Edlene maria da silva Moraes

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE ALAGOAS
CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS
MESTRADO EM AGRONOMIA

Análise de espécies de Curvularia associadas à cultura do
inhame no estado de Alagoas

EDLENE MARIA DA SILVA MORAES

RIO LARGO - AL
2009

EDLENE MARIA DA SILVA MORAES

Análise de espécies de Curvularia associadas à cultura do
inhame no estado de Alagoas
Dissertação apresentada como requisito para
obtenção do grau de Mestre à Coordenação do Curso
de Mestrado em Agronomia (Área de Concentração
em Proteção de Plantas), do Centro de Ciências
Agrárias da Universidade Federal de Alagoas.

Orientação:
Prof. Dr. Eduardo Seiti Gomide Mizubuti

RIO LARGO - AL
2009

25 de Setembro de 2009

A Deus,
Pela dádiva da vida e por seu cuidado
e amor por mim.

OFEREÇO

A Geová Ferreira de Moraes e
Maria Edileuza da Silva Moraes, meus pais,
Ao Geraldo Filho, meu companheiro,
E a toda minha família,
Pela força, paciência e compreensão durante minha ausência.

DEDICO

AGRADECIMENTOS
À Universidade Federal de Alagoas (UFAL), através do Centro de Ciências
Agrárias (CECA), por me possibilitar a realização desse mestrado.
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Alagoas (FAPEAL) pelo
financiamento da bolsa de mestrado.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)
pela concessão das bolsas de Produtividade em Pesquisa de Eduardo S.G. Mizubuti e
Gaus S.A. Lima.
Ao Prof. Dr. Eduardo Seiti Gomide Mizubuti, pela orientação na condução
deste trabalho, e pelo exemplo de profissionalismo e ética.
Ao Prof. Dr. Gaus Silvestre de Andrade Lima, pela co-orientação e
principalmente pela confiança em mim depositada ao me proporcionar a oportunidade
de desenvolver esse trabalho em outra instituição de ensino.
A todos os Professores que compõem o curso de mestrado em Agronomia da
Universidade Federal de Alagoas, pela contribuição na minha formação profissional.
Ao secretário do Curso de Pós-Graduação em Agronomia Geraldo Lima, pela
paciência, amizade e dedicação.
Aos membros da banca examinadora, que se disporam a participar da avaliação
dessa dissertação, contribuindo com sugestões para o aprimoramento do trabalho.
A todos os amigos do Laboratório de Fitopatologia do CECA/UFAL, em
especial a Leonardo Barbosa e Mariote Netto pelo companheirismo e auxílio.
A todos os funcionários do Departamento de Fitopatologia da Universidade
Federal

Viçosa

(DFP/UFV)

pela

contribuição

concedida.

Ao Prof. Dr. Olinto Liparini (UFV), pela amizade e pela colaboração neste
trabalho.
A todos os membros do BIOPOP/UFV (Laboratório de Biologia de Populações
de Fitopatógenos): Braz Júnior, Camila Santana, Carine Rezende, Carlos Bragança,
Lahyre Gomes, Leonardo Miranda, Robson Nascimento, Sarah Galvão e Saulo
Oliveira, por todo auxílio para realização deste trabalho, pela companhia, amizade,
por cada momento e por terem se constituído verdadeiros irmãos. Vocês conquistaram
um lugar especial no meu coração.
Ao Dr. Valdir Lourenço Júnior e à Drª Tatiana Tozzi, pela amizade e auxílio
profissional. Sucesso!
E a todos que contribuíram de alguma maneira para a realização deste
trabalho.
Sinceros votos de gratidão a todos: sem vocês esse trabalho não seria possível.
Amo vocês!

"Bem-aventurado o homem que acha
sabedoria, e o homem que adquire conhecimento."

Provérbios 3. 13

RESUMO

MORAES, Edlene Maria da Silva, Universidade Federal de Alagoas, setembro de 2009.
Análise de espécies de Curvularia associadas à cultura do inhame no estado de
Alagoas. Orientador: Eduardo Seiti Gomide Mizubuti. Co-orientador: Gaus Silvestre de
Andrade Lima.

O inhame (Dioscorea cayennensis Lam.) é cultura importante no Nordeste do Brasil,
principalmente nos estados de Alagoas, Pernambuco e Paraíba, que se destacam como
os maiores produtores. A cultura é afetada por patógenos que reduzem a produtividade.
A queima das folhas, causada pelo fungo Curvularia eragrostidis, pode causar perdas
significativa de produção. Considerando o contexto sócio-econômico no qual se insere a
cultura do inhame, o plantio de variedades resistentes é a estratégia mais adequada de
controle da queima foliar. Contudo, o sucesso desta estratégia depende, entre outros
fatores, do conhecimento da variabilidade genética do patógeno. Nos anos de 2005 e
2008, coletaram-se amostras de folhas afetadas nos municípios de Chã Preta, Paulo
Jacinto e Viçosa e 73 isolados foram obtidos e baseado em características morfológicas,
foram identificados como C. eragrostidis. Todos os isolados utilizados no teste de
patogenicidade foram patogênicos e houve variação quanto aos valores de AACPD ( P=
0,02). Quando diferentes isolados foram pareados em meio de cultura, a maioria
mostrou reação de compatibilidade micelial. Análises de similaridade e filogenéticas
confirmaram a identificação da espécie associada à queima foliar do inhame. O
marcador molecular AFLP foi utilizado com o objetivo de determinar a estrutura
genética da população de C. eragrostidis. A diversidade gênica total foi alta (Ht =0,31)
com baixa diferenciação entre as populações (Gst = 0,06). Não foi detectada
estruturação da população conforme os municípios. A variabilidade genética dentro das
populações de C. eragrostidis estudada foi alta.

Palavras chave: Queima das folhas. Variabilidade genética. Origem geográfica.

ABSTRACT

MORAES, Edlene Maria da Silva, Universidade Federal de Alagoas, September, 2009.
Analysis of species of Curvularia associated with yam in Alagoas State. Adviser:
Eduardo Seiti Gomide Mizubuti. Co-adviser: Gaus Silvestre de Andrade Lima.

The yam (Dioscorea cayennensis Lam.) is an important staple crop in the Northeast
region of Brazil, mainly in the states of Alagoas, Pernambuco, and Paraíba, the highest
producing areas in the region. The crop is affected by pathogens that reduce yield and leaf
blight, caused by the fungus Curvularia eragrostidis, can cause considerable crop
losses. In the socio-economic context in which this crop is placed, the use of resistant
varieties is the most effective control strategy. However, for this strategy to be
successful, knowledge of the genetic variability of the pathogen is required. Samples of
infected yam leaves were collected in 2005 and 2008, from fields in Chã Preta, Paulo
Jacinto, and Viçosa and 73 isolates were obtained. Based on morphological
characteristics all isolates were identified as C. eragrostidis. All isolates were
pathogenic to yam and there were differences in the values of area under the disease
progress curve (P= 0.02). When different isolates were paired in culture, mycelial
compatibility in the majority of pairings. Similarity and phylogenetic analyses
supported the identification of the species associated to yam leaf blight. The AFLP
markers were used to investigate the genetic structure of the population of C.
eragrostidis. Gene diversity was high (Ht = 0.31) and there was low differentiation
between populations (Gst = 0.06). The population was not structured according to
geographical origin. The genetic variability within populations of C. eragrostidis was
high.

Keywords: Leaf blight. Genetic variability. Geographical origin.

SUMÁRIO

Capítulo I – INTRODUÇÃO GERAL........................................................................ 11
1
Introdução Geral............................................................................................................ 12
1.1 A cultura do inhame...................................................................................................... 12
1.2 Aspectos fitossanitários da cultura de inhame............................................................ 13
1.2.1 Queima das folhas do inhame.......................................................................................... 14
1.3 Estrutura genética de populações de fitopatógenos.................................................... 17
2
Literatura citada............................................................................................................ 21
3
Recursos da internet...................................................................................................... 24
Capítulo II - LEVANTAMENTO DE ESPÉCIES DE Curvularia ASSOCIADAS
A INHAME NO ESTADO DE ALAGOAS................................................................. 25
Resumo............................................................................................................................ 26
Abstract........................................................................................................................... 27
1
Introdução....................................................................................................................... 28
2
Material e Métodos........................................................................................................ 31
2.1 Obtenção dos Isolados................................................................................................... 31
2.2 Testes de Patogenicidade e progresso da doença....................................................... 31
2.3 Análise da morfologia de conídios................................................................................ 32
2.4 Compatibilidade vegetativa........................................................................................... 33
2.5 Extração de DNA, amplificação, purificação e sequenciamento das regiões
ITS e β-tubulina.............................................................................................................. 33
2.6 Análises filogenéticas..................................................................................................... 35
2.6.1 ITS.................................................................................................................................... 35
2.6.2 β-tubulina......................................................................................................................... 36
3
Resultados....................................................................................................................... 36
3.1 Isolados............................................................................................................................ 36
3.2 Teste de Patogenicidade e progresso da doença......................................................... 36
3.3 Análise da morfologia de conídios................................................................................ 36
3.4 Compatibilidade vegetativa........................................................................................... 37
3.5 Amplificação e sequenciamento da região ITS e β-tubulina...................................... 37
3.6 Análises filogenéticas..................................................................................................... 38
3.6.1 Análise filogenética com base na região ITS.................................................................. 38
3.6.2 Análise filogenética com base na região da β-tubulina................................................... 38
4
Discussão........................................................................................................................ 38
5
Agradecimentos............................................................................................................. 40
6
Literatura citada............................................................................................................ 41
7
Recursos da internet...................................................................................................... 43
8
Lista de tabelas e figuras............................................................................................... 44

1
2
2.1
2.2
2.3
2.4
2.5
3
4
5
6
7
8

CAPÍTULO III ANÁLISE DA ESTRUTURA GENÉTICA DA POPULAÇÃO
DE Curvularia eragrostidis ASSOCIADA A INHAME NO ESTADO DE
ALAGOAS...................................................................................................................... 53
Resumo............................................................................................................................ 54
Abstract........................................................................................................................... 55
Introdução....................................................................................................................... 56
Material e Métodos........................................................................................................ 60
Isolados............................................................................................................................ 60
Extração de DNA........................................................................................................... 60
Reações de AFLP........................................................................................................... 61
Coloração do gel............................................................................................................. 61
Análise dos dados........................................................................................................... 62
Resultados....................................................................................................................... 63
Discussão......................................................................................................................... 64
Agradecimentos.............................................................................................................. 66
Literatura citada............................................................................................................ 67
Recurso da internet........................................................................................................ 69
Lista de tabelas e figuras............................................................................................... 70
Conclusões Gerais.......................................................................................................... 74

_____________________________________________________________Capítulo I

INTRODUÇÃO GERAL

INTRODUÇÃO GERAL
1.1 A cultura do inhame
O inhame (Dioscorea spp., Ordem Dioscoreales, Família Dioscoreaceae)
constitui um dos principais alimentos em regiões tropicais (Mafra, 1986) e a produção
mundial, no ano de 2004, foi de aproximadamente 40 milhões de toneladas (FAO,
2005). A Nigéria destaca-se como o maior produtor (27,0 milhões de t), seguida por
Gana (3,9 milhões de t), enquanto o Brasil ocupa a décima segunda posição. O Brasil é
o segundo maior produtor dessa hortaliça na América Latina com cerca de 230 mil t/ano
(FAO, 2005). A região Nordeste é responsável pela maior produção de inhame, com
47,3 mil t (Santos e Macêdo, 2002). Paraíba, Pernambuco, Alagoas, Bahia e Maranhão
são os principais produtores dessa Dioscoreaceae na região. O estado de Alagoas é
responsável pela quinta maior produção do país, com 27,172 t e área plantada de 2.292
ha. Os principais municípios produtores são Chã Preta, Paulo Jacinto, Viçosa (Vale do
Paraíba), Taquarana e União dos Palmares (IBGE, 2008).
Entre as 600 espécies do gênero Dioscorea, estima-se que ocorram no Brasil
entre 150 e 200, mas a maioria é pouco estudada (Pedralli, 2002). Somente 14 são
cultivadas, por produzirem túberas comestíveis, com destaque para D. cayennensis
(Lam.), D. alata (L.), D. rotundata (Poir). e D. esculenta (Lour.) Burk. (COPR, 1978).
Nos campos de produção localizados no Nordeste, a espécie predominante é a D.
cayennensis (Moura, 1997), de hábito trepador e de caule herbáceo. Uma única cultivar,
conhecida por Da Costa, é a mais plantada e é considerada como de alto valor
econômico.
O ciclo do inhame tem quatro estádios fenológicos: dormência, vegetativo,
reprodutivo e maturação fisiológica (Santos, 1996). A dormência fisiológica
corresponde ao período do plantio à brotação das túberas-semente. O estádio vegetativo,
que corresponde ao período da brotação ao início do florescimento, ocorre entre 20 e
180 dias após o plantio (DAP) e caracteriza-se por quatro fases morfológicas: brotação
(20 a 80 DAP), surgimento das primeiras folhas (80 a 90 DAP), formação de ramos
primários (90 a 120 DAP) e formação de ramos secundários (120 a 150 DAP). Entre o
terceiro e o quarto mês de plantio, com o aparecimento dos ramos primários, inicia-se a
tuberização, que se estende até o final do ciclo fisiológico da cultura. No estádio

reprodutivo, período do início da floração ao secamento das flores (180 a 210 DAP),
ocorre a maturação parcial da túbera, que pode ser colhida para fim comercial, por meio
da “capação”, técnica tradicional para produção de sementes. O estádio de maturação
corresponde ao período do término da floração à colheita (210 a 270 DAP). Uma planta
de inhame produz dois tipos de túberas: as comerciais, colhidas seis a sete meses após o
plantio, e as sementes, colhidas dois meses após as comerciais (Mafra, 1986).
O inhame é um produto agrícola de alto valor econômico para os mercados
interno ou externo, que movimenta e beneficia a economia das zonas produtoras. A
importância alimentar do inhame decorre do seu alto valor nutritivo e energético (Santos
e Macêdo, 2002), pois é rico em carboidratos e vitaminas do complexo B (Moura,
2005), vitamina A, ácido ascórbico e grãos de amido (responsáveis pela alta
digestibilidade).

1.2 Aspectos fitossanitários da cultura de inhame
Apesar de o inhame ser plenamente adaptado às condições edafo-climáticas do
Nordeste brasileiro e ser cultura de fácil manejo (Mafra, 1986), as doenças são
limitantes à produção, pois podem reduzir a produtividade e o valor unitário das túberas
destinadas ao comércio interno e às exportações (Moura, 1997; Santos, 1996).
A qualidade das túberas sementes em geral é baixa, com altos índices de
infestação pelos nematóides Scutellonema bradys (Steiner e LeHew) Andrássy ou
Pratylenchus coffeae (Zimmermann) Filipjev e Stekhovem, causadores da doença casca
preta; e Meloidogyne incognita (Kofoid e White) Chitwood, M. javanica (Treub)
Chitwood e M. arenaria (Neal) Chitwood, responsáveis pela meloidoginose, conhecida
vulgarmente por bolba do inhame. Infestações múltiplas envolvendo um nematóide
causador da casca preta e outro da meloidoginose são frequentes (Moura, 2002).
As podridões causadas por Penicillium sclerotigenum (Yamamoto) e Rhizopus
oryzae (Went e Prinsen Geerl) afetam túberas em diferentes situações (Moura, 1987;
Moura, 2002).

Além destas, a cultura também pode ser afetada pela rizoctoniose

causada por Rhizoctonia solani (Kühn), que foi relatada pela primeira vez infectando
caule de plantas de inhame no Brasil por Silva et al. (2000).

A antracnose, causada pelo fungo Glomerella cingulata (Colletotrichum
gloeosporioides Penz.), afeta principalmente a espécie D. alata, na forma de manchas
foliares de coloração marrom avermelhada nas folhas e caule, que podem coalescer
formando grandes áreas necrosadas e, consequentemente, reduzir de forma expressiva a
produção de túberas (Coelho, 2002). A patogenicidade de C. gloeosporioides em D.
cayennensis nunca foi comprovada, o que leva a crer que se trata de um agente
secundário em lesões provocadas por C. eragrostidis (Moura, 1997).
Problemas bióticos de importância econômica não determinada são as viroses. O
mosaico das folhas, ou virose do inhame, causado por um Potyvirus (Dasheen mosaic
virus) não tem causado sérios problemas para a cultura no Brasil (Moura, 2002). Na
África Central e Ocidental há a incidência de outras viroses como as causadas pelos
Potyvirus (Yam mosaic virus e Dioscorea alata virus), o Badnavirus (Dioscorea alata
virus), e o Cucumovirus (Cucumber mosaic virus) (IITA, 2009).

1.2.1. Queima das folhas do inhame
Na parte aérea, a principal doença é a queima das folhas, também conhecida por
requeima, pinta preta e varíola (Moura, 1997), que tem como agente causal o fungo
Curvularia eragrostidis (Henn.) Meyer. A queima é uma das principais doenças do
inhame, chegando a reduzir em 35 a 40% o peso das túberas comerciais
(EMATER/IPA, 1985). Esta doença foi reportada pela primeira vez no Brasil, em
Pernambuco, em 1964 (Medeiros e Aquino, 1964).
A espécie Cochliobolus eragrostidis (Tsuda e Ueyama) Sivan. (anamorfo:
Curvularia eragrostidis) pertence ao Filo Ascomycota; Classe Loculoascomycetes;
Ordem Pleosporales; Família Pleosporaceae (Alexopoulos, 1996). Em meio de cultura,
a fase anamórfica apresenta conidióforos com dimensões de 521 x 6 µm (Moura, 2005),
solitários ou em grupos, simples ou raramente ramificados, retos a flexuosos, algumas
vezes geniculados, multiseptados, com coloração marrom, variando no comprimento,
com aproximadamente 6 µm de espessura. Os conídios têm forma elipsoidal ou ovóides,
com dimensões de 18 – 37 x 11 – 20 µm, com três septos, sendo que o septo mediano
apresenta-se com uma banda espessa e escura, as células centrais com coloração
marrom escura e as células externas de coloração marrom pálida (Sivanesan, 1987). Em

meio de cultura BDA forma colônias circulares de aspecto cotonoso e de coloração
negra (Moura, 2005).
A fase teleomórfica, Cochliobolus eragrostidis é observada apenas em
condições de laboratório. Os ascomas são superficiais, globosos a sub-globosos,
escuros, com 375 – 750 µm de largura, com bico ostiolar protuberante, desenvolvendo
sobre estroma colunar ou plano, firmemente aderido ao substrato na base; bico ostiolar
com dimensões de 250 – 1125 x 85 – 190 µm e ápice hialino. Ascas bitunicadas, a
maioria cilíndrica, com oito ascósporos, têm dimensões de 150 – 240 x 12,5 – 22 µm e
pseudoparáfises hialinas. Os ascósporos são hialinos, filiformes ou flageliformes, com
12 a 22 septos paralelamente a frouxamente espiralados nas ascas ou raramente
espiralados em uma hélice, e têm dimensões de 175 – 240 x 3,8 – 6,3 µm, com ou sem
uma fina camada mucilaginosa (Sivanesan, 1990).
Os sintomas primários da queima das folhas são manchas foliares necróticas, de
coloração marrom-escura, que tendem para o formato circular e atingem, em média, 2 a
3 cm de diâmetro, frequentemente circundadas por halos amarelos. É comum a
coalescência de manchas, formando grandes áreas necrosadas. Quando incide sobre
plantas jovens, que possuem folhas em desenvolvimento, o crescimento é afetado e as
folhas retorcidas apresentam um quadro típico de crestamento, o que resulta em perdas
elevadas. Em menor frequência, ocorrem lesões nos pecíolos e ramos. Os sintomas
reflexos são o desenvolvimento reduzido da planta e a desfolha, com a redução drástica
no tamanho das túberas comerciais e sementes (EMATER/IPA, 1985; Moura, 1997).
Sob condições ambientais favoráveis, o patógeno pode provocar, em pouco
tempo, a destruição completa dos campos de cultivo, com o aparecimento de grandes
áreas de plantas queimadas e mortas (Michereff et al., 2000). Temperaturas noturnas de
20 a 22°C com umidade relativa de 100% e temperaturas diurnas, na faixa de 25 a 28°C,
com umidade relativa de 65%, e presença de vento, são consideradas condições
favoráveis a epidemias de queima das folhas. A dispersão dos esporos de C.
eragrostidis ocorre principalmente pelo vento (Sivanesan, 1990) e maior incidência e
severidade ocorrem em épocas chuvosas e em culturas irrigadas por aspersão quando as
perdas podem atingir 100%, caso medidas preventivas não sejam aplicadas (Moura,
2002; Moura, 2005). Os restos culturais e as túberas-semente infestadas constituem as

principais fontes de inóculo primário de C. eragrostidis na cultura do inhame (Mignucci
et al., 1985). Contudo, é provável que o inóculo possa ser proveniente de outros
hospedeiros, uma vez que C. eragrostidis é relatada por ocorrer em espécies botânicas
de outras famílias como sorgo (Sorghum bicolor (L.) Moench (S. vulgare Pers.)), batata
doce (Ipomoea batatas (L.) Lam.), amendoim (Arachis hypogea L.), abacaxi (Ananas
comosus (L.) Merr.) (Menezes e Oliveira, 1993), arroz (Oryza sativa L.) (Rashid, 2001),
chá (Camellia sinensis (L.) Kuntze) (Dasgupta et al., 2005) e tomate (Solanum
lycopersicum L.) (Peregrine e Ahmad, 1982).
Aplicações de fungicidas protetores são realizadas com o propósito de reduzir as
perdas de produção decorrentes da queima foliar. Atualmente, como não existem
fungicidas registrados para a cultura do inhame junto ao Ministério da Agricultura
(Agrofit, 2009), o controle da queima das folhas é baseado, principalmente, em
pulverizações de fungicidas como maneb, mancozeb e iprodione, realizadas logo após o
aparecimento dos primeiros sintomas (Santos, 1996). Observações quanto à
sensibilidade de isolados de C. eragrostidis a mancozeb e iprodione foram realizadas e
todos os isolados foram sensíveis a esses produtos, em testes realizados in vitro e in vivo
(Paula, 2000).
Práticas complementares como tratamento das túberas-semente com fungicidas
antes do plantio e eliminação de restos culturais também são recomendadas (Mignucci
et al., 1985). Uma alternativa ao uso dos fungicidas sintéticos são os óleos essenciais.
Kishore et al. (2007) usaram óleo de canela (Cinnamomum zeylanicum J.Presl) e cravo
(Syzygium aromaticum (L.) Merrill & Perry) no controle in vitro de Curvularia lunata
(Wakker) Boedijn, Alternaria alternata (Fr.) Keissl., Aspergillus flavus Johann Heinrich
Friedrich Link, Fusarium moniliforme Sheldon, F. pallidoroseum (Cooke) Sacc. e
Phoma sorghina (Sacc.) Boerema Dorenbosch & van Kest, e observaram completa
inibição de crescimento na presença de citral (componente dos óleos). No entanto, o uso
de óleos essenciais no campo normalmente não é prática bem sucedida, pelo fato de
serem voláteis na natureza, tornando-se rapidamente ineficazes. Além disso, a maioria
tem maior efeito fungistático que fungicida. A utilização de extratos de plantas
medicinais com propriedades antifúngicas destaca-se também como alternativa
potencial para substituir a proteção tradicional promovida pela aplicação de fungicidas
químicos e pode ser agregada às demais práticas de manejo integrado de doenças e

contribuir para atender à crescente demanda internacional e nacional por produtos
orgânicos (Carvalho et al., 2002). Apesar de promissoras, estas práticas ainda
necessitam de comprovação de eficácia em condições de campo, em larga escala
espaço-temporal.
Considerando o contexto sócio-econômico de exploração da cultura do inhame
na região Nordeste do Brasil, é necessário controlar a queima foliar sem depender da
aplicação de fungicidas ou com quantidades mínimas destes compostos. O plantio de
variedades resistentes é a medida de controle mais eficiente para o manejo da queima
foliar. Porém, para que programas de melhoramento sejam bem sucedidos é necessário
conhecer a estrutura genética da população de C. eragrostidis.

1.3 Estrutura genética de populações de fitopatógenos
A estrutura genética de populações de fitopatógenos refere-se à quantidade de
variabilidade genética existente e de sua distribuição dentro de e entre populações
(Milgroom, 1995). O conhecimento da estrutura genética é componente essencial no
estudo da biologia de populações de fitopatógenos. A variação genética é importante
para o processo evolutivo, por essa razão, a compreensão dos mecanismos evolutivos
que atuam na população de patógenos é o objetivo comum em estudos de biologia de
populações. Do ponto de vista evolutivo, a variabilidade genética das populações é
importante, pois determina o potencial de adaptação do organismo às diferentes
condições. Do ponto de vista epidemiológico, a variabilidade patogênica tem
implicações diretas para o manejo da doença. Por exemplo, a maior agressividade de
isolados de um patógeno implica em maior quantidade de fungicidas para controlar a
doença (Kato et al., 1997) ou no manejo estratégico de variedades resistentes
(McDonald e Linde, 2002a). Sensibilidade a fungicidas e desenvolvimento de
resistência são fortemente influenciados pelos processos evolutivos que afetam
populações de fitopatógenos (Wolfe e Caten, 1987; Milgroom e Fry, 1997; Gisi et al.,
2002; Milgroom e Peever, 2003). Após a introdução de um novo agente seletivo como
um gene R ou fungicida, novas mutações no gene correspondente de avirulência (Avr)
ou no gene alvo do fungicida podem aumentar a variabilidade genética para virulência
ou sensibilidade ao fungicida (Stukenbrock e McDonald, 2009).

Uma vez compreendidas as maneiras como populações de fitopatógenos mantêm
a variabilidade genética, é possível inferir sobre a taxa com a qual estas populações
evoluem e sobre a durabilidade de medidas de controle (McDonald e Linde, 2002a). A
vida útil de fungicidas é determinada, em grande parte, pela taxa de evolução de
populações de fitopatógenos e a rapidez com que variantes tolerantes ao produto são
selecionados numa população (Anderson, 2005; Grünwald et al., 2006; Van den Bosch
e Gilligan, 2008). Em fungos fitopatogênicos, recombinação e mutação são as principais
fontes de variabilidade genética (Burdon e Silk, 1997). Em populações de estrutura
panmítica (acasalamento aleatório) ocorre maior diversidade genotípica e, em tese, há
maiores chances de seleção de isolados resistentes que em populações de estrutura
clonal (organismos que se reproduzem exclusivamente ou preferencialmente de modo
assexuado) (Grünwald et al., 2006). Em adição ao modo de reprodução, mutação e
migração são também muito importantes. Mutações podem alterar a sensibilidade do
indivíduo a fungicidas que, sob seleção, pode contribuir para transferir a sensibilidade à
população inteira. Para patógenos que se reproduzem predominantemente de forma
assexuada, como C. eragrostidis, a taxa de mutação desempenha papel importante na
evolução das populações ao criar variantes resistentes e que poderão ser selecionadas
com a aplicação de fungicidas (Gisi e Sierotzki, 2008; Van den Bosch e Gilligan, 2008),
como aconteceu com Alternaria alternata, A. brassicicola (Schwein.) Wiltshire e A.
dauci (J.G. Kühn) J.W. Groves e Skolko que adquiriram resistência ao fungicida
iprodione (Huang e Levy, 1995, Solel et al., 1996).
Em contraposição, o uso de fungicidas pode afetar a evolução e a estrutura de
populações de fitopatógenos. No caso de Blumeria graminis f.sp. hordei (DC.) Speer,
ocorreu redução da variabilidade genética de populações e houve predominância de
isolados resistentes, quando com aplicações sucessivas do fungicida fenpropimorph
(O'Hara et al., 2000). Neste exemplo, o potencial evolutivo da população foi alterado
com a redução da variabilidade genética (resultado de seleção) e a estrutura
populacional mudou de panmítica para clonal. O uso racional de fungicidas efetivos,
associado ao plantio de variedades com resistência duradoura, contribui para aumentar a
eficiência do controle da doença.
No Brasil, as informações na literatura sobre a sensibilidade de C. eragrostidis
aos principais fungicidas empregados para o controle da pinta preta, são limitadas.

Consequentemente, não há informações sobre a evolução da resistência a fungicidas nas
populações deste patógeno. A sensibilidade de C. lunata ao tricyclazole foi observada
com o bloqueio da biossíntese de melanina, causando o acúmulo de metabólitos. O gene
1,3,8-trihidroxinaphtileno redutase (3HNR), associado com a via da melanina de C.
lunata, foi identificado e caracterizado (Ri ner e Wheeler, 2003). Até o presente, não há
fungicida sistêmico registrado no Ministério da Agricultura para controlar a queima das
folhas do inhame, causada por C. eragrostidis.
A durabilidade de variedades resistentes pode ser estimada com base em
informações da estrutura genética de populações de fitopatógenos (McDonald e Linde,
2002a). Por exemplo, a durabilidade do gene Xa7, que confere resistência de arroz à
queima bacteriana (Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Ishiyama 1922) Swings et al.), foi
determinada com base em estudo da estrutura genética da população da bactéria em
conjunto com estudos de variabilidade patogênica, principalmente de atributos
relacionados à adaptabilidade do patógeno (Vera Cruz et al., 2000). Visando prolongar a
vida útil de variedades resistentes, a estratégia de seu uso é determinada com base na
quantidade de variabilidade genética e na sua distribuição. Um exemplo clássico é o
sistema de recomendação de variedades de trigo resistentes à ferrugem do colmo nos
Estados Unidos, feita com base na distribuição de patótipos de Puccinia graminis f.sp.
tritici Pers. (Frey et al., 1973). No entanto, o sucesso da estratégia de plantio de
materiais com resistência é, frequentemente, comprometido devido à variabilidade
patogênica, evidenciada pelo surgimento de novas raças ou patótipos de P. graminis
f.sp. tritici (Visser et al., 2009). O maior risco para a produção de trigo é a perda da
efetividade do gene Sr31, que é responsável pela resistência a ferrugem causada pela
raça Ug99. O conhecimento da raça auxilia na geração de informação em relação à
virulência e sua frequência e distribuição espacial e temporal (Admassu et al., 2009).
Programas de melhoramento visando resistência a patógenos podem ser
orientados pelos conhecimentos da estrutura genética de populações de patógenos.
McDonald e Linde (2002b) propuseram um modelo para auxiliar na definição de
estratégias de melhoramento visando aumentar a durabilidade da resistência, que se
baseia no potencial evolutivo de populações de fitopatógenos. Por sua vez, o potencial
evolutivo é determinado com base na estrutura genética das populações. Em síntese, o
modelo considera a quantidade e a distribuição da variabilidade genética da população.

No caso de patógenos que apresentam alta variabilidade genética e há intenso fluxo
gênico entre populações, a melhor estratégia seria o uso de resistência do tipo
quantitativa (“horizontal” sensu Van der Plank (1963)), associada ao manejo de
variedades com genes de efeito maior de resistência (“resistência vertical”), em
esquemas de misturas de cultivares ou multilinhas. Para populações com baixa
variabilidade genética e pouco sujeitas a fluxo gênico, o uso de variedades com
resistência conferida por genes de efeito maior (“vertical”) seria a melhor estratégia,
como para Fusarium oxysporum Schlecht. emend. Snyder e Hansen (McDonald e
Linde, 2002a; McDonald e Linde, 2002b). Nesta perspectiva, quantificou-se a
variabilidade genética de Phaeoisariopsis griseola L., fungo causador da mancha
angular do feijoeiro, dentro de populações da América Central, utilizando marcadores
RAPD (Mahuku et al, 2002). Concluiu-se que o manejo da doença seria mais eficiente
com a piramidação de genes de resistência em uma cultivar do que com a utilização de
variedades com genes de efeito maior.
O estudo da dinâmica da variabilidade genética de populações de fitopatógenos é
necessário para conhecer como as populações evoluem e as implicações para
durabilidade de medidas de controle de doenças (McDonald et al., 1999). Para
compreensão da variação espacial e temporal na resistência e virulência, torna-se
necessário combinar métodos de diferentes áreas de pesquisa como, por exemplo,
análises moleculares acopladas com análises estatísticas de genética de populações e
evolução, pois essas variações são de grande interesse para o desenvolvimento de
estratégias de manejo bem sucedidas (Stukenbrock e McDonald, 2009).

2 LITERATURA CITADA
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_____________________________________________________________Capítulo II

LEVANTAMENTO DE ESPÉCIES DE Curvularia ASSOCIADAS A INHAME
NO ESTADO DE ALAGOAS

Trabalho a ser submetido à Revista Tropical Plant Pathology

LEVANTAMENTO DE ESPÉCIES DE Curvularia ASSOCIADAS A INHAME
NO ESTADO DE ALAGOAS

Edlene M. S. Moraes1; Braz T. Hora Júnior2; Saulo A. S. Oliveira2; Eduardo S. G. Mizubuti1,2. 1Centro de
Ciências Agrárias/ Universidade Federal de Alagoas, CEP 57100-000, Rio Largo, Alagoas, Brasil;
2

Departamento de Fitopatologia/ Universidade Federal de Viçosa, CEP 36570-000, Viçosa, Minas Gerais,

Brasil.
Autor para correspondência: Eduardo S. G. Mizubuti. e-mail: mizubuti@ufv.br

RESUMO
Folhas de inhame (Dioscorea cayennensis) com sintomas de queima foram coletadas
nos municípios alagoanos de Viçosa, Chã Preta e Paulo Jacinto, em 2005 e 2008. Foram
obtidos 73 isolados, e com base em características morfológicas, os mesmos foram
identificados como Curvularia eragrostidis (CE). Foi realizado teste de patogenicidade
com 7 isolados e todos foram patogênicos. Houve diferença quanto aos valores de
AACPD entre os isolados (F= 3,8; P= 0,02). Quando diferentes isolados foram pareados
em meio de cultura, a maioria mostrou reação de compatibilidade micelial. Realizou-se
o sequenciamento da região ITS de 10 isolados e de parte do gene da β-tubulina de 8
isolados. Análises de similaridade (BLAST) e filogenéticas usando os métodos de
Neighbor-Joining, Máxima Parcimônia e Máxima Verossimilhança (esta última apenas
para ITS) confirmaram a identificação de apenas uma espécie associada à queima foliar
do inhame. A população de C. eragrostidis associada à queima foliar do inhame tem
alta variabilidade genética e patogênica.

Palavras chave: Variabilidade genética. Filogenia. Queima das folhas.

ABSTRACT
Yam

leaves

(Dioscorea

cayennensis)

with

symptoms

blight

were

collected in the municipalities of Viçosa, Chã Preta, and Paulo Jacinto, Alagoas State, in
2005 and 2008. A total of 73 isolates were obtained and based on morphological
characteristics, they were identified as Curvularia eragrostidis (CE). Pathogenicity tests
were conducted with 7 isolates and all were pathogenic to yam. Values of the area under
the disease progress curve varied among isolates (P= 0.02). When different isolates
were paired in culture, most showed mycelial compatibility reaction. Sequences of the
ITS region were obtained for 10 isolates and of part of the β-tubulin gene for 8 isolates.
Similarity and phylogenetic analysis (BLAST) using Neighbor-joining, Maximum
Parsimony and Maximum Likelihood (only for ITS) methods supported the
identification of only one species associated to yam leaf blight in Alagoas State. The
population of Curvularia eragrostidis associated with leaf blight of yam has high
genetic and pathogenic variability.
Keywords: Genetic variability. Phylogeny. Leaf blight.

1 INTRODUÇÃO
O inhame (Dioscorea cayennensis Lam.) é cultura tropical cultivada
principalmente na África, mas tem grande importância na região Nordeste do Brasil
(Mesquita, 2002). Além de sua importância na dieta, a produção de túberas constitui
fonte de recursos financeiros para agricultores de baixa renda. Na Nigéria, Costa do
Marfim e Gana, maiores produtores de inhame, grande parte da produção é destinada à
exportação aos grandes mercados consumidores: Japão e Estados Unidos. No Brasil, o
cultivo do inhame é regionalizado e maiores áreas concentram-se no Nordeste. Nessa
região, a produtividade da cultura é reduzida pela ocorrência de doenças. Dentre essas, a
queima das folhas, causada pelo fungo Curvularia eragrostidis (Henn) Meyer, é uma
das mais destrutivas (Moura, 1997).
Apesar de C. eragrostidis ser considerada a principal espécie causadora de
queima das folhas, é possível que outras espécies de Curvularia também possam estar
envolvidas. A separação de espécies de Curvularia é baseada principalmente em
aspectos da morfologia conidial tais como tamanho dos esporos, número de septos, o
formato (reto ou curvado), e presença ou ausência de uma célula inchada no conídio
(Sivanesan, 1987). Dois fatores dificultam a correta identificação do agente causal: 1. A
subjetividade de algumas características morfológicas de importância taxonômica,
como, por exemplo, a protuberância do hilo; além do fato de essa característica ser
pouco informativa filogeneticamente (Sun et al., 2003); e 2. A alta variabilidade
constatada entre isolados do patógeno (Paula, 2000) dificulta a identificação correta do
agente causal e torna plausível o envolvimento de mais de uma espécie associada à
queima das folhas. Portanto, a identificação do agente causal baseado apenas em
características morfológicas pode incorrer em equívocos.

A utilização de ferramentas moleculares para identificação de espécies e o
estudo das relações filogenéticas têm contribuído para elucidar aspectos ainda não bem
compreendidos sobre a taxonomia e biologia de fungos fitopatogênicos. Sequências da
região do espaçador interno transcrito – ITS (Internal Transcribed Spacer) são úteis
para identificação e determinação do relacionamento entre gêneros e espécies de fungos
(Glass e Donaldson, 1995). Análises filogenéticas com base em sequências da região
ITS de isolados de Bipolaris oryzae (Breda de Haan) Shoemaker, que têm diferentes
tipos de germinação conidial, juntamente com sequências de outras espécies de
Pleosporaceae, incluindo Curvularia sp. confirmaram o alto nível de proximidade
genética entre essas espécies e o compartilhamento do mesmo teleomorfo, Cochliobolus
sp. (Dela Paz, 2006). Outro gene comumente utilizado para estudos de filogenia
molecular é o que codifica para a β-tubulina (Couch e Kohn, 2002; Keeling et al., 2000;
O’Donnell et al., 2000, Than et al., 2008). A proteína é usualmente sintetizada em altos
níveis durante o crescimento celular e a sequência de nucleotídeos do gene que a
codifica é frequentemente usada em análises filogenéticas para distinguir entre
diferentes espécies e/ou diferentes subgrupos dentro das espécies (Banke et al., 2004).
Apesar do potencial de contribuição da filogenia molecular para melhor
entendimento da classificação e taxonomia de fungos fitopatogênicos, estudos de
delimitação de espécies devem também envolver avaliações de isolamento reprodutivo.
Uma das ferramentas mais comumente empregadas para tal propósito é o teste de
compatibilidade micelial (Leslie, 1993). Por exemplo, testes de compatibilidade foram
realizados com Colletotrichum lindemuthianum (Sacc. e Magnus) Briosi e Cavara, e C.
gossypii Southw. e observou-se incompatibilidade em todos os pareamentos analisados
e ausência de troca de material genético entre os isolados, indicando isolamento
reprodutivo entre as espécies (Roca et al., 2004). Isolados de Sclerotium rolfsii (Sacc.)

foram separados por Serra e Silva (2005) em diferentes grupos de compatibilidade
vegetativa (GCV) com base na formação de zona de aversão, ou ausência desta, quando
os isolados foram pareados em meios de cultura. Quando houve anastomose, os isolados
puderam ser agrupados em um mesmo GCV e, nesse caso, houve similaridade genética
entre os indivíduos. Nesse trabalho, observou-se, também, haver semelhanças de
atributos biológicos, fisiológicos e patogênicos entre isolados de mesmo GCV. Apesar
da utilidade desse teste, até o presente, não se tem conhecimento de análise de
compatibilidade micelial entre isolados de Curvularia spp. que afetam inhame.
O conhecimento detalhado do agente causal de determinada doença é essencial
para que estudos epidemiológicos possam resultar em desenvolvimento de estratégias
eficientes de manejo. Especificamente, busca-se conhecer as espécies comumente
associadas à doença, bem como compreender o relacionamento filogenético do
patógeno e a dinâmica de suas populações (Kohn, 2004; Jeger e Pautasso, 2008). Do
ponto de vista aplicado, tais estudos são importantes para subsidiar programas de
melhoramento visando obtenção de variedades resistentes, estratégia de suma relevância
para culturas de importância sócio-econômica em regiões carentes de países em
desenvolvimento (Danial et al., 2007). Apesar da importância da queima das folhas do
inhame, existem poucos estudos no Brasil sobre a variabilidade genética de isolados de
C. eragrostidis. O presente trabalho teve como principal objetivo realizar o
levantamento de espécies de Curvularia associadas à queima das folhas por meio de
análises morfológicas, estudar as relações filogenéticas do patógeno com base nas
regiões ITS e β-tubulina e avaliar o grau de compatibilidade micelial entre isolados
obtidos de diferentes locais visando analisar a diversidade do agente causal.

2 MATERIAL E MÉTODOS
2.1 Obtenção dos Isolados
Folhas com lesões características da queima foram coletadas em campos de
produção localizados em três municípios alagoanos do Vale do Paraíba: Chã Preta,
Paulo Jacinto e Viçosa (Figura 1). No ano de 2005 foram selecionadas 30 áreas ao acaso
e em 2008, 13 áreas. Durante a coleta foram registrados os estádios fenológicos da
cultura: vegetativo (da brotação ao início do florescimento) e maturação (do término da
floração à colheita) (Santos, 1996), assim como as coordenadas geográficas com
aparelho portátil de posicionamento global (GPS) (Tabela 1).
Em condições de laboratório foram realizados procedimentos para isolamento do
patógeno. Os isolados foram cultivados em meio BDA (Batata, 200g; Dextrose, 20g; e
Ágar, 17g), a 26ºC. Após 7 dias de incubação, obteve-se cultura pura e
subsequentemente cultura monoconidial dos isolados. As culturas foram mantidas em
tubos com meio inclinado e posteriormente armazenadas pelo método de Castellani
(Gonçalves et al., 2007).
2.2 Testes de Patogenicidade e Progresso da Doença
Sete isolados de C. eragrostidis selecionados ao acaso foram utilizados para
realização do teste de patogenicidade. Conídios foram retirados de colônias crescidas
em BDA, a 26ºC, durante 7 dias, após a adição de 10 mL de água destilada esterilizada
às colônias e raspagem com escovas de cerdas macias. A suspensão obtida foi filtrada
em camada dupla de gaze e teve a concentração ajustada para 5 x 105 conídios/mL.
Adicionou-se 0,1% de Tween 20 à suspensão.

Folhas sadias de plantas de inhame cultivar Da Costa de aproximadamente 45
dias de idade, cultivadas em vasos em casa-de-vegetação, foram inoculadas com as
suspensões de conídios preparadas a partir de culturas monospóricas de cada um dos 7
isolados. A inoculação foi efetuada com auxílio de atomizador manual e as plantas
foram mantidas em câmara úmida por 48 h, em casa de vegetação. Após este período, a
severidade da queima foliar foi avaliada diariamente até 15 dias após a inoculação, com
auxílio da escala de notas (Michereff et al., 2000). Folhas pulverizadas com solução de
água e Tween 20 a 0,1 % foram mantidas como controle negativo. A área abaixo da
curva de progresso da doença (AACPD) foi estimada para cada isolado, em cada
repetição (Shaner e Finney, 1977). O experimento foi em delineamento inteiramente
casualizado com três repetições, onde cada par de folíolos inoculado constituiu uma
repetição. Os valores de AACPD foram transformados por raiz quadrada e submetidos à
análise de variância (ANOVA). As médias foram comparadas pelo teste de Tukey a 5%
de probabilidade usando o programa R version 2.9.1 (R Development Core Team,
2008).
2.3 Análise da morfologia de conídios
A análise morfológica de 33 isolados foi avaliada. Conídios da borda das
colônias crescidas em BDA por 7 dias, a 26ºC, sob regime de luz contínua, foram
coletados com alça de platina e transferidos para uma gota de lactofenol
(aproximadamente 50 µL) previamente depositada em lâmina para microscópio. Em
seguida, os conídios foram visualizados ao microscópio (40X), fotografados com
câmera digital, e mensuraram-se o comprimento e largura de 48 conídios por isolado.
Calcularam-se as médias das dimensões dos conídios de cada isolado e estes valores
foram utilizados para a identificação da espécie baseada em chave dicotômica para
espécies de Curvularia (Sivanesan, 1987).

2.4 Compatibilidade vegetativa
Três isolados foram selecionados para o teste de compatibilidade vegetativa: um
de cada município (CEV3A, CEPJ10A e CECP11A). Os isolados foram pareados em
todas as combinações, incluindo o auto pareamento para servir como controle. Dois
discos de 5mm de diâmetro de colônias de 4 dias de idade foram transferidos para BDA
em placas de Petri (9cm de diâmetro) e dispostos equidistantes de 2cm. Os pareamentos
foram realizados em placas individualizadas sendo cada pareamento realizado por 2
vezes. Adicionalmente, uma placa com múltiplos pareamentos, contendo 12 discos de
micélio também foi mantida a 26°C e fotoperíodo de 12 h. Após a incubação, os
isolados foram avaliados observando-se a presença ou ausência de zonas de aversão na
região de contato micelial aos 7 e 14 dias de incubação (Serra e Silva, 2005).
2.5 Extração de DNA, amplificação, purificação e sequenciamento das regiões ITS
e β-tubulina
Os isolados CE1B, CE6D, CE10A, CE20A, CE21A, CE22C, CE24, CEV3A,
CEV5A e CEPJ10A, foram cultivados em meio líquido (sacarose 10 g, L-asparagina 2
g, extrato de levedura 2 g, KH2PO4 1 g, MgSO4.7H2O 0,1 g, ZnSO4.7H2O 0,44 mg,
FeCl3.6H2O 0,48 mg, e MnCl2.H2O 0,36 mg) (Zauza et al., 2007) e mantidos sob
agitação a 150 rpm a 26°C durante 7 dias. Após esse período o micélio foi lavado com
água destilada e mantido em papel filtro esterilizado por 12 h para desidratação. Em
seguida, o micélio foi macerado com nitrogênio líquido em almofariz. A extração de
DNA foi realizada utilizando o protocolo de CTAB (Murray e Thompson, 1980). O
pellet obtido foi ressuspendido em 50 µL de TE 1X com adição de RNAse A (1mg/ml)
(Sambrook et al., 1989) e incubado a 37ºC por 2 h. Uma alíquota do DNA extraído foi
aplicada em gel de agarose a 0,8% corado com brometo de etídio a 1,5% para
visualização e quantificação usando fago lambda como padrão de peso molecular. A

intensidade das bandas foi analisada visualmente após eletroforese. O DNA extraído foi
armazenado a -20ºC. As reações de PCR foram preparadas na presença de tampão 10X,
adicionado de 1,5mM MgCl2; 2,5mM de cada dNTP; 10µM de cada primer; 3,5U Taq
DNA Polimerase e 1µL de DNA diluído. O volume final foi ajustado para 50µL com
água ultra pura. A amplificação da região ITS rDNA (ITS1, 5.8S, ITS2) foi realizada
com os primers ITS4 (5’ TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC 3’) e ITS5 (5’ GGA AGT
AAA AGT CGT AAC AAG G 3’) (White et al., 1990). As condições de PCR foram:
desnaturação inicial a 95°C por 1 min seguida de 35 ciclos formados por 94°C por 1
min, 60ºC por 1:30 min para anelamento dos primers e extensão a uma temperatura de
72°C por 2 min. Parte da sequência do gene da β-tubulina foi amplificada com os
primers Bt1a (5’ TTC CCC CGT CTC CAC TTC TTC ATG 3’) e Bt1b (5’ GAC GAG
ATC GTT CAT GTT GAA CTC 3’) (Glass e Donaldson, 1995). As condições de PCR
foram: 94ºC por 5 min para a desnaturação inicial, seguida de 35 ciclos de desnaturação
por 30 s a 94ºC, anelamento por 2 min a 53ºC e extensão por 1 min a 72ºC.
Adicionalmente foi realizada uma extensão final a 72ºC por 5 min.
Os produtos amplificados foram visualizados após eletroforese em gel de
agarose a 0,8% com brometo de etídio a 1,5%. O marcador de massa de 100pb foi
utilizado para determinar o tamanho do fragmento gerado. As amostras foram
purificadas usando minicolunas, resinas de purificação e tampão, de acordo com
protocolo fornecido pelo fabricante (Roche - High Pure PCR Product Purification Kit).
As amostras purificadas foram enviadas para sequenciamento no Laboratório de
Genômica do Instituto de Biotecnologia Aplicada à Agricultura (BIOAGRO) da
Universidade Federal de Viçosa – MG. A leitura das amostras foi feita em sequenciador
automático MegaBACETM 1000 de 96 capilares (GE Healthcare). Os primers usados
para amplificar os fragmentos foram usados para direcionar o sequenciamento.

2.6 Análises filogenéticas
As sequências foram editadas manualmente usando o programa The Staden
Package, ver 1.6.0 (Staden, 1996) para gerar a sequência consenso. As sequências de
cada isolado foram submetidas ao BLASTn (Nucleotide Basic Local Alignment Search
Tool) para comparação com outras depositadas no GenBank e confirmação da espécie
(www.ncbi.nlm.nih.gov/). Os alinhamentos das sequências foram realizados com o
programa ClustalW (Thompson et al., 1994).
Três métodos de reconstrução filogenética foram empregados: Neighbor-Joining
(NJ), Máxima Parcimônia (MP) e Máxima Verossimilhança (ML) (Ridley, 2006). Para
análise de NJ, a distância foi calculada usando o modelo de Kimura 2-parâmetros
(Kimura, 1980) e utilizou-se o programa MEGA4 (Molecular Evolutionary Genetics
Analysis Program) (Tamura et al., 2007). A confiabilidade das árvores geradas foi
avaliada por meio de 1000 repetições bootstrap.
As análises de MP e ML foram realizadas usando o PAUP* (Phylogenetic
Analysis Using Parsimony) ver. 4.0b10, Sinauer Associates Inc., Sunderland,
Massachusetts (Swofford, 2003). A análise de ML foi realizada apenas para as
sequências de ITS. O modelo de substituição mais adequado foi selecionado pelo
Modeltest 3.7 (Posada e Crandall, 2001). As árvores de MP e ML foram submetidas a
1000 repetições bootstrap e visualizadas com o TreeView ver. 1.6.6 (Page, 1996).
2.6.1 ITS
As sequências de ITS foram alinhadas tomando-se como referência a sequência
de C. eragrostidis depositada no GenBank (AF163077). A sequência outgroup consistiu
de Bipolaris heveae também depositada no GenBank (AB179835) (Tabela 2).

2.6.2 β-tubulina
Árvores filogenéticas para as sequências parciais de β-tubulina foram obtidas
com oito sequências de C. eragrostidis geradas neste estudo. Uma sequência de
Stemphylium botryosum obtida do GenBank (3688539) foi utilizada como outgroup
(Tabela 3).

3 RESULTADOS
3.1 Isolados
Foram obtidos 73 isolados de Curvularia eragrostidis. Os isolados formaram
colônias circulares de aspecto cotonoso e de coloração escura com a presença de grande
quantidade de conidióforos e conídios.
3.2 Teste de Patogenicidade e Progresso da Doença
Todos os isolados testados foram patogênicos ao inhame. Os primeiros sintomas
da doença, caracterizados por pequenas manchas escuras, foram observados 48 h após a
inoculação. Houve diferença entre os isolados quanto aos valores de AACPD (F= 3,8;
P= 0,02). Os isolados CE2A e CE5 diferiram quanto ao valor da AACPD e resultaram
em maior e menor valores, respectivamente. Os demais não diferiram estatisticamente
entre si (Figura 2).
3.3 Análise da morfologia de conídios
Dos 73 isolados obtidos, 33 isolados foram analisados detalhadamente quanto à
morfologia, e apresentaram características típicas de C. eragrostidis.

Os conídios apresentaram-se ovóides, com três septos, um tipicamente mediano
com uma banda mais escura, células centrais de coloração marrom e células das
extremidades mais claras, típicos da espécie, conforme descrito anteriormente
(Sivanesan, 1987). As medidas de comprimento e largura dos conídios variaram de 18,9
– 33,6 (26,2) µm x 10,1 – 16,0 (13,06) µm.
3.4 Compatibilidade vegetativa
Nos tratamentos utilizados como controle (auto pareamento), houve ausência de
zona de aversão entre as colônias, o que caracteriza a compatibilidade micelial e
evidencia a possível troca de material genético entre os isolados. Em geral, nos
pareamentos de colônias de diferentes isolados, não houve formação de zona de
aversão. Em apenas um caso, entre os isolados CEV3A e CEPJ10A, procedentes de
Viçosa e Paulo Jacinto, respectivamente, constatou-se formação de zona de aversão
pouco distinta ou fraca (Figura 3).
3.5 Amplificação e sequenciamento da região ITS e β-tubulina
A amplificação da região ITS resultou em fragmento de aproximadamente
500pb e a da β-tubulina, em fragmento de cerca de 400pb. As sequências de ITS dos
isolados utilizados no presente estudo apresentaram alta similaridade com a sequência
de C. eragrostidis depositada no GenBank (AF163077), com E-value igual a 0.0. Não
foram encontradas sequências de β-tubulina disponíveis de nenhuma espécie de
Curvularia depositada no GenBank.

3.6 Análises filogenéticas
3.6.1 Análise filogenética com base na região ITS
Topologias semelhantes foram recuperadas com os três métodos de reconstrução
filogenética. Os isolados sequenciados neste estudo foram posicionados junto à
sequência do isolado de C. eragrostidis obtida do GenBank (Figura 4). Na análise de
Máxima Parcimônia foram geradas três árvores igualmente parcimoniosas; o índice de
consistência (CI) foi de 0,955 e o índice de retenção (RI) foi de 0.500.
3.6.2 Análise filogenética com base na região da β-tubulina
Em todos os métodos filogenéticos, o relacionamento entre os 8 isolados de C.
eragrostidis sequenciados neste estudo e a sequência de S. botryosum obtida do
GenBank foi similar (Figura 5). Na análise de Máxima Parcimônia foram geradas duas
árvores igualmente parcimoniosas; o índice de consistência (CI) foi de 0,992 e o índice
de retenção (RI) foi de 0.909.

4 DISCUSSÃO
A espécie C. eragrostidis é o agente causal da queima foliar do inhame nos
principais municípios produtores de Alagoas. Contudo, existe a possibilidade do
envolvimento de mais de uma espécie associada à doença. Os resultados do teste de
compatibilidade vegetativa confirmam a ocorrência de apenas uma espécie como agente
causal da queima foliar do inhame em Alagoas. Em estudo recente, envolvendo espécies
de Alternaria causadoras de pinta preta em batateira e tomateiro, constatou-se haver
incompatibilidade entre isolados de A. grandis e A. tomatophila, agentes causais da
doença em batateira e tomateiro, respectivamente (Rodrigues, 2009). No entanto,

reações de compatibilidade foram observadas em alguns casos, possivelmente pelo fato
de haver um processo de especiação recente e isolamento genético ainda não concluído.
No caso de C. eragrostidis não houve correlação entre a compatibilidade vegetativa e a
origem geográfica dos isolados, pois isolados procedentes de locais diferentes foram
compatíveis. Conclui-se que o fator determinante da resposta de compatibilidade foi o
relacionamento filogenético.
A subjetividade na classificação de espécies de Curvularia com base em
características morfológicas foi relatada por outros autores (Sun et al., 2003). Métodos
moleculares, principalmente as análises de sequências de DNA têm sido úteis para
elucidar casos em que a delimitação de morfoespécies é confusa. Sequências da região
ITS do DNA ribossomal são comumente empregadas em análises filogenéticas
conduzidas para auxiliar na taxonomia de fungos (Glass e Donaldson, 1995). Devido
diferenças morfológicas e no DNA, Nakada et al. (1994) propuseram que C. lunata var.
aeria deveria ser tratada como nova espécie de Curvularia. Análises morfológicas
devem ser complementadas por ferramentas moleculares para aumentar a confiabilidade
das conclusões. A origem geográfica dos isolados não influenciou na formação dos
grupos.
Apesar de sequências da região da β-tubulina serem amplamente usadas em
análises filogenéticas, nenhuma sequência de espécies de Curvularia encontra-se
depositada no GenBank. Braun et al. (2003) utilizaram sequências de ITS e de βtubulina para analisar o relacionamento filogenético entre endofíticos e outras espécies
da Família Pleosporaceae. Concluiu-se que as espécies de endofíticos são mais similares
a espécies de Alternaria ou Embellisia que de outros membros de Pleosporaceae.

Aparentemente, as populações de C. eragrostidis associadas à queima foliar do
inhame têm alta variabilidade genética. Considerando o reduzido número de isolados
analisados no teste de patogenicidade, verificou-se haver diferenças de agressividade.
Neste estudo, o isolado CE2A foi o que resultou em maior valor de AACPD, diferindo
estatisticamente do isolado CE5. Thrall et al. (2005) avaliaram a variação de
agressividade dentro da metapopulação de Alternaria brassicicola (Schwein.) Wiltshire
que infecta Cakile maritima Scop. e observaram diferenças entre isolados, mas não
entre as populações do patógeno. Fato semelhante pode estar acontecendo em
populações de C. eragrostidis. Outra observação que sugere haver alta variabilidade
genética na população é a ocorrência de duas mutações na região ITS do isolado
CE21A, assim como uma inversão na sequência de β-tubulina do isolado CE22C.
Considerando que os isolados foram obtidos de regiões geográfica e temporalmente
próximas, a presença destas mutações nas sequências de DNA indica alta variabilidade
genética.

5 AGRADECIMENTOS
Os autores expressam agradecimentos ao Dr. Olinto Liparini Pereira pelo auxílio
na identificação das espécies utilizadas no estudo de filogenia molecular, à FAPEAL
pela concessão de bolsa de mestrado a Edlene Maria da Silva Moraes e ao CNPq pela
concessão de bolsa de Produtividade em Pesquisa de Eduardo S. G. Mizubuti.

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8 LISTA DE TABELAS E FIGURAS
Tabela 1.

Localização geográfica das áreas de plantio de inhame onde os 45
isolados de Curvularia eragrostidis foram obtidos.

Tabela 2.

Lista dos isolados utilizadas nos estudos filogenéticos com a 46
região ITS e seus respectivos números de acesso do GenBank.

Tabela 3.

Lista dos isolados utilizados nos estudos filogenéticos com o 47
gene da beta tubulina e o número de acesso no GenBank da
sequência outgroup.

Figura 1.

A. Mapa do Brasil com o Estado de Alagoas em destaque.
48
B. Mapa de Alagoas indicando as áreas amostrados em regiões
produtoras de inhame. CP: Chã Preta, PJ: Paulo Jacinto, VI:
Viçosa.

Figura 2.

Valores médios de área abaixo da curva de progresso da doença 49
(AACPD) da queima das folhas do inhame (Dioscorea
cayennensis) causada por diferentes isolados de Curvularia
eragrostidis, em condição de casa de vegetação.

Figura 3.

Compatibilidade micelial no auto pareamento, vista do verso (A) 50
e reverso (B) da placa. Arranjo de discos de micélio de
Curvularia eragrostidis em múltiplos pareamentos (ri: reação
incompatível; rc: reação compatível) visto no verso (C) e reverso
(D) da placa.

Figura 4.

Árvore filogenética de Máxima Parcimônia baseada em
sequências de ITS de 10 isolados de Curvularia eragrostidis
com Bipolaris heveae como outgroup. A barra de escala
representa 1 mudança e valores de suporte de bootstrap de 1000
repetições são apresentados nos ramos.

Figura 5.

Árvore filogenética de Máxima Parcimônia baseada em 52
sequências de β tubulina de 8 isolados de Curvularia
eragrostidis. A árvore foi enraizada com Stemphylium
botryosum. A barra de escala representa 1 mudança e valores de
suporte de bootstrap de 1000 repetições são apresentados nos
ramos.

Tabela 1. Localização geográfica das áreas de plantio de inhame onde os isolados de
Curvularia eragrostidis foram obtidos.
Área
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
V-01
V-02
V-03
V-04
V-05
V-06
PJ-07
PJ-08
PJ-09
PJ-10
CP-11
CP-12
CP-13

Latitude
09º20'47,9''
09º20'51,9''
09º20'54,5''
09º20'58,0''
09º21'37,2''
09º15'07,2''
09º15'09,2''
09º22'12,9''
09º18'42,6''
09º18'40,2''
09º18'54,9''
09º18'54,7''
09º18'57,4''
09º18'47,1''
09º15'15,2''
09º15'15,5''
09º15'15,6''
09º15'23,5''
09º15'06,9''
09º20'36,9''
09º17'00,3''
09º17'03,9''
09º17'00,5''
09º22'22,2''
09º22'31,2''
09º22'43,4''
09º22'55,0''
09º22'49,2''
09º22'53,8''
09º22'56,7''
09º23'54,0''
09º23'50,7''
09º24'02,4''
09º24'01,5''
09º23'30,6''
09º20'15,0''
09º22'40,5''
09º22'39,6''
09º21'09,7''
09º21'08,1''
09º15'31,7''
09º15'11,8''
09º15'07,2''

Longitude
36º15'18,6''
36º15'23,4''
36º15'34,4''
36º15'35,8''
36º15'10,1''
36º16'31,4''
36º16'33,7''
36º21'25,2''
36º21'59,9''
36º22'00,1''
36º21'43,7''
36º21'42,7''
36º21'44,9''
36º21'58,9''
36º16'51,4''
36º16'59,8''
36º16'54,7''
36º16'55,7''
36º16'56,7''
36º14'52,9''
36º18'40,9''
36º18'20,1''
36º18'29,4''
36º20'08,6''
36º20'08,9''
36º20'10,7''
36º20'13,7''
36º23'49,8''
36º23'51,6''
36º23'55,7''
36º15'38,7''
36º15'38,7''
36º15'39,8''
36º15'33,5''
36º15'51,6''
36º18'25,4''
36º23'12,7''
36º23'13,4''
36º21'41,6''
36º21'41,3''
36º17'41,9''
36º17'36,3''
36º17'59,6''

Município
Viçosa
Viçosa
Viçosa
Viçosa
Viçosa
Chã Preta
Chã Preta
Paulo Jacinto
Paulo Jacinto
Paulo Jacinto
Paulo Jacinto
Paulo Jacinto
Paulo Jacinto
Paulo Jacinto
Chã Preta
Chã Preta
Chã Preta
Chã Preta
Chã Preta
Viçosa
Chã Preta
Chã Preta
Chã Preta
Viçosa
Viçosa
Viçosa
Viçosa
Paulo Jacinto
Paulo Jacinto
Paulo Jacinto
Viçosa
Viçosa
Viçosa
Viçosa
Viçosa
Viçosa
Paulo Jacinto
Paulo Jacinto
Paulo Jacinto
Paulo Jacinto
Chã Preta
Chã Preta
Chã Preta

Ano de coleta
2005
2005
2005
2005
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2005
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2008
2008
2008
2008
2008
2008
2008
2008
2008
2008
2008
2008
2008

Tabela 2. Lista dos isolados utilizadas nos estudos filogenéticos com a região ITS e
seus respectivos números de acesso do GenBank.
Isolado1
Espécie
GenBank
Bipolaris heveae
Cyn-1
AB179835
Curvularia eragrostidis
95/1857ª
AF163077
C. eragrostidis
CE6D-CP
Presente trabalho
C. eragrostidis
CE21A-CP
Presente trabalho
C. eragrostidis
CE22C-CP
Presente trabalho
C. eragrostidis
CE10A-PJ
Presente trabalho
C. eragrostidis
CEPJ10A-PJ
Presente trabalho
C. eragrostidis
CE1B-Vi
Presente trabalho
C. eragrostidis
CE20A-Vi
Presente trabalho
C. eragrostidis
CE24-Vi
Presente trabalho
C. eragrostidis
CEV3A-Vi
Presente trabalho
C. eragrostidis
CEV5A-Vi
Presente trabalho
1
As letras após a identificação dos isolados oriundos deste trabalho correspondem ao
município de coleta: CP – Chã Preta, PJ – Paulo Jacinto, Vi – Viçosa,
respectivamente.

Tabela 3. Lista dos isolados utilizados nos estudos filogenéticos com o gene da beta
tubulina e o número de acesso no GenBank da sequência outgroup.
Isolado1
Espécie
GenBank
Curvularia eragrostidis
Presente trabalho
CE6D-CP
C.eragrostidis
CE21A-CP
Presente trabalho
C.eragrostidis
CE22C-CP
Presente trabalho
C.eragrostidis
CE10A-PJ
Presente trabalho
C.eragrostidis
CE1B-Vi
Presente trabalho
C.eragrostidis
CE24-Vi
Presente trabalho
C.eragrostidis
CEV3A-Vi
Presente trabalho
C.eragrostidis
CEV5A-Vi
Presente trabalho
Stemphylium botryosum
3688539
ICMP 5620-77
1
As letras após a identificação dos isolados oriundos deste trabalho correspondem ao
município de coleta: CP – Chã Preta, PJ – Paulo Jacinto, Vi – Viçosa,
respectivamente.

Figura 1. A. Mapa do Brasil com o Estado de Alagoas em destaque. B. Mapa de
Alagoas indicando as áreas amostradas em regiões produtoras de inhame. CP: Chã
Preta, PJ: Paulo Jacinto, VI: Viçosa.

CE1B

CE2A

CE3

CE5

CE6B

CE14B

CE23

Figura 2. Valores médios de área abaixo da curva de progresso da doença (AACPD) da
queima das folhas do inhame (Dioscorea cayennensis) causada por diferentes isolados
de Curvularia eragrostidis, em condição de casa de vegetação.
Médias seguidas da mesma letra não diferem entre si ao nível de 5% de probabilidade,
pelo teste de Tukey.

rc
C

Figura 3. Compatibilidade micelial no auto pareamento, vista do verso (A) e reverso
(B) da placa. Arranjo de discos de micélio de Curvularia eragrostidis em múltiplos
pareamentos (ri: reação incompatível; rc: reação compatível) visto no verso (C) e
reverso (D) da placa.

100

Figura 4. Árvore filogenética de Máxima Parcimônia baseada em sequências de ITS de 10
isolados de Curvularia eragrostidis com Bipolaris heveae como outgroup. A barra de
escala representa 1 mudança e valores de suporte de bootstrap de 1000 repetições são
apresentados nos ramos.

Stemphylium botryosum 3688539

100

Figura 5. Árvore filogenética de Máxima Parcimônia baseada em sequências de β
tubulina de 8 isolados de Curvularia eragrostidis. A árvore foi enraizada com
Stemphylium botryosum. A barra de escala representa 1 mudança e valores de suporte de
bootstrap de 1000 repetições são apresentados nos ramos.

____________________________________________________________Capítulo III

ANÁLISE DA ESTRUTURA GENÉTICA DA POPULAÇÃO DE Curvularia
eragrostidis ASSOCIADA A INHAME NO ESTADO DE ALAGOAS

Trabalho a ser submetido à Revista Tropical Plant Pathology

ANÁLISE DA ESTRUTURA GENÉTICA DA POPULAÇÃO DE Curvularia
eragrostidis ASSOCIADA À CULTURA DO INHAME NO ESTADO DE
ALAGOAS

Edlene M. S. Moraes1; Carlos A. D. Bragança2; Eduardo S. G. Mizubuti1,2. 1Centro de Ciências Agrárias/
Universidade Federal de Alagoas, CEP 57100-000, Rio Largo, Alagoas, Brasil; 2Departamento de
Fitopatologia/ Universidade Federal de Viçosa, CEP 36570-000, Viçosa, Minas Gerais, Brasil.
Autor para correspondência: Eduardo S. G. Mizubuti. e-mail: mizubuti@ufv.br

RESUMO
Foram obtidos 50 isolados de Curvularia eragrostidis oriundos de folhas de inhame
(Dioscorea cayennensis) com sintomas de queima, coletadas em 2005 e 2008, nos
municípios alagoanos de Viçosa, Chã Preta e Paulo Jacinto. Todas as amostras foram
geo-referenciadas e a variabilidade genética foi quantificada por meio do marcador
AFLP com duas combinações de primers: EAC-MA e EAA-MA. Foram geradas 150
bandas polimórficas. A diversidade gênica total foi alta (Ht = 0,31) com baixa
diferenciação entre as populações (Gst = 0,06). Os isolados não agruparam conforme
origem geográfica e não houve correlação entre distância genética e distância
geográfica. A AMOVA revelou que a variação genética foi maior dentro (97,9%) do
que entre (2,1%) as populações. A população de C. eragrostidis estudada possui alta
variabilidade genética, o que pode dificultar estratégias de manejo da queima foliar,
como por exemplo, o uso de variedades resistentes.
Palavras chave: Polimorfismo. Variabilidade genética. Origem geográfica.

ABSTRACT
A total of 50 isolates of Curvularia eragrostidis were obtained in 2005 and 2008 from
yam (Dioscorea cayennensis) leaves with symptoms of blight, in Viçosa, Chã Preta, and
Paulo Jacinto, Alagoas State, Brazil. The geographic coordinates of each isolate were
recorded with a portable GPS. The genetic variability was assessed using AFLP
markers with two primers combinations: EAC-MA and EAA-MA and 150 polymorphic
bands were scored. There was high gene diversity (Ht = 0.31) and low differentiation
between populations (Gst = 0.06). The isolates did not group according to geographical
origin and there was no correlation between genetic distance and geographic distance.
The genetic variation was higher within (97.9%) than among (2.1%) populations. The
genetic variability within populations of C. eragrostidis was high and this should be
carefully considered when planning disease management strategies such as the
deployment of resistant varieties.
Keywords: Polymorphism. Genetic variability. Geographical origin.

1 INTRODUÇÃO
A queima das folhas do inhame (Dioscorea cayennensis (Lam.), também
conhecida por requeima, pinta preta ou varíola (Moura, 2005), tem como agente causal
o fungo Curvularia eragrostidis (Henn.) Meyer, e é uma das doenças que mais
comprometem a produtividade dessa cultura no estado de Alagoas. O patógeno infecta
folhas, reduzindo a área fotossintética e consequentemente a produção. Atualmente,
não existem fungicidas registrados para a cultura do inhame, embora o controle da
queima das folhas seja baseado, principalmente, em pulverizações com os produtos
maneb, mancozeb e iprodione, realizadas logo após o aparecimento dos primeiros
sintomas (Santos, 1996).
A cultura do inhame desempenha papel socioeconômico importante no Nordeste
do Brasil, especialmente nos Estados da Paraíba, Pernambuco, Alagoas, Bahia e
Maranhão, prestando enorme contribuição ao desenvolvimento rural (Santos e Macêdo,
2002). Por ser cultura explorada principalmente por pequenos produtores, a necessidade
de controlar a queima foliar sem depender da aplicação de fungicidas ou com
quantidades mínimas destes compostos é evidente. A utilização de métodos alternativos
de controle de doenças de plantas representa um grande desafio para a agricultura
moderna. No caso da cultura do inhame, destaca-se o uso da resistência genética
(Coelho, 2002).
O controle de doenças torna-se mais efetivo, econômico e ecológico, quando se
utilizam diversas técnicas de forma integrada. A utilização da resistência genética
representa um dos métodos de controle mais eficientes, de fácil acesso aos produtores e
econômico, reduzindo, de forma expressiva, os prejuízos com a doença e custos de
produção (Coelho, 2002). Além disso, o uso de variedades resistentes reduz o impacto

ambiental devido à redução de aplicações desnecessárias de fungicidas (Cooke e Kaye,
2006). No entanto, a utilização eficiente de programas de manejo integrado requer
conhecimento sobre a intensidade da doença e população do patógeno (Savary e Cooke,
2006).
Apesar de ser doença destrutiva para a cultura do inhame, são poucas as
informações relacionadas à queima das folhas, em particular ao estudo da população do
patógeno. Neste caso, o conhecimento sobre a estrutura de populações é imprescindível
para entender as variações observadas entre isolados e suas implicações para o
desenvolvimento e controle da doença (McDonald et al., 1999). Especificamente, é
necessário investigar as forças evolutivas que atuam na população do patógeno e que
podem interferir em aspectos ecológicos e epidemiológicos de interesse (McDonald
1997; McDonald e Linde 2002b).
Em fungos fitopatogênicos, a recombinação e a mutação são mecanismos
evolutivos importantes na geração de novos genótipos (Burdon e Silk, 1997). Para
patógenos que se reproduzem predominantemente de forma assexuada, como C.
eragrostidis, é comumente assumido que o processo evolutivo de maior importância é a
mutação, por criar variantes na população que poderão ser rapidamente selecionados por
apresentarem resistência à aplicação de fungicidas com modo de ação sítio-específico
(Gisi e Sierotzki, 2008; Van den Bosch e Gilligan, 2008).
Até o momento, os estudos de populações de C. eragrostidis objetivaram
determinar principalmente a variabilidade fisiológica e, alguns poucos, a variabilidade
genética. Brito (2006) estudou a variabilidade fisiológica e genética de 15 isolados de C.
eragrostidis obtidos na cultura do inhame, coletados nos Estados da Bahia, Paraíba e
Pernambuco. Constataram-se variações fisiológicas e no perfil de proteínas totais e

esterase. Para esse último marcador, houve diferenciação entre os isolados quanto à
mobilidade relativa, número e intensidade de bandas, e a análise de agrupamento
revelou alto polimorfismo entre os isolados permitindo a formação de 11 grupos. Não
houve variação entre os isolados do grupo 1 quanto ao perfil de proteínas totais e de
esterase.

Houve formação de grupos com apenas um isolado. Concluiu-se que há

grande variabilidade fisiológica e genética entre os isolados de C. eragrostidis
analisados.

Em outro trabalho, estudaram-se as características fisiológicas de 42

isolados de C. eragrostidis provenientes do Estado de Pernambuco, e detectou-se a
formação de dois grupos de similaridade em relação à taxa de crescimento micelial,
cinco para a esporulação e quatro para a germinação, indicando a existência de
variabilidade entre os isolados analisados (Paula et al., 2000).
A variabilidade presente em populações de patógenos pode determinar
diferenças na severidade da doença, pois a variabilidade pode determinar o potencial de
adaptação do organismo às condições adversas (Brown, 1998). Diversas técnicas
moleculares têm sido desenvolvidas para determinar a diversidade genética e estrutura
de populações de fitopatógenos (Visser et al., 2009). Marcadores moleculares neutros
como Restriction Fragment Length Polymorphisms (RFLPs), isoenzimas, Random
Amplified Polymorphic DNA (RAPDs), Amplified Fragment Length Polymorphism
(AFPL), microsatélites e Single Nucleotide Polymorphism (SNPs) são usados para
medir a variabilidade em fungos e estudar populações de fitopatógenos (McDonald,
1997; Zaffarano et al., 2006). O marcador RAPD foi utilizado por Ahmad et al. (2006)
para analisar a variabilidade de isolados de C. lunata obtidos de lesões características de
queima das folhas e podridão da raiz de duas variedades de trigo e arroz. Formaram-se
quatro grupos de acordo com o padrão de bandas e agressividade: isolados agressivos,
isolados não agressivos, isolados não agressivos a variedades de arroz e isolados não

agressivos a variedades de trigo. A variação observada na população estabeleceu
correlação positiva entre agressividade, taxonomia e características genéticas.
Os marcadores AFLP (Vos et al., 1995) são efetivos para determinar variação
genética intraespecífica em fungos, e são ferramentas eficientes para discriminar
indivíduos geneticamente próximos, evidenciando a utilidade deste tipo de marcador
para a realização de estudos de variabilidade genética (Arnao et al., 2008; Majer et al.,
1996; (Mueller e Wolfenbarger, 1999). O conhecimento da variabilidade genética de
fitopatógenos é importante para selecionar o tipo apropriado de resistência e para
seleção de genes de resistência em programas de manejo da doença (McDonald e Linde,
2002a). Esse marcador associa o polimorfismo gerado por enzimas de restrição à
capacidade de detecção da técnica de PCR (Ferreira e Grattapaglia, 1998). A técnica
apresenta vantagens comparativas, tais como detecção de maior número de locos,
cobertura ampla do genoma e baixo custo (Lopes et al., 2002), quando considera-se o
grande número de fragmentos que são gerados e resolvidos em um único gel.
O presente trabalho objetivou determinar a estrutura genética da população de C.
eragrostidis associada à queima das folhas do inhame no Estado de Alagoas por meio
da genotipagem de isolados coletados em três regiões produtoras com o marcador
molecular AFLP.

2 MATERIAL E MÉTODOS
2.1 Isolados
Foram utilizados 50 isolados de C. eragrostidis obtidos de folhas com sintomas
da doença, coletadas em 2005 e 2008, em áreas de produção de inhame nos municípios
alagoanos de Chã Preta, Paulo Jacinto e Viçosa (Figura 1). As culturas foram mantidas
em meio de cultura BDA inclinado em tubos de ensaios e posteriormente armazenadas
pelo método de Castellani (Gonçalves et al., 2007).
2.2 Extração de DNA
Para extração do DNA genômico, três discos de micélio com 5 mm de diâmetro
de cada isolado foram depositados em 100 mL de meio líquido (sacarose 10 g, Lasparagina 2 g, extrato de levedura 2 g, KH2PO4 1 g, MgSO4.7H2O 0,1 g, ZnSO4.7H2O
0,44 mg, FeCl3.6H2O 0,48 mg, e MnCl2.H2O 0,36 mg) (Zauza et al., 2007) em
Erlenmeyers de 250 mL, mantidos sob agitação a 150 rpm a 26°C durante 7 dias. Após
esse período, o micélio foi lavado com água destilada e mantido em papel filtro
esterilizado por 12 h para completa desidratação. Em seguida, o micélio foi macerado
em nitrogênio líquido em almofariz. A extração de DNA foi realizada utilizando o
protocolo de CTAB (Murray e Thompson, 1980). O pellet obtido foi ressuspendido em
50 µL de TE 1X com adição de RNAse A (2mg/ml) (Sambrook et al., 1989) e incubado
a 37ºC por 2 h. O DNA extraído foi armazenado a -20ºC e quantificado após
eletroforese em gel de agarose a 0,8% corado com brometo de etídio a 1,5% usando
fago lambda como padrão de massa molecular.

2.3 Reações de AFLP
Todas as reações de AFLP foram realizadas segundo as instruções do fabricante
(Invitrogen KIT AFLP - AFLP® Analysis System I). A concentração de DNA nas
amostras obtidas dos isolados de C. eragrostidis foi ajustada para aproximadamente
14ng. O DNA genômico total padronizado foi clivado com duas enzimas de restrição:
EcoRI e MseI por 2 h a 37°C e em seguida, a 70°C por 15 minutos para interromper a
clivagem. Em seguida, os adaptadores foram ligados nas extremidades dos fragmentos
do DNA digerido por meio da T4 DNA ligase e da solução de ligação dos adaptadores a
20°C por 2 h.
O produto de PCR da pré-amplificação foi diluído (1:50) e usado como molde
para amplificações seletivas com dois e um nucleotídeo(s): E+AC/+MA e E+AA/+MA.
Em seguida, as amostras foram desnaturadas a 90°C por 3 minutos para separação dos
fragmentos em gel de poliacrilamida a 6% submetido à pré-corrida a 120 W. A corrida
foi realizada a 70 W por aproximadamente 3 h, em tampão TBE 1X. Marcadores de
50pb e de 100pb foram utilizados como referência de peso molecular.
2.4 Coloração do gel
Após eletroforese, o gel de poliacrilamida foi submetido ao processo de
coloração das bandas geradas. A coloração seguiu as seguintes etapas: lavagem em
Solução fixadora I (Etanol 10% + Ácido Acético 1%) por 10 min; Solução fixadora II
(Ácido Nítrico 1,5%) por 3 min; Solução de coloração (Nitrato de Prata 0,2%) por 20
min ao abrigo da luz; Solução reveladora (Carbonato 3% + Formaldeído 0,02%) até o
surgimento das bandas e Solução bloqueadora (Ácido Acético 5%) por 5 min. Sempre
efetuando uma lavagem com água entre uma solução e outra (Creste et al., 2001). Todas
as soluções foram mantidas resfriadas e todas as lavagens ocorreram sob agitação

constante. Em seguida, a placa foi submetida à secagem ao ar, fotografada e as bandas
foram avaliadas com base na massa molecular.
2.5 Análise dos dados
Cada banda gerada foi considerada como um loco com 2 alelos: presença (1) ou
ausência (0) da banda. Uma matriz binária foi construída para criar os haplótipos
multilocus no SNAP (Aylor et al., 2006). Cada município foi considerado como uma
população de patógenos e análises intrapopulacionais foram realizadas com a avaliação
da variação na frequência alélica para cada loco e diversidade gênica em cada
município. A diversidade gênica na população total (Ht) e dentro das subpopulações
(Hs), o coeficiente de diferenciação genética (Gst) e a intensidade de fluxo gênico (Nm)
entre as populações dos diferentes municípios foram calculados usando a estatística de
Nei’s (h) (Nei, 1973) no programa POPGENE version 1.32 (Yeh et al., 1997). Uma
análise interpopulacional foi conduzida com a construção de um dendrograma baseado
na distância de Jaccard para estimar a distância genética usando UPGMA (Unweighted
Pair Group Method of Averages) no programa R version 2.9.1 (R Development Core
Team, 2008). A AMOVA foi usada para estimar a variância genética presente dentro e
entre as populações, utilizando o programa Arlequin 3.1 (Excoffier et al., 2005). O
relacionamento entre diversidade genética e distância geográfica foi estimado pelo teste
de Mantel (Mantel, 1967), usando o programa R. A distância genética foi estimada pelo
coeficiente de Jaccard e a significância da correlação foi estimada com base em 1000
permutações.

3 RESULTADOS
Foram geradas 150 bandas polimórficas com tamanho variando entre 100 e 600
pares de bases usando os dados combinados dos primers E+AC/+MA e E+AA/+MA.
Houve alto polimorfismo para as marcas obtidas e cada isolado constituiu em haplótipo
único. A diversidade gênica total (Ht) foi 0,31 (desvio padrão = ± 0,03) e Hs = 0,3 (s.d. ±
0,02). A diversidade gênica (h) detectada para todos os locos (n = 150) foi h = 0,31 (s.d.
± 0,16).
Os valores de diversidade gênica para as populações de Viçosa, Chã Preta e
Paulo Jacinto foram h = 0,28 (s.d. ± 0,17), h = 0,31 (s.d. ± 0,17) e h = 0,29 (s.d. ± 0,17),
respectivamente. A diversidade gênica nas populações de C. eragrostidis foi alta. A
diferenciação genética estimada pela média Gst foi baixa (Gst = 0,06). O fluxo gênico
estimado entre as populações foi alto (Nm = 7,9). Alta identidade genética e baixa
distância genética foram observadas entre as populações (Tabela 1).
Na análise de agrupamento, os isolados não foram agrupados conforme origem
geográfica (Figura 2). A AMOVA revelou que a variação genética foi maior dentro
(97,9%) do que entre (2,1%) as populações. O coeficiente de correlação estimado com o
teste de Mantel não significativo (r = -0,003; P = 0,517), portanto não houve correlação
entre distância genética e distância geográfica.

4 DISCUSSÃO
Este foi o primeiro estudo para determinação da estrutura genética de
populações de C. eragrostidis do Estado de Alagoas, baseado no marcador molecular
AFLP. A variabilidade genética dentro das populações de C. eragrostidis estudada foi
alta, porém houve baixa diferenciação entre as populações. Devido à proximidade
geográfica entre os pontos amostrados para obtenção dos isolados, a alta variabilidade
observada nesta população não era esperada. Além disso, o modo de reprodução de C.
eragrostidis implica em baixa variabilidade na população, pois a reprodução assexuada
caracteriza uma população com estrutura clonal. Neste caso, a taxa de mutação
representa o mecanismo evolutivo mais significativo para gerar variabilidade.
Outra consideração importante e que pode ter influenciado a alta variabilidade
constatada na população é a mistura de espécies de Curvularia. A identificação de
Curvularia spp. é subjetiva e baseada principalmente na morfologia conidial
(Sivanesan, 1987). Essa forma de identificação torna possível a identificação
equivocada, devido à inconsistência e variabilidade que ocorrem dentro do isolado e
entre isolados dependendo das condições (Sun et al., 2003). Alta variabilidade também
foi observada por Lourenço Jr. et al (2009) ao estudar a estrutura genética de
populações de Alternaria solani associadas à batateira e tomateiro de diversos campos
de produção do Brasil. Esse autor detectou a formação de dois grupos de isolados
geneticamente distintos, parcialmente relacionados ao seu hospedeiro de origem. Assim,
a mistura de isolados de diferentes espécies pode ser a causa da alta variabilidade
genética nas populações.
Não foi detectada estruturação da população conforme os municípios. Wang et
al. (2006) obtiveram resultados similares ao analisar a população de Fusarium

oxysporum f.sp. vasinfectum (Fov), agente causal da murcha de fusário do algodoeiro,
provenientes de diferentes regiões da Austrália e concluíram que o patógeno apresenta
distribuição basal e que o desenvolvimento de cultivares resistentes por região deve ser
realizado, assim como, alternativamente, o monitoramento continuado da distribuição
geográfica desses haplótipos deve ser avaliado com medidas quarentenárias mais
severas como uma futura estratégia para o manejo da doença. No presente estudo, a
ausência de estrutura se deve mais provavelmente à alta variabilidade genética
detectada. Uma das implicações da não estruturação para o manejo da doença está
relacionada ao desenvolvimento de cultivares resistentes, que no caso da queima foliar
do inhame deverá priorizar resistência inespecífica e não necessita ser localidadeespecífica.
Na análise de agrupamento, observou-se que os isolados não agruparam
conforme origem geográfica. Dois fatores podem ter influenciado este resultado: alto
grau de polimorfismo da combinação de primers usada no marcador AFLP e a
proximidade geográfica das áreas amostradas. O alto grau de polimorfismo obtido com
os primers selecionados acarretou na geração de haplótipos únicos. O elevado grau de
polimorfismo é também uma das razões para o posicionamento do isolado CE9D no
dendrograma. Nenhuma evidência de subdivisão da população de acordo com a
localização geográfica foi detectada. A análise de Mantel revelou correlação negativa
entre distância genética e geográfica, indicando que isolados de áreas diferentes não
foram mais distintos geneticamente.
Trabalhos subsequentes serão necessários para eliminar a possibilidade de o
polimorfismo elevado da combinação de primers ter introduzido um artefato nas
análises. Novas amostras deverão ser processadas e novas combinações de primers
avaliadas. Entretanto, no presente estudo, a repetibilidade das reações foi avaliada para

um subconjunto de isolados que constituíram em réplica biológica apropriada para o
teste. Não se observou alteração do perfil de bandas para reações realizadas com um
mesmo isolado, o que assegura a reproducibilidade da técnica e diminui a ênfase na
hipótese de artefato. Se constatados os altos níveis de variabilidade, há que se envidar
esforços para elucidar qual(is) o(s) mecanismo(s) evolutivo(s) responsável(is) por este
processo.

5 AGRADECIMENTOS
Os autores expressam agradecimentos à FAPEAL pela concessão de bolsa de
mestrado a Edlene Maria da Silva Moraes e ao CNPq pela concessão das bolsas de
Produtividade em Pesquisa de Eduardo S. G. Mizubuti.

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R Development Core Team R: A language and environment for statistical computing. R
Foundation for Statistical Computing (2008) Vienna, Austria. ISBN 3-900051-07-0.
URL http://www.R-project.org

8 LISTA DE TABELAS E FIGURAS

Tabela 1.

Identidade genética (acima da diagonal) e distância genética
(abaixo da diagonal) de Nei’s entre as populações.

Figura 1.

A. Mapa do Brasil com o Estado de Alagoas em destaque.
B. Mapa de Alagoas indicando as áreas amostrados em regiões
produtoras de inhame. CP: Chã Preta, PJ: Paulo Jacinto, VI:
Viçosa.

Figura 2.

Dendrograma gerado por UPGMA baseado no coeficiente de
Jaccard da análise de AFLP de 50 isolados de Curvularia
eragrostidis de Alagoas. As letras ao final da identificação de
cada isolado correspondem à origem geográfica (CP: Chã Preta,
PJ: Paulo Jacinto e VI: Viçosa).

Tabela 1. Identidade genética (acima da diagonal) e distância genética (abaixo da
diagonal) de Nei’s entre as populações.
População
Viçosa
Chã Preta
Paulo Jacinto

Viçosa

Chã Preta

Paulo Jacinto

****
0.0426
0.0507

0.9583
****
0.0274

0.9506
0.9729
****

Figura 1. A. Mapa do Brasil com o Estado de Alagoas em destaque. B. Mapa de
Alagoas indicando as áreas amostrados em regiões produtoras de inhame. CP: Chã
Preta, PJ: Paulo Jacinto, VI: Viçosa.

CEPJ10B - PJ
CECP13A - CP
CE9C- PJ
CECP13B - CP
CE16- CP
CEPJ10A - PJ
CEPJ8B - PJ
CECP11B - CP
CEV1A - VI
CEV1B - VI
CEPJ7A - PJ
CEV5B - VI
CEPJ8A - PJ
CEV5A - VI
CECP11C - CP
CE24- VI
CE1B- VI
CE15A- CP
CE11B- PJ
CE5- VI
CE1A- VI
CEV3A - VI
CEV2A- VI
CEV4A- VI
CEV3C- VI
CEPJ9B - PJ
CEPJ9A - PJ
CEV6A- VI
CEV3B- VI
CECP12A - CP
CECP11A - CP
CECP12B - CP
CE21A- CP
CE20A- VI
CE14A- PJ
CE6G- CP
CE6E- CP
CE6D - CP
CE3 - VI
CE11E - PJ
CE6B - CP
CE14D - PJ
CE6H - CP
CE10A - PJ
CE4 - VI
CE22A - CP
CE11A - PJ
CE8C - PJ
CE2A - VI
CE9D - PJ

Figura 2. Dendrograma gerado por UPGMA baseado no coeficiente de Jaccard da análise
de AFLP de 50 isolados de Curvularia eragrostidis de Alagoas. As letras ao final da
identificação de cada isolado correspondem à origem geográfica (CP: Chã Preta, PJ: Paulo
Jacinto e VI: Viçosa).

_______________________________________________________Conclusões Gerais

CONCLUSÕES GERAIS

1. Análises morfológicas e filogenéticas suportam a ocorrência de uma espécie
dominante, Curvularia eragrostidis, associada à queima das folhas de inhame no
estado de Alagoas;

2. A população de C. eragrostidis estudada possui alta variabilidade genética e
patogênica, o que pode dificultar estratégias de manejo da queima foliar, como por
exemplo, o uso de variedades resistentes.

______________________________ Normas do periódico Tropical Plant Pathology

Tropical Plant Pathology – Fitopatologia Brasileira

ISSN 1982-5676

Instruções para Autores
Versão 15 feb 2008
Escopo da Revista
A revista Tropical Plant Pathology é um periódico internacional, de periodicidade bimestral, publicado
pela Sociedade Brasileira de Fitopatologia. Tem como objetivo a publicação de resultados de pesquisa
básica e aplicada sobre todos os aspectos da Fitopatologia. São recebidas contribuições das áreas de
micologia, bacteriologia, virologia, nematologia, epidemiologia, interação planta-patógeno, genética de
fitopatógenos, aspectos bioquímicos e moleculares de fitodoenças, doenças não infecciosas e de póscolheita, e outros tópicos que tenham como objetivo o melhor entendimento ou a prevenção de doenças
de plantas. Trabalhos sobre prospecção ou avaliação de produtos naturais e sintéticos ou sobre elementos
de resistência a patógenos podem ser aceitos como artigo somente se apresentarem informações inéditas
sobre o modo de ação ou mecanismos de resistência. Primeiros relatos de fitodoenças devem ser
apresentados no formato ‘Comunicação”.

Política Editorial

Embora Tropical Plant Pathology seja órgão oficial da Sociedade Brasileira de Fitopatologia,
contribuições de membros e não-membros da Sociedade são bem vindas. É pré-requisito fundamental que
manuscritos submetidos não tenham sido e nem serão publicados em outros periódicos. Com a aprovação
do manuscrito para publicação, a Editora adquire plenos e exclusivos direitos sobre a matéria em todas as
línguas e países. Incide custo somente para a produção de páginas coloridas. A pedido dos autores,
separatas serão disponibilizadas em forma de arquivo pdf sem custo adicional.

Manuscritos considerados em consonância com o escopo da revista serão avaliados por um Editor
Associado e pelo menos dois revisores ad-hoc externos. A aceitação do manuscrito pelo Editor se baseia
na qualidade do trabalho como contribuição original e substancial para a área e apresentação geral do
manuscrito.

Submissão de Manuscritos

1 Manuscritos devem ser enviados para:

Ludwig H. Pfenning, Editor Chefe
Tropical Plant Pathology – Comissão Editorial

Universidade Federal de Lavras
Cx. Postal 3066
37200-000 Lavras MG

2 Documentos necessários para submissão de manuscrito:

a) Uma carta de encaminhamento, assinada por todos os autores, declarando a sua anuência com a
submissão do manuscrito e que a matéria não está sendo avaliada nem publicada em outro periódico;
b) Declaração de transferência de direitos autorais à Editora, disponível na página da revista na Web;
c) Uma versão impressa do manuscrito, incluindo fotografias e demais elementos gráficos;
d) Cópia digital do texto e tabelas em plataforma Windows, Figuras em TIFF or JPEG, gravadas em
arquivos separados. (Para Figuras, veja também instruções detalhadas no item 3.1.h.) CD’s e disquetes
devem ser identificados com o nome e sobrenome do primeiro autor;
e) Comprovante de depósito da taxa de tramitação no valor de R$ 50, em favor de Banco do Brasil,
agência 0364-6, conta no. 36.981-0.
A falta de qualquer elemento pode causar atrasos na tramitação ou devolução do manuscrito mesmo antes
da revisão. A Comissão Editorial aprecia os esforços envidados pelos autores para que o texto seja
elaborado em linguagem correta antes da submissão.

3 Formatos

3.1 Artigo Científico

O texto do manuscrito deve ser redigido em Inglês, em espaço duplo usando fonte 12 pt, impresso em
papel A4 em um só lado, com margens de 2,5 cm, numeração contínua de páginas e linhas, começando
pela primeira página, incluindo Agradecimento, Referências, Tabelas, Legendas e Apêndices.
Manuscritos redigidos em Português ou Espanhol também serão aceitos.

Os seguintes elementos devem iniciar-se em uma nova página, na seqüência indicada:

a) A página inicial deve conter: um título conciso e informativo, de preferência com não mais de 150
caracteres com espaços; nome dos autores, sendo o primeiro e último sem abreviação; local de trabalho
ou local da realização do trabalho, incluindo Departamento ou Setor, Instituição, CEP e cidade, estado e
país; locais distintos devem ser indicados com numeração sobrescrita; título resumido de até 35 caracteres
com espaços; nome do autor para correspondência, incluindo endereço de e-mail. O autor para
correspondência é responsável pela leitura da prova tipográfica, o pagamento de ilustrações coloridas e
qualquer outra tarefa inerente à correta tramitação do manuscrito.

b) O “Abstract” sumariza aspectos da metodologia, os principais resultados e conclusões do trabalho.
Deve ser redigido em parágrafo único com não mais de 200 palavras, sem citações bibliográficas. Até seis
palavras chave devem ser incluídas, diferentes de termos mencionados no título. Todos os manuscritos
incluem também um Resumo em português. Manuscritos redigidos em português ou espanhol incluem
também um Abstract em inglês.

c) O texto deve ser redigido da forma mais sucinta e objetiva possível. Citações no texto devem indicar os
sobrenomes dos autores e ano da publicação; quando o trabalho tiver dois autores cita-se o sobrenome de
ambos, quando há três ou mais autores, cita-se o sobrenome do primeiro usando-se et al. Referências com
a mesma citação devem ser listadas em ordem cronológica, referências com o mesmo ano de publicação
devem ser listadas por ordem alfabética do sobrenome do primeiro autor. Trabalhos com o mesmo
primeiro autor são listados em ordem cronológica, separados por vírgula (p.ex. Barreto et al., 1966a,
1966b, 2000). Somente trabalhos publicados ou no prelo devem ser citados. Quando se usa
“Comunicação pessoal” ou “Dados não publicados”, todos os nomes devem ser citados com iniciais e
sobrenome. Números: no texto, números de um a nove são escritos por extenso, exceto quando indicam
datas, fração de decimal, porcentagem ou unidade de medida. A letra arábica é usada para números maior
de nove. Deve-se evitar iniciar uma frase com número. URLs para programas, dados e outras fontes de
informação da Web devem ser listados na seção Recursos da Internet (Internet Resources Section),
imediatamente após da seção Referências Bibliográficas. URLs de citações bibliográficas de artigos
publicados em periódicos eletrônicos, devem ser indicados na seção Referências Bibliográficas.

O texto inclui os seguintes elementos:

Introdução - descrição do contexto que levou a condução do estudo;

Material e Métodos – relata detalhes relevantes para a condução do estudo permitindo a sua repetição.
Métodos da avaliação estatística devem ser explicados no final da seção;

Resultados – deve-se evitar duplicação no texto e em tabelas. Comentários sobre o significado dos
resultados procedem, entretanto a discussão mais aprofundada deve constar da seção Discussão;

Discussão – resultados e descobertas do trabalho devem ser colocados no contexto com outras relevantes
informações publicadas, perspectivas decorrentes do trabalho devem ser mencionadas e discutidas. Idéias
e hipóteses de outras publicações não devem ser discutidas somente no intuito de incrementar a
apresentação. Alguns manuscritos podem exigir um formato diferente em função de seu conteúdo.

d) Agradecimentos. Único parágrafo inserido após a Discussão, que deve fazer referência a apoio
financeiro, e contribuição técnica ou intelectual.

e) Referências Bibliográficas são listadas em ordem alfabética do sobrenome do primeiro autor.
Referências com o mesmo primeiro autor são listadas conforme a seguir: primeiro, como único autor, em
ordem cronológica; segundo, com somente um co-autor, em ordem alfabética de acordo com o sobrenome
do co-autor e então, quando há dois ou mais co-autores, em ordem cronológica, independente do
sobrenome dos co-autores. O título de periódicos é citado por extenso. Somente trabalhos publicados ou
no prelo devem usados como referência. Artigos submetidos não são aceitos como referência. Os autores
devem evitar a citação de Teses e Resumos.

“Comunicação pessoal” ou “Dados não publicados” são citados somente no texto. “Comunicação
pessoal” se refere a informações fornecidas por indivíduos que não são autores do trabalho; “Dados não
publicados” se refere a dados gerados por pelo menos um dos autores do manuscrito em análise.

Artigo científico

Reis RF, Goes A, Timmer LW (2006) Effect of temperature, leaf wetness, and rainfall on the production
of Guignardia citricarpa ascospores and on black spot severity on sweet orange. Fitopatologia Brasileira
31:29-34.

Arnold AE, Medjía LC, Kyllo D, Rojas EI, Maynard Z, Robbins N, Herre EA (2003) Fungal endophytes
limit pathogen damage in a tropical tree. Proceedings of the National Academy of Science USA
26:15649-15654.

Capítulo de livro
Campos VP, Villain L (2005) Nematode parasites of coffee and cocoa. In: Luc M, Sikora RA, Bridge J
(Eds.) Plant parasitic nematodes in subtropical and tropical agriculture. Wallingford UK. CAB
International. pp. 529-580.

Livro de autor
th

Agrios GN (2005) Plant Pathology. 5 Ed. Amsterdam. Elsevier Academic Press.

Livro editado
Kimati H, Amorim L, Rezende JAM, Bergamin Filho A, Camargo LEA (Eds.) (2005) Manual de
Fitopatologia. Vol. 2. Doenças das Plantas Cultivadas. 4ª. Ed. São Paulo SP. Ceres.

Documento eletrônico
CONAB. Cana-de-açucar. Safra 2006 -2007.
www.conab.gov.br/conabweb/download/safra/BoletimCana-Novembro2006-07.pdf

Uma cópia da primeira página ou carta de aceitação deve ser enviada para cada artigo citado que não
esteja publicado. Cópias de Comunicações pessoais também devem ser disponibilizadas, permitindo sua
verificação.

f) Recursos da Internet indica os endereços (URL’s) onde dados apresentados no trabalho são
disponibilizados, programas de software e demais recursos da Internet utilizados na avaliação e
processamento de informação. Na citação de bancos de dados, a data do acesso deve ser indicada.
Exemplo:
CoreNucleotides, www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez (Dezember 12, 2007)
LEM Software, http://dir.niehs.nih.gov/dirbb/weinbergfiles/hybrid_design.htm

g) Tabelas. Cada tabela deve iniciar em uma nova página e receber um título conciso e informativo no
cabeçalho. Um subtítulo deve ser indicado para cada coluna. Tabelas devem são numeradas de acordo
com sua citação no texto. Rodapés devem ser indicados com números sobrescritos, e redigidos logo
abaixo da tabela. As tabelas devem ser inseridas após a seção Referências Bibliográficas.

h) Figuras são numeradas de acordo com sua citação no texto e devem ser formatadas conforme a largura das
colunas da revista, aproximadamente. Gráficos e fotografias devem ser apresentados em formato TIFF ou
JPEG, gravados em arquivos separados, no tamanho aproximado em que aparecerão na revista. Legendas são
apresentadas em página própria, após a seção Referências Bibliográficas. Os autores devem inserir chaves e
barra diretamente na figura. Deve-se evitar figuras que foram digitalizadas a partir de versões impressas.

Para reprodução com qualidade na revista, imagens precisam ter resolução mínima de 300 dpi. Desenhos
e gráficos necessitam resolução mínima de 600-1200 dpi. Essas resoluções se referem ao tamanho em que
as ilustrações serão publicadas. Quando se prevê redução ou aumento, a resolução precisa ser ajustada.
Ilustrações coloridas são aceitas, mas os autores devem assumir os custos. Para submissão, veja item 2
(Submissão de manuscrito).

j) Nomenclatura de nomes científicos deve seguir o padrão internacional atual, disponível para acesso
público na Internet.
Plantas: The International Plant Names Index, www.ipni.org/index.html
Fungos: Index Fungorum, www.speciesfungorum.org/Names/Names.asp
Bactérias: www.isppweb.org/names_bacterial.asp
Nematóides: www.iczn.org/iczn/index.jsp

Vírus: International Code for Classification and Nomenclature, publicado no 8o. Report of the
International Committee on Taxonomy of Viruses - ICTV (2005).

Nomes científicos de gêneros, espécie e taxons infra-específicos devem ser impressos em itálico, na
primeira citação no Resumo e no “Abstract” por extenso. As citações subseqüentes devem ser abreviadas
no nível genérico. Na primeira menção no texto deverão ser escritos por extenso. A autoridade do nome
científico de seres vivos deve ser citada no corpo principal do texto, na ocasião de sua primeira aparição,
somente quando os organismos são objeto do estudo.

j) Culturas e outro material de referência. A origem e o depósito de culturas deve ser indicado. Os
autores são incentivados a depositar material de referência (vouchers) de culturas e espécimes em
coleções certificadas ou reconhecidas para fins de documentação de sua pesquisa, e indicar o local do
depósito no texto.

k) Sequências. Números de acesso citados de Genbank ou outros bancos de dados precisam ser citados e
disponibilizados para o publico no momento da publicação do artigo.

l) Acesso a dados. Acesso a informação detalhada sobre dados e material usado para a realização de
estudos citados deve ser facilitado.

m) Abreviações e Unidades. Unidades SI devem ser usados, como p. ex. mg, g, m, mm, L, mL, µL, h,
min, s, mol, kg/ha. Uma abreviação para qual não há padrão, precisa ser definida por extenso em sua
primeira menção.

n) Defensivos agrícolas. Deve-se utilizar apenas nomes técnicos ou princípios ativos. Não é
recomendável a menção de nomes comerciais de produtos ou de empresas que os produzem e que sugira
sua utilização. As fórmulas químicas devem ser escritas em uma linha e obedecer ao padrão de
nomenclatura atual.

3.2 Comunicação

Destinado à publicação de resultados e observações que não justifiquem a publicação de um artigo
completo. Não devem se basear em resultados meramente preliminares. Destina-se ainda à publicação de
relatos originais de fitodoenças para o território brasileiro ou outros países. Registros novos para regiões
ou estados da Federação são aceitos somente em casos específicos, como no caso de patógenos
quarentenários, patógenos com alta especificidade em relação ao hospedeiro ou em plantas de valor
comercial relevante. Esses manuscritos devem conter ilustrações do patógeno, indicação do depósito de

material de referência de acesso público, de preferência no país de origem, depósito de seqüências de
DNA e ser acompanhados da documentação exigida pela legislação específica, quando couber. Devem
possuir 12 páginas ou menos, digitadas em espaço duplo em fonte 12, já incluindo referências. Todos os
manuscritos incluem também um Resumo em português. Manuscritos redigidos em português ou
espanhol incluem também um Abstract em inglês, não excedendo 200 palavras cada. O texto deve ser
redigido em seqüência única, incluindo Introdução, Material e Métodos, Resultados e Discussão. São
aceitáveis até duas figuras e duas tabelas. O formato da primeira página e da seção Bibliografia segue o
do Artigo.

3.3 Carta ao Editor

Relata ou responde a questões publicadas recentemente. A discussão de assuntos políticos, sociais ou
éticos de interesse para fitopatologistas também é bem vinda.

3.4 Artigo de revisão

Artigos de revisão são bem vindos. Os autores devem consultar o Editor antes da submissão.

4 Prova Tipográfica

A prova tipográfica será enviada ao autor para correspondência. Alterações maiores, que não representem
erros cometidos durante a composição gráfica, sujeitam os autores ao pagamento de taxas. Comentários
adicionados ao texto nessa fase exigem a aprovação do Editor. As provas devem ser devolvidas dentro de
72 horas.

5 Separatas

Separatas são disponibilizadas sem custo na forma de arquivo pdf quando solicitadas.

6 Autoria

Quem submete manuscritos para Tropical Plant Pathology – Fitopatologia Brasileira deve respeitar a
pesquisa de seus pares, evitando a desvalorização da co-autoria. Cada autor deve ter oferecido
contribuição intelectual substancial quanto ao desenho, a condução, análise ou interpretação do estudo.
Cada autor precisa aprovar a versão final do manuscrito a ser publicado e estar disposto a assumir
publicamente responsabilidade por sua contribuição no trabalho. O primeiro autor, assim como o autor
para correspondência, devem assumir responsabilidade pública para o trabalho na íntegra.