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                    UNIVERSIDADE FEDERAL DE ALAGOAS
CENTRO DE ENGENHARIA E CIÊNCIAS AGRÁRIAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL

IVANA FERRO CARMO

HERPESVÍRUS BOVINO TIPO I – EFEITO SOBRE A QUALIDADE
ESPERMÁTICA E ESTRATÉGIAS PARA SUA REDUÇÃO EM SÊMEN
EXPERIMENTALMENTE INFECTADO

Maceió/2025

IVANA FERRO CARMO

HERPESVÍRUS BOVINO TIPO I – EFEITO SOBRE A QUALIDADE
ESPERMÁTICA E ESTRATÉGIAS PARA SUA REDUÇÃO EM SÊMEN
EXPERIMENTALMENTE INFECTADO

Dissertação de mestrado apresentada ao
Programa de Pós-Graduação em Ciência
Animal,

da

Universidade

Federal

de

Alagoas, como requisito parcial para
obtenção do título de mestre em Ciência
Animal.

Orientador:

Prof.

Dr.

Diogo

Ribeiro

Câmara
Coorientador: Prof. Dr. Abelardo Silva
Júnior

Maceió/2025

Catalogação na fonte Universidade Federal de Alagoas Biblioteca Polo Viçosa
Bibliotecário Responsável: Stefano João dos santos

C287h

Carmo, Ivana Ferro.
Herpesvírus Bovino tipo I – efeito sobre a qualidade
espermática e estratégias para sua redução em sêmen
experimentalmente infectado / Ivana Ferro Carmo - 2025.
52f. ; il.
Dissertação (Mestrado em Ciência Animal) - Universidade
Federal de Alagoas, Campus Ceca, Polo Viçosa, 2025.
Orientação: Prof. Dr Diogo Ribeiro Câmara
Coorientador: Prof. Dr. Abelardo Silva j
Inclui bibliografia.
1. Ruminantes. 2. Herpesvírus Bovino . I.
CDU: 636.1

FOLHA DE APROVAÇÃO

IVANA FERRO CARMO

HERPESVÍRUS BOVINO TIPO I – EFEITO SOBRE A QUALIDADE
ESPERMÁTICA E ESTRATÉGIAS PARA SUA REDUÇÃO EM SÊMEN
EXPERIMENTALMENTE INFECTADO

Dissertação de mestrado apresentada ao
Programa de Pós-Graduação em Ciência
Animal - PPGCA, da Universidade Federal
de Alagoas, e aprovada em 27/08/2025.

Orientador: Prof. Dr. Diogo Ribeiro Câmara
(Universidade Federal de Alagoas)
Banca Examinadora

Examinador Interno: Prof. Dr. Abelardo Silva Júnior
(Universidade Federal de Alagoas)

Examinador Externo: Prof. Dr. Rafael Augusto Satrapa
(Universidade Federal de Acre)

DEDICATÓRIA

A todos que seguraram minha
mão quando a estrada apertou,
que enxugaram minhas lágrimas
no silêncio das madrugadas,
e celebraram comigo até as
pequenas vitórias.
Esta página é para vocês, que
moram nas entrelinhas da minha
jornada.

AGRADECIMENTOS
A Deus por guiar meus passos e ouvir a minha mais silenciosa e sincera
oração.
Aos meus pais, José Ivan e Maria Aparecida, e a minha irmã, Isabelly Ferro,
que estiveram presentes em todas as etapas, dedico cada linha escrita com fé e
esforço.
Ao meu noivo, Ryan Leonídio, meu companheiro de dias bons e ruins, por ouvir
minhas angústias sem julgamento, me incentivar a ir além e comemorar comigo cada
passo, por menor que fosse. Sua presença foi abrigo.
Agradeço à Universidade Federal de Alagoas e ao Programa de PósGraduação em Ciência Animal, por tornarem esse sonho possível.
À CAPES e a FAPEAL, pelo apoio financeiro que tornou este trabalho viável
em meio a tantas incertezas.
Ao meu orientador, Prof. Dr. Diogo Ribeiro Câmara, minha profunda gratidão.
Sua paciência, escuta e firmeza me ensinaram muito mais do que teoria e método,
me ensinaram a acreditar na minha própria trajetória.
A todos os professores que cruzaram o meu caminho, em especial ao Prof. Dr.
Abelardo Silva Júnior, por abraçar a nossa ideia e abrir as portas do LAPEVI para a
execução do nosso trabalho.
Aos colegas de pesquisa principalmente os do LARAL e LAPEVI, em especial
a Emelly Calheiros, que foi meu braço direito no processamento das amostras e nas
angústias dos prazos e ao Lucas Matos, por estar comigo no laboratório e nas
preocupações com o passo a passo da pesquisa. Nos dias de exaustão, foram vocês
que me lembraram que ninguém atravessa uma travessia dessas sozinho.
A toda equipe da Nordeste in Vitro, em nome de Lucas Carvalho e da minha
amiga pessoal, Andressa Moreira, por me incentivarem desde a inscrição na seleção
do mestrado. Vocês me abriram as portas de uma longa jornada.
Aos que me esperaram com paciência, aos que acreditaram em silêncio, aos
que estenderam a mão sem que eu precisasse pedir, meu muito obrigado.
E, por fim, a mim mesma. Por ter seguido mesmo quando tudo parecia pesado
demais. Por não ter desistido. Por ter acreditado — nem que fosse um pouquinho —
que eu conseguiria.

RESUMO
As biotecnologias reprodutivas bovinas utilizadas no Brasil colocam o país em
destaque mundial. Todavia, aspectos sanitários podem ser melhorados, como por
exemplo o alto percentual de animais soropositivos para o Herpesvírus bovino tipo 1
(BoHV-1), um vírus capaz de reduzir índices reprodutivos tanto in vivo quanto in vitro,
considerando que touros de alto valor genético podem estar contribuindo para a
disseminação do BoHV-1. Neste trabalho, foi feita uma breve revisão a respeito do
BoHV-1, sua distribuição no Brasil, e técnicas para remoção de vírus em amostras
biológicas. Experimentalmente, foi avaliado o efeito do BoHV-1 sobre o
espermatozoide bovino descongelado, bem como a eficácia do gradiente de Percoll
(GP) e nanopartículas magnéticas associadas a anticorpos anti- BoHV-1 (MNP) para
a redução da carga viral de sêmen experimentalmente infectado. No Experimento I,
diferentes concentrações de BoHV-1 (104 a 108 TCID50/mL) foram incubadas com
sêmen descongelado de touros (n = 3) negativos para BoHV-1. Foram observados
efeitos do touro e tempo de incubação sobre a cinética espermática (P < 0,01) e do
tempo de incubação sobre a morfologia e integridade de membrana dos
espermatozoides (P < 0,01), sem efeito do vírus. No Experimento II, o sêmen
descongelado dos mesmos touros foi artificialmente infectado com BoHV-1 (104
TCID50/mL), mantido sem tratamento por até uma hora (controle positivo), ou tratado
com: 1) GP; 2) incubação das MNPs por 15, 30 e 60 min; 3) Associação de MNP e
GP. Utilizou-se como controle negativo amostra de sêmen não infectada. A carga
viral em todas as amostras foi determinada por titulação. Quando avaliada a
motilidade espermática, enquanto o GP elevou os valores (P < 0,05), não houve
influência das MNPs após incubação por 60 min, enquanto tanto as MNPs quanto
GP reduziram a concentração espermática em aproximadamente 20 e 50%,
respectivamente, quando comparado às amostras controle positivo (P < 0,05).
Observou-se que o uso do GP e MNP, após 60 min de incubação, resultou em
titulação negativa das amostras. Conclui-se que o BoHV-1 não exerceu efeito direto
sobre a qualidade espermática e que o GP foi eficaz em reduzir a carga viral. Caso
a concentração espermática pós-tratamento seja um parâmetro importante, a
incubação por 60 min com MNP é uma alternativa para redução viral, sem aparente
toxicidade sobre os espermatozoides.
Palavras-chave: Carga viral, reprodução bovina, Rinotraqueíte Infeciosa Bovina,
Nanopartículas.

ABSTRACT
Reproductive biotechnologies used in Brazilian cattle farming have positioned the
country as a global leader. However, herd health still presents concerning issues, for
instance, the high percentage of cattle seropositive for Bovine Herpesvirus Type 1
(BoHV-1), a virus capable of reducing both in vivo and in vitro reproductive
performance, considering that high-genetic-value bulls may be contributing to the
spread of BoHV-1. This study provides a brief review of BoHV-1, its distribution in
Brazil, and techniques for viral removal from biological samples. Experimentally, the
effects of BoHV-1 on thawed bovine sperm and the efficacy of Percoll gradient (PG)
and antibody anti-BoHV-1 conjugated with magnetic nanoparticles (MNP) for reducing
viral load in experimentally infected semen were assessed. In Experiment I, different
viral concentrations of BoHV-1 (10⁴ to 10⁸ TCID50/mL) were incubated with thawed
semen samples from BoHV-1-negative bulls (n = 3). Effects of bull and incubation time
were observed on sperm kinematics (P < 0.01), whereas incubation time affected
sperm morphology and membrane integrity (P < 0.01), with no viral effect detected. In
Experiment II, thawed semen from the same bulls were artificially infected with BoHV1 (10⁴ TCID50/mL) and either left untreated for up to one hour (positive control) or
treated with: 1) PG; 2) Samples incubated with MNPs for 15, 30, and 60 min; or 3) a
combination of MNP and PG. Uninfected semen served as the negative control. Viral
load was determined in all samples by titration. Sperm motility was higher after PG (P
< 0.05), with no effect of MNP treatment, whereas MNPs and PG reduced sperm
concentration by approximately 20% and 50%, respectively (P < 0.05), compared to
untreated samples. Both PG and MNP, with an incubation of 60 min, resulted in
negative titration. In conclusion, BoHV-1 had no direct impairment on sperm quality,
and PG eliminated viral titers. Furthermore, if sperm concentration post-treatment is a
critical parameter, incubation with MNP during 60 min provides an alternative for viral
reduction, without apparent sperm toxicity.
Keywords: Viral load, bovine reproduction, Infectious Bovine Rhinotracheitis,
Nanoparticles.

LISTA DE FIGURAS
Figura 1

Prevalência de animais sororreagentes para Herpesvírus
Bovino tipo I, obtidos por estudos realizados em diferentes
estados brasileiros. ........................................................................ 17

Fig 1

Effect of Percoll gradient and incubation with magnetic
nanoparticles associated with anti-BoHV-1 antibodies
(MNPs) for 60 minutes on motility (A) and sperm
concentration (B) in thawed bovine semen samples
artificially infected with Bovine Herpesvirus 1 (10⁴
TCID₅₀/mL). ..................................................................................... 40

Figura 1 Eletroforese em gel de agarose evidenciando os produtos
de PCR amplificados. LD: ladder, S: samples, PC: controle
positivo, NC: controle negativo ...................................................... 49

LISTA DE TABELAS
Table 1 Titration for Bovine Herpesvirus 1 in thawed bovine semen
samples artificially infected (10⁴ TCID₅₀/mL), treated with
Percoll gradient (PG) or magnetic nanoparticles associated
with anti-BoHV-1 antibodies (MNPs) for different periods….

41

Tabela 1. Sequência de oligonucleotídeos utilizados para a detecção
de herpesvírus por nested PCR.................................................... 48
Tabela 2. Avaliação dos efeitos touro, tempo e concentração viral
sobre parâmetros cinemáticos de espermatozoides
bovinos descongelados, infectados experimentalmente .......... 50
Tabela 3. Resultados da análise estatística dos efeitos touro, tempo
e vírus sobre os parâmetros cinemáticos de
espermatozoides bovinos descongelados, infectados
experimentalmente .......................................................................... 50
Tabela 4. Titulação após infecção experimental com Herpesvírus
bovino tipo-1 (104 TCID50/mL) em amostras de sêmen
bovino descongeladas e não tratadas (CP), tratadas com
gradiente de Percoll (GP), tratadas com nanopartículas
magnéticas associadas a anticorpos anti-BoHV-1 (MNP),
ou tratadas com associação das técnicas (MNP+GP). .............. 51

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
BoHV-1

Herpesvírus Bovino tipo 1

CCPS

Centros de Coleta e Processamento de Sêmen

DNA

Ácido desoxiribonucleico

GP

Gradiente de Percoll

HCV

Vírus da hepatite C

IA

Inseminação Artificial

IBGE

Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística

IBR

Rinotraqueíte infecciosa bovina

IETS

Sociedade Internacional de Tecnologia de Embriões

MNP

Nanopartículas magnéticas associadas a anticorpos anti-BoHV-1

OIE

Organização Mundial de Saúde Animal

PCR

Reação em Cadeia da Polimerase

PIVE

Produção in vitro de embriões

SOV

Superovulação

TE

Transferência de embrião

TNRS

Taxa de não retorno ao serviço

SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO .................................................................................................................. 13
2. REVISÃO DE LITERATURA .......................................................................................... 15
2.1. Herpesvírus Bovino tipo 1 ........................................................................................ 15
2.2. Biotecnologias reprodutivas e o impacto do Herpesvírus Bovino tipo 1.... 18
2.3. Resistência do vírus no sêmen bovino ................................................................. 20
2.4. Nanopartículas magnéticas – seu uso na identificação e isolamento de
material biológico ............................................................................................................... 20
3. CONSIDERAÇÕES FINAIS ........................................................................................... 22
4. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................................. 24
5. APÊNDICE I ...................................................................................................................... 35
6. APÊNDICE II ..................................................................................................................... 47
7. ANEXO – COMPROVANTE DE SUBMISSÃO DO ARTIGO ................................... 52

13

1. INTRODUÇÃO
De acordo com a última pesquisa divulgada pelo Instituto Brasileiro de Geografia
e Estatística, em 2023 o rebanho bovino brasileiro apresentava 238,6 milhões de
cabeças (IBGE, 2023), gerando emprego e renda para milhares de brasileiros, com a
pecuária de corte ocupando grande área do território nacional (MALAFAIA et al.,
2019). A Sociedade Internacional de Tecnologia de Embriões (IETS) divulgou que em
2023 foram produzidos 2.247.729 embriões bovinos, colocando o Brasil como o
segundo maior produtor mundial, responsável por aproximadamente 27% da
produção, com 473.872 embriões produzidos tanto in vitro quanto in vivo (VIANA,
2024).
Pouco mais de 83% dos embriões bovinos produzidos no mundo em 2023 foram
obtidos através da técnica de produção in vitro (PIVE), um aumento de quase 16% em
relação ao ano anterior (VIANA, 2024). Essa biotécnica possibilita aumento da
produtividade na bovinocultura através da multiplicação de animais geneticamente
melhorados (VIANA et al., 2017), uma vez que a seleção passa a ser mais criteriosa,
além de reduzir o intervalo entre partos (VARAGO et al., 2008). A PIVE também pode
ser utilizada como ferramenta de reprodução assistida para fêmeas de alto valor
genético e que possuam patologias reprodutivas adquiridas (DAYAN, 2001).
Todavia, a contaminação por microrganismos nos materiais biológicos dos
animais doadores utilizados na PIVE (oócitos e sêmen) pode ter sua origem a partir
de uma infecção sistêmica ou específica do trato reprodutor, ou ainda, ocorrer durante
a manipulação desses materiais no laboratório (BIELANSKI, 2007). Além disso,
diversas doenças infecciosas do trato reprodutor do touro podem impactar na
fertilidade, por efeito direto sobre qualidade seminal, ou liberando o agente no sêmen,
infectando as fêmeas e reduzindo sua fertilidade (WRATHALL et al., 2006).
O Herpesvírus Bovino tipo 1 (BoHV-1, Varicellovirus bovinealpha1), também
conhecido como o vírus da Rinotraqueíte Infecciosa Bovina ou Vulvovaginite Pustular
Infecciosa Bovina (TANGHE et al., 2005), é transmitido por contato direto ou indireto,
geralmente pelo trato respiratório ou pela mucosa do trato reprodutivo, sendo
causador de diversas alterações reprodutivas em bovinos, como endometrites,
absorção embrionária e abortos, além do nascimento de animais com o sistema
nervoso central acometido, comprometendo aspectos econômicos e sanitários dos
rebanhos (STRAUB, 1990). O portador latente pode sofrer reativação viral, com ou

14

sem eliminação do vírus, mas uma vez infectado será portador por toda sua vida
(ASHBAUGH et al., 1997).
Como citado anteriormente, o Brasil é um dos maiores produtores mundiais de
embriões in vitro. Sabe-se que o BoHV-1 reduz os resultados da PIVE por diminuir a
atividade fertilizante dos espermatozoides e, quando infecta os oócitos, reduz a
formação e desenvolvimento embrionário (ALVES et al., 2019). O vírus possui camada
superficial pela membrana plasmática dos espermatozoides, podendo aderir à região
pós-nuclear, o que contribui para o aumento das anomalias e redução da capacidade
de fertilização dos gametas (EL-MOHAMADY et al., 2020). As pesquisas sobre os
riscos de transmissão de infecções por gametas e embriões, bem como os possíveis
prejuízos causados pela presença de um patógeno durante o procedimento de PIVE,
estimularam a criação de protocolos de controle e da certificação sanitária dos
produtos utilizados (WALDROP et al., 2004). Dessa forma, é importante utilizar
ferramentas que sejam capazes de reduzir ou eliminar a carga viral em amostras de
sêmen.
O gradiente de Percoll é uma técnica de separação celular baseada na
centrifugação em meios de diferentes densidades, amplamente utilizada na seleção
de espermatozoides para a PIVE bovinos. Sua principal importância reside na
capacidade de isolar subpopulações de espermatozoides com maior motilidade,
integridade de membrana e potencial fertilizante. Além disso, a técnica pode ser
ajustada em termos de volume, força e tempo de centrifugação, sem comprometer a
qualidade espermática ou o desenvolvimento embrionário (MISSIO et al., 2018).
Uma vez que esse vírus também causa impacto negativo sobre a PIVE na
espécie bovina, o desenvolvimento de estratégias que permitam minimizar ou eliminar
o efeito negativo desse vírus sobre a biotecnologia da PIVE seria capaz de elevar os
índices de produção de embriões. Até o momento, não foi possível identificar nenhum
estudo que testou diferentes estratégias para remoção de BoHV-1 em amostras de
sêmen bovino, mas isso já foi feito para outros vírus em sêmen de outras espécies
(BIELANSKI, 2007).
O uso de nanopartículas magnéticas associadas a anticorpos representa uma
abordagem inovadora para a remoção eficiente de partículas virais em diferentes
contextos biomédicos e ambientais, conferindo alta especificidade para a captura do
vírus-alvo (DELAVIZ et al., 2015).

15

Caso seja demonstrada a eficácia da técnica, a estratégia tem o potencial de ser
utilizada para o controle de taxas de infecção causadas por outros vírus, em amostras
de sêmen, ou mesmo outras espécies que também utilizam a PIVE como estratégia
reprodutiva, como a humana, onde a contaminação viral em amostras de sêmen tem
sido um problema observado em laboratórios de reprodução assistida (MICHOU et al.,
2012). Além disso, pode permitir o uso do sêmen de reprodutores de alto valor
genético com a infecção viral, eliminando o risco de transmissão do vírus para as
vacas inseminadas ou embriões produzidos, melhorando índices produtivos na
bovinocultura nacional.
Dessa forma, objetivou-se com este trabalho avaliar o efeito do BoHV-1 sobre a
qualidade espermática em sêmen bovinos descongelados e a eficácia do gradiente
de percoll e o uso de nanopartículas magnéticas para a remoção do BoHV-1 de
amostras de sêmen artificialmente infectadas.
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. Herpesvírus Bovino tipo 1
O Herpesvírus Bovino tipo 1 (BoHV-1, Varicellovirus bovinealpha1) é um
membro

da

família

Orthoherpesviridae,

subfamília

Alphaherpesvirinae,

gênero Varicellovirus, cujas principais características são a presença de um cerne
contendo DNA linear de fita dupla e um capsídeo icosadeltahédrico (FRANCO, 2012).
Os membros dessa subfamília apresentam uma ordem constante na forma de sua
organização gênica, ocorrendo pouca alteração na forma de aparecimento da maioria
dos genes quando comparados aos diferentes tipos de herpesvírus, além de
possuírem ciclo replicativo rápido, causando grande taxa de destruição celular nos
tecidos infectados (ENGELS e ACKERMANN, 1996).
O BoHV-1 apresenta as glicoproteínas gB, gD, gH e gL, sendo gB e gD as
principais proteínas responsáveis pela replicação viral e pela interação com as células.
A penetração do vírus na célula hospedeira ocorre por uma fusão única do envelope
viral com a membrana plasmática, seguida do movimento para dentro do citoplasma,
através da formação de poros e invaginação da membrana plasmática (SCHWYZER
e ACKERMANN, 1996).

16

A infecção por BoHV-1 causa prejuízos sanitários e econômicos no rebanho
bovino, sendo a sua manifestação respiratória comumente denominada Rinotraqueite
Infecciosa Bovina (IBR), enquanto a apresentação de sua forma genital é denominada
Vulvovaginite/Balanopostite Pustular Infecciosa Bovina (LOY et al., 2013). A via de
transmissão mais importante é a via direta horizontal, que ocorre por meio do contato
direto entre os animais através da cópula, sendo também possível a transmissão por
aerossóis e fômites, além da inseminação artificial, causa importante de ingresso do
agente em rebanhos que nunca tiveram contato com o vírus (BROWLIE, 1990). Caso
o contato da fêmea com o vírus ocorra durante o período gestacional, o embrião e o
feto são infectados por via vertical/transplacentária (LEMAIRE et al., 1994).
O BoHV-1 está disseminado por todas as regiões do Brasil (Figura 1), atingindo
elevados índices de infecção nos rebanhos (BEZERRA et al., 2012b), sendo um vírus
capaz de induzir latência sem produção de progênie viral (ENGELS e ACKERMANN,
1996). A latência, nesse contexto, representa um estado em que não há replicação
viral ativa nem manifestação de sinais clínicos, impedindo a excreção do vírus pelos
animais infectados. Esse período de inatividade viral é estabelecido pela supressão
da expressão dos genes alfa. Uma vez que os produtos desses genes são cruciais
para as fases subsequentes de expressão gênica e replicação do genoma viral, sua
inibição resulta na interrupção do ciclo viral (COLODEL et al., 2002).
Durante a infecção latente, exames nos animais não revelam evidências da
infecção, exceto pela detecção de anticorpos, que são uma resposta à infecção aguda
anterior. No animal portador do vírus em latência, pode ocorrer a reativação viral em
consequência de estresse significativo do animal, eliminando partículas virais, muitas
vezes sem apresentar sinais clínicos (COLODEL et al., 2002).

17

Figura 1. Prevalência de animais sororreagentes para Herpesvírus Bovino tipo 1, obtidos por estudos
realizados em diferentes estados brasileiros.

Fonte: MÉDICI e ALFIERI, 2000; DIAS et al., 2008, HOLZ, 2009; LIMA et al., 2011; BEZERRA et al.,
2012a; SANTOS et al., 2014; SILVA et al., 2015; NOGUEIRA, 2018; DE ARRUDA et al., 2019; MENDES
et al., 2025. Estados em branco: não foi localizado artigo com soroprevalência

O BoHV-1 pode interferir nos índices reprodutivos dos plantéis infectados
(TAKIUCHI et al., 2005). A infecção pelo BoHV-1 pode comprometer tanto o
desenvolvimento do embrião como do feto, embora seja observado abortamento mais
frequentemente no segundo e terceiro trimestres de gestação (KIRKBRIDE, 1985).
Todos os bovídeos saudáveis atuam como hospedeiros suscetíveis nesta cadeia
epidemiológica (FRANCO e ROEHE, 2007).
As manifestações clínicas da infecção pelo BoHV-1 podem ser controladas e
prevenidas através dos programas de vacinação. No Brasil esses programas
requerem uma análise de custo-benefício que deve considerar a prevalência,
manifestação clínica da doença, o grau de melhoramento genético dos animais,
despesas com exames laboratoriais (sorodiagnóstico e identificação viral), vacinação
e descarte de animais infectados (VAN OIRSCHT, 1999).

18

2.2. Biotecnologias reprodutivas e o impacto do Herpesvírus Bovino tipo 1
Sendo o agronegócio um setor importante na economia do Brasil, sua expansão
deu espaço para a participação de investimentos vindo tanto de empresas nacionais
quanto multinacionais (MEDINA, 2021). Em números, a pecuária brasileira alcançou
a marca de 2,29 milhões de toneladas de carne exportadas em 2023, 1,31% acima do
montante descrito no ano anterior, demonstrando a solidez da atividade mesmo em
tempos de instabilidade econômica (ABIEC, 2024).
Com a expansão do mercado, várias biotecnologias foram desenvolvidas e
aprimoradas, principalmente na espécie bovina. Inicialmente, a inseminação artificial
(IA) teve um importante papel na disseminação do material genético do macho e,
posteriormente, técnicas como o controle do ciclo estral, superovulação (SOV) e
transferência de embriões (TE) proporcionaram um aumento na possibilidade da
multiplicação do material genético da fêmea (DAYAN, 2001). Este é o cenário que
confirma o uso das diferentes biotécnicas da reprodução e o seu crescimento
permanente. Além disso, o Brasil é detentor de um bom nível técnico-científico nesta
área, destacando-se como um dos maiores produtores de embriões in vitro bovino,
não só pelo domínio da técnica, mas pela qualidade do seu rebanho (DA SILVA et al.,
2015).
Sabe-se que a replicação do BoHV-1 acontece principalmente na mucosa
prepucial e uretral, contaminando o sêmen durante a ejaculação, quando o líquido
seminal entra em contato com as mucosas infectadas. Foi comprovado que mais de
90% do DNA do BoHV-1 está no fluido seminal, praticamente não havendo detecção
do vírus junto aos espermatozoides (VAN ENGELENBURG et al., 1993). Durante os
últimos anos, foi demonstrado que o BoHV-1 pode estar presente no material utilizado
no sistema de produção in vitro (VANROOSE et al., 1999), no fluido folicular,
associado às células epiteliais de oviduto, nos oócitos (BIELANSKI et al., 1993) e nos
espermatozoides de touros infectados (ROCHA et al., 1998). Uma vez que este vírus
pode estar presente em animais aparentemente saudáveis, devido a capacidade de
latência, o risco de transmissão do BoHV-1 através da produção in vitro de embriões
deve ser considerado (FENNER, 1993).
Devido às informações supracitadas, o Código Sanitário para os Animais
Terrestres da Organização Mundial de Saúde Animal – OIE, afirma que os
reprodutores bovinos devem ser testados a fim de ingressarem e se manterem em

19

centros de coleta e processamento de sêmen (OIE, 2024a). Dentre os testes
recomendados pela OIE para a detecção do BoHV-1 no sêmen, de forma a garantir a
segurança do sêmen destinado à inseminação artificial e as demais biotécnicas da
reprodução, estão o isolamento viral e a Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
(OIE, 2024b). A segurança sanitária no comércio de sêmen bovino é crucial para
impulsionar as exportações e importações. Ao garantir essa segurança, minimiza-se
os riscos de surtos de doenças e a introdução de novas enfermidades em rebanhos
controlados, protegendo assim a saúde animal e a economia do setor (EAGLESOME
e GARCIA, 1997).
Todavia, os Centros de Coleta e Processamento de Sêmen – CCPS que seguem
as determinações nacionais oficiais podem estar disseminando esse agente para os
rebanhos brasileiros através da comercialização nacional de sêmen bovino, levando
em consideração que as regulamentações vigentes no Brasil não determinam
exigências sanitárias em relação ao BoHV-1 para o processamento e comercialização
do sêmen no país (BRASIL, 2003). Já o sêmen utilizado na produção de embriões
para o comércio internacional provém, na maioria das vezes, de lotes processados
em centrais de inseminação internacionalmente credenciadas. Esses touros são
rigorosamente testados e contam com certificados negativos para enfermidades
agudas e epidêmicas (como febre aftosa), além de doenças crônicas como brucelose,
tuberculose,

leptospirose,

herpesvirose,

campilobacteriose

e

tricomonose

(WRATHALL et al., 2006).
Os estudos demonstram que os impactos do BoHV-1 sobre as taxas de
fertilidade são variáveis. WHITE e SNOWDON (1973) avaliaram 149 vacas
provenientes de 20 rebanhos distintos, quando investigaram o impacto da
contaminação sêmen pelo BoHV-1 e a taxa de não retorno ao serviço (TNRS). Os
resultados revelaram uma TNRS significativamente menor em animais inseminados
com sêmen contaminado por BoHV-1 (13,4%) em comparação com o grupo controle,
que utilizou sêmen não contaminado (60,8%). Adicionalmente, entre as fêmeas que
retornaram ao serviço, 22,1% apresentaram encurtamento do ciclo estral, tendo
duração inferior a 18 dias. De um grupo de 11 animais, ELAZHARY et al. (1980)
isolaram o BoHV-1 do conteúdo uterino de oito vacas, caracterizadas por
apresentarem baixa taxa de prenhez e elevada taxa de serviço, levando em
consideração que o touro empregado no programa de reprodução do plantel excretava
o vírus no sêmen.

20

Já o estudo realizado por KUPFERSCHIMIED et al. (1986) verificou a
contaminação de vacas inseminadas com sêmen importado, contaminado pelo BoHV1, proveniente de touro soronegativo. Essas vacas demonstraram taxas de não
retorno ao cio 10% abaixo da média do rebanho, além de soroconversão. OLIVEIRA
et al. (2011) analisaram 23 amostras de sêmen congelado de uma central de
inseminação artificial brasileira, sendo cinco (21,7%) positivas para BoHV-1.
Para avaliarem os impactos do BoHV-1 na PIVE, AGUIAR et al. (2014)
realizaram uma pesquisa onde 1329 embriões foram transferidos, sendo 161 oriundos
de doadoras positivas e 1168 oriundos de doadoras negativas para BoHV-1. As
receptoras que receberam embriões das vacas positivas obtiveram uma taxa de
prenhez de 39,13% (63/161), já as que receberam embriões de doadoras negativas,
apresentaram a taxa de 44,95% (525/1168).
2.3. Resistência do vírus no sêmen bovino
O BoHV-1 é o vírus mais frequentemente encontrado no sêmen bovino
(AFSHAR e EAGLESOME,1990) e, infelizmente, o processamento das amostras de
sêmen utilizando refrigeração e congelação não é capaz de reduzir a titulação ou
mesmo a virulência do BoHV-1. A infectividade do BoHV-1 no sêmen pode
permanecer conservada por até sete dias em temperatura de 4 °C e por cinco dias em
temperatura ambiente (DREW et al., 1987). Chapman et al. (1979) demonstraram, por
meio de isolamento em cultivo celular e quantificação, que não há perda significativa
no título de BoHV-1 em sêmen bovino armazenado em nitrogênio líquido por mais de
um ano. Corroborando essa persistência, Spradbrow (1968), ao examinar o sêmen de
40 touros, isolou o BoHV-1 em três ampolas distintas de uma mesma coleta,
descongeladas em momentos diferentes, utilizando cultivo celular de rim bovino.
Notavelmente, após 12 meses de armazenamento, o vírus permaneceu detectável em
uma das amostras, a uma concentração de 104.3 TCID50/ml.
2.4. Nanopartículas magnéticas – seu uso na identificação e isolamento de
material biológico
A nanotecnologia favorece o desenvolvimento de materiais em nanoescala com
tamanho, forma e área de superfície definidos, compatíveis aos de entidades

21

biológicas, como células, vírus, moléculas, proteínas e até mesmo genes, as tornando
adequadas às aplicações biomédicas (SAVUNTHARI et al., 2021). Devido a isso,
esses nanomateriais estão se tornando comuns em pesquisas biomédicas como
adjuvantes de novas terapias para a administração eficaz de medicamentos,
reconhecimento de patógenos e/ou sensores biomoleculares (ROUT et al., 2018).
Além disso, as nanopartículas estão atraindo interesse de diferentes campos, como a
química de materiais, tecnologia da informação, agricultura, eletrônica, meio
ambiente, energia e sensores (AROKIYARAJ et al., 2015; SURENDRA et al., 2016).
As ferramentas da nanotecnologia permitem acelerar o desenvolvimento
tecnológico, reduzir custos e tempo de produção, impactos econômicos e ambientais,
como, por exemplo, na remoção de contaminantes de águas residuais como metais
tóxicos, orgânicos e microrganismos (DESHPANDE et al., 2020). Cerca de 70% dos
diagnósticos médicos são embasados em resultados de exames laboratoriais, cujas
despesas chegam até 25% dos custos com diagnósticos no país (SUMITA e
SHCOLNIK, 2017).
Além disso, a nanotecnologia é promissora para a terapêutica veterinária.
Sabe-se que a terapia mediada por nanocarreadores de mistura é eficaz no
tratamento de doenças que afetam animais que produzem alimentos para consumo
humano (KLIER et al., 2012). Uma vez que a resistência bacteriana aos antibióticos
convencionais representa uma grave ameaça à saúde global, as nanopartículas
emergem como uma alternativa promissora, oferecendo novas abordagens para
combater infecções, especialmente aquelas mediadas por biofilmes, com menor
probabilidade de induzir resistência ao longo do tempo. A eficácia das nanopartículas
reside em seus diversos mecanismos de ação, que dificultam a adaptação bacteriana
e o desenvolvimento de inúmeros sistemas baseados em nanopartículas, visando
aprimorar a eficácia antimicrobiana (GUPTA et al., 2016).
Com a aplicação de um revestimento superficial, as nanopartículas magnéticas
podem ser eficientemente dispersas em solventes compatíveis, resultando na
formação de suspensões transparentes como fluidos magnéticos. Essa característica
possibilita uma gama diversificada de aplicações biomédicas. Elas podem ser
empregadas como agentes de contraste em ressonância magnética (FERGUSON et
al., 2009; SCHLORF et al., 2010), atuar como carreadores de medicamentos guiados
por campo magnético (YUAN et al., 2010), como também são utilizadas em
diagnósticos e na separação biomolecular magnética (FERGUSON et al., 2009).

22

No campo da produção de vacinas veterinárias, o uso de nanopartículas é
capaz de elevar a resposta imunológica, fazendo com que os antígenos sejam
liberados lentamente e consequentemente aumentando o desempenho vacinal (KIM
et al., 2010). Além disso, as nanopartículas têm um grande impacto na proteção e
sustentação da liberação de hormônios da reprodução, como hormônios esteroides e
hormônios gonadotrópicos, bem como no diagnóstico e tratamento de problemas
reprodutivos (JOANITTI e SILVA, 2014).
Uma das vantagens significativas das nanopartículas magnéticas sobre outras
nanopartículas é sua maior resistência a condições corrosivas, ácidas e oxidantes,
juntamente com uma melhor biocompatibilidade (MARKIDES et al., 2012). Além disso,
as nanopartículas magnéticas destacam-se como uma ferramenta ideal para a
remoção de partículas virais de sistemas biológicos, principalmente devido às suas
propriedades magnéticas intrínsecas, característica ausente em nanopartículas
metálicas não magnéticas. Essa particularidade permite que as nanopartículas
magnéticas, juntamente com as partículas virais a elas ligadas, sejam facilmente
separadas da solução por meio da aplicação de um campo externo magnético.
Um estudo realizado por Delaviz et al. (2015) avaliou a aplicação de
nanopartículas magnéticas revestidas de amido para a remoção de partículas do vírus
da hepatite C (HCV) de amostras de plasma humano. Através da metodologia
adotada, foi observada uma redução significativa da carga viral alcançando uma
eficiência de captura de até 91%.
3. CONSIDERAÇÕES FINAIS
É possível perceber que a infecção por BoHV-1 está amplamente disseminada
no Brasil, caracterizado como o país que possui o maior rebanho e é o maior
exportador de carne bovina do mundo. Todavia, quando comparado a outros países
da Europa e América do Norte, as regulamentações no país não elencam estratégias
para o controle desta infecção. Além disso, o real impacto econômico do BoHV-1 no
sistema produtivo, seja ele tradicional ou com o emprego de biotecnologias
reprodutivas, é desconhecido.
Mesmo tendo sido demonstrado o risco de que o BoHV-1 seja transmitido
através de amostras de sêmen comercializadas pelas centrais de produção de sêmen
nacionais, e que, nos últimos anos, novas estratégias para o controle de transmissão

23

de vírus através do sêmen tenham sido desenvolvidas, ainda não são empregadas
nas rotinas das centrais. Dessa forma, este trabalho pode contribuir para o controle
da disseminação do BoHV-1 de animais de alto valor genético, mas portadores da
infecção.

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35

5. APÊNDICE I

ARTIGO SUBMETIDO À REVISTA TROPICAL ANIMAL HEALTH AND
PRODUCTION – Fator de Impacto 1,7

36

Effects of bovine herpesvirus 1 on thawed bull sperm and evaluation of methods for its removal from
experimentally infected semen

Ivana Ferro Carmo1 0000-0002-8918-8649, Emelly Barbosa Calheiros2 0009-0000-7383-3968, Juliana Carla
Cavalcanti Marques1 0000-0003-3205-7020, Lucas Santos Matos1 0000-0003-1438-9734, Abelardo Silva-Júnior2
0000-0002-9379-1686, Diogo Ribeiro Câmara1* 0000-0002-9873-7419

1

Laboratóro de Reprodução Animal de Alagoas, Universidade Federal de Alagoas - UFAL

2

Laboratório de Pesquisas em Virologia e Imunologia, Universidade Federal de Alagoas - UFAL

*Corresponding author - email: diogo@vicosa.ufal.br

Abstract
In the present study, the effects of different concentrations (0, 10⁴, 10⁵, and 10⁶ TCID₅₀/mL) of bovine herpesvirus
1 (BoHV-1) on thawed semen samples from BoHV-1-PCR negative bulls (PCR-negative) were initially evaluated
during incubation. In the second experiment, the efficacy of Percoll gradient (PG), magnetic nanoparticles
associated with anti-BoHV-1 antibodies (MNPs), and the association of both techniques for reducing the viral load
in semen experimentally infected with BoHV-1 (10⁴ TCID₅₀/mL) was assessed by viral titration. Sperm kinematics
were influenced by both bull and time, with bull × time interaction (P < 0.001), while membrane integrity and
morphology were influenced only by time (P < 0.01), with no effect of viral infection (P > 0.05). All PG-treated
samples were negative after viral titration, whereas MNP resulted in negative viral titration when samples were
incubated with MNPs for 60 min. It is concluded that BoHV-1 had no direct effect on thawed bull sperm quality
and that PG was effective in reducing the viral load. Furthermore, MNP is an alternative for viral control in semen
samples, with no apparent toxicity to spermatozoa.
Keywords: Cattle, Reproductive virus, Magnetic nanoparticles, Semen treatment.

Introduction
Transmitted among animals through direct or indirect contact, usually via the respiratory tract or the
mucosa of the reproductive tract, BoHV-1 causes reproductive disorders in cattle, compromising the economic and
sanitary aspects of herds (Straub, 1990). Once infected, an animal becomes a lifelong carrier (Ashbaugh et al.,
1997). Furthermore, BoHV-1 impairs the outcomes of in vitro embryo production, not only decreasing the

37

fertilizing capacity of sperm but also impairing embryonic formation and development when it infects the oocytes
(Vanroose et al., 1999; Alves et al., 2019).
In Brazil, the prevalence of BoHV-1 in herds is considered high, with approximately 70% of animals from
properties with a history of abortion being seropositive (Lima et al., 2011). However, current Brazilian regulations
do not establish sanitary requirements regarding BoHV-1 bulls allocated in AI Centers (BRASIL, 2003). A previous
study used PCR for BoHV-1 detection in 76 fresh semen samples from bulls in reproductive activity and 23 frozen
semen samples from an AI Center, resulting in 44.7% and 21.7% positive samples, respectively (Oliveira et al.,
2011).
Bielanski et al. (1998) demonstrated that the use of 0.3% trypsin can eliminate the virus from bovine semen
samples artificially infected with BoHV-1 (10³ or 10⁴ TCID₅₀/mL), but this strategy negatively affected sperm
quality. Other techniques for virus removal have been tested in semen from other species, including washing
strategies, medium acidification, and incubation with monoclonal antibodies that inhibit the binding of the virus
to the target cell (Bielanski, 2007; Wrathall et al., 2006).
Considering that viral contamination in semen samples has been a problem in assisted reproduction
laboratories (Michou et al., 2011), the high prevalence of BoHV-1 infection in Brazil, and that bulls of high genetic
merit may be BoHV-1 positive, strategies reducing viral load in bull semen might alleviate the negative effect on
reproductive outcomes. Furthermore, it could be a strategy for controlling viral infection in the semen of other
species. Thus, the present study evaluated the influence of BoHV-1 on sperm quality and the efficiency of Percoll
gradient (PG) and magnetic nanoparticles associated with anti-BoHV-1 antibodies (MNPs) for reducing the viral
load in experimentally infected bovine semen.

Materials and methods

Biologicals
Semen samples from three Angus bulls, obtained from the same batches at an AI Center and negative for
BoHV-1 DNA (Nested-PCR), were used in the experiments. The BoHV-1 virus was the Los Angeles strain,
replicated in MDBK cultured in monolayers (37 °C, 5% CO₂), using Low Glucose DMEM (Gibco™, Grand Island,
USA) with 0.4 mg/L streptomycin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) and 1.6 mg/L penicillin (Sigma-Aldrich,
St. Louis, MO, USA), supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS, Gibco-BRL, Grand Island, USA). Viral
titration was obtained using the TCID₅₀ (Tissue Culture Infectious Dose) technique described by Reed and Muench

38

(1938). The blood serum, for incubation with the magnetic nanoparticles, was obtained from naturally infected
cows, exhibiting an anti-BoHV-1 titer of 128, measured by the serum neutralization technique (House and Baker,
1971).

Experiment I – Effect of BoHV-1 on thawed bull sperm
Three straws from each bull were thawed (37 °C, 30 s) with the contents individually loaded into
microtubes. After one minute (Time 0, T0), sperm kinetics (CASA; total motility, VCL, VSL, and VAP), physical
membrane integrity (eosin-nigrosin), and sperm morphology were evaluated. Sperm endpoints were assessed as
described by Matias et al. (2021).
Subsequently, the sample was equally distributed into four microtubes, and BoHV-1 was added to achieve
final concentrations of 0 (control), 10⁴, 10⁵, and 10⁶ TCID₅₀/mL. The tubes were then maintained in a water bath
at 37°C and evaluated after 2, 4, and 8 hours of experimental infection (T2, T4, and T8, respectively). At the
different incubation times, the same sperm analyses described for time T0 were performed.

Experiment II – Evaluation of Percoll gradient (PG) and magnetic nanoparticles associated with antiBoHV-1 antibodies (MNPs) to reduce viral load
This study was performed in duplicate. For each replicate, three straws from each bull were thawed (37
°C, 30 s), the contents were pooled into a single microtube, and homogenized. As a negative control, an aliquot
(200 µL) of the non-infected semen was transferred to a microtube at room temperature (approximately 22 °C)
under agitation, and at different intervals (0, 15, 30, and 60 min), the aliquots were stored for titration.
Artificial infection of the semen was performed by serial dilution of thawed BoHV-1 stock solution (108
TCID₅₀/mL; 37 °C, 30 s) in TL-Semen (Bioembryo, Bauru, Brazil), to obtain a final concentration of 10⁴
TCID₅₀/mL of semen. After 10 min under agitation at room temperature, aliquots were harvested for titration
(positive control, T0), to determine sperm concentration (Neubauer chamber), total motility (CASA), and to
execute PG and MNPs treatments. The remaining infected sample was kept at room temperature under agitation,
and after 15, 30, and 60 min, the aliquots were collected for both titration (positive control T15, T30, and T60,
respectively) and MNP treatment.
The PG (90% and 45%) was prepared by diluting Percoll (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) in TLSemen. In a conical-bottom microtube (1.5 mL), 500 µL of 90% Percoll was slowly deposited under the 45%
Percoll layer, finalizing with the addition of 200 µL of the infected semen on top of the gradient. The sample was

39

centrifuged (7000 g, 5 min), and 50 µL of the formed pellet was collected for titration (PG treatment). Aliquots of
the sperm pellet were also taken for the determination of sperm concentration and total motility, as described.
For the preparation of the MNPs, 50 µL of nanoparticles (Dynabeads™ Protein G, Invitrogen, Carlsbad,
CA, USA), 100 µL of serum, and 100 µL of TL-Semen were added to a microtube and maintained at room
temperature under agitation for 10 minutes. Subsequently, the microtube was placed on a magnetic stand (Exoflow
700A-1, System Biosciences, CA, USA) until the nanoparticles adhered to the wall of the tube. The solution was
carefully removed without disturbing the nanoparticles, then 1.0 mL of artificially infected semen was added,
maintained under agitation at room temperature for different intervals (15, 30, and 60 min). At each time point,
the microtube was again placed on the magnetic stand, and after the nanoparticles were separated, aliquots were
collected for titration. Also, aliquots of infected semen treated for 60 min with MNPs were used to assess sperm
concentration and total motility.
For titration, aliquots (50 µL) from all samples (negative control, positive control, GP, and MNPs treated)
were diluted in TL-Semen (50 µL), homogenized, loaded into 0,25 mL straws, and stored in liquid nitrogen until
analysis. Viral titrations were performed on MDBK cell lineages culture in Low Glucose DMEM medium (37 ºC,
5% CO₂), using the TCID₅₀ technique (Reed and Muench, 1938). The experiment was conducted in a 96-well
microtitration plate (USA Scientific, Inc., Ocala, FL) containing 50 µL of Low Glucose DMEM, supplemented
with 2% FBS (Gibco™), 1% PSA (Gibco™), and 1% L-Glutamine (Gibco™), containing 5 x 10⁴ MDBK cells.
The test was analyzed after 72 hours of incubation to check for the absence or presence of a cytopathic effect,
compared to negative and positive controls (OIE, 2021).

Statistical analysis
In Experiment I, data normality was assessed using the Shapiro-Wilk test. The influence of the variables
bull, time, and viral concentration, as well as their interactions, was determined using two-way ANOVA.
Differences between means were compared using Tukey's test. In Experiment II, the effects of PG and MNPs (60
min) treatment on sperm concentration and motility, compared to infected non-treated samples, were assessed
using the Mann-Whitney test. For all comparisons, differences with probabilities lower than 5% (P < 0.05) were
considered significant.
The efficacy of PG or MNPs (T15, T30, T60) for reducing the viral load in the semen samples was
compared using descriptive statistics, considering the effectiveness in achieving negative titration results.

40

Results

Experiment I
After eight hours of incubation, no motile spermatozoa were identified in any of the treatments; therefore,
this time point was disregarded for statistical analysis. For all sperm kinetic parameters (TM, VSL, VCL, and
VAP), there was an effect of bull and time (P < 0.001), with an interaction between them (P < 0.001), but no effect
of viral infection (P > 0.05). Regarding plasma membrane integrity and the percentage of normal spermatozoa, a
time effect was observed (P < 0.001), but no effect of bull or viral concentration was found (P > 0.05), and no
interaction was detected.

Experiment II
Following Experiment 1, the addition of BoHV-1 at the different concentrations tested did not influence
the evaluated sperm parameters. Therefore, in Experiment 2, the effects of PG and incubation with MNP for 60
min on sperm motility and concentration were compared with untreated infected samples. The PG treatment
resulted in higher motility (P < 0.05), while no effect of MNPs was observed for this parameter (Fig. 1A).
Furthermore, although MNP treatment reduced sperm concentration compared to untreated infected semen, PG
resulted in the lowest post-treatment sperm concentration (P < 0.05) – Fig. 1B.

a

a

ab
b

b
c

A

B

Fig. 1 Effect of Percoll gradient and incubation with magnetic nanoparticles associated with anti-BoHV1 antibodies (MNPs) for 60 minutes on motility (A) and sperm concentration (B) in thawed bovine semen
samples artificially infected with Bovine Herpesvirus 1 (10⁴ TCID₅₀/mL).
Different letters above each boxplot indicate significant differences (P < 0.05) between the different
treatments for the same parameter.

41

No cytopathic effect was observed during titration in any of the negative control samples. The positive
control samples (semen infected with 10⁴ TCID₅₀/mL of BoHV-1, after 0, 15, 30, and 60 minutes of incubation at
room temperature post-thaw) showed an increase in titer over the incubation period, from approximately 10²
TCID₅₀/mL to 10³ TCID₅₀/mL after 60 min.
The use of PG resulted in 100% negative samples after viral titration, while the use of MNPs resulted in
a reduction of the mean titer as the incubation time increased, achieving 100% negative samples after titration only
when the infected semen was incubated with MNPs for 60 minutes (Table 1).
Table 1 Titration for Bovine Herpesvirus 1 in thawed bovine semen samples
artificially infected (10⁴ TCID₅₀/mL), treated with Percoll gradient (PG) or
magnetic nanoparticles associated with anti-BoHV-1 antibodies (MNPs) for
different periods.
Treatment*

Viral titre

Positive samples after

(TCID50/mL)

titration (%)

Below detection

0

MNP15

102.3

50

MNP30

1.5

10

50

MNP60

Below detection

0

PG

*15, 30 e 60 refer to diferente incubation times (min) of infected samples with
MNP.

Discussion
The absence of direct effects of BoHV-1 on bovine spermatozoa, detected in the present study, even
adding viral concentrations thousands of times higher than those reported in ejaculates of artificially infected bulls
(10⁴ TCID₅₀/mL; Spradbrow, 1968), is consistent with previous findings. Tanghe et al. (2005) stated that the virus
can interfere with the binding between the sperm and the oocyte's zona pellucida but observed no alteration in the
kinematics or acrosomal integrity of bovine spermatozoa. Souza et al. (2018) also reported no impact of
experimental infection of bulls with BoHV-1 on sperm quality in fresh or post-thaw semen. In bulls naturally
infected with BoHV-1, used in a natural mating system, no influence on sperm parameters or bull fertility was
identified (Montoya-Monsalve et al., 2021).
Conversely, El-Mohamady et al. (2020) reported that bulls naturally infected with BoHV-1 exhibited
lower motility, concentration, and sperm viability, in addition to a higher percentage of sperm defects, when
compared to negative bulls. We infer the findings of El-Mohamady et al. (2020) may reflect individual variation,

42

since the negative control consisted of bulls not carrying BoHV-1, or even systemic conditions that were reflected
in sperm quality.
The increase in titration in the positive control samples over the incubation period was an unexpected
result, since when cultivated in MDBK cells, BoHV-1 can only increase the viral titer from 10⁴ TCID₅₀/mL to
approximately 10⁵ TCID₅₀/mL after 24 hours (Marin et al., 2012). These results may indicate a reduction in viral
infectivity in the initial moments after experimental semen infection, either due to differences in biochemical
composition between the virus culture medium and the dilution medium, or even effects of the semen and its
extender, as they contain factors that can influence viral activity/infectivity, such as proteolytic enzymes (Bielanski
et al., 1998), directly impacting titration results, as demonstrated in humans (Münch et al., 2007; Chen et al., 2021).
It should be noted that there is no evidence that BoHV-1 replicates directly in spermatozoa (Engelenburg et al.,
1993).
In the present experiment, the Percoll gradient demonstrated effectiveness in reducing BoHV-1 titration.
These results corroborate those of Galuppo et al. (2012), who demonstrated that the Percoll gradient reduced the
viral load in semen samples contaminated with bovine viral diarrhea virus (BVDV) from 10⁶.⁷ to values between
10².³ and 10¹ TCID₅₀/mL. Similar results were observed by Hideji Hanabusa et al. (2000) with human
immunodeficiency virus 1 (HIV-1), where Percoll gradient centrifugation followed by swim-up reduced HIV-1
RNA and proviral DNA to undetectable levels, while the Percoll gradient alone resulted in 8% positive samples.
It is important to note that the results regarding the effectiveness of eliminating positive titration for
BoHV-1 with the Percoll gradient in the present study should be viewed with caution, as the technique was
performed approximately 10 minutes after experimental infection, a period in which a low titer value was
demonstrated through the titration of the positive control samples.
It was demonstrated that the use of serum from animals with a high titer for BoHV-1, as a source of
antibodies to be conjugated to the nanoparticles, resulted in negative titrations for BoHV-1 after 60 minutes of
incubation, we suggest that the use of purified polyclonal or monoclonal antibodies for association with the
nanoparticles could result in greater efficacy, reducing the time required for viral removal, since the concentration
of antibodies conjugated to the nanoparticles influences separation efficiency (Smith et al., 2011; Haghighi et al.,
2020).
Furthermore, it was demonstrated that the MNPs did not result in apparent toxicity to bovine spermatozoa,
reinforcing the idea that this could be a strategy used not only for virus elimination. It is possible to associate
populations of nanoparticles with different "targets" in the same semen sample, aiming, for example, at bacterial

43

control and the control of other contaminants, without compromising sperm quality and expanding biosafety
strategies in assisted reproduction (Pérez-Duran et al., 2020), like removing nanoplastics (Chen et al., 2024), or
defective sperm (Odhiambo et al., 2014).
Thus, it is concluded that, even at high concentrations, BoHV-1 did not reduce the quality of artificially
infected bovine spermatozoa, and the use of the Percoll gradient was effective in reducing BoHV-1 in semen
samples infected with 10⁴ TCID₅₀/mL. Furthermore, the use of magnetic nanoparticles conjugated with antiBoHV-1 antibodies caused no apparent toxicity to thawed bovine spermatozoa, representing a promising
alternative for viral reduction when conjugated to antibodies.

Authors contributions
IFC, DRC, and ASJ conceptualized the work and designed the study; IFC, EBC, JCCM, and LSM collected and
provided the data; IFC, DRC, EBC, and ABJ analyzed the data; IFC and DRC wrote the manuscript; DRC and
ASJ critically reviewed the manuscript. All the authors read and reviewed the manuscript.

Funding
The authors thank the Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) and Fundação de
Amparo à Pesquisa do Estado de Alagoas (FAPEAL) for the financial support (Code 0001 and Process number
60030.0000001651/2023, respectively).

Data availability
The data generated in the present study are available from the corresponding author upon reasonable request.

Conflicts of interest
The authors declare no conflicts of interest.

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47

6. APÊNDICE II

DADOS ORIGINAIS

48

6.1 PAN-Nested-PCR para detecção de herpesvírus nas amostras de sêmen
Os primers (Sintese Biotecnologia, Belo Horizonte, Brasil) utilizados estão
apresentados na Tabela 1. Para a PCR primária foram adicionados em cada poço
12,5 µL de GoTaq® MasterMix (Promega Corporation, WI, USA), 1 µL dos primers
DFA, ILK e KG1 (10 µM), 4,5 µL de água livre de nucleases e 5 µL de sêmen
descongelado. Foram efetuados 45 ciclos de 94 ºC por 30 segundos, 46 ºC por 60
segundos e 72 ºC por 60 segundos, com uma extensão final de 72 ºC por sete minutos
(VeritiPro™ Thermal Cycler. Applied Biosystems, MA, USA). Como controle positivo,
utilizou-se uma amostra da cepa Los Angeles de BoHV-1.
Para a realização da PCR secundária, foram adicionados 12,5 µL de GoTaq®
MasterMix; 1 µL dos primers TGV e IYG (10 µM), 5,5 µL de água livre de nucleases e
5 µL do produto da PCR primária. O ciclo foi o mesmo utilizado na PCR primária. Os
fragmentos oriundos 5 µL do produto da PCR secundária de cada amostra foram
visualizados em gel de agarose (2%). O gel foi preparado com 50 mL de TBE 1X, 1 g
de agarose e 5 µL de Sybr Safe DNA Gel Stain (Promega Corporation, WI, USA). O
tamanho do fragmento esperado para a confirmação de amostras positivas foi entre
215 pb e 315 pb.
Tabela 1. Sequência de oligonucleotídeos utilizados para a detecção de herpesvírus por nested PCR.
PRIMER

SEQUÊNCIA

DFA

5’-GAYTTYGCNAGYYTNTAYCC-3’

ILK

5’-TCCTGGACAAGCAGCARNYSGCNMTNAA-3’

KG1

5’-GTCTTGCTCACCAGNTCNACNCCYTT-3’

TGV

5’-TGTAACTCGGTGTAYGGNTTYACNGGNGT-3’

IYG

5’-CACAGAGTCCGTRTCNCCRTADAT-3’

Nenhuma das amostras de sêmen foi positiva para BoHV-1 (Figura 2).

49

1200 bp
400 bp
300 bp
200 bp
100 bp

LD

S1

S2

S3

S4

S5

S6

PC

NC

Figura 1 Eletroforese em gel de agarose evidenciando os produtos de PCR amplificados.
LD: ladder, S: samples, PC: controle positivo, NC: controle negativo.

50

6.2 Dados do efeito da infecção experimental com Hespesvírus bovino tipo 1 em amostras de
sêmen descongelado bovino
Tabela 2. Avaliação dos efeitos touro, tempo e concentração viral sobre parâmetros cinemáticos
de espermatozoides bovinos descongelados, infectados experimentalmente.

TOURO

TEMPO
(H)
0
2

1
4
0
2
2
4
0
2
3
4

VIRUS
(TCID50/mL)
0
0
104
105
106
0
104
105
106
0
0
104
105
106
0
104
105
106
0
0
104
105
106
0
104
105
106

MOTILIDADE
TOTAL (%)
79.1 ± 1.1
42.6 ± 4.6
36.3 ± 4.5
47.8 ± 2.3
44.6 ± 2.4
7.4 ± 1.6
11.8 ± 1.9
7.5 ± 1.3
13.3 ± 2.1
78.7 ± 1.3
64.9 ± 2.3
48.9 ± 4.2
37.5 ± 4.3
59.0 ± 4.5
6.8 ± 1.4
2.9 ± 0.4
5.4 ± 1.0
6.6 ± 1.4
46.8 ± 2.8
31.9 ± 3.1
21.0 ± 1.8
28.4 ± 4.4
21.8 ± 5.0
4.4 ± 0.5
2.7 ± 0.4
3.9 ± 0.3
3.6 ± 0.5

VSL
(µm/s)
36.6 ± 1.6
27.2 ± 0.9
17.0 ± 1.9
30.1 ± 0.8
29.7 ± 2.2
11.5 ± 1.4
10.2 ± 0.9
9.8 ± 1.0
6.8 ± 0.6
44.2 ± 1.1
26.8 ± 1.2
24.1 ± 1.7
25.6 ± 1.8
29.7 ± 2.2
7.5 ± 0.9
4.7 ± 0.4
6.3 ± 0.3
5.7 ± 0.4
40.9 ± 1.5
17.8 ± 1.2
11.3 ± 1.3
12.9 ± 1.4
11.0 ± 1.3
5.6 ± 0.3
4.0 ± 0.3
5.4 ± 0.4
5.6 ± 0.4

VCL
(µm/s)
72.3 ± 1.4
63.6 ± 2.4
51.2 ± 3.6
72.3 ± 0.9
64.6 ± 2.2
32.8 ± 1.6
42.3 ± 3.1
44.8 ± 2.2
31.8 ± 0.9
79.1 ± 1.4
65.6 ± 1.7
68.5 ± 1.7
66.1 ± 2.5
73.6 ± 3.0
32.6 ± 2.6
24.1 ± 1.6
41.4 ± 0.9
23.8 ± 1.4
76.3 ± 2.3
50.3 ± 2.2
54.5 ± 3.9
52.5 ± 3.0
42.7 ± 2.8
30.2 ± 1.8
24.4 ± 3.9
30.1 ± 3.5
29.6 ± 2.2

VAP
(µm/s)
41.6 ± 1.8
33.1 ± 1.1
25.8 ± 1.5
37.6 ± 0.8
33.5 ± 1.1
21.1 ± 1.0
23.3 ± 1.6
24.9 ± 0.8
20.9 ± 0.8
48.1 ± 1.1
33.1 ± 1.1
30.2 ± 1.5
30.6 ± 1.5
35.7 ± 2.5
23.2 ± 1.4
15.3 ± 1.6
22.4 ± 0.9
15.0 ± 1.6
45.8 ± 1.5
28.3 ± 0.8
22.6 ± 1.6
26.0 ± 1.0
21.3 ± 1.1
18.7 ± 2.2
12.3 ± 3.1
16.5 ± 1.0
15.8 ± 1.2

Tabela 3. Resultados da análise estatística dos efeitos touro, tempo e vírus sobre os parâmetros
cinemáticos de espermatozoides bovinos descongelados, infectados experimentalmente.

PARÂMETRO

TOURO

FATOR
TEMPO

VIRUS

TEMPO

INTERAÇÃO
TOURO ×
VIRUS

VIRUS ×
TEMPO

MOTILIDADE

< 0.001

< 0.001

0.15

< 0.001

0.42

0.07

VSL

< 0.001

< 0.001

0.08

< 0.001

0.83

0.06

VCL

< 0.001

< 0.001

0.09

< 0.001

0.88

0.36

VAP

< 0.001

< 0.001

0.18

< 0.001

0.55

0.37

TOURO ×

51

6.3 Dados originais das análises de titulação viral

Tabela 4. Titulação após infecção experimental com Herpesvírus bovino tipo-1 (104
TCID50/mL) em amostras de sêmen bovino descongeladas e não tratadas (CP),
tratadas com gradiente de Percoll (GP), tratadas com nanopartículas magnéticas
associadas a anticorpos anti-BoHV-1 (MNP), ou tratadas com associação das
técnicas (MNP+GP).
Tratamento*

Titulação média

Amostras positivas

(TCID50/mL)

pós-titulação

CP0

101.5

100

CP15

102.0

100

CP30

101.6

100

CP60

103.0

100

GP

Não detectado

0

MNP15

102.3

50

MNP30

50

MNP60

101.5
Não detectado

MNP15 + GP

Não detectado

0

MNP30 + GP

Não detectado

0

MNP60 + GP

Não detectado

0

0

52

7. ANEXO – COMPROVANTE DE SUBMISSÃO DO ARTIGO