Leonardo Vinicius Da Silva Lima

ANÁLISE MOLECULAR DO VÍRUS CHIKUNGUNYA EM VETORES: IMPLICAÇÕES PARA VIGILÂNCIA EPIDEMIOLÓGICA EM ALAGOAS

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE ALAGOAS
CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL

LEONARDO VINÍCIUS DA SILVA LIMA

ANÁLISE MOLECULAR DO VÍRUS CHIKUNGUNYA EM VETORES:
IMPLICAÇÕES PARA VIGILÂNCIA EPIDEMIOLÓGICA EM ALAGOAS

RIO LARGO - AL
2024

LEONARDO VINÍCIUS DA SILVA LIMA

ANÁLISE MOLECULAR DO VÍRUS CHIKUNGUNYA EM VETORES:
IMPLICAÇÕES PARA VIGILÂNCIA EPIDEMIOLÓGICA EM ALAGOAS

Dissertação de Mestrado apresentada ao
Programa de Pós-Graduação em Ciência
Animal da Universidade Federal de Alagoas,
como requisito parcial para obtenção do grau de
Mestre em Ciência Animal.
Orientador(a): Dra. Thais Fernanda de Campos
Fraga-Silva.
Coorientador: Dr. Abelardo Silva-Junior.

Rio Largo - AL
2024

Catalogação na fonte
Universidade Federal de Alagoas
Biblioteca Polo Viçosa
Bibliotecário Responsável: Stefano João dos santos

L732

Lima, Leonardo Vinicius da Silva
Análise molecular do vírus chikungunya em vetores:
implicações para vigilância epidemiológica em Alagoas / Leonardo Vinicius
da Silva Lima - 2025.
50f. ; il.
Dissertação (Mestrado em Ciência Animal) - Universidade Federal de
Alagoas, Campus Ceca, Polo Viçosa, 2025.
Orientação: Prof. Dra. Thais Fernanda de Campos Fraga-Silva

Inclui bibliografia.
Chikungunya. 2. Alagoas. I. Abelardo Silva Junior
CDU: 636.1

Folha de Aprovação

LEONARDO VINÍCIUS DA SILVA LIMA

ANÁLISE MOLECULAR DO VÍRUS CHIKUNGUNYA EM VETORES: IMPLICAÇÕES
PARA VIGILÂNCIA EPIDEMIOLÓGICA EM ALAGOAS

Dissertação apresentada ao Programa de PósGraduação em Ciência Animal - PPGCA/CECA
da Universidade Federal de Alagoas, como
requisito parcial para obtenção do título de mestre
em Ciência Animal.

Aprovado em: 26/02/2025.

Banca Examinadora:

_________________________________________
Dra. Thais Fernanda De Campos Fraga Da Silva
(Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal, Universidade Federal de Alagoas)

___________________________________________________________
Professor Doutor Fernando Nogueira de Souza
(Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal, Universidade Federal de Alagoas)

___________________________________________________________
Professora Doutora Letícia Anderson Bassi
(Instituto de Química e Biotecnologia, Universidade Federal de Alagoas)

Dedico este trabalho a todas as pessoas
que enfrentaram ou enfrentam os desafios
impostos pela chikungunya, demonstrando força
e resiliência. Também dedico este esforço aos
profissionais de saúde, pesquisadores e agentes
comunitários, que lutam diariamente à prevenção,
ao cuidado e à busca por soluções para mitigar o
impacto dessa doença.
Que este estudo possa contribuir, ainda
que modestamente, para a conscientização e o
combate à chikungunya, ajudando a construir um
futuro mais saudável para todos.

AGRADECIMENTOS

Agradeço primeiramente a toda a comunidade de Maceió, Maragogi, Viçosa e União
dos Palmares por nos acolher e permitir a realização deste trabalho, demonstrando respeito e
confiança com os esforços científicos para a melhoria de todos.
Agradeço a todas as equipes de agentes de endemias que cederam seu tempo e foram
para a linha de frente, permitindo assim que o estudo fosse realizado.
Agradeço à secretaria municipal de saúde de Maceió - AL, pelo acolhimento e por
disponibilizar meios necessários para que a pesquisa realizada no município fosse realizada
com maestria.
Ao Laboratório Central de Saúde Pública de Alagoas (LACEN/AL) pelo suporte
essencial fornecido durante a pesquisa. Minha profunda gratidão também ao Jean, a Mykaella
e ao Magliones, cujo comprometimento e expertise na condução das análises moleculares foram
fundamentais para o desenvolvimento deste estudo. O empenho e a dedicação de cada um foram
indispensáveis para a realização dos experimentos, contribuindo significativamente para o
avanço do nosso trabalho.
Ao Laboratório de Pesquisa em Virologia e Imunologia (LAPEVI), e todos os meus
amigos que dividiram seus dias, resenhas, estresses e momentos felizes comigo, encerro esse
ciclo com a certeza de que tê-los no meu dia a dia tornou tudo mais leve. Em especial, ao Prof.
Dr. Abelardo Silva-Júnior por me ensinar tanto e ser essa pessoa incrível e doce com todos os
seus orientandos. Muito obrigado por ser essa pessoa incrível e espero muito que continue sendo
assim! Agradeço aos meus amigos Camila, Grazi, Júlia, Luccas e Michel, que fizeram parte
desse estudo, que me ensinaram muita coisa e me aguentaram muito durante esses anos de
pesquisa, não sei o que teria sido de mim sem vocês.
Deste ponto, gostaria de agradecer primeiramente a Profa. Dra. Thais Fernanda de
Campos Fraga da Silva, minha orientadora, pois ela é o motivo de termos chegado até aqui. De
fato, a pesquisa não teria o sentido que tem se não fosse pela orientação e dedicação que ela deu
e que todos os ensinamentos e puxões de orelha, que serão levados comigo na minha vida
profissional e pessoal. Muito obrigado!

Aos professores do Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal, por compartilhar
todo o conhecimento que tinham para auxiliar na minha formação como pesquisador.
Aos meus familiares, agradeço imensamente por toda confiança e energia positiva
depositados em mim. Vocês são meu alicerce, meu ponto de apoio e a minha esperança, amo
vocês de forma inexpressiva. À minha mãe, agradeço da forma mais pura possível, pois todos
os dias fui incentivado a continuar realizando o que eu gosto e sendo essa pessoa que ela me
ensinou a ser. Obrigado mãe!
À FAPEAL– Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Alagoas, pelo apoio
financeiro concedido durante a elaboração deste estudo.
O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de
Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001.

RESUMO

O vírus Chikungunya (CHIKV) é um arbovírus que causa a febre chikungunya, doença
transmitida por mosquitos Aedes aegypti e Ae. albopictus e identificado pela primeira vez em
1950 na Tanzânia, CHIKV pertence à família Togaviridae e ao gênero Alphavirus. No Brasil,
dois diferentes genótipos do CHIKV circulam em diferentes regiões do país, tendo como
predominante nos dias atuais o genótipo Leste-Central-Sul-Africano (ECSA), principalmente
na região Nordeste. O município de Maceió foi o segundo da região Nordeste com maior
registro de casos prováveis da febre chikungunya, que corresponde a 5.908 casos (572,7
casos/100 mil hab.). A circulação de diferentes genótipos aumenta o risco de coinfecções e
eventos de recombinação genética, promovendo mutações que podem impactar a infectividade
viral, a eficiência de disseminação e a transmissão entre distintos vetores. Assim, a vigilância
contínua do vírus, principalmente em áreas de alto risco que possuem o vetor endêmico,
juntamente com dados genômicos, pode fornecer informações oportunas para orientar respostas
eficazes de saúde pública. Portanto, nosso objetivo Neste contexto, nosso objetivo é estudar a
epidemiologia do CHIKV em Aedes aegypti de quatro municípios do estado de Alagoas. Para
tanto, amostras de vetores coletados nas regiões epidêmicas foram submetidas à análises
moleculares através de RT-qPCR para identificação de divergências moleculares em relação a
cepas previamente existentes. As análises moleculares foram realizadas em fêmeas
individualizadas e pools de até cinco machos de Ae. aegypti. Para criação de uma hipótese
filogenética da circulação do vírus foi realizado um levantamento de 25 sequências genômicas
de CHIKV em vetores e 569 sequências isoladas de humanos de 4 (quatro) Estados brasileiros
retirados do banco de dados do GISAID para relacionar à surtos anteriores. Foram coletados
1052 mosquitos e pudemos detectar, a partir de análises moleculares, o CHIKV em quatro
vetores coletados no Bairro de Ponta Verde, no município de Maceió, tornando-se o primeiro
estudo realizado em Alagoas que detectou o vírus circulante em mosquitos. Através da análise
filogenética foi possível identificar que o genótipo ECSA continua circulando nos quatro
Estados e analisados e o agrupamento de sequências isoladas em vetores indicou que algumas
linhagens de CHIKV estão sendo mantidas em certas regiões ao longo do tempo, enquanto
outras aparecem em um curto período e desaparecem. Diante dos achados deste estudo, reforçase a importância da vigilância contínua do CHIKV e de seu vetor, especialmente em regiões
endêmicas, a fim de compreender melhor a dinâmica de circulação do vírus e mitigar possíveis
surtos. Além disso, novas investigações são necessárias para aprofundar o conhecimento sobre
a evolução viral e seus impactos na saúde pública.

Palavras-chave: Chikungunya, Vetor, Vigilância epidemiológica, Saúde pública.

ABSTRACT

The Chikungunya virus (CHIKV) is an arbovirus that causes chikungunya fever, a disease
transmitted by Aedes aegypti and Ae. albopictus mosquitoes. First identified in 1950 in
Tanzania, CHIKV belongs to the Togaviridae family and the Alphavirus genus. In Brazil, two
different CHIKV genotypes circulate in various regions, with the East-Central-South-African
(ECSA) genotype currently predominant, especially in the Northeast. The municipality of
Maceió had the second-highest number of probable chikungunya fever cases in the Northeast,
totaling 5,908 cases (572.7 cases per 100,000 inhabitants). The circulation of different
genotypes increases the risk of coinfections and genetic recombination events, promoting
mutations that can impact viral infectivity, dissemination efficiency, and transmission across
different vectors. Therefore, continuous surveillance of the virus, particularly in high-risk areas
with endemic vectors, along with genomic data, can provide timely information to guide
effective public health responses. In this context, our objective is to study the epidemiology of
CHIKV in Aedes aegypti from four municipalities in Alagoas. Vector samples from epidemic
regions were analyzed through RT-qPCR to identify molecular divergences in relation to
previously existing strains, with molecular analyses conducted on individual female mosquitoes
and pools of up to five males. To establish a phylogenetic hypothesis on viral circulation, a
dataset of 25 CHIKV genomic sequences from vectors and 569 sequences isolated from humans
across four Brazilian states was retrieved from the GISAID database to correlate with previous
outbreaks. A total of 1,052 mosquitoes were collected, and CHIKV was detected in four vectors
from the Ponta Verde neighborhood in Maceió, marking the first study in Alagoas to detect the
circulating virus in mosquitoes. Phylogenetic analysis revealed that the ECSA genotype
continues to circulate in the four analyzed states, and sequence clustering indicated that some
CHIKV lineages persist in specific regions over time, while others emerge briefly and
disappear. These findings reinforce the importance of continuous CHIKV and vector
surveillance, especially in endemic regions, to better understand the virus's circulation
dynamics and mitigate potential outbreaks, while also highlighting the need for further studies
on viral evolution and its public health impact.

Keywords: Chikungunya, Vector, Epidemiological surveillance, Public health.

SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO…………………………………………………………….……...…11
2. REVISÃO DE LITERATURA………………………….……………………….…..13
2.1 FEBRE CHIKUNGUNYA………………………………………..……..….……13
2.2 VÍRUS CHIKUNGUNYA …………...………………..............................….…...14
2.3 HISTÓRICO DO VÍRUS CHIKUNGUNYA ……………………….............….16
2.4 EPIDEMIOLOGIA DO VÍRUS CHIKUNGUNYA …………………...........…18
2.5 VETORES…………..…………………………………………..…………….…..20
3. CONSIDERAÇÕES FINAIS…………………………………………………….…..24
4. ARTIGO……………………………………………………………………………....25
5. REFERÊNCIAS……………………………………………………………………....46

1. INTRODUÇÃO
A febre de chikungunya é uma doença infecciosa causada por um arbovírus e é
transmitida através de um vetor artrópode, especificamente por mosquitos do gênero Aedes. A
infecção é desencadeada por um vírus de RNA da família Togaviridae e gênero Alphavirus,
conhecido como vírus Chikungunya (CHIKV).
O CHIKV é caracterizado por um genoma de RNA de fita simples e sentido positivo,
codificando proteínas estruturais e não estruturais essenciais para sua replicação e infectividade.
A doença associada ao vírus, inicialmente limitada a regiões da África e do sudeste asiático,
alcançou proporções epidêmicas nas Américas desde 2013, com surtos relatados em diversos
países, incluindo o Brasil, onde o Nordeste se destaca como uma das áreas mais afetadas (Silva
et al., 2018; Zanluca et al., 2019).
A febre de chikungunya geralmente consiste em uma doença com sintomatologia
dividida em três fases, aguda, subaguda e crônica. A fase aguda é caracterizada principalmente
por febre de início súbito e surgimento de intensa poliartralgia, geralmente acompanhada de
dores nas costas, cefaleia e fadiga, tendo em média sete dias de duração. A febre durante a fase
aguda pode variar entre contínua, intermitente ou bifásica, porém a variação da temperatura não
está diretamente ligada a piora dos sintomas. Já a fase subaguda a febre torna-se ausente e iniciase a persistência ou o agravamento da poliartralgia e surgimento de poliartrite distal,
exacerbação de dores articulares em regiões acometidas na fase aguda, além de tenossinovite
hipertrófica subaguda em punhos e tornozelos. Nesta fase, é comum o surgimento de prurido
generalizado e edemas de intensidade variável. Caso os sintomas persistam até três meses,
inicia-se a fase crônica, destaca-se nesta fase a persistência ou recidivante de sintomas
articulares e dores na musculatura esquelética. Outros sintomas que podem persistir durante a
fase crônica são edemas, limitação de movimento, deformidade e ausência de eritema (Brasil,
2016).
Apesar de não apresentar altas taxas de mortalidade, a disponibilidade limitada de
tratamentos para doenças concomitantes (por exemplo, anemia, desnutrição, coinfecções) pode
aumentar a taxa de letalidade e os surtos podem sobrecarregar a capacidade da
infraestrutura/força de trabalho dos sistemas de saúde (World Health Organization, 2020).
Com a limitação observada no combate à febre chikungunya, nota-se que os desafios
enfrentados para o controle do vírus incluem a ausência de uma vacina licenciada e a limitada
eficácia de estratégias de controle vetorial, que dependem fortemente da redução da população
de mosquitos e da conscientização da comunidade.

O genoma viral pode ser rastreado através da análise do genoma presente nos vetores.
Atualmente, todos os estados brasileiros estão infestados por ambos os principais vetores do
CHIKV, Aedes aegypti e Ae. albopictus gerando preocupação com o estabelecimento de surtos
sustentados de CHIKV em todo o país, (Carvalho, Lourenço-de-Oliveira e Braga, 2014;
Kraemer et al., 2015). Portanto, a vigilância entomológica é essencial para entender o papel das
espécies vetoras na transmissão do CHIKV, especialmente em países tropicais, onde há grande
circulação dos vetores transmissores de arboviroses.
Sabe-se que ambas as espécies são vetores competentes para o CHIKV quando
infectados em condições de laboratório (Vega-Rúa et al., 2014). Neste sentido, o estudo de
Costa-da-Silva e colaboradores coletou mosquitos em casas do município de Aracaju, no estado
de Sergipe, e foi o primeiro relato de Ae. aegypti naturalmente infectado com o genótipo do
vírus ECSA no Brasil (Costa-da-Silva et al., 2017).
De acordo com o Boletim Epidemiológico da Secretaria de Vigilância da Saúde do
Ministério da Saúde, referente às notificações ocorridas entre as semanas epidemiológicas 1 a
44 (2/1/2022 a 5/11/2022), houve aumento de casos nacionais de chikungunya registrados para
o mesmo período de 33,0% e 83,3% em comparação com os anos de 2019 e 2021,
respectivamente. Para o ano de 2022, a região Nordeste apresentou a maior incidência da
doença, que corresponde a 256,2 casos a cada 100 mil habitantes. Alagoas chegou a registrar
um aumento de 969% dos casos de chikungunya, de 2 de janeiro até 30 de abril (semana
epidemiológica 17 de 2022). Sendo Maceió o segundo município com maior registro de casos
prováveis de chikungunya até a semana epidemiológica 44, que corresponde a 5.908 casos
(572,7 casos/100 mil hab.) (BRASIL. Ministério da Saúde, 2022).
Registros de anos anteriores fornecem um recorte temporal atualizado da circulação do
vírus e das condições epidemiológicas recentes. Portanto, esses dados ajudam a entender
padrões de transmissão e avaliar o impacto de medidas de controle adotadas e comparar com
anos anteriores para detectar tendências emergentes. Esses fatores estão diretamente ligados à
vigilância epidemiológica e molecular do vírus no vetor, uma vez que a identificação do vírus
no vetor ajuda a entender melhor a dinâmica de transmissão e a distribuição do vírus em
diferentes regiões. As mutações podem afetar a virulência, transmissibilidade e resposta
imunológica ao vírus. Algumas variantes podem tornar o vírus mais eficiente na infecção de
mosquitos ou humanos, influenciar a gravidade da doença e até impactar a eficácia de vacinas
e tratamentos. Monitorar mutações é essencial para prever mudanças na epidemiologia da
doença e adaptar estratégias de controle.

2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. FEBRE CHIKUNGUNYA
Clinicamente, a febre Chikungunya é caracterizada por sintomas que se manifestam em
três fases: aguda, subaguda e crônica. Durante a fase aguda, sintomas como dor intensa nas
articulações, febre, calafrio, cefaleia, náusea, vômito, fadiga, dor nas costas, mialgia, artralgia
simétrica e poliartralgia debilitante são manifestados de dois a seis dias após a infecção pelo
vírus (Lima e Nascimento, 2016). Manifestações extra-articulares também podem ocorrer,
incluindo erupções cutâneas e sintomas neurológicos. Em casos graves, especialmente em
indivíduos com comorbidades como a hipertensão, diabetes, doenças cardíacas e asmas, podem
elevar os quadros clínicos da infecção, podendo resultar em óbito (de Lima et al, 2021; Castro
et al, 2016; Badawi et al, 2018; Córdova-Pluma et al., 2018).
Na fase subaguda, que se estende de 15 a 90 dias após o início dos sintomas, as artralgias
podem persistir, e alguns pacientes desenvolvem artrite, com inchaço e rigidez nas articulações
afetadas. Já a fase crônica é caracterizada a partir da persistência da poliartralgia durante o
período de recuperação, prolongando-se por semanas ou anos (Castro et al, 2016).
Na fase crônica, que pode durar meses ou até anos, pacientes com artrite crônica podem
se beneficiar de terapias utilizadas em doenças reumatológicas, como o metotrexato, visando
reduzir a inflamação articular e melhorar a qualidade de vida. No entanto, a evidência científica
sobre a eficácia dessas intervenções ainda é limitada, e mais estudos são necessários para
estabelecer protocolos terapêuticos adequados (Silva et al., 2024).
O tratamento da febre Chikungunya é predominantemente sintomático ou de suporte,
uma vez que não há antiviral específico disponível. Na fase aguda, o uso de analgésicos comuns,
como paracetamol, é recomendado para o controle da febre e da dor. Anti-inflamatórios não
esteroides (AINEs) devem ser evitados inicialmente devido ao risco de complicações
hemorrágicas especialmente em áreas endêmicas de dengue, pois o uso desses AINES em
pessoas que estejam infectadas com o vírus da Dengue pode desenvolver essas complicações
hemorrágicas. Já na fase subaguda, caso as dores articulares persistam, pode-se considerar o
uso cauteloso de AINEs e corticosteroides em doses baixas para alívio dos sintomas, sempre
sob supervisão médica (Marques et al., 2017).

2.2 VÍRUS CHIKUNGUNYA
Pertencente ao gênero Alphavirus e à família Togaviridae, o CHIKV é um vírus de RNA
de fita simples, e o vírion do CHIKV é formado por uma cápside icosaédrica composta por 240
cópias da proteína de capsídeo (C), que encapsula o RNA genômico viral (Kuhn, 2013; Voss et
al, 2010). Essa cápside está associada a uma camada lipídica derivada da membrana celular do
hospedeiro, formando o envelope viral. O envelope contém glicoproteínas E1 e E2, que são
fundamentais para a entrada do vírus nas células hospedeiras, facilitando a fusão do envelope
viral com a membrana celular e a subsequente infecção (Voss et al, 2010).
A origem do CHIKV está relacionada a vírus ancestrais que circulavam em primatas na
África. Um estudo filogenético indicou que a diversidade genômica do CHIKV reflete sua
adaptação evolutiva e epidemiológica, especialmente após sua introdução em áreas tropicais e
subtropicais fora da África. Modificações genéticas, como a mutação A226V na proteína E1,
foram associadas a uma maior capacidade de transmissão pelo mosquito Aedes albopictus,
contribuindo para a rápida expansão global do vírus em regiões da Ásia e das Américas
(Tsetsarkin et al., 2007).
O CHIKV possui aproximadamente 11.800 nucleotídeos, sendo constituído por apenas
uma fita simples de RNA de sentido positivo, com um cap na extremidade 5' de 7metilguanosina e uma cauda poli-A na extremidade 3' (Khan et al, 2002). Esse RNA codifica
quatro proteínas não estruturais (nsP1, nsP2, nsP3 e nsP4) responsáveis pela replicação viral, e
três proteínas estruturais: a proteína de capsídeo (C) e as glicoproteínas de envelope E1 e E2.
As proteínas estruturais são essenciais para a formação do virion e a infectividade do vírus
(Campos, 2015).
Os alfavírus em geral codificam proteínas estruturais e não estruturais, das quais as
lipoproteínas não estruturais são produzidas pela tradução do RNA genômico 49 S que
transcreve o RNA subgenômico 26 S através do intermediário de RNA de fita negativa. Após
a transcrição do RNA 26 S a poliproteína estrutural é produzida. As proteínas nsP1, nsP2, nsP3
e nsP4 são formados a partir do processamento de lipoproteínas não estruturais (Strauss and
Strauss, 1994; Shirako et al., 2000; Tomar et al., 2011).
A análise do genoma viral possibilitou a descrição de diferentes genótipos: LesteCentral-Sul-Africano (ECSA), África Ocidental, asiático e Oceano Índico (Tsetsarkin
et al., 2011). A análise de polimorfismos na região E1 também tem sido utilizada para a análise
e comparação do genoma viral (Souza et al., 2019; Tanabe et al., 2018). A análise do genoma
viral mostrou que a epidemia indiana de 2006 foi causada pelo genótipo ECSA, diferente do

observado na epidemia indiana de 1963 a 1973, que foi causada pelo genótipo asiático (Pialoux
et al., 2007).

2.3 HISTÓRICO DO VÍRUS CHIKUNGUNYA
O vírus causador da febre chikungunya, Chikungunya Vírus (CHIKV), foi identificado
pela primeira vez em 1952-1953 em Newala, durante um surto na Tanzânia, inicialmente
atribuído ao vírus da dengue (Donalisio & Freitas, 2015). Desde então, tem sido responsável
por surtos periódicos de febre chikungunya (Silva & Dermody, 2017). Após os surtos
identificados na Tanzânia, surtos imprevisíveis com intervalos de 7 a 20 anos foram relatados
na África e na Ásia. Entre os anos de 1960 e 1990, novos surtos foram notificados no leste e
oeste africano e na África Central (Presti et al, 2014).
Em 1958, CHIKV foi isolado na Tailândia, em Bangkok, porém só em 1960 foi
registrado o primeiro surto urbano em Bangkok. Após esse período, as taxas de infecção por
CHIKV se elevaram drasticamente por toda a cidade de Bangkok (Nimmannitya et al, 1969;
Halstead et al, 1969; Khongwichit et al, 2021). Posteriormente, a Índia registrou os primeiros
surtos, em 1963, e rapidamente foi se espalhando por toda África e Ásia, até os anos de 2000,
que posteriormente se espalhou para o sudeste Asiático e Oceano Índico (Khongwichit et al,
2021).
Entre 2004 e 2006, uma importante epidemia de CHIKV ocorreu nas ilhas do Oceano
Índico, destacando a linhagem Oceano Índico (IOL), uma sublinhagem do genótipo ECSA. Esta
epidemia foi amplificada pela adaptação do vírus ao Ae. albopictus, vetor predominante em
climas temperados, possibilitando surtos em áreas anteriormente não afetadas, incluindo Índia
e partes da Europa (Staples et al., 2009). Em 2007, foi relatado o primeiro surto autóctone na
Europa, especificamente na Itália, confirmando a expansão de CHIKV para novas fronteiras
(Rezza et al., 2006).
No Brasil, os primeiros casos autóctones foram confirmados em 2014, quando duas
linhagens genéticas distintas começaram a circular: o genótipo Asiático no Amapá e o ECSA
na Bahia. A partir de então, o vírus se espalhou rapidamente pelo país, com a Região Nordeste
apresentando os maiores números de casos, como observado entre 2018 e 2022, quando mais
de 453 mil infecções foram notificadas na região, com destaque para os estados da Bahia e
Ceará (Santos et al., 2024).
O Brasil registrou, até a Semana Epidemiológica 26 de 2024, 233.225 casos prováveis
de Chikungunya no País (taxa de incidência de 114,9 casos por 100 mil habitantes) sendo
equivalente a 78% dos casos registrados no ano anterior. Aproximadamente 59 casos por 100
mil habitantes foram registrados. Com uma taxa de 0,06% de letalidade, no mesmo período

foram registrados 134 óbitos por Chikungunya, representando um aumento de 42,5% quando
comparado com o ano anterior (Brasil, 2024).

2.4 EPIDEMIOLOGIA DO VÍRUS CHIKUNGUNYA
Após sua identificação inicial, o CHIKV permaneceu restrito a áreas específicas da
África e da Ásia, com surtos esporádicos. No entanto, a partir de 2004, o vírus começou a se
espalhar para novas regiões, causando epidemias em escala global (Silva & Dermody, 2017).
Em 2013, foi introduzido nas Américas, com os primeiros casos autóctones registrados na Ilha
de São Martinho, no Caribe (OMS, 2023).
O genótipo ECSA foi descrito em casos autóctones no Rio de Janeiro (Cunha et al.,
2017; Souza et al., 2017). Enquanto casos importados de genótipo asiático também têm sido
descritos no Sudeste do Brasil (Conteville et al., 2016). O estudo de Souza et al (2019), analisou
o genoma viral em amostras de plasma ou soro de 1835 pacientes com suspeita de Chikungunya
entre os anos de 2016 e 2017 no Rio de Janeiro. A análise filogenética indicou que todas as
sequências brasileiras do Rio de Janeiro pertenciam ao genótipo ECSA, apresentando baixa
diversidade genômica. No entanto, a análise de 14 sequenciamentos mostrou uma forte
correlação entre a divergência genética e a data em que a amostra foi coletada.
Utilizando uma ferramenta conhecida como “relógio molecular”, que permite relacionar
o tempo de divergência entre duas linhagens atuais com o número de diferenças moleculares
entre elas, os autores sugerem que o genótipo ECSA foi provavelmente introduzido em um
único evento no Brasil em 2013, até um ano antes das estimativas anteriores (Souza et al., 2019).
Além disso, através da análise filogenética temporal, os autores sugerem que após a entrada no
estado da Bahia, o genótipo ECSA se espalhou para outros estados do Nordeste (Alagoas e
Paraíba) e para o Rio de Janeiro (região Sudeste) e que, a partir do Rio de Janeiro, essa linhagem
retornou à região Nordeste, espalhando-se para Sergipe (Souza et al., 2019).
A análise da disseminação do vírus chikungunya (CHIKV) revela que os primeiros
casos autóctones foram registrados em 2015 em Pernambuco, Brasil, com o estado alternando
entre períodos de endemia e epidemia desde então (Santos et al., 2023).
Em 2017, um estudo destacou que a disseminação do CHIKV está associada à presença
de mosquitos vetores como Ae. aegypti e Ae. albopictus, intensificada por fatores como
urbanização desordenada, mudanças climáticas e aumento da mobilidade humana (Silva &
Dermody, 2017). Entre 2018 e 2022, o Nordeste brasileiro notificou mais de 453 mil casos,
com Bahia e Ceará liderando em notificações (23% e 22%, respectivamente), enquanto o Rio
Grande do Norte apresentou a maior taxa de incidência (24,2 casos/100 mil habitantes) (Santos
et al., 2024).

Já em 2023, o vírus expandiu-se para a Região Sudeste do Brasil, anteriormente
concentrada no Nordeste (BRASIL, 2024). No início de 2024, foram registrados 14.958 casos
prováveis no Brasil nas semanas epidemiológicas 1 a 4, com maior incidência nas regiões
Sudeste, Centro-Oeste e Norte, enquanto os maiores óbitos se concentraram no Nordeste
(SAÚDE, 2024). Até 30 de novembro de 2024, 480.000 casos e mais de 200 mortes foram
relatados mundialmente, com maior impacto no Brasil, Paraguai, Argentina e Bolívia, e a
presença do CHIKV registrada em 23 países (ECDC, 2024). A capacidade do vírus de
estabelecer ciclos de transmissão urbana e a influência de fatores climáticos reforçam o risco
de epidemias futuras (Araújo et al., 2024).

2.5 VETORES
O vírus da febre Chikungunya é transmitido principalmente pelos mosquitos Aedes
aegypti e Aedes albopictus, espécies reconhecidas por seu papel como vetores na transmissão
de diversas arboviroses, incluindo o vírus da dengue e o Zika vírus. Esses mosquitos possuem
uma alta adaptação ao ambiente urbano, onde depositam seus ovos em recipientes com água
parada, como pneus, latas e vasos de plantas. A transmissão do CHIKV ocorre quando o
mosquito se infecta ao picar uma pessoa infectada e, após um período de incubação no
mosquito, o vírus é transmitido para humanos por meio da picada subsequente (Pereira et al.,
2015).
O Ae. aegypti é o vetor mais associado à transmissão de CHIKV nas áreas urbanas,
sendo o responsável pela disseminação do vírus em várias regiões tropicais e subtropicais,
especialmente na América Latina e Caribe. O Ae. albopictus, embora mais comumente
encontrado em áreas rurais e suburbanas, também tem desempenhado um papel importante na
transmissão do CHIKV, especialmente em regiões onde a densidade do Ae. aegypti é menor
(Fonseca et al., 2019; Maciel et al., 2020).
O ciclo de vida do Ae. aegypti pode variar conforme as condições ambientais, mas, em
média, o mosquito passa por quatro estágios de desenvolvimento: ovo, larva, pupa e adultos. O
tempo total de vida do mosquito, desde o ovo até a fase adulta, geralmente dura entre 7 a 10
dias em condições ideais de temperatura e umidade. Fatores climáticos, como temperatura
elevada e chuvas, favorecem a reprodução e a proliferação dos mosquitos, uma vez que o Aedes
prefere ambientes urbanos e áreas de água parada para depositar seus ovos, como recipientes
de lixo, pneus e depósitos de água (Rezza et al., 2006).
Após emergirem dos ovos, os mosquitos podem voar brevemente, porém é necessário
um repouso de até 48 horas para que seu exoesqueleto e asas endureçam antes do voo para que
seja mais eficiente. Além disso, os machos necessitam do endurecimento dos pelos fibrilares
das antenas para que possam localizar as fêmeas, essa ereção ocorre em 15 e 24 horas após a
emergência (Clements, 1963; Nelson, 1986; Facchinelli, 2023). De acordo com Gwadz et al
(1971), as fêmeas de Ae. aegypti não são inseminadas até 48 após emergir. No entanto, após 2
ou 5 horas de seu surgimento, elas tornam-se atrativas para os machos, podendo assim haver
copulação, ainda que sem inseminação (Gwadz et al, 1968; Lea, 1968).
As fêmeas de Ae. aegypti, possuem um comportamento hematófago incessável, sendo
atraída pelo hospedeiro a partir da temperatura corporal e pelo dióxido de carbono liberado pela
pele do hospedeiro (McMeniman et al, 2014; Strauss et al, 1966). Ao decorrer do tempo, as

fêmeas de Ae. aegypti desenvolveram comportamentos endofílicos, onde preferem esperar por
hospedeiros ao invés de caçá-los. Esse comportamento foi observado em populações de
mosquitos domésticos e selvagens após uma observação comportamental do Aedes aegypti
durante um surto de dengue em Ouagadougou, Burkina Faso, nesse estudo os pesquisadores
observaram que os mosquitos domésticos possuíam o comportamento de “sentar e esperar”
quando os mosquitos selvagens iam buscar suas presas (Badolo et al, 2022).
Como as fêmeas de Ae. aegypti necessitam de grandes quantidades energéticas para a
oviposição, as fêmeas se alimentam de sangue em grande quantidade após o acasalamento para
o desenvolvimento dos ovos. Esse comportamento pode ocorrer duas vezes com o repasto
sanguíneo até a oviposição (Klowden et al, 1978; Brown et al, 1994). Após a alimentação, as
fêmeas necessitam repousar até o desenvolvimento dos ovos, buscando um local isolado e com
condições ambientais propícias para o seu descanso e oviposição (Howard, 1923). Áreas com
sombras e superfícies escuras não reflexivas e próximas à fontes de água são preferenciais para
as fêmeas, para a deposição dos ovos (Tainchum et al, 2013; Schoof, 1967; Clark e Suarez,
1991). Essa preferência por superfícies escuras pode ser analisada no estudo realizado por
Ouédraogo et al (2022), que observou a preferência considerável por repousar/ovipositar em
pneus ao invés de outros recipientes como bebedouro de animais e pequenos recipientes
contendo água.
Dado o desenvolvimento e comportamento do vetor, os surtos de doenças transmitidas
por esses vetores para hospedeiros dependem de fatores intrínsecos como a capacidade genética
de portabilidade e desenvolvimento do vírus e extrínsecos como os fatores ambientais
propiciam um ambiente adequado para a sobrevivência e disseminação do vírus (Kramer e
Ciota, 2015).
Portanto, quando uma fêmea de Aedes se alimenta do sangue de um hospedeiro
infectado, o vírus é ingerido junto com a refeição sanguínea. Inicialmente após a infecção pelo
vírus, adquirida através de um hospedeiro infectado, o vírus necessita ultrapassar algumas
barreiras biológicas para que enfim consiga se replicar no vetor. O ciclo de replicação inicia-se
ao ultrapassar microbiota intestinal para se desenvolver nos tecidos do intestino médio. Após o
desenvolvimento do vírus no intestino médio, o vírus infecta tecidos adjacentes, como as
gônadas e os tecidos das glândulas salivares (Lounibus e Kramer, 2016). Esse processo,
conhecido como disseminação sistêmica, depende da capacidade do CHIKV de evadir respostas
antivirais do inseto, como a via do RNAi (RNA interferente), que normalmente atuaria como
um sistema de defesa (Mathur et al, 2016).

O Estudo de Tsetsarkin et al, (2007), publicado na PLoS Pathogens, destacam que
mutações específicas no genoma viral, como a substituição E1-A226V, aumentam a adaptação
do CHIKV ao Ae. albopictus, permitindo que o vírus se replique mais eficientemente nesse
vetor. Essa adaptação é um exemplo notável de como mudanças genéticas podem ter grandes
impactos epidemiológicos, especialmente em regiões onde esse mosquito é predominante. Um
outro estudo realizado por Weaver et al, (2016), explica que a interação entre proteínas virais e
componentes celulares do vetor como a proteína de capa do vírus e receptores mosquitos é
crucial para garantir a sobrevivência do CHIKV, o que permite a entrada do vírus no vetor de
forma silenciosa e eficaz.
A etapa final da replicação do vírus no vetor ocorre quando o CHIKV se acumula nas
glândulas salivares do mosquito, pronto para ser injetado em um novo hospedeiro durante a
próxima picada (Veja-Rúa et al, 2015). Curiosamente, o estudo de Coffey et al. (2008), revela
que a eficiência dessa transmissão não depende apenas da carga viral, mas também da resposta
imunológica local do vetor. Alguns mosquitos, por exemplo, produzem moléculas antivirais em
suas glândulas salivares que podem limitar a disseminação, embora o CHIKV frequentemente
consiga contornar essas defesas. Esse processo imunológico e molecular entre vírus e vetor
ajuda a explicar por que certas linhagens de CHIKV se tornam dominantes em surtos, enquanto
outras desaparecem, como podemos ver a predominância de determinados genótipos circulantes
em diferentes locais do mundo.
Fatores ambientais, como a temperatura, também influenciam nesse desenvolvimento.
Um estudo de Dubrulle et al. (2009), no American Journal of Tropical Medicine and Hygiene,
mostra que temperaturas mais elevadas aceleram o ciclo de replicação do CHIKV no mosquito,
encurtando o período de incubação extrínseco. A eficiência de transmissão é maior em
temperaturas mais altas, o que facilita a disseminação do vírus durante períodos de clima quente
e úmido. A relação entre a dinâmica populacional dos mosquitos e a circulação do vírus é
também determinada pela taxa de infecção dos mosquitos e pelo comportamento das fêmeas
que buscam sangue para a produção de ovos (Zanluca et al., 2019). Isso significa que, em um
mundo cada vez mais quente, os mosquitos podem transmitir o vírus mais rapidamente após a
infecção, ampliando o risco de epidemias.
Apenas as fêmeas são responsáveis pela transmissão do vírus, já que são as fêmeas que
se alimentam de sangue, essencial para o desenvolvimento de seus ovos. Os machos, por sua
vez, se alimentam exclusivamente de néctar e não têm contato com o sangue humano, não
participando da transmissão do vírus (Lambrechts et al., 2010). Além disso, há evidências de
que o vírus pode ser transmitido de uma geração de mosquitos para outra, ou seja, transferência

vertical do CHIKV. Isso ocorre quando a fêmea infectada transmite o vírus para seus ovos, que,
ao eclodirem, produzem larvas infectadas. A transferência vertical tem sido observada como
um fator de risco significativo para a perpetuação do vírus nas populações de mosquitos,
principalmente em áreas com alta carga de casos (Mourya et al., 2016).

3. CONSIDERAÇÕES FINAIS
Através desse estudo foi possível identificar a grande importância do estudo do vírus
em vetores, uma vez que o estudo do vetor permite a compreensão da dinâmica epidemiológica
dessa doença. Os resultados obtidos demonstraram que a vigilância epidemiológica deve ser
intensificada, com foco no monitoramento das populações de mosquitos e nas análises
moleculares do vírus CHIKV. A identificação de genótipos do vírus pode fornecer informações
valiosas sobre a evolução do patógeno e suas implicações para a saúde pública.
Além disso, é fundamental que as políticas de controle de vetores sejam aprimoradas,
integrando estratégias de educação em saúde, mobilização comunitária e uso de tecnologias
inovadoras. A colaboração entre instituições de pesquisa, órgãos de saúde e a comunidade é
essencial para o sucesso das ações de prevenção e controle da febre Chikungunya.
Por fim, este trabalho ressalta a necessidade de mais estudos sobre a interação entre o
vírus, os vetores e o ambiente, visando não apenas a compreensão da epidemiologia da doença,
mas também a implementação de medidas eficazes para a proteção da saúde da população.

4. ARTIGO CIENTÍFICO ORIUNDO DA DISSERTAÇÃO

Morphological identification of Aedes aegypti and first detection of a
naturally infected vector with the Chikungunya virus in the state of Alagoas,
Brazil.

Abstract
The increasing incidence of mosquito-borne diseases, such as dengue and chikungunya fever,
has become a significant public health concern in several regions of Brazil, especially in urban
and peri-urban areas. This study aimed to detect the presence of Chikungunya virus (CHIKV)
in Aedes aegypti mosquitoes in the state of Alagoas, Brazil, and to compare the similarity of the
viral genome in different hosts, including mosquitoes and humans, through phylogenetic
analyses. Collections were performed at specific morning times using a vacuum aspirator, and
mosquitoes were identified based on morphological characteristics of adult specimens. RNA
extraction was performed on individual females and pools of males of Ae. aegypti, followed by
detection of CHIKV via RT-qPCR. For phylogenetic analysis, 25 CHIKV sequences isolated
from Aedes aegypti from its first isolation until 2024, in four Brazilian states, were investigated
and aligned with 569 human sequences from the same states and periods. A total of 1,052
mosquitoes were collected, of which 477 were identified as Ae. aegypti, 51.15% females. The
results indicated that four females and one pool of males tested positive for CHIKV, while all
samples tested negative for the four dengue virus serotypes. Phylogenetic analysis revealed that
viral sequences from human samples and vectors clustered with sequences from the same years,
suggesting different transmission dynamics. This study provides the first evidence of CHIKV
circulation in mosquitoes in the state of Alagoas, reinforcing the importance of molecular
surveillance of the virus in vectors to better understand its transmission dynamics.

Keywords: Arboviruses, CHIKV, Mosquito-borne disease.

Introduction
Between March 2013 and June 2022, a total of 253,545 chikungunya cases were
confirmed in Brazil across more than 5,000 cities in all states, with the northeast region being
the most affected, reporting over 160,000 laboratory-confirmed cases (160,909/253,545) (de
Souza et al., 2023). In Alagoas, the number of chikungunya cases increased significantly from

41.5 to 514.8 cases per 100,000 inhabitants between 2015 and 2016, reflecting an 8.06% rise
(Ministério da Saúde, 2016).
The fever chikungunya disease is caused by an RNA virus belonging to the Togaviridae
family and the Alphavirus genus, known as Chikungunya virus (CHIKV). The disease typically
presents with acute symptoms, including fever, skin rash, and severe joint pain (arthralgia), as
well as headaches and ocular pain (Brazil, 2016). Although the disease does not have a high
mortality rate, limited access to treatments for coexisting conditions (e.g., anemia, malnutrition,
coinfections) can increase case fatality rates. Additionally, outbreaks may overwhelm the
healthcare system’s infrastructure and workforce capacity (World Health Organization, 2024).
Chikungunya is an infectious disease transmitted by a culicine mosquito of the genus Aedes,
which is frequently referred in the literature as Stegomyia due to some phylogenetic debate
(HARBACH, 2007).
Since 2004, the chikungunya virus has spread to other regions of the world, and has
been identified in more than 60 countries across Asia, Africa, Europe, and the Americas (World
Health Organization, 2024). The first case of autochthonous transmission in the Americas was
reported on the Caribbean island of Saint Martin in 2013, where the Asian genotype was
identified. After the virus was introduced to the region, approximately 600,000 suspected cases
were reported, approximately 4,356 cases were laboratory-confirmed and 37 deaths occurred
due to chikungunya disease (Leparc-Goffart et al., 2014; Vasconcelos, 2014). Since 2014, both
the Asian and East/Central/South African (ECSA) genotypes have circulated in Brazil’s
northern (Amapá) and northeastern (Bahia) regions, respectively (Nunes et al., 2015; Teixeira
et al., 2015). The ECSA genotype has subsequently been detected in other states, particularly
in Sergipe (Costa-da-Silva et al., 2017) and Rio de Janeiro (Souza et al., 2017), in the northeast
and southeast regions, respectively.
The circulation of multiple genotypes increases the potential for co-infections and
genetic recombination (Machado et al., 2019). In Brazil, the Asia genotype was the unique
detected, if not, the most prevalent until 2015. After which the ECSA genotype, which is better
adapted to the environment, has remained in circulation (Souza et al., 2019; de Souza et al.,
2024). Continuous surveillance of the virus in high-risk areas with endemic mosquitoes,
combined with genomic data, can offer timely insights to guide effective public health
responses. Furthermore, more studies are needed to understand the role of mutations in
mosquito adaptability, viral replication, and chikungunya pathogenesis (Cunha et al., 2020).
Given the high number of arbovirus cases recorded across Brazil and the historical
global circulation of these diseases, the need for in-depth studies on the dynamics of arboviruses

and their arthropod mosquitoes is evident. Mosquitoes such as Ae. aegypti and Ae. albopictus
are of critical importance to global public health because of their rapid reproductive cycles,
swift dissemination, and remarkable vector capacities. Therefore, viral identification is
essential, as the virus reproductive cycle occurs within mosquitoes and hosts through both
intrinsic and extrinsic factors (Lounibos and Kramer, 2016). Furthermore, all federative units
worldwide, including Brazil, must intensify the epidemiological surveillance of mosquitoes and
arboviruses. The aims of this study were investigate the evaluate the presence of chikungunya
virus (CHIKV) in Aedes aegypti mosquitoes in the state of Alagoas, Brazil, and to assess the
similarity among the virus genome in different hosts, mosquitoes and humans, using
phylogenetic analyses.

Materials and Methods
Study Area and Mosquito Collection. Vector collection was carried out in regions with recent
cases of chikungunya disease. Four cities in the state of Alagoas, Brazil, were selected for
collections, including Maceió (9°39'57''S 35°44'06''W), Maragogi (9°00'44''S 35°13'21''W),
União dos Palmares (09º09'46"S 36º01'55"W) and Viçosa (20°45'14''S 42°52'55'') (Figure 1).
In Maceió, collection sites were selected based on the 2022 Rapid Index Survey for A. aegypti
(LIRAa) of 2022, using epidemiological data from the first and third epidemiological cycles
(weeks 1 to 38) to identify high-risk areas. A total of 15 neighborhoods were included: Barro
Duro, Bom Parto, Chã da Jaqueira, Garça Torta, Gruta de Lourdes, Jaraguá, Jardim Petrópolis,
Jatiúca, Pinheiro, Pitanguinha, Poço, Ponta Verde, Prado, Santo Amaro, and São Jorge. In
Maragogi, União dos Palmares and Viçosa, mosquito collection was conducted by teams of
endemic disease control agents in predefined areas based on cases reported by the Central
Laboratory of Alagoas (LACEN/AL). Collections were carried out in residential, peridomestic,
and building sites between 8:00 AM and 11:00 AM using a vacuum aspirator (Horst
Armadilhas, São Paulo/SP) (Costa-da-Silva et al., 2017), from January to June 2024, with two
collections in the Barro Duro, Gruta de Lourdes and Ponta Verde neighborhoods and only one
collection in the other neighborhood.

Mosquitoes Identification. At the end of the collections, the mosquitoes were kept alive and
transported in thermal boxes containing ice to the Virology and Immunology Research
Laboratory (LAPEVI) of the Federal University of Alagoas, where they were anesthetized with
ice. The mosquitoes were then placed on glass plates and identified using binocular

stereomicroscopes and the entomological key for the main species of public health importance
in Brazil (Consoli and Oliveira, 1994). To differentiate the two species of interest in the study,
all mosquitoes with a black body and white-striped legs, characteristic of mosquitoes from the
Aedes genus, were screened. Ae. aegypti and Ae. albopictus were retained for the study, while
mosquitoes from other species were discarded. After selecting the mosquitoes of interest, Ae.
aegypti and Ae. albopictus were identified and separated based on morphological patterns. In
Ae. aegypti, silver-white and black scales were identified on the scutellum in a lyre shape (the
convex dorsal region of the thorax) (Figure 2E), a silver-colored clypeus (Figure 2A), and a
light band on the anterior face of the femur of the middle leg (Figure 2B), as well as two
separate scales on the mesoepimeron (Figure 2D) and serrated tarsal claws on the foreleg of
the female (Figure 2C). For Ae. albopictus, identification was based on the longitudinal band
on the convex dorsal region of the thorax, the absence of both the silver-colored clypeus and
the light band on the femur, and the presence of joined scales on the mesoepimeron, according
to the entomological key (Consoli and Oliveira, 1994). Additionally, the number of males and
females was quantified. The mosquitoes were stored in a freezer at -20°C until RNA extraction.

RNA Extraction and CHIKV/DENV Detection by RT-qPCR in Mosquitoes. For total RNA
extraction, samples of individual female mosquitoes were prepared from the head, thorax, and
abdomen, as well as pools of 5 whole males. Each sample was first macerated with 200 µL of
1x PBS and 5 µL of Proteinase K (K204-2, Bioclin, MG, Brazil). To serve as an internal
extraction control, 10 µL of the RP-V IC 2 from Seegene kit (Allplex™ SARS-CoV2/FluA/FluB/RSV Assay, MG, Brazil) was added. This internal control consists of an
exogenous molecule whose nature is not specified by the manufacturer. It serves to monitor the
efficiency of RNA extraction, amplification and possible inhibition during the RT-PCR process.
The internal control was amplified according to the manufacturer's instructions (Allplex™)
after all extractions to confirm extraction efficiency. The sample was stored at -80ºC until RNA
extraction. The extraction was performed automatically using the Extracta® 96 DNA and RNA
extractor and purifier, with the Extracta Kit – DNA and RNA from Pathogens (Loccus, São
Paulo, Brazil), following the manufacturer's recommendations. The samples underwent
molecular analysis for the detection of Dengue virus serotypes (DENV 1/4 and DENV 2/3) and
CHIKV, using a multiplex kit (IBMP Biomol ZDC, Paraná, Brazil). The detection of DENV
serotypes aimed to verify whether the mosquitoes carried more than one virus or only CHIKV.
The samples were processed in a CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System of BioRad
(BioRad, SP) with One Step qRT-PCR multiplex conditions. The total volume and cycles for

DENV and CHIKV were as follows: 9.5 µL of total RNA in triplicate, 6.66 µL of dNTPs, 2.0
µL of primers, 1.0 µL of probe, 0.5 µL of RT enzyme, and 0.34 µL of RNAse-free water per
sample. The thermocycler conditions were set for an initial incubation at 51 ºC for 30 min,
followed by 95ºC for 15 min, and 40 cycles at 95ºC for 15 sec and 60 ºC for 1 min. For each
target of interest, a positive control consisting of specific viral RNA (DENV 1/3, DENV 2/4,
and CHIKV) was added. Cycle threshold (CT) values below 36 were considered positive, CT
values equal to or greater than 36 were classified as indeterminate, and the absence of
amplification was considered negative, following the protocol of the kit used. The negative
control consisted of RNAse-free water.

Phylogenetic Analysis. To conduct phylogenetic analysis among the circulating genotypes in
mosquitoes and humans, a collection of CHIKV sequences from humans and mosquitoes was
generated, both with more than 10,000 base pairs and high sequencing coverage on the GISAID
database, and all sequences obtained in this analysis were of the ECSA genotype. 25 vector
sequences were collected in GISAID from four Brazilian states between the years 2016 to 2024.
Were obtained mosquito sequences, Minas Gerais, Pará, São Paulo and Sergipe were aligned
using Aliview. To assess the phylogenetic relationships of the CHIKV genomes, the sequences
were realigned together with 569 human sequences from the same states as the sequences
obtained from vectors between the same years from GISAID. After alignment, a representative
sequence from each state was selected to construct the phylogenetic tree. The selected
sequences were aligned using MAFFT (Katoh and Standley, 2013) using the Unipro UGENE
software (Okonechnikov et al., 2012). The alignment was subsequently refined in the Aliview
program (Larsson, 2014), ensuring the uniformity of the sequence lengths. The final alignment
file was processed in MEGA version 11 (Tamura et al., 2021), where the phylogenetic analyses
were conducted. The phylogenetic tree was built using the Neighbor Joining method (Saitou
and Nei, 1987), and its reliability was assessed using the bootstrap analysis (Felsenstein, 1985)
with 1000 replicates. The substitution model used was Maximum Composite Likelihood
(Tamura et al., 2004).

Statistical Analysis. The statistical analysis of the vector population data statistical analysis
was conducted using GraphPad Prism Version version 8 (GraphPad Software for Windows,
Inc., San Diego, CA, USA). Chi-square test was used to analyze the relative abundance between
cities. A significance level of 5% (P < 0.05) was adopted to determine the statistical significance
of the results.

Results
Epidemiology of Ae. aegypti in Alagoas
Our results showed that Ae. aegypti accounted for 477 (45.35%) out of 1052 collected
specimens across the four cities analyzed, with 244 (51.15%) being Ae. aegypti females (Table
1). Among the cities evaluated in this study, during the first collection in all cities, Maceió
presented a significantly higher percentage of Ae. aegypti (Figure 4).

Figure 1. Vector collection location in the Alagoas state. Mosquitoes collections were
conducted in four cities in areas with a high level of detection of Ae. aegypti and cases of
chikungunya fever and dengue fever according to the city health departments, including
Maceió, Maragogi, União dos Palmares, and Viçosa. The red markers indicated the
neighborhoods visited in each city. These areas were selected based on recent records of
chikungunya cases reported by the health departments of each municipality.

Figure 2. Morphological characteristics of the Aedes aegypti species used for entomological
identification after collections. A) Clypeus with two silvery tufts on the head; B) light band on
the anterior face of the femur of the middle leg; C) Serrated tarsal claws on the foreleg of the
female; D) Mesoepimeron with two separate silvery escapes; E) Median-longitudinal white
stripe lyre-shaped thoracic pattern scales.

Table 1. Viral sample positivity and the abundance of Ae. aegypti captured across multiple
Alagoas cities.

Cities

Collecti Neighborhoods
on
Period

Total
mosquitoes
collected

RT-qPCR
Total of
Ae. aegypti
CHIKV
DENV 1/4 DENV 2/3
Ae. aegypti
collected Male Female Pool Femal Pool Femal Pool Female
e
e

Barro Duro

Chã da Jaqueira

Clima Bom

Garça Torta

Gruta de
Lourdes

Jaraguá

Jardim
Petrópolis

Jatiúca

Pinheiro

Pitanguinha

Poço

Ponta Verde

Prado

Santo Amaro

São Jorge

Barro Duro

129

Ponta Verde

114

111

Gruta de
Lourdes

União January
dos
2024
Palmares

Roberto
Correia de
Araújo

Viçosa

Santa Ana

1052

477

233

244

January
to
March
2024
Maceió

July
2024

Maragog
i
TOTAL

Figure 3. Relative abundance of mosquitoes among sampled cities. Relative abundance (%) of
Ae. aegypti and other mosquitoes collected in Maceió, Maragogi, União dos Palmares and
Viçosa. **** represent p<0.0001 comparing Maceio vs other cities.
In Maceio, the highest vector abundance was observed in the Barro Duro, Poço, and
Ponta Verde neighborhoods (Figure 4A), while 100% of the mosquitoes captured in the Chã
da Jaqueira, Clima Bom, and Gruta de Lourdes neighborhoods were identified as Ae. aegypti
(Figure 4B).
During the collection, a shift in the abundance of both Ae. aegypti and other mosquitoes
collected was observed in three neighborhoods of Maceió: Barro Duro, Gruta de Lourdes and
Ponta Verde across two periods with different climatic conditions (Table 1, Table 2 and Figure
4A). The first collection, conducted between January and March during a hot and dry period,
recorded 134 mosquitoes. In contrast, the second collection, conducted in July during a hot and
rainy period, recorded 286 mosquitoes, representing an increase of 118.32% in mosquitoes
abundance within the same area, the second collection was carried out using data from positive
cases of chikungunya fever provided by LACEN-AL.

Figure 4. Abundance of Aedes in Maceió, Alagoas, Brazil. Absolute (A) and relative (B)
abundance of Aedes and other mosquitoes that are of other genus and not Aedes genus in 15
endemic neighborhoods of Maceió, distributed in two periods: January to March 2024 and July
2024.

Table 2. Climatic conditions of the collection months carried out in the Maceió city - AL.
City

Maceió

Collection month
2024

Average
Precipitation (mm)

Average
Temperature (ºC)

Average relative
air humidity (%)

January

30,9

63,30

February

1,18

30,3

74,19

March

31,3

69,10

July

0,85

26,6

86,08

Detection of CHIKV and DENV in mosquitoes
A total of 327 samples were analyzed for DENV 1/4, DENV 2/3, and CHIKV,
comprising 244 samples from individual females, including head, thorax, and abdomen, and 83
samples from male pools. Among all the analyzed samples, four individual female samples and
one male pool tested positive for CHIKV, with Cycle threshold (Ct) values ranging from 30 to
35. All positive samples were collected in the Ponta Verde neighborhood, which is located in
Maceió.
In parallel with CHIKV detection, the four serotypes of DENV were also tested to
determine whether the mosquitoes were carriers of multiple viruses or only CHIKV. All tested
samples returned negative results for DENV serotypes.

Phylogenetic analysis
From the GISAID database, 25 CHIKV sequences found in infected Aedes mosquitoes
from four Brazilian states between 2016 and 2024 and 569 sequences derived from humans
infected with CHIKV from the same states as the vector sequences were selected. The collected
data allowed the construction of a phylogenetic tree (Figure 5).
Genetic sequences derived from vector samples formed clades alongside sequences
obtained from humans from the same states. Furthermore, significant genomic affinity was
observed in samples circulating in the same region of the country as vector samples from the
same or close years, as observed in a vector sample from Pará (2017) and Sergipe (2016), where
this sequence clustered with human sequences from 2017 and 2018 from the same location.
Furthermore, sequences from São Paulo and Minas Gerais clustered with human sequences

from 2024 and 2023, indicating that transmission may be occurring in a sustained manner in
the region.

Figure 5. The phylogenetic tree presented was constructed using the Neighbor Joining method
to infer the evolutionary relationships among the viral sequences. The reliability of the
groupings was assessed through a bootstrap analysis with 1000 replicates. The prefix “h”
represents the sequences extracted from humans The colors represent vector genomic
sequences. The red color represents sequences from Minas Gerais in 2022. The blue color
represents sequences from Pará in 2017. The green color represents sequences from Sergipe in
2016 and the purple color represents sequences from São Paulo in 2024..

Discussion
The present study aimed to detect Chikungunya virus (CHIKV) in mosquitoes and this
study is the first to identify the presence of the CHIKV in mosquitoes from the state of Alagoas,

Brazil. The mosquitoes were identified using an entomological key (Consoli and Oliveira,
1994), which is essential for ensuring traceability, organization, and interpretation of the data
obtained. The use of entomological keys has often been neglected in many studies, leading to
difficulties in replicating results and even interpretative errors. Therefore, the use of
identification keys strengthens the methodological quality in the handling of mosquitoes and
guarantees the correct identification of the vector species.
Among the locations evaluated in our study, Maceió had the highest abundance of Aedes
among the total of mosquitoes collected. In addition, a change in the absolute abundance of
these mosquitoes was observed in three neighborhoods of Maceió, comparing collections made
during a hot and dry period with those made during a hot and rainy period, Table 2. A study
conducted in 2016 in the state of Alagoas reported human-positive CHIKV samples during the
rainy periods, with the peak number of positive samples in May, suggesting the greater
proliferation of disease-transmitting mosquitoes (Tanabe et al., 2018). Climatic conditions can
influence the reproductive rate of mosquitoes, as favorable environments with high
temperatures, humidity, and rainfall are essential for mosquito reproduction (Martin et al.,
2021). Rainfall precipitation is a critical factor for the reproduction of mosquitoes, as plastics
and other improperly discarded containers collect water, providing an ideal environment for
insect breeding (Morrison et al., 2004).
Aedes aegypti mosquitoes are recognized vector for arboviruses such as Dengue, Zika,
and Chikungunya, which have been identified in various regions of Brazil (Aragão et al., 2018;
Costa-da-Silva et al., 2017). However, studies on the molecular epidemiology of CHIKV have
focused mostly on human blood samples. A literature review identified 12 studies that
performed genome sequencing of viral samples from mosquitoes, with only two in Brazil
(Aragão et al., 2019; Auksornkitti et al., 2010; Carrasquilla et al., 2021; Hapuarachchi et al.,
2021; Intayot et al., 2021; Le et al., 2020; Nanakorn et al., 2021; Phumee et al., 2021; Ribeiro
Cruz et al., 2020; Selhorst et al., 2020; White et al., 2018). These studies used different
strategies to detect CHIKV in mosquitoes, using individualized females and male pools, as we
did, and others using female or male pools. All studies detected a low percentage of infected
mosquitoes when compared to the amount collected, with less than 4% of pools of infected
females tested for CHIKV and DENV in each study. When we compare the studies that detected
individual females for CHIKV, it is possible to observe the low number of infected mosquitoes
found, as well as ours. The detection of infected males only serves to investigate the vertical
transmission of the virus in vectors and the mechanism of preservation of the virus in nature.

The greater detection of infected females than males can be linked to their hematophagic
behavior, as females require human blood for oviposition. Human blood represents an energy
source, providing glycoproteins that assist in egg maturation. Therefore, by feeding on blood,
the female mosquito may acquire the virus from an infected host or transmit it if previously
infected (Lounibos and Kramer, 2016). Ae. aegypti are highly susceptible to storing and
reproducing CHIKV in various tissues of their bodies, which may facilitate the transmission of
the virus from adult individuals to their offspring (Velandia-Romero et al., 2017). Ae. aegypti
tissues found in the head, thorax, and abdomen are commonly infected with CHIKV. This is
because viral replication starts in the midgut, as the virus infects epithelial cells of the mesentery
and parental tissues after ingesting infected blood. These cells replicate the virus and spread it
to other tissues, including the salivary glands and head, where the proboscis is located through
which the mosquito injects saliva before feeding and sucks blood (Hardy, 2020).
During the molecular analyses conducted in the present study, only one male pool of
Ae. aegypti tested positive for CHIKV. The molecular identification of CHIKV in male
mosquitoes reinforces the occurrence of vertical transmission, as males do not exhibit
hematophagic behavior. In this way, vertical transmission is one of the mechanisms that
maintain virus circulation in nature, as infected females deposit eggs that hatch already infected
(Agarwal et al., 2014; Honório et al., 2019). In experimental studies, females were fed blood
infected with CHIKV and analyzed over gonotrophic cycles. The vertical transmission rates
increased in subsequent reproductive cycles, indicating that viral replication in ovarian tissues
is an important factor for egg infection (Agarwal et al., 2014; Dzul-Manzanilla et al., 2015).
As mentioned, the present study is the first to report CHIKV in Ae. aegypti in the State
of Alagoas, contributing to this survey, which was carried out by few studies in other regions
of the country (Costa-da-Silva et al., 2017; Krokovsky et al., 2022; Leandro et al., 2020;
Monteiro et al., 2020; Ribeiro Cruz et al., 2020; Silva et al., 2024).
However, our study has some limitations that made our analyses difficult: the first is the
time of collection and the second is the low percentage of infected mosquitoes. The first
limitation directly involves obtaining infected mosquitoes from CHIKV positive locations,
which made it difficult to detect the virus during the procedure. A study carried out by Crespo
et al. (2024) revealed that the biological performance of Ae. aegypti mosquitoes were negatively
affected when they were infected with CHIKV, reducing their longevity and reproductive
capacity. This factor may explain the low number of infected mosquitoes collected in regions
with Chikungunya cases.

Finally, we constructed a phylogenetic tree with viral genome sequences obtained from
mosquitoes, correlating with sequences obtained from human samples. The phylogenetic
analyses revealed distinct clustering patterns of Chikungunya virus (CHIKV) sequences over
time and space, suggesting different transmission dynamics. Samples from Minas Gerais (2022)
clustered with sequences from 2023, while those from São Paulo (2024) formed a clade with
human sequences from 2023 and 2024, indicating the possible sustained circulation of the virus
in these regions. In contrast, samples from Pará (2017) and Sergipe (2016) clustered exclusively
with sequences from 2017 and 2018, suggesting punctual introduction events without continuity
in subsequent years. These findings may reflect both the local persistence of specific lineages
in certain regions and the introduction and disappearance of the virus in others, possibly
influenced by epidemiological and environmental factors, as well as human and vector mobility
dynamics..
The variation among CHIKV genotypes is crucial for understanding the epidemiology
and dynamics of viral infections. The study by Machado et al. (2019) revealed that both the
African ECSA and Asian/Caribbean genotypes were simultaneously circulating in the
northeastern region of Brazil, specifically in Pernambuco. Through genome sequencing directly
from clinical samples, researchers identified evidence of coinfection in individuals, suggesting
that the coexistence of different genotypes may be more common than previously thought. This
genetic diversity not only complicates the diagnosis and treatment of infections but also may
influence the virulence and immune response of hosts. Therefore, understanding the variations
among genotypes is essential for developing effective strategies for controlling and preventing
future outbreaks (Machado et al., 2019).

Conclusion
Despite its limitations, our results reinforce the importance of virus detection in mosquitoes and
suggest, through phylogenetic analyses, that clades are predominantly formed based on
geographic and temporal proximity, reflecting the regional dynamics of CHIKV. The clustering
of sequences from closely related years indicates sustained virus circulation in certain areas,
suggesting continuous local transmission, while the absence of more recent samples in some
clades may indicate sporadic introductions without long-term persistence. These findings
highlight that CHIKV dispersion is not solely determined by the type of host but also by human
mobility, vector ecology, and other epidemiological factors. In addition to viral detection, this
study describes the morphological identification of Aedes aegypti using an entomological key,

ensuring methodological reproducibility and confirming the accurate identification of the
analyzed vector species.

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