al. 1997). Estes autores constataram uma modificação no metabolismo de carboidratos de
folhas de milho sob estresse hídrico, o que levaram a um aumento do conteúdo de hexoses
(glicose + frutose) dessas plantas associado a um estímulo na atividade da invertase e inibição
da atividade da sintase sacarose fosfato (SPS). O mesmo pode ter ocorrido com as duas
variedades de cana estudadas nesse experimento.
Em contraste à diminuição nos teores de sacarose, observou-se um aumento
significativo dos teores de glicose e frutose nas duas variedades em razão do estresse hídrico,
(figura 7 E, F, G e H). Fato que pode ser uma estratégia de adaptação das plantas às condições
hídricas desfavoráveis ao crescimento, buscando realizar a osmorregulação, e assim forçar a
absorção de água, diminuindo o efeito limitante da seca. Quando a regulação é insuficiente e o
metabolismo não se ajusta para manter as funções metabólicas da célula, os danos
eventualmente, resultam em morte celular (LAWLOR & CORNIC, 2002).
O teor de glicose nas folhas aumentou significativamente nas duas variedades quando
as plantas foram colocadas sob estresse (Figura 7 E e F), atingindo 39,52 mmol kg-1 na
variedade RB855536 e 32,94 mmol kg-1 MS na variedade RB867515 aos seis dias de estresse.
Somente as plantas submetidas até quatro dias de estresse permaneceram com níveis de
glicose mais elevados em relação ao controle quando reidratadas.
Aos quatro e seis dias de seca, os níveis de glicose da RB855536 subiram 222 e 134%,
enquanto que na RB867515 o aumento foi de 216 e 367%, respectivamente (figura 7 B). Após
a reidratação, observou-se na variedade RB855536 um acréscimo nos níveis de glicose com
oito dias de seca emcomparação ao controle, enquanto que a RB867515 apresentou redução
nos valores de glicose a níveis muito baixos a partir do sexto dia de restrição hídrica.
Clifford et al. (1998) mencionaram um incremento significativo de hexoses em
Ziziphus mauritiana após 13 dias de seca, sugerindo que esta alteração na partição de solutos
é um importante fator na tolerância a seca.
42
B
RB855536
2,5
2,5
2,0
2,0
aA
1,5
abA aAB
bB
abAB
bA
1,0
aA
bA
aA
bB
abA
bB
0,5
0,0
2
4
6
Amido g Kg-1 MS
Amido g Kg-1 MS
A
RB867515
aA
bAB
aAB
1,5
abB
1,0
cB
2
4
bA bB
D
aA
aA
bB
cB
bBC
bC
2
4
6
bC
140
120
100
80
60
40
20
0
aA aA
aA
aA
4
F
aB
aB
bA
bB
bA
cB
cC
10
Teor de glicose
mmol Kg-1 MS
Teor de glicose
mmol Kg-1 MS
aC
0
6
8
RB867515
40
30
20
aB
aA
aA
aA
bA
bB
cA
aC
bA
bB
10
cC
cC
0
2
4
6
8
2
4
Tempo (dias)
H
RB855536
60
50
aA
40
aB
aB
bA
30
aC
bA
20
bB
bB
cAB
bAB
bB
bB
10
0
2
4
6
8
Tempo (dias)
6
8
Tempo (dias)
Teor de frutose
mmol Kg-1 MS
G
Teor de frutose
mmol Kg-1 MS
cB
50
bA
20 aAB
bB
bC
Tempo (dias)
aAB
30
aB
cC
2
aA
40
aA
bA
cB
8
RB855536
50
8
RB867515
Tempo (dias)
E
6
Tempo (dias)
Teor de sacarose
mmol Kg-1 MS
Teor de sacarose
mmol Kg-1 MS
aA
aA
aAB aB
0,0
8
RB855536
aA
140
120
100
80
60
40
20
0
aA
bB
0,5
Tempo (dias)
C
aAB
aAB aA
60
50
40
30
20
10
0
RB867515
Estresse hídrico
Reidratação
aA
aB
Controle
aC
bA
cAB
bA
cA
bAB
cB
2
4
6
aB aD aB
8
Tempo (dias)
Figura 7 Teores de amido (A e B), sacarose (C e D), glicose (E e F), e frutose (G e H) das variedades de
cana-de-açúcar RB855536 (A, C, E e G) e RB867515 (B, D, F e H) submetidas a estresse hídrico e
reidratação, cultivadas em casa de vegetação aos 121 dias após o plantio. Médias seguidas de letras iguais,
tanto para condição hídrica dentro de um mesmo tempo (letras minúsculas), quanto para tempos na mesma
condição hídrica (letras maiúsculas), não diferem estatisticamente entre si P < 0,05 pelo teste de Tukey.
43
Os teores de frutose das duas variedades (figura 7 G e H), apresentaram respostas
semelhantes às reveladas pela glicose sob déficit hídrico. Nota-se aumento nos níveis de
frutose de 227 e 102% na variedade RB855536 com quatro e seis dias de limitação hídrica,
enquanto que na RB867515 nas mesmas condições, quantificou-se incremento de 239 e 190%
no segundo e quarto dia respectivamente. Níveis inferiores deste açúcar foram observados aos
oito dias de seca nas duas variedades. Em geral, os teores de frutose em condição de déficit
hídrico revelaram valores superiores quando comparados com o controle e a reidratação.
Tabela 2 Glicose, frutose, sacarose e amido das variedades de cana-de-açúcar RB855536 e
RB867515, submetidas a estresse hídrico e reidratação, cultivadas em casa de vegetação aos
121 dias após o plantio. Médias de variedades, estado hídrico e tempo com letras iguais em colunas no
mesmo atributo não diferem significativamente entre si P < 0,05 pelo teste de Tukey.
Fator
Variedades
RB855536
RB867515
Estado hídrico
Controle
Estresse
Reidratado
Tempo de estresse (dias)
2 (dois)
4 (quatro)
6 (seis)
8 (oito)
Glicose
22,06 a
15,68 b
Médias dos Fatores (mmol kg-1 MS)
Frutose
Sacarose
Amido
19,41 a
86,51 a
21,39 b
19,80 a
58,28 b
24,66 a
12,95 c
28,32 a
15,34 b
11,78 c
31,47 a
15,56 b
97,81 a
50,43 c
68,94 b
23,49 b
18,77 c
26,82 a
18,49 b
22,69 a
18,22 b
16,07 c
21,57 b
27,95 a
18,05 c
10,84 d
95,21 a
78,91 b
62,33 c
53,13 d
25,56 a
20,59 c
22,44 bc
23,51 ab
Após a reidratação, os teores de frutose decaíram nas duas variedades a partir do sexto
dia de estresse hídrico. Esse resultado também foi observado na glicose, sugerindo que o
estresse hídrico tenha afetado a atividade de enzimas responsáveis pela síntese e degradação
de carboidratos, provavelmente sacarose sintase e invertase.
Keller & Ludlow (1993) também observaram reduções nos teores de amido e sacarose
em folhas de guandu sob estresse hídrico, como também elevações nos níveis de glicose e
frutose, além de aumentos na atividade de enzimas responsáveis pela quebra de amido
(amilase) e sacarose (invertase).
Liu et al. (2004) pesquisando o efeito da seca na distribuição de carboidratos em
folhas de soja, relataram diminuição de sacarose e amido, e incrementos nas concentrações de
glicose e frutose foliar, como consequência da redução da fotossíntese e ψw, contudo sem
alterações na atividade da invertase solúvel.
44
Pelleschi et al. (1997) observaram um incremento nos teores de glicose e frutose em
folhas de milho após três dias de estresse hídrico, onde também foi observado um aumento no
teor de sacarose porém em menor grau, e sem correlação com a atividade da invertase ácida e
SPS.
Estas alterações na composição relativa de carboidratos, indicam que a elevação nos
níveis de glicose e frutose se deram às custas de sacarose e amido, porém, para tal
comprovação, seria necessário um estudo mais aprofundado a respeito da atividade de
enzimas responsáveis pela síntese e degradação desses açúcares.
4.5 Atividade de enzimas antioxidantes
As duas variedades de cana tiveram aumento da atividade de enzimas antioxidantes
quando submetidas ao estresse hídrico (figura 8). A RB855536, apresentou um aumento de
61% na atividade da CAT com oito dias de déficit hídrico em comparação com controle, o
qual se manteve constante (figura 8 A). Espécies reativas de oxigênio produzidas sob altas
temperaturas, provocam estresse oxidativo produzido pelo calor, ativando respostas celulares,
como alta regulação antioxidativa (ALMESELMANI et al. 2006).
Já na RB867515 (figura 8 B), constataram-se elevações de 76% na atividade da CAT
com oito dias de déficit hídrico em relação ao controle. Nos demais estados hídricos avaliados
(controle e reidratação), a atividade foi estável não diferindo em nenhuma destas condições
nos períodos analisados.
Analisando a atividade da CAT nas duas variedades, sugere-se que a RB867515
possua melhor mecanismo de ativação dessa enzima em condições de déficit hídrico, visto
que a atividade da CAT apresentou valores mais elevados nessa variedade (tabela 4), o que
provavelmente poderá implicar em maior tolerância da RB867515 a seca, em contraste a
RB855536. A aparente tolerância de um genótipo ao estresse hídrico, que reflete sua
peroxidação lipídica comparativamente com índices inferiores e superiores de estabilidade da
membrana, conteúdos de clorofila e carotenóides, estão intimamente associadas com as
propriedades do sistema de enzimas antioxidantes (ARORA et al. 2002).
45
RB855536
0,14
0,12
0,10
0,08
0,06
0,04
0,02
0,00
aA
aB
aB
aAB
aA
aA
aA
bA
2
RB867515
B
4
aB
aAB
bA
6
bB
u CAT min-1 mg-1 proteína
u CAT min-1 mg-1 proteína
A
0,14
0,12
0,10
0,08
0,06
0,04
0,02
0,00
aA
aA
abA
bA
8
2
4
D
RB855536
1,2
1,0
0,8
aA
0,6
bA
aA
bA
aA
aA
aA
aA
aA
aA
abA
bA
0,4
0,2
0,0
2
4
6
1,2
aB
0,8
bAB
0,6
0,4
bC
bA
bC
2
cA
0
2
4
6
8
u de SOD mg-1 proteína
u de SOD mg-1 proteína
aB
bBC
bA
bB
cBC
cC
0,0
2
aA
cA
bAB
bA
0,2
4
F
bB
4
aAB
aA
6
8
Tempo (dias)
8
6
8
cAB
8
aA
aB
bA
Controle
Estresse hídrico
Reidratação
aA
aA
1,0
RB855536
10
bA
6
RB867515
Tempo (dias)
E
abA
Tempo (dias)
u APX min-1 mg-1 proteína
u APX min-1 mg-1 proteína
C
aA bA
aA
Tempo (dias)
aA
aA
RB867515
10
aA
8
bA
4
2
aB
aB
aAB
6
bA
bA
bB
bB bA
cA
cA
0
2
4
6
8
Tempo (dias)
Tempo (dias)
Figura 8 Atividade de enzimas antioxidantes: catalase (A e B), ascorbato peroxidase (C e D) e
superóxido dismutase (E e F) das variedades de cana-de-açúcar RB855536 (A, C e E) e RB867515 (B, D
e F) submetidas a estresse hídrico e reidratação, cultivadas em casa de vegetação aos 121 dias após o
plantio. Médias seguidas de letras iguais, tanto para condição hídrica dentro de um mesmo tempo (letras
minúsculas), quanto para tempos na mesma condição hídrica (letras maiúsculas), não diferem
estatisticamente entre si P < 0,05 pelo teste de Tukey.
As duas variedades apresentaram incrementos na atividade da ascorbato peroxidase
(APX) sob deficiência hídrica em relação ao controle (figura 8 C e D). Na RB855536 houve
atividade superior desta enzima de 37 e 54% em relação ao controle com dois e oito dias de
46
restrição hídrica respectivamente, não demonstrando diferenças significativas nos demais
períodos quando comparados estresse hídrico, controle e reidratação.
A variedade RB867515 mostrou diferenças significativas na atividade da APX em
todos os tempos sob estresse hídrico em comparação ao controle (figura 8 D). Os tratamentos
estressados tiveram maior atividade quanto às demais condições hídricas, exceto aos quatro
dias de seca onde apresentaram atividade semelhante ao tratamento reidratado. Foi observado
ainda, que sob estresse, não houve acréscimo na atividade da APX com o aumento do período
de exposição à seca. Após a reidratação a atividade da APX foi superior a apresentada pelo
controle em todos os tempos estudados. O estresse hídrico somado com a temperatura elevada
provavelmente contribuiu com esse resultado.
Tabela 3 Enzimas antioxidantes: catalase (CAT), ascorbato peroxidase (APX) e superóxido
dismutase (SOD) das variedades de cana-de-açúcar RB855536 e RB867515, submetidas a
estresse hídrico e reidratação, cultivadas em casa de vegetação aos 121 dias após o plantio.
Médias de variedades, estado hídrico e tempo com letras iguais em colunas no mesmo atributo não diferem
significativamente entre si P < 0,05 pelo teste de Tukey.
Fator
Variedades
RB855536
RB867515
Estado hídrico
Controle
Estresse
Reidratado
Tempo de estresse (dias)
2 (dois)
4 (quatro)
6 (seis)
8 (oito)
Médias dos Fatores (u min-1 mg-1 proteína)
SOD
CAT
APX
3,81 a
0,075 b
0,51 b
4,20 a
0,084 a
0,61 a
2,18 c
6,28 a
3,56 b
0,070 b
0,097 a
0,072 b
0,39 c
0,75 a
0,54 b
4,01 a
4,24 a
3,33 b
4,44 a
0,080 a
0,082 a
0,079 a
0,078 a
0,56 a
0,56 a
0,57 a
0,55 a
Vasconcelos et al. (2009) verificaram elevações bem superiores na atividade da APX
em relação às constatadas pelo presente estudo, (25,3 e 28,5 u mg-1 Proteína) em milho e soja
respectivamente aos 42 dias sob seca. Silva (2010), comparando três variedades com três
clones de cana-de-açúcar cultivadas em casa de vegetação, relatou um leve aumento na
atividade da APX sob estresse hídrico severo, ao passo que também observou incrementos na
atividade da SOD e CAT sob deficiência hídrica.
Sofo et al. (2005), também mencionaram maior atividade da CAT, SOD e APX em
folhas de oliveiras sob déficit hídrico severo, indicando que a regulação do sistema
47
antioxidante pode ser uma importante ferramenta de tolerância a seca, ajudando a diminuir o
dano celular causado por espécies reativas de oxigênio.
A atividade da SOD apresentou aumento em resposta ao estresse hídrico nas duas
variedades (figura 8 E e F). Verificou-se na RB855536 maior atividade da SOD do início da
suspensão hídrica até o sexto dia, com maior nível de atividade no quarto dia, diferindo
significativamente do controle e da reidratação. A partir deste ponto a atividade da SOD
apresentou queda. Após a reidratação a atividade da SOD manteve-se estável até o sexto dia
de déficit hídrico, não apresentando diferença significativa com o decorrer do tempo de
estresse. Nestas condições, diferiu do controle com dois e oito dias de estresse, revelando,
neste último, maior atividade entre os tratamentos reidratados. Provavelmente após este
período de seca, mesmo reidratada, a planta começa a apresentar distúrbios semelhantes aos
tratamentos sob estresse, visto que a resposta da atividade enzimática após a reidratação já
não difere da observada nos tratamentos estressados.
Por outro lado, diferentemente da variedade RB855536, a RB867515 mostrou nos
tratamentos estressados, um incremento na atividade da SOD com o aumento do período de
exposição à seca, diferindo significativamente do controle em todos os tempos avaliados.
Após a reidratação não se observou diferenças significativas entre os tratamentos reidratados,
contudo aos dois e oito dias de déficit hídrico a reidratação apresentou maior atividade da
SOD em relação ao controle.
Zhang & Kirkham (1994), mencionaram a elevação na atividade da SOD em
genótipos de trigo no início da exposição à seca, no entanto observaram uma queda na
atividade desta enzima com o aumento do período de estresse. Um comportamento
semelhante foi mostrado pela variedade RB855536 no presente trabalho.
Sairam et al. (1998) comparando genótipos de trigo sensíveis e tolerantes à seca, observaram
maior atividade da CAT e APX no genótipo tolerante em relação ao suscetível, enquanto que
a atividade da SOD não mostrou diferença significativa entre tratamentos bem irrigados em
relação aos estressados. Sairam & Srivastava (2001), em outro estudo também comparando a
tolerância de genótipos de trigo ao estresse hídrico, relataram aumento na atividade da SOD
sob estresse hídrico, no entanto sem demonstrar diferenças entre genótipos.
Chugh et al. (2011) notaram aumento na atividade da APX de genótipos de milho
tolerantes em resposta à seca, e declínio nos genótipos sensíveis, ao mesmo tempo,
observaram atividade da SOD ligeiramente superior em genótipos tolerantes sob estresse
hídrico, enquanto que os genótipos sensíveis mostraram uma inibição significativa na
atividade desta enzima.
48
Propõe-se que a variedade RB867515 possua melhores mecanismos antioxidantes em
relação a RB855536, visto que a RB867515 apresentou maior atividade em todas as enzimas
antioxidantes analisadas, o que pode se configurar em maior tolerância desta variedade ao
estresse hídrico. Allen (1995) menciona que a atividade de uma ou mais destas enzimas é
geralmente maior em plantas expostas a condições de estresse e a elevação da atividade
correlaciona-se com maior tolerância ao estresse.
49
5 CONCLUSÕES
Ambas as variedades apresentaram uma diminuição nos níveis de amido e sacarose, e
incremento de glicose e frutose com o aumento da seca, não sendo um bom indicador para
discernir variedades quanto à sensibilidade à seca.
A variedade RB867515, considerada mais resistente à seca, apresentou maior atividade da
CAT e APX, além de atividade crescente da SOD com aumento do tempo de seca em relação
à variedade RB855536, considerada mais sensível à seca. Isso talvez tenha possibilitado uma
menor redução do Fv/Fm e ΦPSII ao meio dia da variedade RB867515. Esses mecanismos
podem estar associados à maior resistência dessa variedade a seca em relação a RB855536,
sugerindo a sua utilização como marcador fisiológico para a resistência à seca.
50
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58
APÊNDICES
4 ,0
3 ,5
D P V (K P a)
3 ,0
2 ,5
2 ,0
1 ,5
1 ,0
0 ,5
0 ,0
0
20
40
60
80
100
120
D ia s
Apêndice A Dados diários de déficit de pressão de vapor (DPV) registradas dentro da casa de
vegetação durante o período experimental.
59
U m idade gravim étrica (% )
16
14
12
10
8
6
4
2
0
10
12
14
16
18
P o te n c ia l (a tm )
Apêndice B Curva característica de retenção de água no solo, utilizado no cultivo das
variedades RB855536 e RB867515.
Apêndice C Análise de variância (valores de F) para máximo rendimento quântico do
PSII (Fv/Fm) - 4h e 11h e rendimento quântico efetivo do PSII (ΦPSII) das variedades de
cana-de-açúcar RB855536 e RB867515, submetidas a estresse hídrico e reidratação,
cultivadas em casa de vegetação aos 121 dias após o plantio. * P < 0.05; ** P < 0.01.
Fator de Variação
Variáveis Fisiológicas
FvFm 4h
FvFm 11h
ΦPSII
1,57ns
0,00*
5,27*
Variedades (V)
Estado hídrico (Eh)
Tempo em dias (T)
21,90**
15,60**
47,37**
11,86**
59,91**
15,61**
V x Eh
0,63ns
0,15ns
5,18**
VxT
2,05ns
4,34**
2,49ns
Eh x T
V x Eh x T
4,29**
1,18ns
5,79**
1,69ns
5,31**
2,78*
CV (%)
9,56
9,21
17,14
60
Apêndice D Análise de variância (valores de F) para teores de glicose, frutose, sacarose
e amido das variedades de cana-de-açúcar RB855536 e RB867515, submetidas a
estresse hídrico e reidratação, cultivadas em casa de vegetação aos 121 dias após o
plantio. * P < 0.05; ** P < 0.01.
Fator de Variação
Açúcares Solúveis
GLI
FRU
SAC
AMIDO
138,33**
0,42ns
227,37**
17,33**
Variedades (V)
Estado hídrico (Eh)
Tempo em dias (T)
309,93**
26,02**
403,28**
140,95**
216,82**
98,39**
35,41**
6,99**
V x Eh
3,11ns
7,92**
20,86**
30,01**
VxT
48,98**
20,27**
12,47**
4,94**
Eh x T
V x Eh x T
54,98**
9,96**
33,03**
7,99**
16,55**
14,17**
7,95**
8,13**
CV (%)
14,07
15,01
12,67
16,70
Apêndice E Análise de variância (valores de F) para enzimas antioxidantes catalase
(CAT), ascorbato peroxidase (APX) e superóxido dismutase (SOD) das variedades de
cana-de-açúcar RB855536 e RB867515, submetidas a estresse hídrico e reidratação,
cultivadas em casa de vegetação aos 121 dias após o plantio. * P < 0.05; ** P < 0.01.
Fator de Variação
Enzimas Antioxidantes
SOD
CAT
APX
3,87ns
9,54**
25,90**
Variedades (V)
Estado hídrico (Eh)
Tempo em dias (T)
147,93**
5,99**
36,23**
0,34ns
107,99**
0,23ns
V x Eh
11,32**
0,94ns
39,89**
VxT
6,64**
0,86ns
1,53ns
Eh x T
V x Eh x T
7,23**
11,62**
5,16**
0,51ns
5,82**
2,55*
CV (%)
24,17
17,63
17,30
Apêndice F Análise química do solo, utilizado como substrato para o cultivo das variedades
de cana-de-açúcar RB855536 e RB867515, submetidas ao estresse hídrico e reidratação.
Resultado de análise de solo
3
pH
g./dm
mg/dm3
mmolc/dm3 TFSA
%
Relações
CaCl2
Água
SMP
MO
P
K
Ca
Mg
H + Al
SB
CTC
V%
Ca/Mg
Mg/K
4,5
5,7
5,8
27
17
1,3
11
5
52
17,3
69,3
24,9
2,2
3,84